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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54714
Automatic Translation
1,2,3, 1, 4, 3, 5, 6, 1,7, *1, *3,8,9
1Department of Pediatric Oncology/Hematology, VU University Medical Center, 2Department of Hematology, VU University Medical Center, 3Department of Medical Oncology, VU University Medical Center, 4Department of Clinical Genetics, VU University Medical Center, 5Division of General and Transplant Surgery, Azienda Ospedaliera Universitaria Pisana, Universita’ di Pisa, 6Amsterdam Immunology and Rheumatology Center, VU University Medical Center, 7Princess Máxima Center for Pediatric Oncology, 8Cancer Pharmacology Lab, AIRC Start-Up Unit, University of Pisa, 9Institute of Nanoscience and Nanotechnology, CNR-Nano
* These authors contributed equally

Summary

Aqui nós descrevemos um protocolo teve como objetivo investigar o impacto do splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de modelos parentais e resistentes in vitro através de RNA-seq e estabeleceu um método baseado qRT-PCR para validar genes candidatos.

Abstract

A resistência aos medicamentos continua a ser um grande problema no tratamento de câncer, tanto para doenças malignas hematológicas e tumores sólidos. resistência intrínseca ou adquirida pode ser causada por uma variedade de mecanismos, incluindo aumento da eliminação da droga, diminuição da absorção da droga, a inactivação de drogas e alterações de alvos de drogas. Dados recentes mostraram que diferente de pelo conhecido genética (mutação, amplificação) e modificações epigenéticas (hipermetilação DNA, histonas pós-translacional modificação), mecanismos de resistência a drogas também pode ser regulada por aberrações splicing. Este é um campo de rápido crescimento de investigação que merece atenção futuro, a fim de planejar abordagens terapêuticas mais eficazes. O protocolo descrito no presente trabalho tem como objetivo investigar o impacto de splicing aberrante na resistência aos medicamentos em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. Para este objetivo, foram analisados os perfis transcriptomic de vários modelos in vitro através de RNA-seq e estabelecerEd um qRT-PCR baseado método para validar os genes candidatos. Em particular, foi avaliada a splicing diferencial da DDX5 e PKM transcrições. O splicing aberrante detectado pela ferramenta computacional PAD foi validado em células leucémicas, que mostra que diferentes variantes de splicing DDX5 são expressos nas células resistentes comparada parental. Nestas células, observaram-se também uma maior proporção PKM2 / PKM1, que não foi detectada na Panc-1 homólogo gemcitabina resistente em comparação com as células parentais Panc-1, sugerindo um mecanismo diferente de resistência à droga-induzida pela exposição a gemcitabina.

Introduction

Apesar dos avanços consideráveis no tratamento do cancro, a resistência de células malignas à quimioterapia, quer intrínseca ou adquirida após exposição prolongada da droga, é a principal razão para o insucesso do tratamento de uma vasta gama de leucemias e tumores sólidos 1.

Para delinear os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos, em modelos de linhas celulares in vitro são desenvolvidos por selecção gradual de células cancerosas resistentes a agentes quimioterapêuticos. Este procedimento imita os regimes utilizados nos ambientes clínicos e, portanto, permite a investigação aprofundada dos mecanismos de resistência relevantes. As células resistentes que sobrevivem ao tratamento, em seguida, são distinguidas das células parentais sensíveis usando ensaios de viabilidade celular / citotoxicidade 2. Nos perfis de resistência a drogas in vitro de células primárias foram mostrados para ser significativamente relacionada com a resposta clínica à quimioterapia 3.

cytoto de alto rendimentoensaios xicity constituem um método conveniente para determinar a sensibilidade de drogas in vitro. Nisto, a viabilidade das células é avaliada por, por exemplo, o ácido 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio - ensaio MTT 4, o qual é baseado numa conversão metabólica de determinados substratos (isto é, sais de tetrazólio) em produtos coloridos, refletindo assim a atividade mitocondrial das células. Alternativamente, o teor de proteína celular pode ser quantificada utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB) 5. Aqui, o número de células viáveis ​​é proporcional à densidade óptica (DO) medida num comprimento de onda apropriado num espectrofotómetro, sem necessidade de extenso e procedimentos de contagem de células demorado. A inibição do crescimento induzida por um determinado fármaco quimioterapêutico pode ser calculado com base no diâmetro externo das cavidades em que as células foram tratadas com um agente de teste e comparado com o OD de células de controlo não tratadas. Uma curva de dose-resposta é obtainada representando graficamente as concentrações de fármaco, em função percentagens de células viáveis ​​em relação às células de controlo. Por fim, a sensibilidade ao fármaco pode ser avaliado como a concentração que resulta em 50% de inibição do crescimento de células, em comparação com células não tratadas (IC50).

Os mecanismos subjacentes a resistência aos medicamentos incluem muitas anormalidades diferentes, tais como alterações que afectam a expressão do gene de determinantes de atividade de drogas e metabolismo celular. Estas lesões moleculares, incluindo mutações, aberrações em um nível transcricional e pós-transcricional, bem como regulação epigenética perturbado muitas vezes afetam genes envolvidos tanto no metabolismo de drogas ou apoptose 6.

Alternative splicing de pré-mRNA e sua regulação intrincada recentemente recebeu atenção considerável como uma entidade romance que pode ditar a resistência aos medicamentos de células cancerosas 7. Até 95% dos genes humanos estão alternativamente, dividida em células normais, por meio da presentebem regulado processo que produz muitas isoformas de proteínas diferentes do mesmo gene. O splicing alternativo é frequentemente desregulado no cancro e vários tumores são caracterizados por splicing alterada de um número cada vez maior de genes envolvidos no metabolismo do fármaco (isto é, desoxicitidina-quinase, folilpoliglutamato-sintetase, ou proteínas de resistência a múltiplas drogas) 6,8. No entanto, uma análise abrangente de perfis de splicing de células resistentes aos medicamentos é dolorosamente falta. Portanto, é imperativo desenvolver métodos de alto rendimento para a análise de splicing alternativo. Isto poderia ajudar a desenvolver abordagens terapêuticas mais eficazes.

Durante a última década, o rápido desenvolvimento das tecnologias da próxima geração de sequenciamento (NGS) enriqueceu pesquisa biomédica com novos insights sobre os mecanismos moleculares que regulam a regulação da expressão do genoma e seu papel em vários processos biológicos 9. ARN-sequenciação (ARN-SEQ), é um sub-potente aplicaçãoda NGS no campo da transcriptomics. Isso permite que um perfil de todo o genoma (tanto qualitativa como quantitativamente) dos padrões de milhares de genes simultaneamente expressão e é bem adequada para a caracterização de novos ARNm de codificação, bem como ARN de não codificação de comprimento, miARN, siRNA, e outra de ARN pequeno classes (eg, snRNA e Pirna) 10,11.

RNA-Seq tem muitas vantagens em relação a tecnologias anteriores para a caracterização do transcriptoma (por exemplo, sequenciação de Sanger e microarranjos de expressão). Ele não se baseia no genoma anotação existente, que tem um nível de um único nucleótido de resolução e tem uma gama dinâmica mais ampla para a estimativa do nível de expressão. Resumidamente, o fluxo de trabalho experimental básico de experiências de ARN-SEQ consiste de transcrição selecção poliadenilado (ARNm) e fragmentação, seguido por conversão em ADNc, construção de biblioteca e sequenciação profunda finalmente, maciçamente paralelo 12,13. Devido à rápida queda de sequencinCusta G ao longo dos últimos anos, o RNA-seq está gradualmente substituindo outras tecnologias e esforços significativos estão sendo feitos para melhorar os protocolos de preparação biblioteca. Por exemplo, é agora possível reter a informação de transcritos de ARNm de cadeia por marcação do segundo filamento de cDNA com o trifosfato de desoxiuridina (dUTP) e, antes da amplificação por PCR, digestão da cadeia marcada com uracilo-ADN-glycosilase (UDG). Este processo aumenta a precisão da estimativa de anotação do gene e dos níveis de expressão de 14,15.

A análise e interpretação dos dados de RNA-seq exigem pacotes de software computacional complexas e poderosas e transformação no âmbito dos oleodutos de bioinformática 16,17. Em primeiro lugar, a matéria-lê passam por um controle de qualidade através da remoção de artefatos técnicos e biológicos e descartando (corte) as sequências que não atingem os requisitos de qualidade rigorosos. Subsequentemente as leituras para cada amostra são mapeados para um genoma de referência e indexadosno gene de nível, de nível de exão, ou transcrição de nível, a fim de determinar a abundância de cada categoria. Dependendo da aplicação, os dados refinados são então calculado através de modelos estatísticos para a identificação de expressão alelo-específico, splicing alternativo, fusões de genes e polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) 12. Finalmente, a análise diferencial no nível seleccionado (isto é, expressão do gene ou de splicing alternativo) pode ser utilizado para comparar as amostras obtidas em condições diferentes.

análise de splicing diferencial descreve as diferenças no uso local de união entre duas amostras. Um número crescente de pacotes de software dedicados a este fim estão disponíveis com base em diferentes modelos estatísticos, performances e interface de usuário 18. Entre estes, PAD (análise multivariada de Transcrição emenda) surge como uma ferramenta computacional disponível gratuitamente e precisa com base em um quadro estatístico Bayesian e projetado para detectar difeeventos de splicing rential de ambos os dados de ARN-SEQ finais simples ou emparelhadas. A partir dos arquivos alinhados (.bam), tapetes podem detectar todos os principais tipos de eventos alternativos de splicing (salto de exon, alternativa "local de splicing alternativo, 5 '3 local de união, exons mutuamente exclusivas e retenção de intron - também ver Figura 1).

Em primeiro lugar, os identifica software lê que suportam um determinado evento emenda, para pular exemplo exão, e classifica-os em dois tipos. "Inclusão lê" (para o evento emenda canônica) mapear dentro do exão investigado e abrangem as junções entre que exão específico e os dois exons que ladeiam a montante ea jusante. "Skipping lê" (para o evento de união alternativa) abrangem a junção entre os dois exons flanqueando. Posteriormente, MATS retorna o nível de inclusão normalizado para ambos os eventos canônicas e alternativos e compara valores entre amostras ou condições. Em última análise, ele calcula P-valor umnd taxa de descoberta de falsas (FDR), assumindo que a diferença na proporção variante de um gene entre duas condições exceder um limite definido pelo usuário dada para cada evento splicing 19,34.

Após a análise de splicing diferencial em conjunto com ARN-SEQ, uma extensa validação experimental é garantido de modo a identificar genes candidatos verdadeiro-positivo 18. Quantitativa reversa-reacção em cadeia da polimerase transcrito (qRT-PCR) é o método mais vulgarmente usado e óptimo em validação de candidatos obtidos a partir de análise de RNA-Seq 20. O objetivo deste trabalho é fornecer uma metodologia sólida para investigar os perfis de emenda relacionados com resistência a drogas em tumores sólidos e doenças malignas hematológicas. A nossa abordagem utiliza ARN-SEQ-base de perfis transcriptoma de modelos de linhas celulares seleccionadas de cancros resistentes a fármacos em combinação com um método de qRT-PCR estabelecido para a validação de genes candidatos envolvidos na resistência à droga.

21,22 e o metotrexato (MTX) sub-linha resistente à CEM / R30dm 23. Embora as terapias actuais com base em GC e MTX estabelecer benefício clínico em cerca de 90% dos casos, o surgimento de GC-resistência ainda representa um problema não resolvido com um mecanismo molecular claro. Para isolar clones de sub-GC-resistentes, células CEM-wt foram cultivadas em 1 uM de dexametasona (Dex) durante 2 a 3 semanas. sublinha resistente-MTX CEM / R30dm foi desenvolvido por meio de curto prazo repetido (24 h) a exposição de células CEM-WT a 30 mM MTX como um imitador de protocolos clínicos. Curiosamente, esta linha celular também exibida resistência cruzada a Dex (resultados não publicados) para que o mecanismo não é completamente compreendido.

O tum sólidaou modelo investigado no presente estudo é o adenocarcinoma ductal pancreático, notório por sua extraordinária refractoriness à quimioterapia. Para este fim, foram selecionados linha Panc-1 de células e a sua sub-clone de gemcitabina-resistente Panc-1R obtido por incubação com 1 uM contínua do fármaco 24. Aqui nós descrevemos uma abordagem para descobrir novos mecanismos subjacentes in-vitro resistência aos medicamentos através da combinação de três protocolos: ensaios de citotoxicidade colorimétricos para avaliar a sensibilidade de drogas em células leucêmicas e células cancerosas de tumores sólidos, gasoduto RNA-seq-base para identificar novas variantes de emenda relacionadas com sensibilidade ao fármaco / resistência e RT-PCR e análise de qRT-PCR para validar os potenciais candidatos.

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Protocol

1. Caracterização de Perfis de resistência a medicamentos através de Citotoxicidade

  1. Cultura Linha de células leucémicas
    1. Manter a célula T parental toda a linha celular CCRF-CEM (CEM-WT), bem como as suas sublinhas resistentes a drogas, incluindo a CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3, em 25 cm2 em meio de 10 ml de RPMI-1640 contendo 2,3 uM de ácido fólico suplementado com 10% de soro fetal de vitelo e 100 unidades / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina.
    2. Cultura das células numa atmosfera humidificada a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5%.
    3. Permitir o crescimento de células para concentrações entre 2-3 x 10 6 células / ml.
    4. Dividir as células duas vezes por semana a uma concentração inicial de 0,3 x 10 6 culas / ml (por exemplo, se a concentração de células é de 3 X 10 6 células / ml, transferir a suspensão de células de 1 ml de um novo frasco contendo 9 ml de meio fresco). Descartar a cultura depois de 20 passagens consecutivas.
    Cultura Linha pâncreas Carcinoma
    NOTA: Manter a linha de células de carcinoma pancreático humano Panc-1 em 75 cm 2 frascos de cultura em 10 ml de meio DMEM com elevado teor de glucose e de L-glutamina, suplementado com 10% de soro bovino fetal e 100 unidades / ml de penicilina G e 100 ug / ml de estreptomicina . A variante resistente a fármacos, Panc-1R, é cultivada no mesmo meio de cultura contendo 1 uM de gemcitabina dissolvidos em água estéril. Mais detalhes são fornecidos em 24.
    1. Cultura das células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 a 5%.
    2. Dividir as células a cada 2 - 3 dias a uma razão de 1: 5, quando as células atingem a confluência de cerca de 90%.
    3. Para dividir as células, lava-se a duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS), adicionar 1 ml de tripsina / EDTA por 75 centímetros 2 balão de cultura e incuba-se a 37 ° C durante 3 min.
    4. Adicionar 9 ml de meio e colheita das células destacadas em um tubo de 15 ml. Semente de suspensão de células de 2 ml em um balão de novo Containing 8 ml de meio. Descartar a cultura depois de 20 passagens consecutivas.
  2. Ensaio MTT para células leucémicas
    1. Prepara-se previamente a solução de MTT: dissolver 500 mg de MTT em formazano de 10 ml de PBS e de agitação (protegido da luz), com um agitador magnético durante cerca de 1 h. Esterilizar a solução com um filtro de 0,22 um. NOTA: A solução pode ser armazenada em alíquotas de 10 ml a -20 ° C. Proteger da luz direta após o descongelamento.
    2. Prepara-se previamente o isopropanol acidificada: adicionar 50 ml de HCl 2 M a 2,5 L de isopropanol. NOTA: Guarde a solução para pelo menos um mês à temperatura ambiente antes do uso. Se o isopropanol não é acidificada corretamente, ele pode formar precipitados com o meio e comprometer a leitura espectrofotométrica.
    3. Prepara-se uma 96 poços de fundo plano separado "Dia 0" (controlo) placa para assegurar estimativa mais precisa da inibição do crescimento: 3 a dedicar 6 poços por linha de células, adicionar 30 ul de crescimentomeio e 120 uL de suspensão de células (8000 células) por cada poço e 150 ul de meio de crescimento aos poços correspondentes aos espaços em branco (sem células). Continuar a partir do passo 1.3.9 a 1.3.13 passo desta secção para medir a densidade óptica (OD). NOTA: Mais detalhes são fornecidos em 4.
    4. Prepare uma placa experimental de 96 poços de fundo plano: dedicar 30 poços para concentrações da droga (10 concentrações, cada uma em triplicado), 10 poços para controlar células e 10 poços para controlar meio sem células (espaços em branco) e preparar uma série de diluições de drogas de dexametasona ( Dex) utilizando dimetilsulfóxido como solvente.
      NOTA: Para as células CEM-WT a gama de diluição Dex é entre 2 mM e 0,97 nM. Para CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3 células a gama de diluição Dex é entre 640 uM e 0,33 nM.
    5. Adicionar 30 ul de cada diluição de Dex num poço apropriado da placa de 96 poços. Certifique-se de incluir cada concentração em triplicado.
    6. Adicionar 30 mL de meio de crescimento para o bems correspondente às células de controlo e de 150 ul de meio de crescimento aos poços correspondentes aos espaços em branco.
    7. Colheita exponencialmente o crescimento de células e ressuspender a sua concentração óptima de semeadura.
      NOTA: De modo a determinar as concentrações de células de partida ideais, recomenda-se para avaliar o perfil de crescimento de cada linha de células de linha celular numa placa de 96 poços por células de sementeira em várias concentrações e medi-la por dia durante pelo menos 4 dias. Escolha uma concentração de semeadura que impede a proliferação de células após 72 horas, pois isso irá influenciar o experimento saturando os valores de DO. Para CEM-WT, CEM-C5 e R5 CEM-sementeira a concentração óptima é de 8.000 células / poço, enquanto que para CEM / R30dm é 5.000 células / poço.
    8. Adicionar 120 ul de suspensão celular a cada uma ou a solução de um fármaco bem contendo ou o meio de crescimento (cavidades que corresponde às células de controlo). Encha as cavidades exteriores vazios, da placa com 150 ul de PBS para garantir uma boa humidade na placa e incubar the as placas durante 72 h a 37 ° C com 5% de CO 2 num incubador de cultura de células.
    9. Adicionar 15 ul de solução de MTT a cada poço e agitar a placa durante 5 minutos com um agitador de placa, com um máximo de 900 agitações / min.
    10. Colocar as placas de novo a 37 ° C com 5% de CO 2 num incubador de cultura de células e incuba-se durante mais 4-6 horas.
    11. Adicionar 150 uL de isopropanol acidificado a cada poço e misturar bem com uma pipeta de canais múltiplos para ressuspender completamente todos os cristais de formazano. Comece com os poços em branco e certifique-se de lavar as pontas bem antes de prosseguir para outra linha da placa.
    12. Incubar a placa à temperatura ambiente (TA) durante 10 min.
    13. Utilizando um leitor de microplacas, determinar a densidade óptica a 540 e 720 nm, para garantir uma medição precisa, corrigindo para a OD de fundo. Em seguida, salvar os dados em um arquivo de planilha e analisá-lo 4.
  3. SRB Ensaio para células pancreáticas Carcinoma
    1. Dissolve-se o reagente de SRB em ácido acético a 1% na concentração final de 0,4% (w / v).
    2. Dissolve-se ácido tricloroacético (TCA) em água ultrapura com uma concentração final de 50% (w / v).
    3. Dissolver -aminometano Tris (hidroximetil) em água ultrapura com uma concentração final de 10 mM.
    4. Prepara-se uma placa de 96 poços de fundo controlo "Dia 0" plana separada para assegurar a estimativa mais precisa da inibição do crescimento: as sementes 6 poços com células em crescimento em fase exponencial em 100 meio de ul a uma concentração de sementeira adequado e adicionar 100 forma ul apenas para os poços correspondendo a espaços em branco. Incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2 para garantir adesão adequada das células à placa. Em seguida, adicione 100 � de meio a todos os poços e continuar com as etapas 1.4.8 - 1.4.16 desta seção.
    5. Prepara-se uma placa experimental de 96 cavidades de fundo plano: células de sementes de crescimento em fase exponencial em triplicado em placas de 96 poços de fundo plano a uma densidade apropriada em 100 ul de medium usando uma pipeta multicanal.
      NOTA: De modo a determinar as concentrações de células de partida ideais, recomenda-se para avaliar o perfil de crescimento de cada linha de células de linha celular numa placa de 96 poços por células de sementeira em várias concentrações e medi-la por dia durante pelo menos 4 dias. Escolha uma concentração de semeadura que impede a proliferação de células após 72 horas, pois isso irá influenciar o experimento saturando os valores de DO. Para as células Panc-1 e Panc-1R, a concentração óptima é de semeadura 8000 células / poço.
    6. Adicionar 100 ul de meio para médio-só poços e incubar durante a noite a 37 ° C com 5% de CO 2 para garantir adesão adequada das células à placa.
    7. Prepara-se uma série de diluições de droga de gemcitabina entre 1 pM e 10 nM para Panc-1 e 1 mM e 100 nM para células Panc-1R. Adiciona-se 100 ul de cada diluição em um poço apropriado da placa de 96 poços utilizando uma pipeta multicanal. Certifique-se de ter cada concentração em triplicado. Além,adiciona-se 100 ul de meio para os médio apenas poços e as células de controlo. Incubar a 37 ° C com 5% de CO 2 durante 72 h.
    8. Adicionar 25 ul de solução de TCA frio aos poços utilizando uma pipeta multicanal e incubar as placas durante pelo menos 60 min a 4 ° C, a fim de precipitar as proteínas e fixar no fundo dos poços.
    9. Esvaziar a placa removendo o meio brevemente e seco sobre um tecido.
    10. Lavar 5 vezes com água da torneira, em seguida, esvazie o prato e deixe secar à temperatura ambiente.
    11. Adicionar 50 ul de solução de SRB por poço usando uma pipeta de repetição-mancha e durante 15 min à temperatura ambiente.
    12. Esvaziar a placa removendo a mancha SRB.
    13. Lave 4 vezes com ácido acético a 1%, em seguida, esvazie o prato e deixe secar à temperatura ambiente.
    14. Adicionar 150 ul de solução de Tris por poço utilizando uma pipeta multicanal e misturar durante três minutos em um agitador de placa, com um máximo de 900 agitações / min.
    15. Leia a densidade óptica a 540 nm (ou 492 nm no caso de Tele OD valores são muito altos).
    16. Analisar os dados.
  4. Análise de dados para ensaios de MTT e SRB
    1. Calcular os valores de DO de células no "Dia 0" usando a seguinte fórmula: OD Dia 0 células = controlo OD - poços branco DO média
    2. Calcula-se a percentagem de células sobreviventes para cada concentração de fármaco de acordo com a seguinte fórmula:% de células tratadas = Média [OD de células tratadas - poços em branco DO média - Day OD 0] / [células de controlo OD - poços em branco DO média - OD Day0] * 100
    3. Traça-se a curva de dose-resposta (concentração de fármaco versus a inibição do crescimento em%).
    4. Calcular a concentração da droga que inibe o crescimento das células em 50% (IC50) utilizando a curva de dose-resposta.

2. Isolamento de ARN e Biblioteca de Preparação para o ARN-sequenciação

  1. amostra CollIsolamento de ARN e exão
    1. Para células CEM: colher 10 6 células directamente a partir do meio de cultura.
    2. Para Panc-1 e Panc-1R: remover o meio, lavar as células duas vezes com PBS e destacam pela adição de tripsina-EDTA e incubado a 37 ° C durante 3 min. Adicionar meio de cultura e colheita 10 6 células.
    3. Centrifugue as amostras a 300 xg durante 3 minutos, remover o sobrenadante e extrai-se mRNA total utilizando colunas de rotação com membrana de sílica disponíveis comercialmente, seguindo o protocolo manufacturer`s.
    4. Determinar a concentração e pureza do ARN total utilizando um espectrofotómetro de UV-Vis.
      NOTA: O ARN é considerada de alta pureza, se a razão de absorvâncias 260 nm / 280 nm é superior a 1,8. As amostras podem ser armazenadas a - 80 ° C.
    5. Avaliar a integridade de ARN total por electroforese de 200 ng de amostra em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio.
      NOTA: A detecção de duas bandas correspondendo ao mamífero intactas 28S e 18S ARNr a aproximadamente2 kb e 1 kb em tamanho é indicativo de uma boa integridade do ARN total.
  2. Sequenciamento Biblioteca Preparação
    1. Use 2 ug de ARNm total por cada amostra. Siga ARNm protocolo biblioteca de preparação de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Determinar a qualidade e a concentração de cada biblioteca por meio de um sistema de Bioanalyzer. Reunir as bibliotecas de uma única amostra até uma concentração final de 10 nmol / L e medi-lo com o Bioanalyzer.
    3. Utilize o sistema de sequenciamento de alto rendimento com Single Leia modo de 100 pb.
      NOTA: Leia comprimento> 80 pb é necessário para a identificação de isoformas de transcrição.

3. Detecção de processamento diferencial de Sequenciamento Lê

  1. Alinhamento de Lê para Referência Genoma e de Verificação da Qualidade
    1. Compilar uma anotação gene (arquivo .gtf) da tabela NCBI refGene usando UCSC navegador mesa (25,963 genes).
    2. realizaralinhamento gapped anotação-aware do sequenciamento lê o genoma de referência (GRCh37) usando STAR.
    3. Classificar e indexar os arquivos de alinhamento resultantes com ferramentas de Picard.
    4. Realizar o controle de qualidade de pós-mapeamento usando RSeQC e samtools.
  2. Diferencial de Detecção de emenda entre grupos amostrais
    1. Instalar Python e as correspondentes versões do NumPy e SciPy. Baixe e instale samtools. Baixe e instale bowtie e tophat,
    2. Adicione os diretórios Python, gravata borboleta, tophat e samtools à variável de ambiente $ PATH. Download de pré-construídos índices gravata borboleta (hg19). Baixar rMATS versão 3.0.9.
      NOTA: Mais detalhes sobre rMATS são fornecidos em 19 e 34.
    3. Detectar eventos de splicing alternativo, comparando cada linha de células resistentes-Dex a CEM-WT e Panc-1 para Panc-1R em MATS separado é executado de acordo com a Figura 5A.
    4. Para detectar eventos de splicing diferenciais de previously sequenciamento alinhados lê (arquivos .bam), Mats executados usando os comandos a partir da Figura 5B para CEM-WT vs. CEM- C3, CEM-WT vs. CEM-R5, CEM-WT vs. CEM / R30dm e Panc1 para Panc- comparações 1R.
      Nota: Tapetes irá criar uma pasta de saída com dois arquivos .txt com resultados por tipo de evento splicing analisados ​​(SE - salto de exon, A5SS - alternativa 5 'local de união, A3SS - alternativa 3' local de união, MEX - exons mutuamente exclusivas e RI - retenção de intron): um arquivo contendo os resultados com base apenas as contagens de junção e um segundo arquivo com resultados baseados em contagens de junção e lê no alvo. Além disso, um ficheiro txt adicional com uma visão geral resultado é gerado na mesma pasta.
    5. Para SE, A5SS, A3SS e importação RI para planilhas os arquivos .txt baseado na contagem de junção e lê no alvo. Para MEX importar os arquivos .txt com base em apenas contagens de junção.
      NOTA: arquivo de saída MATS é classificada por ascendente P-valores e contém vários parâmetros: ID gene, símbolo do gene, Cromossomo ea posição vertente, coordenadas genômicos dos fragmentos de splicing alternativo, conta, bem como o comprimento de inclusão e pular formas para ambas as amostras analisadas, a duração da inclusão e pular formulário utilizado para normalização, p-valor, a taxa de descoberta de falsas (FDR ), nível de inclusão para cada amostra com base nas contagens normalizadas ea pontuação inclusão diferencial (média (IncLevel1) - média (IncLevel2)).
    6. Selecione genes candidatos estatisticamente significativas com um FDR <10% para posterior validação (por exemplo, DDX5 e PKM2).
    7. Visualizar eventos de splicing alternativo com Integrative Genomics Viewer (IGV, https://www.broadinstitute.org/igv/), conforme relatado na Figura 5.

4. validação dos resultados por RT-PCR e qRT-PCR Ensaios

  1. projeto Primer
    NOTA: De modo a proporcionar uma validação fiável dos resultados obtidos usando o pipeline de bioinformática, o ARNm transcripts resultantes de eventos de splicing alternativo são amplificados por meio de RT-PCR e visualizados por electroforese em gel de agarose dos produtos de PCR. Cyanine corante verde, como SYBR ensaio qRT-PCR verde é utilizada para quantificar emenda específica variantes em relação a um gene de manutenção. A Figura 7 representa a estratégia utilizada para visualizar o salto caso de o gene DDX5 exão 12 e para quantificar o mutuamente exclusivos exão 9 e o exão 10 do gene de PKM.
    1. Para o ensaio de RT-PCR, os pares projeto iniciador que emparelham com exons constitutivos (exão 10 e exon 13) situados a montante ea jusante dos locais de splicing alternativo (Figura 7A).
      NOTA: O tamanho amplicão deve abranger entre 100 e 800 pb, a fim de assegurar uma separação clara dos produtos de PCR em gel de agarose preditos. A temperatura de emparelhamento dos iniciadores deve ser entre 55 e 65 ° C e o teor de GC não deve exceder 60%.
    2. Ensaio verde cianina (Figura 7B). Verifique a homologia da sequência dos dois exões que se excluem mutuamente e de criação de dois pares de iniciadores cada um dos quais especifica e exclusivamente detecta apenas uma das duas variantes de splicing.
      NOTA: Para PKM, o iniciador de sentido inverso hibrida com o exão 11 comum a ambas as variantes, enquanto que os iniciadores directos são específicos da variante e emparelham ao exão 9 (PKM1) ou exão 10 (PKM2).
    3. A fim de detectar gene de comprimento completo DDX5, recozer o iniciador inverso dentro do exão ignorados (exão 12).
      NOTA: Para a detecção específica da variante DDX5 ΔEx12, o iniciador inverso abrange o limite exon11 / exon13. Use o mesmo iniciador directo que hibrida com o exão constitutiva 10 para ambas as reações.
      NOTA: O tamanho do fragmento amplificado deve ser entre 80 e 200 pb.
  • A primeira cadeia de síntese de ADNc
    1. Defina-se a transcrição inversa de 1 pg de ARN isolado em ADNc usando 200 U / mL de vírus da Leucemia Murina de Moloney Rever (M-MLV)SE transcriptase no seu tampão de reacção diluiu-se 1: 5 com água estéril. Adicionar DTT a 1 uM, 0,05 ug de hexâmeros aleatórios, mistura de desoxinucleótido (dNTP) 1 mM, e 40 U / ul de inibidor de ribonuclease.
    2. Vortex brevemente e incubar a mistura de reacção a 37 ° C durante 2 h.
    3. Incubar a mistura de reacção a 70 ° C durante 5 min, para inactivar a transcriptase reversa, transferir a mistura em gelo e girar para baixo usando uma microcentrífuga. As amostras podem ser utilizadas imediatamente ou armazenadas a - 20 ° C.
  • A reacção de RT-PCR e do gel de agarose
    1. Defina-se a reacção de PCR num tubo de PCR de cada amostra por mistura de 12,5 ul de 2x concentrado mastermix de PCR, 1,25 ul de 10 mM de iniciadores para a frente e a mesma quantidade para o iniciador inverso até um volume final de 25 ul com água estéril.
    2. Adicionar 1 ml de ADNc, para a mistura e coloque os tubos no termociclador. Executar o programa como se segue: desnaturação inicial: 95 ° C durante 2 min.Reiterar os seguintes passos durante 35 ciclos de: desnaturação a 95 ° C durante 25 seg; hibridação a 52 ° C durante 35 seg; extensão a 72 ° C durante 1 min. Conjunto de extensão final a 72 ° C durante 5 min.
    3. Prepare gel de agarose a 1% por dissolução de 1 g de agarose em 100 ml de 1X tampão TBE. Adicionar 2,5 mL de brometo de etídio para a solução. CUIDADO: O brometo de etídio é cancerígeno, manusear com cuidado usando uma coifa química.
    4. Coloque as amostras e executar o gel em tampão TBE 1x a 100 V durante cerca de 30 minutos num sistema de electroforese.
    5. Revelar o gel com uma câmera UV digital e salvar a imagem.
  • qRT-PCR e análise de dados
    1. Defina-se a verde reacção de PCR Cianina por cada amostra por mistura de 12,5 ul de 2x verde PCR Mastermix, 2 ul de 5 uM de iniciadores para a frente e a mesma quantidade para o iniciador inverso até um volume final de 15 ul com água esterilizada num tubo de PCR . Prepare uma mistura para cada emenda específicavariante a ser detectado (PKM1, PKM2, DDX5 comprimento completo, DDX5 ΔEx12) e para o gene doméstico (GUS).
    2. Carregar o mastermix em uma placa de 96 poços branca e preparar duplicados de cada amostra.
    3. Diluir o cDNA 10x em água, adicionar 5 mL de cada mistura e coloque a placa no termociclador. Executar o programa como se segue: desnaturação inicial: 95 ° C durante 5 min. Reiterar os seguintes passos durante 45 ciclos de: desnaturação a 95 ° C durante 10 seg; hibridação a 58 ° C (para DDX5 e DDX5 ΔEx12 mistura) ou 60 ° C (para PKM1 e mistura PKM2) durante 20 seg. Conjunto de extensão final a 72 ° C durante 20 seg. Definir curva de fusão pela aplicação de um gradiente de 65-97 ° C.
    4. A fim de avaliar a especificidade dos conjuntos de iniciadores para o seu alvo, verificar as curvas de fusão e verificar se um único pico é formada por cada conjunto de iniciadores.
    5. Calcule o segundo valores derivados das curvas de amplificação e exportar os valores de limite de ciclo (CT).
    6. calculate os níveis de expressão relativa (REL) do splicing do mRNA variantes em comparação com a arrumação de GUS (referência) de genes em cada amostra, utilizando a "delta Ct (ΔCt)" método. A fórmula é: REL = 2 - ΔCt, onde ΔCt = Ct alvo variante de processamento - gene de referência Ct
    7. A fim de quantificar a abundância relativa de variantes de splicing, o cálculo da relação REL por meio da seguinte fórmula: Proporção REL proporção = REL variante de splicing 1 / REL variante de processamento 2.

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    Representative Results

    Os ensaios de citotoxicidade descritos no protocolo de proporcionar um método fiável e robusto para avaliar a resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos in vitro. Por meio do ensaio de MTT, sensibilidade a Dex foi determinada em quatro linhas T-ALL de células, incluindo células CEM-WT parentais @ Dex-sensíveis, e três sub-linhas resistentes à Dex: CEM / R30dm, CEM-R5 e CEM-C3. Duas faixas de concentração diferentes tinham de ser usados, devido à grande diferença na sensibilidade entre a CEM-WT (2 uM - 0,97 nM) e as linhas de células resistentes Dex (640 ^ M - 0,33 nM). O ensaio de MTT mostrou claramente a resistência de Dex na CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 pM), CEM-R5 (IC50> 640 pM) e CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98 pM) em comparação com o CEM- células WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 m). Da mesma forma o ensaio SRB demonstrado alta resistência gemcitabina na linha celular de Panc-1R (IC 50 = 3.16 ± 0,01 uM) em comparação com as células parentais Panc-1 (IC 50 = 0,077 ± 0,03 uM) como mostrado na Figura 2.

    Após a confirmação da resistência aos medicamentos em todas as linhas de células consideradas, nós próxima procedeu ao isolamento de mRNA, a preparação biblioteca e RNA-sequenciação. Extracção do ARNm total utilizando colunas de rotação com membrana de sílica é a escolha preferida em relação a outros métodos, uma vez que evita a contaminação de fenol e de proteína e fornece alta pureza da amostra com 260 nm / 280 nm, razão de absorvância bem acima de 1,8. Este é um requisito importante para aplicações a jusante complexas, tais como a sequenciação de profundidade. O método usado para verificar a integridade das amostras de ARN por de agarose a 1% é particularmente adequado para as células isoladas de fresco (Figura 3). Uma vez que o objectivo deste protocolo é detectar variantes de splicing alternativos expressos de maneira aberrante em linhas de células resistentes aos medicamentos, escolhemos selectio positivan de ARNm poliadenilado para a preparação da biblioteca de sequenciação, utilizando kit de ARNm de cadeia simples. Electroferogramas de bibliotecas individuais e combinadas estão representados na Figura 4, que mostra um tamanho médio de fragmento de cerca de 300 pb, consistente com os requisitos do sistema de sequenciação. As bibliotecas preparadas foram então sequenciados usando um chip com leitura única modo de 100 pb. A escolha de sequenciamento lê de 100 pb é necessário para detectar splicing alternativo através de gasodutos de bioinformática jusante.

    Após as etapas de processamento iniciais e controle de qualidade, a limpeza lê alinhado com genoma humano (hg19) foram submetidos a análise diferencial splicing usando esteiras. Nesta análise, fizemos comparações entre a linha de células de drogas sensíveis dos pais e cada um dos seus medicamentos sublinhas resistentes separadamente (isto é, a CEM WT vs. CEM / R30dm, CEM WT vs. CEM-C3, etc.). MATS se baseia em um modelo estatístico flexíveis e precisosutilizado para detectar o splicing diferencial entre as amostras. Usando opções de análise padrão e um valor FDR <10% como um cut-off (mostrado na Figura 5B), fomos capazes de identificar 38 ± 12 importantes candidatos de genes diferencialmente emendados por comparação ordenados por tipo de evento splicing alternativo, com a maioria dos acessos classificadas como salto de exon. A Figura 6 ilustra uma análise típica de saída de comparação Panc-1 vs Panc-1R.

    Estamos focados ainda mais o nosso estudo sobre dois tipos mais comuns de eventos de splicing alternativo: eventos de exão mutuamente exclusivas com um candidato representante por categoria descrito abaixo salto de exon e. DDX5 (DEAD-box helicase 5), foi detectada por análise MATS como estatisticamente significativa na comparação CEM-WT vs. CEM-C3 e CEM-R5, mas não significativa na comparação CEM-WT vs. CEM / R30dm. Dado o seu papel putativo na leucemia 25,26, nósescolher o candidato para posterior validação. É altamente recomendável para visualizar dados de RNA-seq em uma ferramenta navegador-como genoma. IGV fornece uma interface versátil e fácil de utilizar para este fim, como mostrado na Figura 7 para a DDX5 gene candidato. PKM (piruvato-quinase isoenzima muscular) é um evento de exão mutuamente exclusivos estatisticamente significativa na comparação CEM-WT vs. todos sublinhas resistentes Dex, mas não na comparação Panc-1 vs Panc-1R. Dada a relevância desta enzima no metabolismo do tumor sólido 27,28 eo papel emergente do metabolismo celular na resistência glicocorticóides em T-ALL 29, escolhemos este candidato para posterior validação usando RT-PCR.

    desenho de primers devem ser conduzidos com o máximo cuidado, a fim de amplificar o fragmento amplificado correcta, especialmente quando os iniciadores emparelham com o exão-exão limites (no caso de o iniciador inverso detectar variante DDX5 ΔEx12) ou quando they emparelham com mutuamente exons exclusivas com alta homologia de sequência (exão 9 e exon 10 de PKM). A Figura 8 mostra a estratégia de desenho do iniciador, enquanto a Figura 9 mostra os resultados de uma RT-PCR para DDX5 gene candidato. DDX5 ΔEx12 é detectada na amostra de WT-CEM e CEM / R30dm mas não em CEM-C3 e CEM-R5, confirmando assim dados PAD de uma forma qualitativa. Ensaio com verde de cianina qRT-PCR quantifica com precisão os níveis de as variantes de splicing e DDX5 PKM de expressão de ARNm, tal como mostrado na Figura 10 e Figura 11, respectivamente.

    figura 1
    Figura 1: Representação esquemática de eventos de splicing alternativo. Representação esquemática dos possíveis padrões de eventos de splicing alternativo de um gene. As caixas são exons discretos que podem ser independentemente incluídos ou excluídos do mRtranscrição NA. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 2
    Figura 2: Resultados de Citotoxicidade. (A) ensaio de MTT para linhas de células leucémicas mostra níveis elevados de resistência dexametasona em CEM-C3 (IC 50 = 386 ± 98), CEM-R5 (IC50> 640 pM) e CEM / R30dm (IC 50 = 456 ± 49 pM ), em comparação com o parental CEM-WT (IC 50 = 0,028 ± 0,003 uM). Os ensaios (B) SRB para linhas celulares de carcinoma pancreático revelar níveis elevados de resistência gemcitabina em Panc-1R (IC50 = 3,16 ± 0,01 uM) em comparação com o parental Panc-1 (IC 50 = 77,22 ± 2,76 nM). Os gráficos apresentar um crescimento celular significativo% ± SEM de três indepexperimentos endent. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3: Avaliação da qualidade do RNA utilizando um gel de agarose. Duzentos ng de ARNm total de foram corridos em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. A presença de bandas intactos correspondentes aos 18S RNA ribossomal (rRNA) da espécie e 28S e a ausência de manchas a pesos moleculares mais baixos são indicativos de RNA de boa qualidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4: <strong> Traços Bioanalyzer do sequenciamento bibliotecas. (A) electroferogramas de bibliotecas de sequenciação mostram picos a cerca de 300 pb, o que é indicativo de boa qualidade. Amostra 1-6 = CEM-WT, CEM-C3, CEM-R5, CEM / R30dm, Panc-1 e Panc-1R. (B) eletroferograma das amostras combinadas (FU, Fluorescência unidades).

    Figura 5
    Figura 5: Detecção de processamento diferencial com esteiras. Comparações grupo (A) e scripts (B) utilizados para executar esteiras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 6
    Figura 6: MATS lista de saída. A figura mostra uma saída típica de análise MATS em um software com planilhas: aqui são relatados os candidatos diferencialmente emendados na comparação Panc-1 vs. Panc-1R para eventos salto de exon (FDR <10%). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 7
    Figura 7: Visualização de processamento diferencial de DDX5 Candidate Gene através IGV Genoma do navegador. Arquivos com Alinhados lê (.bam), correspondendo a células leucêmicas foram carregados no navegador IGV genoma e visualizados usando parcelas Sashimi (contagens de junção valor mínimo = 10 para visualizar eventos de splicing significativos). contagens de junção de processamento são representados por linhas de conexão eum número correspondente ao ARN-SEQ lê abrangendo os exões. CEM-WT e CEM / R30dm mostrar contagens de pular abrangendo exon 11 ao exão 13 em comparação com CEM-C3 e CEM-R5 que não apresentem qualquer exão 12 skipping. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 8
    Figura 8: o desenho de primers para RT-PCR e Cianina verde qRT-PCR. (A) RT-PCR: pares de iniciadores de detecção de splicing diferencial de DDX5 emparelham com os exões constitutivas (exão 10 e exão 13) localizados a montante e a jusante dos exões de processamento alternativo. (B) Ensaio de qRT-PCR: Para a quantificação relativa de transcrições resultantes de eventos ignorando exão em comparação com os transcritos canónicos, o iniciador de sentido reverso liga-se quer no interior do exão ignorados (variante alternativa) oupara o limite exon11 / exon13 (variante canônica) do gene DDX5. Para a quantificação de exões que se excluem mutuamente, o iniciador de sentido inverso hibrida com o exão 11 comum a ambas as isoformas, enquanto o recozimento do iniciador para a frente, quer ao exão 9 (PKM1) ou exão 10 (PKM2). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 9
    Figura 9: RT-PCR de Validação DDX5 processamento diferencial. O gel de agarose a 1% mostra splicing diferencial do gene DDX5 em células leucémicas. O fragmento correspondente a DDX5 amplicon comprimento total (650 bp) é amplificado em todas as amostras, enquanto DDX5 ΔEx12 (430 pb) variante é amplificado em CEM-WT e CEM / R30dm amostras e o tamanho corresponde ao Exon 12 skipping. Este não é detectada em células CEM-C3 e CEM-R5, como dissuadirminado por análise de esteiras. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 10
    Figura 10: Níveis de expressão de ARNm de variantes de processamento DDX5 em células CEM. Ensaio (A) qRT-PCR. A média de níveis de expressão relativa e erro padrão da média (REL ± SEM) de duas experiências independentes. (B) Rácio de REL (± SEM) das variantes de processamento. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 11
    Figura 11: Nível de expressão do mRNAs de PKM variantes de processamento em CEM e Panc-1 células. Ensaio (A) qRT-PCR. A média de níveis de expressão relativa e erro padrão da média (REL ± SEM) de duas experiências independentes e proporção de REL das variantes de splicing para células CEM. Ensaio (B) de qRT-PCR. REL média ± SEM de duas expericias independentes e proporção de rel (± SEM) das variantes de splicing de células Panc-1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

    Aqui nós descrevemos uma nova abordagem que combina técnicas de rastreio de citotoxicidade bem estabelecidos e poderosos transcriptomic baseado em NGS análises para identificar eventos de splicing diferencial em relação à resistência aos medicamentos. Ensaios espectrofotométricos são métodos de alto rendimento convenientes e robustos para avaliar a sensibilidade de drogas em modelos in vitro de câncer e representam a primeira escolha para muitos laboratórios que realizam exames de citotoxicidade. Solução de problemas, bem como as possíveis variações para este método foram amplamente descritos em outros lugares 4,5.

    De alta capacidade genómico análises actualmente utilizado para explorar mecanismos de resistência a drogas baseiam-se principalmente na detecção de SNPs e diferenciado estimativa de genes associados com um determinado fenótipo resistente à droga de expressão. Neste estudo, descrevemos o uso de métodos de sequenciação de ARN, juntamente com condutas de bioinformática robustos para anotação precisa dos transcritos de ARNm e detecção de DIFsplicing cial. Uma característica particularmente importante do protocolo descrito, é a capacidade de identificar novas variantes de splicing entre os dois grupos de amostras com perfis de sensibilidade aos fármacos distintos. Um dos passos fundamentais para uma análise exacta e imparcial é o isolamento de RNA, que deve ser de alta pureza e integridade.

    PAD é o software que escolher entre uma série de ferramentas de bioinformática similares disponíveis (por exemplo, Cuffdiff 2, DEXseq, DiffSplice e emenda Compass) para a detecção de splicing alternativo 18. As principais características que o tornam a opção preferida é a sua precisão superior e precisão, bem como a possibilidade de identificar novos eventos. PAD gera dois tipos de análise de splicing diferencial de saída que contém: a primeira é baseada somente na contagem de junção de exões e a segunda baseia-se na contagem de junção assim como lê no alvo. Enquanto o último é o preferido para a detecção de eventos ignorando o exão, recomenda-se ausar a primeira opção para a análise dos exons mutuamente exclusivas como esta abordagem reduz o número de candidatos falsos positivos para este tipo específico de alteração splicing.

    Além disso, para as análises com foco na retenção de intron, eventos 3 'e 5' do sítio de splicing alternativos, um arquivo .gtf com íntrons anotados deve ser usado. Em última análise, a fim de reduzir a variabilidade biológica e técnica dentro dos grupos de amostra e garantir elevados verdadeiras taxas positivas, é altamente recomendável a sequência de pelo menos três repetições 34. A selecção dos candidatos de genes diferencialmente excisadas com base na saída PAD foi combinada com uma etapa de validação utilizando RT-PCR. Isso é extremamente importante para a seleção de verdadeiras variantes positivos entre um grande lista de candidatos estatisticamente significativos. O factor chave para uma validação é a precisão do desenho de oligonucleótidos e para a optimização de reacções de PCR de acordo com as normas de biologia molecular. Um cuidado especialdevem ser tomados ao projetar primers abrangendo junções exão-exão e etapas de validação adicionais, como a sequenciação dos fragmentos amplificados pelo método de Sanger, são necessários a fim de confirmar a sua especificidade.

    O splicing diferencial da DDX5 e PKM transcritos detectados por Mats representam dois exemplos de um splicing aberrante relacionados à resistência aos medicamentos. DDX5 ΔEx12 não foi expressa nas linhas de células de GC-resistente (CEM-C3 e R5), os quais foram seleccionados após exposição prolongada Dex. DDX5 ΔEx12 foi expressa na linha celular parental, mas também no subclone CEM / R30dm, que foi seleccionado relativamente à resistência ao agente quimioterapêutico MTX em vez de Dex. Em células cancerosas, PKM2 foi altamente expressa em comparação com a sua variante de splicing PKM1, mas a proporção PKM2 / PKM1 foi maior em células resistentes-Dex, como sugerido pelos resultados NGS. Este não foi observado para Panc-1 amostra comparado com o seu homólogo gemcitabina-resistente e, na verdade, este gene candidato não estava entreos eventos estatisticamente significativas na análise esteiras. Isso pode refletir o tipo de célula diferente e mecanismos de fármaco-resistência induzida pela exposição gemcitabina.

    Em conclusão, este protocolo constitui uma abordagem adequada para a descoberta de variantes de splicing que podem estar subjacentes a resistência aos medicamentos e podem ser aplicados para a utilização de células leucémicas 30 ou células de tumores sólidos 31. Uma limitação é claro que as linhas de células de tumor capturar apenas uma pequena parte da heterogeneidade do cancro. Além disso, a maioria das linhas de células foram mantidas durante muitos anos em monocamadas em meio de promoção de crescimento. Estas condições de afectar as características celulares, resultando na selecção de sub-populações que diferem dramaticamente a partir das células dos tumores primários que lhe deram origem. No entanto, muitos dos genes que estão envolvidos na resistência à droga também estão envolvidos em outras funções celulares cruciais tais como o crescimento celular e a apoptose que podem ser afectados por culturin longo prazo g em plástico. Por conseguinte, a fim de melhorar o estudo da resistência a drogas, mais os esforços devem ser dirigidos para o desenvolvimento de novos modelos pré-clínicos, tais como culturas primárias e xenoenxertos, que imitar mais de perto o in vivo microambiente do cancro, de modo a evitar alterações significativas nas características celulares causada por longos períodos de cultura de células e condições de cultura. 32 Surpreendentemente, o nosso protocolo pode ser aplicado também para células primárias, utilizando ensaios de citotoxicidade, a fim de determinar ex vivo Os valores de IC50. Outra limitação é que uma vez que existem vários mecanismos de resistência para cada uma das drogas anti-cancro, mecanismos semelhantes ou diferentes de resistência pode desenvolver-se em células expostas a tratamentos idênticos mas independentes. Portanto, uma estratégia de selecção comparativo deve envolver as selecções e análises paralelas, incluindo análises genéticas sobre variantes de splicing, das mesmas células parentais tratados com o mesmo agente de quimioterapia.

    jove_content "> abordagens adicionais para validação funcional deve ser destinada a superexpressão da variante de processamento de interesse em linhas celulares ou especificamente regular negativamente a sua expressão usando RNA de interferência ou oligonucleotídeos de comutação de emenda 33.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Sulforhodamine B Sigma-Aldrich 230162
    Trichloroacetic acid Sigma-Aldrich 251399
    CCRF-CEM ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CCL-119
    Panc-1 ATCC, Manassas, VA, USA ATCC CRL-1469
    DMEM high glucose Lonza, Basel, Switzerland 12-604F
    RPMI-1640  Gibco, Carlsbad, CA, USA 11875093
    Fetal bovine and calf serum Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 758093
    penicillin G streptomycin sulphate Gibco, Carlsbad, CA, USA 15140122
    Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Sigma Aldrich 252859
    MTT formazan Sigma Aldrich M2003
    Anthos-Elisa-reader 2001 Labtec, Heerhugowaard, Netherlands UV-Vis 96-well plate spectrophotometer
    Greiner CELLSTAR 96 well plates Greiner/Sigma M0812-100EA
    Trypsin/EDTA Solution 100 ml Lonza, Basel, Switzerland CC-5012
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 25 cm2 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82051-074
    CELLSTAR Cell Culture Flasks 75 cm3 Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 82050-856
    Phosphate Buffered Saline (NaCl 0.9%) B.Braun Melsungen AG, Germany 362 3140

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

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    Cancer Research edição 118 a quimioterapia a resistência a citotoxicidade splicing alternativo RNA-seq transcriptomics
    Usando RNA-sequenciação para detectar Novel Splice variantes relacionadas à resistência aos medicamentos em<em&gt; In Vitro</em&gt; modelos de cancro
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    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A.,… More

    Sciarrillo, R., Wojtuszkiewicz, A., Kooi, I. E., Gómez, V. E., Boggi, U., Jansen, G., Kaspers, G. J., Cloos, J., Giovannetti, E. Using RNA-sequencing to Detect Novel Splice Variants Related to Drug Resistance in In Vitro Cancer Models. J. Vis. Exp. (118), e54714, doi:10.3791/54714 (2016).

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