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Biology

A técnica de rim perfundidos rato isolado

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Os tampões e técnica cirúrgica encontram-se descritos em pormenor.

Abstract

O mouse rim isolado perfundido (MIPK) é uma técnica para manter um rim do rato em condições ex vivo perfundidos e funcionais durante 1 h. Este é um pré-requisito para o estudo da fisiologia do órgão isolado e para muitas aplicações inovadoras que possam ser possíveis no futuro, incluindo decellularization perfusão de bioengenharia nos rins ou a administração de anti-rejeição ou drogas edição do genoma em altas doses para preparar o rim para transplante. Durante o tempo da perfusão, o rim pode ser manipulada, a função renal pode ser avaliada, e vários produtos farmacêuticos administrados. Após o procedimento, o rim transplantado ou pode ser processado para a biologia molecular, bioquímica, ou microscopia.

Este artigo descreve o perfusado e da técnica cirúrgica necessária para a perfusão ex-vivo de rins de rato. Os detalhes do aparelho de perfusão são dados e os dados são apresentados mostrando o vESPONSABILIDADE da preparação do rim: fluxo sangüíneo renal, resistência vascular, e urina dados como funcionais, micrografias eletrônicas de transmissão de diferentes segmentos dos néfrons como leituras morfológicas e Western blot de proteínas de transporte de diferentes segmentos dos néfrons como leitura molecular.

Introduction

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A perfusão isolada de órgãos tem sido objecto de um esforço contínuo entre os fisiologistas por muitas décadas 1. A técnica permite que a função do órgão, sem influências sistêmicas, tais como pressão arterial, hormônios ou nervos, a ser estudado. Carl Eduard Loebell é considerado para ser o primeiro a ter descrito a perfusão bem sucedida de um rim isolado, em 1849 2. Desde então, o aparelho de perfusão foi submetido refinamento significativa. Frey e Gruber introduzido um pulmão artificial para bombas de oxigenação e pulsátil para perfusão contínua 2. Enquanto os primeiros pesquisadores estudaram principalmente os rins de mamíferos de grande porte, ou seja, porcos e cães 2 3 -o primeiro relatório do uso de rins de ratos, por Weiss et al. , Foi um marco no estudo da perfusão-mamífero-órgão pequeno 4. Schurek et ai. relataram a necessidade de adição de eritrócitos de mamífero para o perfusato se tubular renal suficienteoxigenação deveria ser alcançado 5. Crítico para experiências a longo prazo foi a introdução de diálise contínua do tampão pelo mesmo grupo de pesquisa 6. Em 2003, Schweda et al. foram os primeiros a relatar um rim do rato funcional isolado perfundido (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 e Lindell et ai. 14.

Embora tecnicamente mais exigente do que o de rato perfundido isolado de rim, o uso do MIPK carrega a vantagem de permitir o uso de uma grande variedade de ratinhos geneticamente alterados. Este artigo apresenta os dados sobre o método dos autores para perfusão isolados de rato rins durante 1 h. O método permite a avaliação contínua da taxa renal fluxo, resistência vascular, liberação de hormônio, gasometria, análise de urina, bem como a aplicação de medicamentos. Seguindo o procedimento, rins podem ser processadas para análise molecular e bioquímica, ser fixo por microscopia, outransplantado para um rato receptor (Figura 1).

figura 1
Figura 1: Visão geral do Possível entrada / saída para o rim isolado perfundido. BGA: Hemogasometria. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Esta técnica provavelmente vai receber uma atenção crescente nos próximos anos, como muitas aplicações inovadoras estão sendo discutidas com o alvorecer da perfusão renal normotérmica prolongado antes do transplante (com ou sem a aplicação de anti-rejeição ou drogas edição do genoma) 8, 9, 10 , 11, a bioengenharia dos rins inteiros de andaimes descelularizados 12, bem como a aplicação de doses elevadas de corantes fluorescentes para a imagem latente multiphoton 13 14.

Um protocolo de passo-a-passo é dado para permitir que outros laboratórios para realizar isolado rato perfusão renal com sucesso. Em primeiro lugar, a composição e preparação do buffer é especificado. Em seguida, a cirurgia é descrito em pormenor e os passos críticos são mostrados. Em terceiro lugar, os dados são apresentados que são representativos de uma preparação bem sucedida: o fluxo sanguíneo renal, resistência vascular, taxa de filtração glomerular, e eletrólitos fraccionada medições funcionais de viabilidade e eletrônica de transmissão micrografias da morfologia dos diferentes segmentos dos néfrons de Rins todos excreção- fixado após 1 hora de perfusão.

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Protocol

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Todos os procedimentos que envolvem animais descritos neste manuscrito foram conduzidos de acordo com a lei suíça e aprovado pela administração veterinária do Cantão de Zurique, Suíça.

1. Preparação Tampão

  1. Preparar soluções 1 - 4 e a solução de hormônio antidiurético (ADH) (Tabela 1).
  2. Prepara-se o tampão de diálise (Tabela 1).
    NOTA: Este é o tampão utilizado como o tampão de diálise durante a perfusão. Mais tarde, os eritrócitos serão diluídas neste tampão para formar o perfusato final.
  3. preparação de eritrócitos.
    1. Dilui-se 250 ml de concentrado de eritrócitos humana (material testado obtido a partir do banco de sangue local) para 500 ml com tampão de diálise. Centrifugar a 2000 xg durante 8 minutos. Remover o tampão, tomando cuidado para não remover quaisquer eritrócitos. 3x.
  4. Prepara-se o (albumina de soro de bovino; BSA) de albumina de tampão.
    1. Em 200 ml de dialysitampão s, dissolver 44 g de BSA usando uma barra de agitação. Filtra-se a solução com papel de filtro.
  5. Prepara-se o perfusado.
    1. Filtrar os eritrócitos a partir do passo 1.3.1 através de papel de filtro para o tampão de BSA. Encha até um volume total de 800 ml com tampão de diálise.
      NOTA: Este é o perfusato final. O hematócrito agora deve situar-se entre 8 e 12%. O perfusato pode ser armazenado durante até 12 h a 4 ° C.

2. Início de Diálise e Oxigenação

  1. Ligar o banho de água em torno do reservatório maior tampão, menor do reservatório tampão, e a câmara de humidade (uma pequena câmara, de parede dupla trazida a 37 ° C e 100% de humidade para realizar mais tarde, o rim) a 37 ° C (Figura 2) .
  2. Encher o reservatório de tampão de maior com o tampão de diálise e o reservatório menor com o perfusato.
  3. Ligue a 5% de CO 2/95% O 2 afluxo de gás para o tampão de diálise.
  4. Ligar diálise contínua do perfusado contra o tampão de diálise. Tome o cuidado de usar tubos de diálise baixo fluxo. Vá para a Etapa 3.

Figura 2
Figura 2: Desenho esquemático do circuito de perfusão. Esquema mostra os principais componentes do circuito de perfusão e a direcção do fluxo tampão. Todos os componentes rodeados por azul escuro são mantidos a 37 ° C com um banho de água / termostato. 1: tampão de diálise de pelo menos 3 vezes o volume de tampão de perfusão é continuamente borbulhada com 95% de O2 / 5% de CO 2. 2: tampão de diálise e tampão de perfusão são continuamente dialisada contra o outro num tubo de diálise por uma bomba de rolos. 3: througho constante Devido a esta diálise, o tampão de perfusão é enriquecida com 9% de O2 / 5% de CO 2 e de electrólitos são mantidos níveisperfusão ut. 4: Uma bomba de cilindro impele o tampão de perfusão para o rim. 5: Uma Windkessel remove as ondas peristálticas e funciona como uma armadilha de bolhas. 6: transdutor de pressão (ligados a 4. (bomba de roletes) para manter a pressão contínua, permitindo o fluxo alternando livremente). 7: Durante a perfusão, o rim permanece numa câmara húmida para 100% de humidade atmosférica e 37 ° C Temperatura de rim. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

3. Cirúrgica Procedimento Parte 1 (para um diagrama de todas as ligaduras, consulte a Figura 3)

Nota: Executar todas as ligaduras usando 5-0 fio cirúrgico.

  1. Anestesiar um rato por injecção intraperitoneal (10 mL / g de peso corporal, de 20 mg / ml de cetamina e 1 mg / ml de xilazina dissolvido em 0,9% de NaCl). Confirmar profundidade suficiente de AnesthAIAS por testar a ausência de reflexos traseira pés.
  2. Corrigir o rato em decúbito dorsal na câmara húmida. Proteger os olhos com pomada veterinário. Coloque uma seringa de 1 ml abaixo da coluna vertebral para elevar os vasos lombares.
  3. Realizar uma laparotomia mediana da crista púbica para a abertura do esterno primeira a pele, em seguida, os músculos abdominais, com uma tesoura.
  4. Remover o intestino e colocá-lo no lado esquerdo da lateral do mouse a partir do abdômen.
  5. Libertar a bexiga de tecido conjuntivo e explorar ambos os ureteres e uretra.
  6. Coloque uma ligadura em torno do ureter esquerdo (ligadura I). Fecha-o.
  7. Colocar uma ligadura em torno da uretra (ligadura II). Fecha-o.
  8. Coloque um "laço" ligadura em torno de toda a bexiga (ligadura III).
  9. Faça uma incisão na bexiga 1 mm.
  10. Canular a abertura com dois centímetros PE 50 tubos.
  11. Fechar ligadura III em torno do tubo.
  12. Cortar o uréter esquerdo e uretra distai das ligaduras. o bladder agora está ligado ao ureter direito apenas e movimentando-se livremente.
  13. Desmarque a aorta abdominal de tecido conjuntivo e gordura.
  14. Coloque uma ligadura meados de aorta abdominal (ligadura IV).
  15. Colocar uma ligadura em torno da aorta abaixo do diafragma entre a artéria mesentérica superior e o tronco celíaca (V ligadura).
  16. Colocar uma ligadura à volta da artéria mesentérica superior (VI ligadura).
  17. Coloque uma ligadura da aorta imediatamente abaixo do direito e acima da artéria renal esquerda (VII ligadura).
  18. Coloque uma ligadura em torno do pacote de caudal veia (veia) (VIII ligadura). Vá para a Etapa 4.

Figura 3
Figura 3: Desenho esquemático das ligaduras colocadas durante a cirurgia. Vista do abdómen aberto após a laparotomia. O intestino é movido para fora para a esquerda. L e R indicam o rim esquerdo eo direito. olinhas pretas mostram a área da respectiva laqueação. Ligaduras primeira colocação e depois fechada, na sequência indicada no texto. X marca a localização da incisão para canulação da aorta. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Priming do circuito de perfusão

  1. Inicie a bomba rotativa e encher o tubo com perfusato. Tome cuidado para esvaziar todas as bolhas de ar.
  2. Encha o dispositivo Windkessel a cerca de nível médio com perfusato.
  3. Calibra-se o transdutor de pressão até 0 mm de Hg quando toda a tubagem é cheio e o fluxo é 0. Manter a agulha de perfusão, a nível renal durante este tempo.
  4. Manter o fluxo em um nível mínimo constante (0,6 ml / min) e vá para a Etapa 5.

5. Surgical Procedimento Parte 2

  1. Coloque um grampo entre ligadura IV ea ramificação da rena esquerdal artéria.
  2. Faça uma pequena incisão no caudal aorta de ligadura IV, tomando cuidado para não cortar a parede dorsal.
  3. Dilatar a abertura da aorta com um vaso dilatador.
  4. Canular a aorta, com uma agulha (2 cm de comprimento, puxado PE 50), empurrando a ponta apenas para o grampo.
  5. Abra o grampo.
  6. Empurrar a ponta da agulha cranialmente até atingir a junção da artéria renal direita e da aorta.
  7. Fechar ligadura VII.
  8. Fechar ligadura IV.
  9. Abra o peito com uma tesoura dissecando o diafragma. Com um único corte, separe a aorta, a veia cava, coração e nervos vegetativos. Com este passo, o animal foi sacrificado através de exsanguinação sob anestesia profunda rápida contínua.
  10. Iniciar o controle da pressão da bomba de perfusão. Manter a pressão média entre 80 e 100 mmHg.
  11. Fechar V. ligadura
  12. Fechar ligadura VI.
  13. Fechar ligadura VIII.
  14. Livre do rim direito de tissu conjuntivoe e sua incorporação na cápsula adiposo com uma tesoura.
  15. Corte a aorta proximal à ligadura V.
  16. Corte da artéria mesentérica superior distalmente à ligadura VI.
  17. Cortar o feixe vascular-sustentável rim para fora, tomando cuidado para não cortar os próprios vasos.
  18. Cortar o fígado na ligação para o rim. Cuidar para libertar o rim, mas deixa uma pequena parte do aderente fígado a ele, de modo que a veia cava é mantida aberta por ela.
  19. Pegue o pacote de rim para fora do mouse. Remover o rato da câmara úmida.
  20. Coloque um "laço" ligadura à volta da ligação de fígado e rim (IX ligadura).
  21. Canular a veia cava com uma linha venosa (dois centímetros PE 50).
  22. Fechar ligadura IX. fluxo venoso através do cateter venoso deve começar imediatamente.
  23. Feche a câmara úmida.

6. As análises a jusante

  1. Durante a hora seguinte, monitorar continuamente o fluxo sanguíneo e intravasculpressão de ar 15. Recolhe fluxo venoso, que pode ser utilizado para análise de, por exemplo, a libertação de renina renal 7. Coleta de urina para análise da concentração de eletrólitos e taxa de filtração glomerular 14. Após 1 hora de perfusão, os rins podem ser snap-congelados por western blot ou ser fixado para a imagem latente aproxima 16.

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Representative Results

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Com o método descrito, rins isolados do rato podem permanecer viáveis ​​durante pelo menos 1 h. Foi testada a viabilidade dos tecidos depois de 1 hora de perfusão contínua com funcional (fluxo sanguíneo renal e resistência vascular, gasometria do fluxo venoso, taxa de filtração glomerular, urinário fraccionada Na + e K + excreção, e osmolaridade urinária) e morfológico (eletrônica de transmissão microscopia, TEM) em quatro métodos rins de tipo selvagem C57BL / 6. Além disso, transferências de Western de proteínas marcadoras apicais de diferentes segmentos do túbulo foram realizadas, comparando rins perfundidos isolados de rins não perfundidada dos mesmos animais. Em todas as experiências, utilizou-se a perfusão de pressão constante, mantendo-se a pressão de perfusão em ~ 100 mmHg (Figura 4). Nestas rins, o fluxo de perfundido e resistência vascular permaneceu estável ao longo de um tempo de 55 min a 15,6 ± 0,4 ml / min * g de peso do rim e 35 ± 1,0 mmHg * min / mL, respectivamente (Figura 4 A). A diminuição do fluxo de perfusato ou um aumento da resistência vascular é um parâmetro muito sensível no que diz respeito à diminuição da viabilidade do tecido e deve ser monitorizada ao longo da perfusão com cuidado. De gás do sangue e a análise do electrólito em amostras de 100 ul administrado 60 minutos após o início da perfusão renal revelou produção de CO 2 e consumo de O 2, quando o influxo arterial foi comparado com o fluxo de saída venosa (Tabela 2). Os outros parâmetros permaneceram inalteradas entre a artéria e veia (Tabela 2). Ênfase especial deve ser colocado sobre a liberação de potássio venosa inalterado, pois pode ocorrer um aumento durante o dano tecidual. Taxa de filtração glomerular, avaliados através de apuramento FITC-inulina 14, tendeu a aumentar ao longo do tempo (Figura 4 B), mas esta tendência não atingiu significância. fração de excreção de sódio e potássio avaliada após 55 minutos de perfusãoé aumentada em comparação com a situação in vivo (Figura 4 C). A osmolaridade urinária não é elevada acima da osmolalidade do fluxo venoso após 55 min de perfusão (Figura 4 D).

Para os estudos morfológicos, os rins foram fixadas após perfusão em paraformaldeído a 3% e 0,1% de glutaraldeído em tampão de diálise como previamente descrito 17. ultrassonografia renal foi avaliada com TEM. Glomérulos e S1 segmentos de túbulos proximais apareceu em grande parte inalterado após a perfusão (Figuras 5 A e B). Alguns, mas não todos os segmentos S2 / S3 de túbulos proximais e os membros ascendentes grossos que não foram perto de feixes vasculares foram mostrando sinais de danos em órgãos, como descrito anteriormente em ratos isolado Rins 5 (Figuras 5 C e D). Mesmo após a inspeção, túbulos contorcidos distais e dutos coletores não mostrou sinais evidentes de necrose (As Figuras 5E, F, e G). Em conclusão, os achados morfológicos em rins de rato espelhar a situação encontrada no rato rim isolado perfundido 5.

Western blot de proteínas marcadoras apicais dos diferentes segmentos dos néfrons em Rins isolados (snap-congelados após 1 hora de perfusão) em comparação com os rins contralaterais não perfundidada do mesmo animal (snap-congelados antes do início da perfusão) não revelou alterações significativas. Foram estudados NaPi-IIa (localizado nos túbulos proximais), NKCC2 (membros ascendente espesso), NCC (túbulos contornados distais), e ENaC (túbulos de ligação / recolha de condutas) (Figuras 6 A e B).

Figura 4
Figura 4: Avaliação da viabilidade funcional de Rins por 55 min. A) </ Strong> Durante a perfusão pressão constante, a resistência vascular e fluxo de perfusato manteve-se estável durante 55 minutos. Os primeiros 15 min são excluídas devido à alta variabilidade sempre visto durante este tempo. B) a taxa de filtração glomerular (FITC-inulina) de quatro rins avaliadas após 25 e 55 min exibido aumento significativo ligeira, mas não ao longo do tempo. C) a excreção fracionada de sódio e potássio avaliada após 55 min de perfusão. D) plasma venoso e na urina osmolaridade após 55 min de perfusão. n = 4 em todas as experiências. Os dados estão apresentados como médias ± SEM. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5
Figura 5: Microscopia Eletrônica de Transmissão. Representante Morfologia do D Segmentos ifferent Nephron de perfusão Rins em um ponto de 1 hr End. A) Os glomérulos estão intactos. Detalhe de uma podócito em um glomérulo. Segmento B) S1 de um túbulo proximal. segmentos S1 estão intactos. Segmento C) S2 / S3, de um túbulo proximal. Alguns, mas não todos os segmentos S2 / S3 do túbulo proximal são altamente necrosado. Células aparecem inchado e mostrar grandes danos intracelular. O esboço tubular é mantida apenas pela membrana basal. D) membro grosso ascendente (TAL). Esses TALs que estão longe de os feixes vasculares mostrar os primeiros sinais de degeneração hidrópica. membranas luminais apareça diluído e frágil. E) Distal túbulo contornado (DCT). DCT estão intactos. F) Detalhe das invaginações basolateral de uma célula DCT. Fenestrated endotélio, membrana basal, invaginações basolateral e mitocôndrias estão intactos. G) Recolher conduta (CD). CDs estão intactos.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Western Blot de apicais marcador proteínas em Rins isolados Comparado a não perfundidada Rins dos mesmos animais. A) As transferências de Western de rins perfundidos durante 1 hr e os rins não perfundidada. NaPi-IIa é representativo para o túbulo proximal. NKCC2 é representativo para o ramo ascendente espesso. NCC e NCC fosforilada na treonina 53 (pT53 NCC) são encontradas exclusivamente no túbulo contornado distal. Alfa e gama subunidades de ENaC em seu corpo inteiro e seus respectivos produtos proteoliticamente clivados são mostrados representante para o ligar túbulo / ducto coletor. B) Quantificação de A) não revelou diferenças significativas entre f rins perfundidosou 1 hr e os rins não perfundidada. n = 3 em todas as experiências. Os dados são apresentados como médias ± SEM e os valores individuais são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

tabela 1
Tabela 1: Composição das Soluções e tampão de diálise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

mesa 2
Tabela 2: Gás de sangue e Análise de eletrólitos de Arterial entrada e saída venosa de perfusão mouse Rins 60 min após o início da perfusão (n = 4). Os dados são apresentados como médias ±SEM.

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Discussion

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O mouse rim isolado perfundido é uma ferramenta para o estudo da função renal em um ambiente controlado ex vivo, durante 1 hora, fazendo a ponte entre experiências in vivo em animais intactos, o que pode ser falho pelo impacto de vários fatores sistêmicos e experimentos in vitro em segmentos dos néfrons isolados ou células cultivadas, o que necessariamente negligenciam o impacto da estrutura de órgãos intactos na função. Há, ao conhecimento dos autores, nenhuma técnica alternativa com a qual para executar esta tarefa específica. Estudos bioquímicos sobre o tecido renal, no entanto, pode ser realizada de uma forma muito mais simples que utiliza fatias de rim 17. Enquanto a técnica apresentada é actualmente utilizado principalmente para estudar a fisiologia renal, muitas novas aplicações estão sendo discutidos. Por exemplo, poderia ser usado para bioengenharia rim durante descelularização perfusão e recelularização 12. Além disso, a perfusão normotérmica prolongado de rins antes da transplantation, com a administração de doses elevadas de anti-rejeição ou genoma de edição de drogas em solução de perfusão, está a ser estudado; mesmo em ambientes clínicos 8, 9, 10, 11. O rim de rato perfundido isolado é uma excelente ferramenta que pode ser usado para estas aplicações, especialmente para elucidar o papel dos genes individuais com modelos knockout.

Três passos são essenciais para uma experiência bem sucedida. Este documento fornece laboratórios interessadas os meios para reproduzir o procedimento. Em primeiro lugar, o tampão tem de ser preparada de tal modo que o rim recebe a maior parte dos nutrientes necessários para a viabilidade prolongado sob condições reprodutíveis. Um equilíbrio deve ser encontrado entre as condições totalmente controlados (tampão sintético) e uma condição de perfusão nativa (sangue total). Portanto, albumina e eritrócitos de mamífero a um hematócrito de 10% devem ser incluídas. Este hematócrito representa, na experiência dos autores, o melhor compromisso entre suficientes tproblema de oxigenação e baixa viscosidade tampão (aumento do hematócrito diminui o fluxo dramaticamente durante a perfusão de pressão constante (comparar os valores apresentados neste trabalho com os valores em Rins sem eritrócitos 18)). A qualidade e frescura dos eritrócitos é crítica. Durante os passos de lavagem, os eritrócitos precisa de ser manuseado com cuidado para evitar a hemólise. O tampão deve ser preparada de fresco no dia da experiência. Em segundo lugar, a cirurgia deve ser realizado por um cirurgião treinado dentro do tempo mais curto possível. O cirurgião tem de executar 6 ligaduras em torno dos principais vasos comunicantes do rim para o resto do corpo, ao mesmo tempo manter a perda de sangue do animal a um mínimo. Para melhores resultados, as intervenções cirúrgicas deve ser realizado dentro de 30 minutos. Se a pressão sanguínea arterial média do animal gotas, durante a cirurgia ou prolongada devido à anestesia, abaixo de 60 mmHg, perfusão renal vai já ser mínimo e o tecido vai ser propensoa necrose. Para descartar isso, o rim esquerdo pode ser feita após a cirurgia, quando a perfusão do rim direito já começou, e usado como um controlo não tratado. Terceiro, durante o tempo da perfusão o correcto funcionamento do aparelho de perfusão, que consiste de um circuito de pequenos animais-perfusão padrão, tem de ser assegurada. Enquanto o computador executa a perfusão, por si só, é necessária supervisão humana, por exemplo para verificar a existência de bolhas no circuito de perfusão.

Os dados representativos fornecidos permite a avaliação da viabilidade do rim 1 hora depois da perfusão ex-vivo e a comparação do sucesso técnico de qualquer execução deste método para a abordagem aqui descrita. Durante pelo menos 1 hora, o fluxo sanguíneo renal, resistência vascular, gases sanguíneos do fluxo venoso e taxa de filtração glomerular deve permanecer estável.

Existem certas limitações para a técnica, que tem de se manter em mente. Mesmo um Kidney emissão da cirurgia de maior sucesso só podem permanecer viáveis ​​por um tempo limitado. Os autores encontraram uma HR de ser o melhor ponto de tempo em que a parar de perfusão. Além disso, enquanto a perfusão do rim isolado permite o estudo do órgão inteiro isolado em profundidade, é difícil diferenciar efeitos específicos sobre um tipo de célula. Rins corrigidos após 1 hora pode mostrar defeitos em segmentos S3 de túbulos proximais e células ascendente de membros grossos, enquanto glomérulos, segmentos S1, DCT e CDs devem permanecer intactos. A utilização obrigatória de eritrócitos, especialmente de seres humanos, também está ligada a riscos potenciais (por exemplo, infecções) para o experimentador.

Em resumo, o rim de rato perfundido isolado é uma técnica útil para estudar com que todo o órgão ex vivo. Como qualquer técnica, tem certas vantagens e limitações. Os autores acreditam que ambas as novas aplicações múltiplas atualmente surgindo e este protocolo poderia fornecer sufficient impulso para outros laboratórios para reproduzir este esforço.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

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References

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A técnica de rim perfundidos rato isolado
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Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

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