Summary
마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 버퍼 수술 기법은 상세하게 설명된다.
Abstract
마우스 절연 신장 관류 (MIPK)를 관류하고 1 시간 동안 기능성 생체 조건 마우스 신장을 유지하기위한 기술이다. 이 분리 된 기관 및 관류 신장 생명 공학에 대한 탈세 포화 또는 항 거부 또는 소수 신장에 고용량의 게놈 편집 약물의 투여를 포함한 미래에 가능할 수있다 많은 혁신적인 애플리케이션에 대한 생리 연구를위한 전제 조건입니다 이식. 재관류 시간 동안 신장은 신장 기능이 평가 될 수 있고, 조작, 및 다양한 제약으로 투여 될 수있다. 절차 후 신장 이식 될 수있다 또는 분자 생물학, 생화학 분석, 또는 현미경에 대한 처리.
본 논문은 관류 및 마우스 신장의 생체 외 관류에 필요한 수술 기법에 대해 설명합니다. 관류 장치의 상세에 주어진 데이터는 V를 도시 제시신장의 제조 iability : 형태소 판독 및 분자 판독 상이한 네프론 세그먼트 수송 단백질의 웨스턴 블랏 상이한 네프론 세그먼트 기능, 투과 전자 현미경과 같은 신장 혈류, 혈관 저항 및 소변 데이터.
Introduction
기관의 고립 된 관류는 수십 년 1 생리 학자들 사이에서 지속적인 노력의 대상이되고있다. 기술은 혈압, 호르몬 또는 신경 조직 등의 영향없이, 기관의 기능을 가능하게 검토한다. 칼 에두아르 Loebell는 1849 2, 고립 된 신장의 성공적인 재관류을 설명했습니다 첫 번째로 간주됩니다. 그 이후로, 관류 장치에 상당한 정련을 실시하고있다. 프레이와 그루버는 지속적인 관류 2 산소와 타악기 펌프 용 인공 폐를 소개했다. 초기 연구는 주로 큰 포유 동물 - 즉, 돼지 2 개 3 쥐 신장의 사용 - 첫번째 보고서, 와이즈 등으로의 신장을 공부하는 동안. , 작은 포유 동물 기관 관류 (4)의 연구에서 획기적인 사건이었다. Schurek 등. 충분한 신 세뇨관 경우 관류에 포유류의 적혈구를 추가의 필요성을보고산소는 5를 달성 할 수 있었다. 장기간 실험 긴급 동일한 연구 그룹 (6)에 의해 버퍼의 연속 투석의 도입이었다. 2003 년 SCHWEDA 등. 나중에 Rahgozar 등에 의해 정제 기능 마우스 고립 관류 신장 (MIPK) 7을보고 처음이었다. 18 Lindell 등의 알. 14.
절연 신장 관류 래트보다 기술적으로 어려운 반면, MIPK의 사용은 유전자 변형 마우스의 다양한 배열의 사용을 가능하게하는 장점을 맺는다. 이 논문은 1 시간 동안 고립 된 마우스 신장 관류에 대한 저자의 방법의 세부 사항을 제공합니다. 상기 방법은 신장 유량 혈관 저항 호르몬 방출 혈액 가스 분석, 소변 분석, 약물의 애플리케이션의 지속적인 평가를 허용한다. 절차에 따라, 신장은, 분자 및 생화학 분석을 위해 처리 할 수있는 현미경에 대한 고정, 또는받는 사람 마우스에 이식 (그림 1).
그림 1 : 절연 관류 신장에 가능한 입 / 출력의 개요. BGA : 혈액 가스 분석. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
많은 혁신적인 응용 프로그램 (또는 항 거부 또는 게놈 편집 약물의 응용 프로그램없이) 8, 9, 이전 이식에 장기간 정상 체온 신장 관류의 새벽 논의되는 바와 같이이 기술은 가능성, 10, 향후 몇 년에 걸쳐 관심을 증가 받게됩니다 11, decellularized 발판 (12)의 전체 신장의 생명 공학 및 광자 이미징 13 형광 염료의 고용량의 적용 (14) 중 특정 유전자의 역할을 연구와 이상적인 모델이다.
단계별 프로토콜은 다른 실험실에서 성공적으로 격리 된 마우스 신장 재관류를 수행 할 수 있도록 설명한다. 첫째, 조성물 및 완충액의 제조 지정된다. 그리고, 수술 상세히 설명되며 중요한 단계가 도시되어있다. 셋째, 데이터가 성공적으로 제조 나타내는 것을 제시되어 신장 혈류, 혈관 저항, 사구체 여과율 및 분수 전해질 배설 모두 관류 신장 다른 네프론 세그먼트 형태의 생존 및 투과형 전자 현미경의 기능적 측정 관류의 1 시간 후 고정.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 논문에 기술 된 동물과 관련된 모든 절차는 스위스 법률에 따라 취리히, 스위스의 캔톤의 동물 관리의 승인을 실시 하였다.
1. 버퍼 준비
- (4)과 항 이뇨 호르몬 (ADH) 용액 (표 1) - 솔루션 (1)을 준비합니다.
- 투석 완충액 (표 1)을 준비한다.
주 : 이것은 재관류 동안 투석 버퍼로서 사용되는 버퍼이다. 나중에, 적혈구 최종 관류 액을 형성하는 버퍼에 희석한다. - 적혈구 준비.
- 인간의 적혈구 농축액 투석 버퍼 500 ml의 (지역 혈액 은행에서 얻은 시험 물질) 250 ml에 희석. 8 분 동안 2,000 XG에 원심 분리기. 어떤 적혈구를 제거하지 않도록주의, 버퍼를 제거합니다. 배를 반복합니다.
- 완충액, 알부민 (BSA 소 혈청 알부민)를 준비한다.
- dialysi 200 ㎖에서의 버퍼는 교반 막대를 사용하여 BSA의 44g을 녹인다. 필터 종이와 솔루션을 필터링합니다.
- 관류를 준비합니다.
- BSA에 버퍼에 여과지를 통해 단계 1.3.1에서 적혈구를 필터링합니다. 투석 버퍼 800 ML의 총 부피까지 입력합니다.
주 :이 최종 관류이다. 헤마토크릿 이제 8과 12 % 사이 여야합니다. 관류 12 시간까지 4 ℃에서 저장할 수 있습니다.
- BSA에 버퍼에 여과지를 통해 단계 1.3.1에서 적혈구를 필터링합니다. 투석 버퍼 800 ML의 총 부피까지 입력합니다.
2. 시작 투석 및 산소화
- 더 큰 버퍼 저수지, 작은 버퍼 저장하고 촉촉한 챔버를 37 ° C로 (작은, 이중벽 챔버 나중에 신장을 유지하기 위해 37 ° C와 100 % 습도하게) 주변의 물을 욕조를 켜십시오 (그림 2) .
- 투석 버퍼로 큰 버퍼 저수지와 관류와 작은 저수지를 입력합니다.
- 투석 버퍼에 5 % CO에 2 / 95 % O 2 가스 유입을 돌립니다.
- 투석 버퍼에 대한 관류의 연속 투석 전환합니다. 저 유량 투석 튜브를 사용하도록주의하십시오. 3 단계로 진행합니다.
그림 2 : 관류 회로의 개략도. 반응식은 관류 회로의 주요 구성 요소와 버퍼 흐름의 방향을 나타낸다. 진한 파란색에 둘러싸여 모든 구성 요소는 물 목욕 / 온도 37 ° C로 유지된다. 1 : 재관류 버퍼의 적어도 3 배의 용적의 투석 버퍼 연속 95 % O 2 / 5 % CO 2로 버블 링된다. 2 : 투석 완충액 관류 완충액 연속적 롤러 펌프에 의해 투석 튜브에서 서로에 대해 투석한다. 3 :이 투석, 관류 완충액 9 % O 풍부 인해 2 / 5 % CO 2 및 전해질 농도가 일정하게 유지된다 througho유타 관류. 4 : 롤러 펌프는 신장 방향으로 관류 완충액 추진. 5 : windkessel가 연동 파도를 제거하고 버블 트랩 역할을합니다. 6 : 압력 변환기 (자유롭게 교류의 흐름을 허용하면서 4 (롤러 펌프에 연결)은 지속적인 압력을 유지하기 위해). 7 : 관류 전반에 걸쳐, 신장은 100 % 공기 습도 및 37 ° C의 신장 온도 촉촉한 챔버에 남아 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
3. 수술 1 부 (모든 합자의도를 들어, 그림 3 참조)
참고 : 5-0 수술 스레드를 사용하여 모든 합자를 수행합니다.
- 복강 내 주사하여 마우스 (0.9 % 염화나트륨에 용해 체중, 20 ㎎ / ㎖ 케타민 및 1 ㎎ / ㎖의 자일 라진 10 μL / g)를 마취. anesth의 충분한 깊이를 확인후방 발 반사의 유무를 테스트하여 ESIA.
- 습한 챔버에서 부정사 위치에 마우스를 고정합니다. 수의사 연고와 눈을 보호합니다. 요추 혈관을 상승 척추 아래 1 ML의 주사기를 놓습니다.
- 가위로 먼저 흉골 개방 피부, 후 복부 근육에 음모 문장에서 중간 개복술을 수행합니다.
- 장을 제거하고 복부에서 마우스 측면의 왼쪽에 놓습니다.
- 결합 조직에서 방광을 확보하고 요관 및 요도 모두를 탐구한다.
- 왼쪽 요관 (합자 I)의 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다.
- 요도 (합자 II) 주위에 끈을 놓으십시오. 닫습니다.
- 전체 방광 (합자 III)의 주위에 "올가미"합자를 놓습니다.
- 블래 1 mm의 절개.
- 2cm PE (50) 튜브와 개방을 Cannulate.
- 튜브 주위 닫기 합자 III.
- 합자에서 왼쪽 요관 및 요도의 말단을 잘라. BLAD데르는 이제 자유롭게 이동 오른쪽 요관에 연결되어 있습니다.
- 결합 조직과 지방의 복부 대동맥을 취소합니다.
- 복부 중간 대동맥 결찰 (합자 IV)를 놓습니다.
- 장간막 동맥과 복강 트렁크 (합자 V) 사이의 다이아 프램 아래의 대동맥 주위 합자를 놓습니다.
- 장간막 동맥 (합자 VI)의 주위에 끈을 놓으십시오.
- 직접 오른쪽 아래 왼쪽 신장 동맥 (합자 VII) 위의 대동맥 결찰를 놓습니다.
- 꼬리 정맥 패키지 (맥) (합자 VIII)의 주위에 끈을 놓으십시오. 4 단계로 진행합니다.
그림 3 : 수술 중에 배치 된 합자의 개략도. 개복술 후 오픈 복부보기. 소장은 왼쪽 밖으로 이동합니다. L 및 R이 좌측 및 우측 신장을 나타낸다. 그만큼검은 색 선은 각각의 봉합사의 면적을 나타낸다. 합자이 먼저 배치하고 텍스트에 주어진 순서에 폐쇄된다. X는 동맥 삽관에 대한 절개의 위치를 표시한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
관류 회로 4. 프라이밍
- 로터리 펌프를 시작하고 관류와 튜브를 입력합니다. 그것에서 모든 공기 방울을 비우주의하십시오.
- 관류 대략 중간 수준에 windkessel 장치를 채 웁니다.
- 모든 튜브가 작성 흐름이 시간 동안 신장 수준에서 관류 바늘을 유지하다 0 0 mmHg로에 압력 변환기 보정.
- 일정한 최소 수준 (0.6 ml / 분)에서 흐름을 유지하고 5 단계로 진행합니다.
5. 수술 2 부
- 합자 IV와 왼쪽 레나의 분기 사이에 클램프를 놓습니다리터 동맥.
- 지느러미 벽을 절단하지 않도록주의하면서 합자 IV의 대동맥 꼬리에 작은 절개를합니다.
- 용기와 확장기 대동맥의 팽창 개구.
- 바늘로 대동맥을 Cannulate 단지 클램프로 끝을 밀어 (2cm 길이, PE 50 당겨).
- 클램프를 엽니 다.
- 이 오른쪽 신장 동맥 및 대동맥의 교차점에 도달 할 때까지 바늘 두개쪽으로의 끝을 밀어 넣습니다.
- 닫기 합자 VII.
- 닫기 합자 IV.
- 다이어프램을 해부하여 가위로 가슴을 엽니 다. 하나의 컷으로, 대동맥, 대정맥, 마음과 식물 신경을 분리합니다. 이 단계로, 동물 연속 깊은 마취 빠른 방혈로 희생된다.
- 관류 펌프의 압력 제어를 시작합니다. 80 ~ 100 mmHg의 사이의 평균 압력을 유지한다.
- 닫기 합자 V.
- 닫기 합자 VI.
- 닫기 합자 VIII.
- 결합 tissu 무료 오른쪽 신장전자와 가위로 지방 캡슐로의 삽입.
- V.를 합자하는 근위 대동맥을 잘라
- VI를 합자하기 위해 원심 장간막 동맥을 잘라.
- 혈관 자체로 절단하지 않도록주의하면서 신장지지 용기 번들을 잘라.
- 신장에 대한 연결에 간을 잘라. 신장을 확보하는데주의를 기울여야하지만, 대정맥이 그것에 의해 개방 유지되도록, 그것에 간 접착의 작은 부분을 둡니다.
- 마우스에서 신장 번들을 가져 가라. 습한 챔버에서 마우스를 제거합니다.
- 간 및 신장 (합자 IX)의 연결 주위에 "올가미"합자를 놓습니다.
- 정맥 라인 (2cm의 PE 50)와 대정 맥을 Cannulate.
- 닫기 합자 IX. 정맥 라인을 통해 정맥 유출을 즉시 시작해야합니다.
- 촉촉한 챔버를 닫습니다.
6. 다운 스트림 분석
- 다음 시간 동안 연속적으로 혈류 intravascul 모니터링아칸소 압력 15. 예를 들면 분석을 위해 사용할 수있는 정맥 유출, 신장 레닌 방출 7 수집. 전해질 농도와 사구체 여과율 (14)의 분석을 위해 소변을 수집합니다. 관류 1 시간 후, 신장 서부 블로 팅에 대한 스냅인을 동결 할 수 있습니다 또는 이미지에 대한 고정 (16)에 접근한다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
방법 설명과 함께, 고립 된 마우스 신장은 적어도 1 시간 동안 가능한 남아있을 수 있습니다. 우리는 기능 (신장 혈류 및 혈관 저항 정맥 유출 사구체 여과율 비뇨기 분수 나 + 및 K + 배설 혈액 가스 분석, 소변 삼투압) 및 형태학 (투과형 전자 연속 재관류 1 시간 후 조직 생존력을 시험 야생형 C57BL / 6 마우스의 네 신장 현미경, TEM) 방법. 또한 다른 세관 세그먼트 정점 마커 단백질의 웨스턴 블랏은 동일한 동물 unperfused 신장 관류 절연 신장을 비교 하였다. 모든 실험에서, 정압 관류 ~ 100 mmHg로 (도 4) 관류 압력을 유지 하였다. 이러한 신장, 관류 흐름 및 혈관 저항 신장 중량 3 15.6 ± 0.4 ㎖ / 분 * g에서 55 분의 시간 동안 안정적으로 유지5 ± 1.0 mmHg로 * 분 / ㎖, 각각 (그림 4 A). 관류 흐름 또는 혈관 저항의 증가의 감소는 조직 생존을 감소시키고 케어 관류 걸쳐 모니터링해야에 관해서 민감 파라미터이다. 동맥 유입이 정맥 유출 (표 2)와 비교했을 때 혈액 가스와 관류의 발병 후 60 분 촬영 한 100 μl의 샘플 전해질 분석, 신장 CO 2 생산 및 O (2) 소비를 한 것으로 밝혀졌습니다. 다른 매개 변수는 동맥과 정맥 (표 2) 사이의 변화가 없었다. 증가는 조직 손상하는 동안 발생할 수 있으므로 특별한 강조가 변경되지 않은 정맥 칼륨 자료에 배치해야합니다. FITC-이눌린 클리어런스 (14)를 통해 평가 사구체 여과 속도는 시간이 지남에 따라 (도 4 B)을 증가시키는 경향이 있지만, 이러한 경향은 유의 도달하지 않았다. 나트륨과 칼륨의 소수 배설 관류의 55 분 평가생체 내 상황 (도 4 C)에 비해 증가한다. 소변 삼투압은 재관류 55 분 (그림 4 D) 후 정맥 유출의 삼투압 이상 상승하지 않습니다.
이전 17 바와 같은 형태 학적 연구를 들어 신장 투석 완충액으로 3 %의 파라 포름 알데히드의 관류 및 0.1 % 글루 타르 알데히드 후 고정시켰다. 신장 미세 구조는 TEM으로 평가 하였다. 근위 세뇨관의 사구체와 S1 세그먼트는 관류 (그림 5 A와 B) 후 크게 변경되지 않은 것처럼 보였다. 일부 있지만, 관다발에 종료되지 않은 근위 세뇨관의 모든 S2 / S3 세그먼트 및 두꺼운 오름차순 사지가 쥐 고립 된 관류 신장 5 전술 한 바와 같이 장기 손상의 흔적을 보여주는 사람이 아닙니까 (그림 5 C 및 D). 심지어 가까운 검사에, 말단 복잡한 세관 및 수집 덕트 (괴사의 명백한 징후를 보이지 않았다도 5 E, F 및 G). 결론적으로, 마우스 신장의 형태 학적 소견 래트 절연 신장 관류 5에서 볼 수있는 상황을 반영.
고립 된 관류 신장에서 다른 네프론 세그먼트의 정점 마커 단백질의 서양 말은 같은 동물의 unperfused 반대측 신장에 비해 (관류의 1 시간 후 스냅인 냉동) 상당한 변화를 공개하지 않았다 (관류의 발병하기 전에 스냅인 냉동). 우리는 (그림 6 A와 B) (덕트를 수집 / 세관 연결) (근위 세뇨관에 위치) NAPI-인천 국제 공항, NKCC2 (두꺼운 오름차순 사지), NCC (말초 복잡한 세관), 및 ENAC을 공부했다.
그림 4 : 55 분 동안 관류 신장의 기능 생존의 평가. A) <일정한 압력 관류, 혈관 저항 및 관류 흐름 중> / 강해 55 분 동안 안정적으로 유지. 첫 번째 15 분 인해 항상이 시간 동안 볼 수있는 높은 변동성에 제외됩니다. B) 사구체 여과율 (25) 55 분 후 평가 네 개의 신장 (FITC - 이눌린은) 시간이 지남에 따라 약간 있지만 크게 증가 표시됩니다. 나트륨과 칼륨의 C) 분수 배설 관류 55 분 후 평가 하였다. 관류 55 분 후 D) 정맥 혈장과 소변 삼투압. N = 4 모든 실험한다. 데이터는 ± SEM 수단으로 표시하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 투과 전자 현미경. D의 대표 형태학 1 시간의 종료 시점에서 관류 신장의 ifferent 네프론 세그먼트. A) 사구체 손상되지. 사구체에서 발 세포의 세부 사항입니다. 근위 세뇨관의 B) S1 세그먼트. S1 세그먼트는 그대로이다. 근위 세뇨관의 C) S2 / S3 세그먼트. 일부는 아니지만 근위 세뇨관 모든 S2 / S3 세그먼트 매우 괴사이다. 세포는 팽창 한 것처럼 큰 세포 손상을 보여줍니다. 튜브형 윤곽은 기저막에 의해 유지된다. D) 두꺼운 오름차순 사지 (TAL). 혈관 번들 거리가 멀다 그 나누지는 수증 성의 변성의 첫 번째 징후를 보여줍니다. 내강 막은 얇아 연약한 나타납니다. E) 원위 세뇨관 (DCT). DCT에 그대로 있습니다. F)는 DCT 셀의 기저 infoldings의 세부 사항. 유창의 내피 세포, 기저막, 기저 infoldings 및 미토콘드리아는 그대로입니다. G) 덕트 (CD 수집). CD는 그대로입니다.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : 같은 동물에서 Unperfused 신장에 비해 절연 관류 신장에 혀끝 마커 단백질의 웨스턴 블롯. A) 신장의 웨스턴 블롯 1 시간과 unperfused 신장을 위해 관류. NAPI-IIA는 근위 세뇨관에 대한 대표입니다. NKCC2은 두꺼운 오름차순 사지에 대한 대표입니다. NCC와 NCC는 독점적으로 원위 세뇨관에서 발견 쓰 레오 닌 (53) (PT53 NCC)에서 인산화. 자신의 전체 길이 ENAC 및 각각의 단백질 가수 분해 절단 제품의 알파와 감마 서브 유닛은 연결하는 가느 다란 관 / 집합관에 대한 담당자 표시됩니다. B A의) 정량)은 신장 관류 F 사이에 유의 한 차이를 공개하지 않았다1 시간 및 unperfused 신장 나. N = 3 모든 실험한다. 데이터는 ± SEM을 의미하며, 개별 값이 표시됩니다으로 표시하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1 : 솔루션 및 투석 버퍼의 조성. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 2 : 혈액 가스와 동맥 유입의 전해질 분석 및 관류의 발병 후 관류 마우스 신장 60 분의 정맥 유출 (N = 4). ± 수단으로 데이터 제시SEM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
관류 신장 절연 마우스 수많은 전신 요인의 영향에 의해 결함이 될 수있다 손상 동물 생체 실험 간의 격차를 1 시간 동안 제어 된 환경 생체 신장 기능을 연구하기위한 도구이고, 시험 관내 실험에서 격리 된 네프론 세그먼트 또는 반드시 기능에 손상 장기 구조의 영향을 무시 배양 된 세포. , 저자의 지식과 대안 기술이 특정 작업을이 수행하지 않는 것입니다. 신장 조직의 생화학 적 연구는, 그러나, 신장 조각 (17)을 이용하여보다 간단한 형태로 수행 될 수있다. 제시된 기술은 현재 신장 생리학을 연구하기 위해 주로 사용되는 동안, 많은 새로운 응용 프로그램이 논의되고있다. 예를 들면, 관류 탈세 포화 및 recellularization 12시 신장 생명 공학에 사용될 수 있습니다. 또한, 이전에 신장의 장기간 정상 체온 관류는 그럴 필요합니다ansplantation, 안티 거부 또는 게놈 편집 관류에 약물이 연구되고있다 고용량의 관리와; 심지어 임상 8, 9, 10, 십일인치 마우스 고립 관류 신장 특히 녹아웃 모델과 개별 유전자의 역할을 규명하기 위해,이 응용 프로그램에 사용할 수있는 훌륭한 도구입니다.
세 단계는 성공적인 실험 중요하다. 이 논문은 절차를 재현 할 수있는 수단으로 관심이 실험실을 제공합니다. 우선, 버퍼가 신장 재현 조건 하에서 장기간 생존에 필요한 영양분의 대부분을 수신하는 방식으로 제조 될 필요가있다. 균형이 완전히 통제 된 조건 (합성 버퍼) 및 기본 관류 조건 (전혈) 사이에서 발견되어야합니다. 따라서, 10 %의 적혈구 용적을 알부민 포유류 적혈구가 포함되어야한다. 이 적혈구 용적률은, 저자의 경험, 충분한 t 사이의 최고의 타협을 나타냅니다문제의 산소와 낮은 버퍼 점도 (적혈구 용적률은 (적혈구 (18)없이 관류 신장에 값이 논문에 제시된 값을 비교 압력 일정 관류 동안 극적으로 흐름을 감소 증가)). 적혈구의 품질과 신선도는 매우 중요하다. 세척 단계 동안, 적혈구가 용혈을 방지하기 위해주의하여 취급해야합니다. 버퍼는 실험 일에 신선하게 제조 할 필요가있다. 둘째, 수술은 가능한 최단 시간 내에 숙련 된 의사에 의해 수행 될 필요가있다. 의사는 최소한으로 동물의 혈액 손실을 유지하면서 신체의 나머지에 신장을 연결하는 주 혈관 약 6 합자를 수행 할 필요가있다. 최적의 결과를 위해 수술 개입은 30 분 이내에 수행되어야한다. 동물의 평균 동맥 혈압은 마취에 장시간 수술 중 또는 인해 떨어지면, 60 mmHg로 아래, 신장 관류는 이미 최소화하고 조직은 경향이있을 것이다괴사합니다. 이 문제를 배제하기 위해, 왼쪽 신장이 오른쪽 신장의 관류가 이미 시작하고, 비 처리 대조군으로 사용했을 때, 수술 후 촬영할 수 있습니다. 셋째, 표준 소형 동물 관류 회로 이루어진 관류 관류 장치의 정확한 기능의 시간 동안 확보 할 필요가있다. 컴퓨터 자체 재관류 진행 중일 예 관류 회로 기포를 확인하기 위해, 인간의 감시는 필요하다.
제공하는 대표적인 데이터는 1 생체 관류의 시간과 여기에 기술 된 방법이 방법의 실행의 기술적 성공의 비교 후 신장 생존 능력의 평가를 할 수 있습니다. 적어도 1 시간, 신장의 혈류, 혈관 저항 동안 정맥 유출 사구체 여과율의 혈액 가스가 안정적으로 유지한다.
하나 염두에 두어야하는 기술에 특정 제한이 있습니다. 심지어 기가장 성공적인 수술 발행 dney 수는 제한된 시간 동안 만 가능한 남아있다. 저자는 관류를 중지하기에 가장 좋은 시점으로 1 시간을 발견했다. 단리 신장 재관류 깊이에서 절연 전체 기관의 조사를 허용하면서 또한, 하나의 세포 유형에 대한 특정 효과를 구별하기 어렵다. 사구체, S1 세그먼트, DCT에, 그리고 CD는 그대로 유지해야하는 동안 1 시간 후 고정 신장 근위 세뇨관 두꺼운 오름차순 사지 세포의 S3 세그먼트에서 결함을 표시 할 수 있습니다. 특히 인간의 적혈구로부터의 필수 사용은 또한 실험에 대한 잠재적 위험 (예를 들어, 감염)에 연결된다.
요약하면, 마우스 절연 신장 관류 전체 기관 생체 외 연구를 갖는 유용한 기술이다. 어떤 기술과 마찬가지로, 그것은 어떤 장점과 제한 사항이 있습니다. 저자는 모두 매니 폴드 새로운 응용 프로그램이 현재 발생하고이 프로토콜은 sufficien을 제공 할 수 있다고 생각다른 실험실에 대한 t 모멘텀이 노력을 재현합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfusion Circuit: | |||
| Moist chamber 834/8 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2901 | |
| Cannular with basket and side port | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2947 | |
| Thermostat TC120-ST5 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-4544 | |
| ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-0114 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 1 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3438 | |
| Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3436 | |
| Pressure Transducer APT300 | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3862 | |
| TAM-D Plugsys Transducer | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-1793 | |
| SCP Plugsys servo controller | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-2806 | |
| Windkessel | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3717 | |
| HSE-USB data acquisition | Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH | 73-3330 | |
| Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone | B.Braun | 7203525 | |
| PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. | Scientific Commodities Inc. | BB31695-PE/8 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buffer reagents: | |||
| Aminoplasmal 10% | B.Braun | 134518064 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256-25G | |
| L-Glutamic acid monosodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G1626-100G | |
| L-(-)-Malic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | M1125-25G | |
| Sodium-L-Lactate | Sigma-Aldrich | L7022-10G | |
| alpha-Ketoglutaric acid sodium salt | Sigma-Aldrich | K1875-25G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 31434-1KG-R | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761-5KG | |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60130-1KG | |
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378-500G | |
| Creatinine | Sigma-Aldrich | C4255-10G | |
| Ampicillin | Roche | 10835242001 | |
| MgCl2 * 6H2O | Sigma-Aldrich | M2393-500G | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| CaCl2 * 6H2O | Riedel-de-Haën | 12074 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638-500G | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S0876-500G | |
| Antidiuretic Hormone dDAVP | Sigma-Aldrich | V2013-1MG | |
| FITC-Inulin | Sigma-Aldrich | ||
| Filter used for erythrocyte filtration | Macherey-Nagel | MN 615 | |
| BGA Analysis: | |||
| ABL 80 flex | Radiometer Medical ApS | ||
| Electron Microscope: | |||
| Philips CM100 TEM | FEI |
References
- Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81 (2112), 621-623 (1935).
- Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123 (4-6), 249-273 (1908).
- Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7 (1), 1-11 (1975).
- Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196 (5), 1115-1118 (1959).
- Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53 (2), 145-155 (1985).
- Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16 (3), 377-384 (1979).
- Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284 (4), F770-F777 (2003).
- Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360 (1), 7-19 (2009).
- Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13 (5), 1246-1252 (2013).
- Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38 (4), 352-361 (2014).
- Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
- Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19 (5), 646-651 (2013).
- Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22 (7), 1297-1304 (2011).
- Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
- Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100 (4), 556-563 (2007).
- Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. , (2016).
- Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8 (10), 1227-1236 (2015).
- Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9 (5), 288-296 (2004).
