Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón

doi: 10.3791/54712 Published: November 17, 2016

Summary

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Los tampones y técnica quirúrgica se describen en detalle.

Abstract

El aislado de riñón perfundido ratón (MIPK) es una técnica para mantener un riñón de ratón bajo condiciones ex vivo perfundidos y funcionales para 1 hr. Este es un requisito previo para el estudio de la fisiología del órgano aislado y para muchas aplicaciones innovadoras que pueden ser posibles en el futuro, incluyendo descelularización la perfusión de bioingeniería renal o la administración de anti-rechazo o drogas genoma de edición en altas dosis para cebar el riñón para el trasplante. Durante el tiempo de la perfusión, el riñón puede ser manipulado, la función renal puede ser evaluada, y diversos productos farmacéuticos administrado. Después del procedimiento, el riñón puede ser trasplantado o tratados con la biología molecular, análisis bioquímicos, o microscopía.

Este artículo describe el líquido de perfusión y la técnica quirúrgica necesaria para la perfusión ex vivo de los riñones de ratones. Los detalles del aparato de perfusión y se dan los datos se presentan mostrando la vESPONSABILIDAD de la preparación del riñón: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, y de orina de datos como, micrografías electrónicas de transmisión funcionales de los diferentes segmentos de la nefrona como lecturas morfológicas, y transferencias Western de las proteínas de transporte de los diferentes segmentos de la nefrona como lectura molecular.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

La perfusión aislada de órganos ha sido objeto de un esfuerzo continuo entre los fisiólogos durante muchas décadas 1. La técnica permite la función del órgano, sin influencias sistémicas como la hipertensión arterial, las hormonas, o los nervios, para ser estudiado. Carl Eduard Loebell se considera que es el primero que ha descrito la perfusión con éxito de un riñón aislado, en 1849 2. Desde entonces, el aparato de perfusión ha sufrido refinamiento significativo. Frey y Gruber introdujeron un pulmón artificial para las bombas de oxigenación y perfusión continua para pulsátiles 2. Mientras que los primeros investigadores estudiaron principalmente los riñones de los mamíferos grandes, a saber, cerdos y perros 2 3 -el primer informe del uso de riñones de rata, por Weiss et al. , Fue un hito en el estudio de la perfusión de los órganos mamífero pequeño 4. Schurek et al. informaron la necesidad de la adición de eritrocitos de mamíferos al perfundido si tubular renal suficienteoxigenación debía lograrse 5. Crítico para experimentos a largo plazo fue la introducción de la diálisis continua de la memoria intermedia por el mismo grupo de investigación 6. En 2003, Schweda et al. fueron los primeros en informar de un riñón aislado perfundido funcional del ratón (MIPK) 7, posteriormente refinado por Rahgozar et al. 18 y Lindell et al. 14.

Aunque técnicamente más difícil que la rata aislado y perfundido de riñón, el uso de la MIPK lleva la ventaja de permitir el uso de una amplia gama de ratones genéticamente alterados. Este artículo presenta los detalles del método de los autores de la perfusión de los riñones de ratones aislados durante 1 hora. El método permite la evaluación continua de la tasa de flujo renal, la resistencia vascular, la liberación de hormonas, el análisis de gases en sangre, análisis de orina, y la aplicación de fármacos. Después del procedimiento, los riñones podrían ser procesados ​​para el análisis molecular y bioquímica, se fijarán para microscopía, otrasplantado en un ratón receptor (Figura 1).

Figura 1
Figura 1: Visión general de la posible entrada / salida para el riñón aislado y perfundido. BGA: análisis de gases en sangre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Esta técnica es probable que reciba una atención creciente en los próximos años, ya que muchas aplicaciones innovadoras se están discutiendo con el amanecer de la perfusión renal normothermic prolongado antes del trasplante (con o sin la aplicación de anti-rechazo o drogas genoma de edición) 8, 9, 10 , 11, la bioingeniería de los riñones enteros de andamios descelularizados 12, y la aplicación de altas dosis de tintes fluorescentes para la imagen multifotónica 13 14.

Un protocolo paso a paso se da para permitir que otros laboratorios para realizar la perfusión aislada de riñón de ratón con éxito. En primer lugar, se especifica la composición y preparación de la memoria intermedia. A continuación, la cirugía se describe en detalle y se muestran los pasos críticos. En tercer lugar, se presentan los datos que son representativos de una preparación exitosa: el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, la tasa de filtración glomerular, y el electrolito fraccionada mediciones funcionales de micrografías de viabilidad y electrónicas de transmisión de la morfología de los diferentes segmentos de la nefrona de los riñones perfundidos todos excreción- fijo después de 1 hora de perfusión.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Todos los procedimientos con animales descritos en este manuscrito se realizaron de acuerdo con la legislación suiza y aprobados por la administración veterinaria del Cantón de Zurich, Suiza.

1. tampón de preparación de

  1. Preparar soluciones de 1 - 4 y la solución de la hormona antidiurética (ADH) (Tabla 1).
  2. Preparar el tampón de diálisis (Tabla 1).
    NOTA: Este es el tampón utilizado como el tampón de diálisis durante la perfusión. Más tarde, los eritrocitos se diluyeron en este tampón para formar el líquido de perfusión final.
  3. preparado de eritrocitos.
    1. Diluir 250 ml de concentrado de eritrocitos humanos (material ensayado obtenida del banco de sangre local) a 500 ml con tampón de diálisis. Se centrifuga a 2.000 g durante 8 min. Eliminar el tampón, teniendo cuidado de no eliminar los eritrocitos. Se repite 3 veces.
  4. Preparar el (albúmina de suero bovino; BSA) de albúmina de buffer.
    1. En 200 ml de dialysitampón s, se disuelven 44 g de BSA utilizando una barra de agitación. Se filtra la solución con papel de filtro.
  5. Preparar el líquido de perfusión.
    1. Filtrar los eritrocitos de la etapa 1.3.1 a través de papel de filtro en el tampón de BSA. Llenar hasta un volumen total de 800 ml con tampón de diálisis.
      NOTA: Este es el líquido de perfusión final. El hematocrito ahora debe estar entre 8 y 12%. El líquido de perfusión se puede almacenar durante un máximo de 12 horas a 4 ° C.

2. Inicio de la diálisis y Oxigenación

  1. Encienda el baño de agua que rodea el depósito más grande de amortiguación, depósito de regulación más pequeña, y la cámara húmeda (una pequeña cámara, de doble pared llevó a 37 ° C y 100% de humedad para sostener más tarde el riñón) a 37 ° C (Figura 2) .
  2. Llenar el depósito de regulación más grande con el tampón de diálisis y el depósito más pequeña con el perfundido.
  3. Encienda el 5% de CO 2 O de entrada de gas 2/95% a tampón de diálisis.
  4. Cambie en diálisis continua del líquido de perfusión frente al tampón de diálisis. Tenga cuidado de usar un tubo de diálisis de bajo flujo. Continúe con el Paso 3.

Figura 2
Figura 2: Dibujo esquemático del circuito de perfusión. Esquema muestra los componentes principales del circuito de perfusión y la dirección del flujo de tampón. Todos los componentes rodeadas de azul oscuro se mantienen a 37 ° C con un baño de agua / termostato. 1: Diálisis tampón de por lo menos 3 veces el volumen del tampón de perfusión se burbujea continuamente con 95% O2 / 5% de CO 2. 2: Diálisis tampón y tampón de perfusión se dializan de forma continua entre sí en un tubo de diálisis por una bomba de rodillos. 3: througho constante Debido a esta diálisis, el tampón de perfusión se enriquece con 9% de O2 / 5% de CO 2 y electrolitos niveles se mantienenperfusión ut. 4: una bomba de rodillos propulsa el tampón de perfusión hacia el riñón. 5: Un receptor de aire elimina ondas peristálticas y actúa como una trampa de burbujas. 6: El transductor de presión (conectado a 4. (bomba de rodillos) para mantener una presión continua al tiempo que permite el flujo libre alterna). 7: A lo largo de la perfusión, el riñón se mantiene en una cámara húmeda para la humedad del aire 100% y 37 ° C de temperatura de riñón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Procedimiento quirúrgico Parte 1 (para un diagrama de todas las ligaduras, véase la Figura 3)

Nota: Realizar todas las ligaduras utilizando 5-0 hilo quirúrgico.

  1. Anestesiar un ratón mediante inyección intraperitoneal (10 l / g de peso corporal, 20 mg / ml de ketamina y 1 mg / ml de xilazina disuelto en 0,9% NaCl). Confirmar suficiente profundidad de anesthEIAS ensayando la ausencia de reflejos del pie trasero.
  2. Fijar el ratón en una posición supina en la cámara húmeda. Proteger los ojos con ungüento veterinario. Colocar una jeringa de 1 ml por debajo de la columna vertebral para elevar los vasos lumbares.
  3. Realizar una laparotomía media de la cresta del pubis a la apertura del esternón primero la piel, los músculos abdominales, con unas tijeras.
  4. Retire el intestino y lo coloca en el lado izquierdo del ratón lateral del abdomen.
  5. Liberar la vejiga a partir de tejido conjuntivo y explorar ambos uréteres y la uretra.
  6. Colocar una ligadura alrededor del uréter izquierdo (I ligadura). Cierralo.
  7. Colocar una ligadura alrededor de la uretra (ligadura II). Cierralo.
  8. Colocar una ligadura "lazo" alrededor de toda la vejiga (ligadura III).
  9. Incisión en la vejiga 1 mm.
  10. Canular la abertura con 2 cm PE 50 tubos.
  11. Cerrar ligadura III alrededor de la tubería.
  12. Cortar el uréter izquierdo y la uretra distal de las ligaduras. el bladder está ahora unido al uréter derecho solamente y se mueve libremente.
  13. Desactive la aorta abdominal de tejido conectivo y grasa.
  14. Colocar una ligadura mediados de aorta abdominal (IV ligadura).
  15. Colocar una ligadura alrededor de la aorta por debajo del diafragma entre la arteria mesentérica superior y el tronco celíaco (V ligadura).
  16. Colocar una ligadura alrededor de la arteria mesentérica superior (VI ligadura).
  17. Colocar una ligadura aórtica directamente debajo de la derecha y por encima de la arteria renal izquierda (VII ligadura).
  18. Colocar una ligadura alrededor de la vena caudal del paquete (cava) (VIII ligadura). Vaya al paso 4.

figura 3
Figura 3: Representación esquemática de las ligaduras colocadas durante la cirugía. Vista del abdomen abierto después de la laparotomía. El intestino se mueve hacia la izquierda. L y R indican el riñón izquierdo y derecho. lalíneas negras muestran el área de la respectiva ligadura. Las ligaduras se colocan primero y luego cerrados, según el orden indicado en el texto. X marca la ubicación de la incisión para la canulación de la aorta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. El cebado del circuito de perfusión

  1. Arrancar la bomba rotativa y llenar el tubo con líquido de perfusión. Tenga cuidado de vaciar todas las burbujas de aire.
  2. Complete el dispositivo receptor de aire a aproximadamente a mitad de la altura de líquido de perfusión.
  3. Calibrar el transductor de presión a 0 mm Hg cuando todos los tubos se llena y el flujo es 0. Mantenga la aguja de perfusión a nivel del riñón durante este tiempo.
  4. Mantener el caudal a un nivel mínimo constante (0,6 ml / min) y vaya al paso 5.

5. Procedimiento quirúrgico Parte 2

  1. Colocar una pinza de ligadura entre el IV y la ramificación de la izquierda renal arteria.
  2. Hacer una pequeña incisión en la aorta caudal de ligadura IV, teniendo cuidado de no cortar la pared dorsal.
  3. Dilatar la abertura en la aorta con un dilatador de vasos.
  4. Canular la aorta con una aguja (2 cm de largo, tirado PE 50), empujando la punta justo a la abrazadera.
  5. Abra la pinza.
  6. Empuje la punta de la aguja cranealmente hasta que llega a la unión de la arteria renal derecha y la aorta.
  7. Cerrar ligadura VII.
  8. Cerrar ligadura IV.
  9. Abre el cofre con las tijeras de disección por el diafragma. Con un solo corte, separar la aorta, vena cava, el corazón y los nervios vegetativos. Con este paso, el animal se sacrificó mediante exanguinación rápida bajo anestesia profunda continua.
  10. Comience control de la presión de la bomba de perfusión. Mantener la presión media de entre 80 y 100 mmHg.
  11. Cerrar V. ligadura
  12. Cerrar ligadura VI.
  13. Cerrar ligadura VIII.
  14. Libre el riñón derecho de tissu conjuntivoE y su incorporación en la cápsula adiposa con unas tijeras.
  15. Cortar la aorta proximal a la ligadura V.
  16. Cortar la arteria mesentérica superior distal a la ligadura VI.
  17. Cortar el paquete recipiente de riñón de apoyo a cabo, teniendo cuidado de no cortar en los propios vasos.
  18. Cortar el hígado en la conexión con el riñón. Tener cuidado para liberar el riñón, pero dejar una pequeña parte de la adherente hígado a ella, de modo que la vena cava se mantiene abierta por el mismo.
  19. Tome el paquete de riñón de ratón. Retire el ratón desde la cámara húmeda.
  20. Colocar una ligadura "lazo" alrededor de la conexión del hígado y el riñón (IX ligadura).
  21. Canular la vena cava con una línea venosa (2 cm PE 50).
  22. Cerrar ligadura IX. La salida venosa a través de la línea venosa debe comenzar inmediatamente.
  23. Cierre la cámara húmeda.

6. Los análisis intermedios

  1. Durante la siguiente hora, supervisar continuamente el flujo sanguíneo y intravasculla presión ar 15. Recoger el flujo venoso, que se puede utilizar para el análisis de, por ejemplo, la liberación de renina renal 7. Recoger la orina para el análisis de la concentración de electrolitos y el filtrado glomerular 14. Después de 1 hora de perfusión, los riñones pueden ser congeladas instantáneamente por el Western Blot o fijarse para obtener imágenes de los enfoques 16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Con el método descrito, aislados riñones de ratón pueden permanecer viables durante al menos 1 hr. Hemos probado la viabilidad del tejido después de 1 hora de perfusión continua con el funcional (flujo sanguíneo renal y la resistencia vascular, el análisis de gases en sangre del flujo venoso, la tasa de filtración glomerular, urinaria fraccional de Na + y K + excreción, y la osmolaridad urinaria) y morfológica (electrónica de transmisión microscopía, TEM) métodos en cuatro riñones de tipo salvaje C57BL / 6 ratones. Adicionalmente, se realizaron transferencias Western de proteínas marcadoras apicales de los diferentes segmentos del túbulo, comparando los riñones perfundidos aislados a los riñones no perfundido de los mismos animales. En todos los experimentos, se utilizó la perfusión a presión constante, manteniendo la presión de perfusión en ~ 100 mmHg (Figura 4). En aquellos riñones, el flujo de líquido de perfusión y la resistencia vascular se mantuvieron estables durante un tiempo de 55 min a 15,6 ± 0,4 ml / min * g de peso del riñón y 35 ± 1,0 mmHg * min / ml, respectivamente (Figura 4 A). Una disminución del flujo de perfundido o un aumento de la resistencia vascular es un parámetro sensible con respecto a la disminución de la viabilidad del tejido y debe controlarse en toda la perfusión con cuidado. Gas de la sangre y análisis de electrolitos en muestras de 100 l tomadas 60 min después del inicio de la perfusión renal reveló la producción de CO 2 y el consumo de O 2, cuando el flujo de entrada arterial se comparó con el flujo de salida venoso (Tabla 2). Los otros parámetros se mantuvieron sin cambios entre la arteria y la vena (Tabla 2). Especial énfasis debe colocarse sobre la liberación de potasio venosa inalterada, como un aumento puede ocurrir durante el daño tisular. Tasa de filtración glomerular, evaluado a través de aclaramiento FITC-inulina 14, tendía a aumentar con el tiempo (Figura 4 B), pero esta tendencia no alcanzó significación. La excreción fraccional de sodio y de potasio evaluó después de 55 minutos de perfusiónse incrementa en comparación con la situación in vivo (Figura 4 C). Osmolalidad de la orina no se eleva por encima de la osmolalidad de la salida venosa después de 55 min de perfusión (Figura 4 D).

Para los estudios morfológicos, los riñones se fijaron después de la perfusión en 3% de paraformaldehído y 0,1% de glutaraldehído en tampón de diálisis como se describió anteriormente 17. ultraestructura renal se evaluó con TEM. Segmentos glomérulos y S1 de los túbulos proximales aparecieron en gran medida sin modificaciones después de perfusión (Figuras 5 A y B). Algunos, pero no todos los segmentos S2 / S3 de los túbulos proximales y las gruesas ramas ascendentes que no estaban cerca de los haces vasculares estaban mostrando signos de daño orgánico, tal como se describe anteriormente en los riñones perfundidos aislados de rata 5 (Figuras 5 C y D). Incluso tras la inspección cercana, túbulos contorneados distales y conductos colectores no mostraron signos evidentes de necrosis (Las figuras 5 E, F, y G). En conclusión, los hallazgos morfológicos en los riñones de ratones reflejan la situación que se encuentra en el riñón de rata aislado y perfundido 5.

transferencias Western de proteínas marcadoras apicales de los diferentes segmentos de la nefrona en los riñones perfundidos aislados (snap-congelados después de 1 hora de perfusión) en comparación con los riñones contralaterales no perfundido del mismo animal (se congelaron antes del inicio de la perfusión) no reveló alteraciones significativas. Estudiamos NaPi-IIa (que se encuentra en los túbulos proximales), NKCC2 (gruesas ascendente extremidades), NCC (túbulos contorneados distales), y ENaC (conexión túbulos / conductos colectores) (figuras 6 A y B).

Figura 4
Figura 4: Evaluación de la viabilidad funcional de los riñones perfundidos durante 55 min. A) </ Strong> Durante la perfusión de presión constante, la resistencia vascular y el flujo de líquido de perfusión se mantuvo estable durante 55 minutos. Los primeros 15 min se excluyen debido a la alta variabilidad siempre visto durante este tiempo. B) la tasa de filtración glomerular (FITC-inulina) de cuatro riñones evaluados después de 25 y 55 min representada ligero aumento significativo pero no en el tiempo. C) La excreción fraccional de sodio y potasio evaluó después de 55 minutos de perfusión. D) en plasma venoso y orina osmolaridad después de 55 minutos de perfusión. n = 4 en todos los experimentos. Los datos se presentan como medias ± SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5
Figura 5: Microscopía Electrónica de Transmisión. Representante Morfología de D Segmentos ifferent Nephron de perfundido riñones en un punto final de 1 hora. A) Los glomérulos están intactas. Detalle de una de podocitos en un glomérulo. Segmento B) S1 de un túbulo proximal. segmentos S1 están intactas. Segmento C) S2 / S3 de un túbulo proximal. Algunos, pero no todos los segmentos S2 / S3 de los túbulos proximales son altamente necróticos. Las células tienen aspecto hinchado y muestran gran daño intracelular. El contorno tubular se mantiene sólo por la membrana basal. D) rama ascendente gruesa (TAL). Esos TALs que están lejos de los haces vasculares muestran los primeros signos de degeneración hidrópica. membranas luminales aparecen adelgazados y frágil. E) túbulo contorneado distal (DCT). DCT están intactas. F) Detalle de los repliegues basolateral de una célula DCT. Fenestrado endotelio, membrana basal, repliegues basolateral, y las mitocondrias están intactas. G) del conducto colector (CD). CDs están intactas.e.jove.com/files/ftp_upload/54712/54712fig5large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6
Figura 6: Western Blot de proteínas marcadoras apicales en los riñones aislados y perfundidos En comparación con los no perfundido Los riñones de los mismos animales. A) Las transferencias Western de los riñones perfundidos durante 1 hora y los riñones no perfundido. NaPi-IIa es representativo para el túbulo proximal. NKCC2 es representativa de la rama gruesa ascendente. NCC NCC y fosforilados en treonina 53 (pT53 NCC) se encuentra exclusivamente en el túbulo contorneado distal. Alfa y gamma subunidades de ENaC en toda su longitud y sus respectivos productos escindidos proteolíticamente se muestran representativo para el túbulo / conducto colector de conexión. B) Cuantificación de A) no reveló diferencias significativas entre f riñones perfundidoso 1 hora y los riñones no perfundido. n = 3 en todos los experimentos. Los datos se presentan como medias ± SEM y los valores individuales se muestran. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

tabla 1
Tabla 1: Composición de las soluciones de diálisis y de búfer. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

Tabla 2
Tabla 2: Blood Gas y análisis de electrolitos de entrada y salida arterial venosa de perfundido ratón Riñones 60 minutos después del comienzo de la perfusión (n = 4). Los datos se presentan como media ±SEM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

El ratón aislados del riñón perfundido es una herramienta para el estudio de la función renal en un ambiente controlado ex vivo durante 1 hora, reduciendo la brecha entre los experimentos in vivo en animales intactos, lo que puede ser defectuoso por el impacto de numerosos factores sistémicos, y los experimentos in vitro en segmentos de la nefrona aisladas o células cultivadas, lo que necesariamente descuidar el impacto de la estructura de los órganos intactos en la función. Hay, al conocimiento de los autores, no hay una técnica alternativa con la que llevar a cabo esta tarea específica. Los estudios bioquímicos sobre el tejido del riñón, sin embargo, se pueden realizar de una manera mucho más simple utilizando rodajas de riñón 17. Si bien la técnica presentada se utiliza actualmente sobre todo para estudiar la fisiología renal, se están discutiendo muchas nuevas aplicaciones. Por ejemplo, se podría utilizar para la bioingeniería riñón durante descelularización perfusión y recelularización 12. Además, la perfusión normotérmica prolongada de los riñones antes de transplantation, con la administración de altas dosis de anti-rechazo o, se está estudiando el genoma de edición de fármacos en el líquido de perfusión; incluso en entornos clínicos 8, 9, 10, 11. El riñón aislado y perfundido de ratón es una excelente herramienta que podría ser utilizado para estas aplicaciones, especialmente para dilucidar el papel de los genes individuales con los modelos knockout.

Tres pasos son críticos para un experimento exitoso. Este documento proporciona los laboratorios interesados ​​con los medios para reproducir el procedimiento. En primer lugar, la memoria intermedia tiene que estar preparado de tal manera que el riñón recibe la mayor parte de los nutrientes necesarios para la viabilidad prolongada en condiciones reproducibles. Un equilibrio que debe buscarse entre las condiciones totalmente controladas (tampón sintética) y una condición de perfusión nativa (sangre completa). Por lo tanto, la albúmina y eritrocitos de mamíferos a un hematocrito de 10% deben ser incluidas. Este hematocrito representa, según la experiencia de los autores, el mejor compromiso entre la suficiente tcuestión oxigenación y baja viscosidad tampón (aumento de hematocrito disminuye el flujo de manera espectacular durante la perfusión a presión constante (comparar los valores presentados en este documento a los valores en los riñones perfundidos sin eritrocitos 18)). La calidad y la frescura de los eritrocitos es crítica. Durante las etapas de lavado, eritrocitos deben ser manejados con cuidado para evitar la hemólisis. El tampón debe estar preparada recientemente en el día del experimento. En segundo lugar, la operación tiene que ser realizada por un cirujano entrenado en el menor tiempo posible. El cirujano tiene que realizar 6 ligaduras alrededor de los vasos principales que conectan el riñón para el resto del cuerpo, mientras se mantiene la pérdida de sangre del animal a un mínimo. Para obtener resultados óptimos, las intervenciones quirúrgicas deben llevarse a cabo dentro de los 30 minutos. Si la presión sanguínea arterial media de los animales gotas, durante la cirugía prolongado o debido a la anestesia, por debajo de 60 mmHg, la perfusión renal ya estará mínimo y el tejido será propensoa necrosis. Para descartar esta posibilidad, el riñón izquierdo se puede tomar después de la cirugía, cuando la perfusión del riñón derecho ya ha comenzado, y se utiliza como un control no tratado. En tercer lugar, durante el tiempo de la perfusión el correcto funcionamiento del aparato de perfusión, que consta de un circuito de animal pequeño perfusión estándar, necesita ser asegurado. Mientras el ordenador lleva a cabo la perfusión por sí mismo, la supervisión humana es necesario, por ejemplo para comprobar si hay burbujas en el circuito de perfusión.

Los datos representativos proporcionados permite la evaluación de la viabilidad del riñón después de 1 hr de perfusión ex vivo y la comparación de la éxito técnico de cualquier ejecución de este método para el enfoque descrito en el presente documento. Durante al menos 1 hora, el flujo sanguíneo renal, la resistencia vascular, los gases sanguíneos del flujo venoso y la tasa de filtración glomerular deben permanecer estables.

Existen ciertas limitaciones a la técnica, lo que uno tiene que tener en cuenta. Incluso un kidney que sale de la cirugía mayor éxito sólo puede permanecer viable durante un tiempo limitado. Los autores encontraron 1 hr a ser el mejor punto de tiempo en el que para detener la perfusión. Además, mientras que la perfusión del riñón aislado permite el estudio de todo el órgano aislado en profundidad, es difícil diferenciar efectos específicos sobre un tipo de célula. Los riñones fijos después de 1 hora pueden mostrar defectos en los segmentos S3 de los túbulos proximales y células ascendente extremidades gruesas, mientras que los glomérulos, los segmentos S1, DCT, y CDs deben permanecer intactos. El uso obligatorio de los eritrocitos, en especial de los seres humanos, también está vinculado a riesgos potenciales (por ejemplo, infecciones) para el experimentador.

En resumen, el riñón aislado y perfundido de ratón es una técnica útil con el que estudiar todo el órgano ex vivo. Como cualquier técnica, tiene ciertas ventajas y limitaciones. Los autores creen que tanto las nuevas aplicaciones múltiples que surgen en la actualidad y este protocolo podrían proporcionar suficient impulso para otros laboratorios para reproducir este esfuerzo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Perfusion Circuit:
Moist chamber 834/8 Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2901
Cannular with basket and side port Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2947
Thermostat TC120-ST5  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-4544
ISM 827/230V Roller Pump Reglo Analogue Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-0114
Reservoir jacketed for buffer solution 1 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3438
Reservoir jacketed for buffer solution 0.5 L Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3436
Pressure Transducer APT300  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3862
TAM-D Plugsys Transducer Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-1793
SCP Plugsys servo controller Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-2806
Windkessel  Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3717
HSE-USB data acquisition Harvard Apparatus/Hugo Sachs Elektronik GmbH 73-3330
Low-Flux Dialysator Diacap Polysulfone B.Braun 7203525
PE-Tubing for aorta cannulation 1.19 mm I.D. x 1.70 mm O.D. Scientific Commodities Inc. BB31695-PE/8
Name Company Catalog Number Comments
Buffer reagents:
Aminoplasmal 10% B.Braun 134518064
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P2256-25G
L-Glutamic acid monosodium salt hydrate Sigma-Aldrich G1626-100G
L-(-)-Malic acid sodium salt Sigma-Aldrich M1125-25G
Sodium-L-Lactate Sigma-Aldrich L7022-10G
alpha-Ketoglutaric acid sodium salt Sigma-Aldrich K1875-25G
NaCl Sigma-Aldrich 31434-1KG-R
NaHCO3 Sigma-Aldrich S5761-5KG
KCl Sigma-Aldrich 60130-1KG
Urea Sigma-Aldrich U5378-500G
Creatinine Sigma-Aldrich C4255-10G
Ampicillin Roche 10835242001
MgCl2 * 6H2O Sigma-Aldrich M2393-500G
D-Glucose Sigma-Aldrich G8270-1KG
CaCl2 * 6H2 Riedel-de-Haën 12074
NaH2PO4 Sigma-Aldrich S9638-500G
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S0876-500G
Antidiuretic Hormone dDAVP Sigma-Aldrich V2013-1MG
FITC-Inulin Sigma-Aldrich
Filter used for erythrocyte filtration Macherey-Nagel MN 615
BGA Analysis:
ABL 80 flex Radiometer Medical ApS
Electron Microscope:
Philips CM100 TEM FEI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carrel, A., Lindbergh, C. A. The culture of whole organs. Science (New York, N.Y.). 81, (2112), 621-623 (1935).
  2. Skutul, K. Über Durchströmungsapparate Pflüger's Archiv. 123, (4-6), 249-273 (1908).
  3. Nizet, A. The isolated perfused kidney: possibilities, limitations and results. Kidney Int. 7, (1), 1-11 (1975).
  4. Weiss, C., Passow, H., Rothstein, A. Autoregulation of flow in isolated rat kidney in the absence of red cells. Am J Physiol. 196, (5), 1115-1118 (1959).
  5. Schurek, H. J., Kriz, W. Morphologic and functional evidence for oxygen deficiency in the isolated perfused rat kidney. Lab Invest. 53, (2), 145-155 (1985).
  6. Stolte, H., Schurek, H. J., Alt, J. M. Glomerular albumin filtration: a comparison of micropuncture studies in the isolated perfused rat kidney with in vivo experimental conditions. Kidney Int. 16, (3), 377-384 (1979).
  7. Schweda, F., Wagner, C., Krämer, B. K., Schnermann, J., Kurtz, A. Preserved macula densa-dependent renin secretion in A1 adenosine receptor knockout mice. AJP Renal Physiol. 284, (4), F770-F777 (2003).
  8. Moers, C., Smits, J. M., et al. Machine perfusion or cold storage in deceased-donor kidney transplantation. N Engl J Med. 360, (1), 7-19 (2009).
  9. Nicholson, M. L., Hosgood, S. A. Renal transplantation after ex vivo normothermic perfusion: the first clinical study. Am J Transplant. 13, (5), 1246-1252 (2013).
  10. Worner, M., Poore, S., Tilkorn, D., Lokmic, Z., Penington, A. J. A low-cost, small volume circuit for autologous blood normothermic perfusion of rabbit organs. Art Org. 38, (4), 352-361 (2014).
  11. Kaths, J. M., Spetzler, V. N., et al. Normothermic Ex Vivo Kidney Perfusion for the Preservation of Kidney Grafts prior to Transplantation. J Vis Exp. (101), e52909 (2015).
  12. Song, J. J., Guyette, J. P., Gilpin, S. E., Gonzalez, G., Vacanti, J. P., Ott, H. C. Regeneration and experimental orthotopic transplantation of a bioengineered kidney. Nature Med. 19, (5), 646-651 (2013).
  13. Hall, A. M., Crawford, C., Unwin, R. J., Duchen, M. R., Peppiatt-Wildman, C. M. Multiphoton imaging of the functioning kidney. JASN. 22, (7), 1297-1304 (2011).
  14. Lindell, S. L., Williams, N., Brusilovsky, I., Mangino, M. J. Mouse IPK: A Powerful Tool to Partially Characterize Renal Reperfusion and Preservation Injury. Open Transplant J. 5, 15-22 (2011).
  15. Wagner, C., De Wit, C., Kurtz, L., Grünberger, C., Kurtz, A., Schweda, F. Connexin40 is essential for the pressure control of renin synthesis and secretion. Circ Res. 100, (4), 556-563 (2007).
  16. Czogalla, J., Vohra, T., Penton, D., Kirschmann, M., Craigie, E., Loffing, J. The mineralocorticoid receptor (MR) regulates ENaC but not NCC in mice with random MR deletion. Pflüger's Archiv. (2016).
  17. Poosti, F., et al. Precision-cut kidney slices (PCKS) to study development of renal fibrosis and efficacy of drug targeting ex vivo. Dis Model Mech. 8, (10), 1227-1236 (2015).
  18. Rahgozar, M., Guan, Z., Matthias, A., Gobé, G. C., Endre, Z. H. Angiotensin II facilitates autoregulation in the perfused mouse kidney: An optimized in vitro model for assessment of renal vascular and tubular function. Nephrology. 9, (5), 288-296 (2004).
La Técnica del riñón perfundido aislado del ratón
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).More

Czogalla, J., Schweda, F., Loffing, J. The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique. J. Vis. Exp. (117), e54712, doi:10.3791/54712 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter