Introduction
Il protozoo parassita, Trypanosoma brucei, è un agente eziologico di malattie che colpiscono gli esseri umani (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animali (via Trypanosoma brucei brucei) in tutta l'Africa sub-sahariana. Si trasmette all'host mammiferi attraverso la saliva del vettore mosca tsetse. Sia umane che animali africani tripanosomiasi causano un grave onere economico in regioni endemiche, e pochi farmaci sono disponibili o in fase di sviluppo per il trattamento di entrambe le malattie. La comprensione dei meccanismi di evasione immunitaria è fondamentale per lo sviluppo di farmaci per la tripanosomiasi. Variazione antigenica del denso, Variante di superficie glicoproteina (VSG) mantello che copre il parassita è uno dei mezzi principali con cui T. brucei elude la risposta anticorpale dei mammiferi. Esistono circa 2.000 varianti del gene VSG nel genoma tripanosoma, ma solo uno è trascritto in un dato momento da una delle ~ 15 expressiti di Sion. 'Commutazione' del VSG espresso può avvenire sia con la copia di un gene VSG nel sito espressione attiva, o attraverso l'attivazione trascrizionale di un sito espressione precedentemente silenziosa (rivisto in 1).
Anche se molto lavoro è stato dedicato alla comprensione variazione antigenica in T. brucei, i fattori che influenzano la frequenza di commutazione sono ancora poco conosciuti. Gli studi finora sono stati ostacolati dal fatto che, mentre la commutazione avviene stocasticamente in vitro, frequenze di commutazione sono molto bassi, dell'ordine di 1 a circa 10 6 cellule 2. Questo rende difficile misurare se un fattore dato aumenta o diminuisce la frequenza di commutazione, poiché commutazione è difficile da rilevare in primo luogo. Prima del 2009, i metodi per isolare switchers in una data popolazione sono stati lungo e laborioso. Questi passaging trypanosomes attraverso topi immunizzati contro il VSG dominante e quindi che raccolgono le cellule inclusiil giorno dopo 3 o contando centinaia di cellule mediante immunofluorescenza 4,5. Un'altra strategia si basa sulla selezione per la resistenza ai farmaci per isolare switcher 6. Perché trypanosomes africani coltivate in vitro sono in genere costituiti da una grande popolazione che esprime una variante importante, e una popolazione molto più piccola di switcher che esprimono varianti alternative, si fa riferimento alla grande variante in questo documento come dominante, VSG partenza. Così facendo, abbiamo in nessun modo vogliamo implicare che questo importante variante ha una maggiore fitness di altre varianti nella popolazione.
Qui si descrive un metodo che può attendibilmente misurare il numero di trypanosomes esprimere un VSG non dominante in una data popolazione in 3 - 4 ore. Questo metodo è particolarmente utile quando si vuole verificare se un dato manipolazione genetica o trattamento farmacologico aumenta il numero di celle commutate in una popolazione. Invece di liberare la popolazione di cellule che esprimono il faiminant, a partire VSG attraverso le droghe o con mezzi immunologici, queste cellule vengono eliminati dal primo rivestimento con sfere magnetiche accoppiate ad anticorpi contro il VSG dominante e poi isolandoli su una colonna magnetica. La popolazione commutata viene poi raccolto in flusso continuo e trattata ancora con un fluoroforo anticorpo marcato anti-VSG per identificare contaminanti. La quantificazione è ottenuta aggiungendo un numero definito di conteggio sfere assoluti ad ogni campione in modo che il rapporto di perline di cellule può essere determinato e utilizzato per quantificare il numero di commutatori nella popolazione 7.
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Protocol
NOTA: Durante la procedura, è necessario mantenere le cellule in ghiaccio. supporti a freddo dovrebbero essere utilizzati in tutto.
Raccolta 1. Esempio
- Grow Lister 427 tripanosomi ceppo sangue per una densità di 0,5 - 1 milione / ml. È meglio iniziare culture con un piccolo numero di parassiti. Spin down 50 x 10 6 cellule / campione per 10 min a 1500 x g. Assicurarsi di lasciare 1 x 10 6 cellule in coltura per poi utilizzare i controlli di anticorpi come positivi e negativi.
NOTA: Questo protocollo può essere utilizzato anche su trypanosomes isolate dal sangue animale (vedi la discussione per i dettagli). - Pipetta o versare fuori la maggior parte del surnatante (lasciare circa 750 ml). Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Spin cellule a 4 ° C per 4 min a 5200 xg in una microcentrifuga e rimuovere il surnatante.
2. L'etichettatura magnetica
- Risospendere le cellule in 150 microlitri terreno di coltura (HMI-9 with siero per esempio) + anticorpo anti-VSG primaria alla diluizione appropriata.
NOTA: L'anticorpo anti-VSG è fatta in casa e utilizzato a una diluizione 1:50. È importante utilizzare un anticorpo primario anti-VSG che non è etichettato con un fluoroforo. - cellule Vortex utilizzando un vortice adattatore 60 a velocità 6 - 8 in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Lavare con 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero.
- Spin a 4 ° C per 4 min a 5200 xg e aspirare il surnatante. Lavare con 1 ml di HMI-9 con il siero e spin come sopra. Aspirare il surnatante. Risospendere il pellet in 100 ml di HMI-9 con siero.
- Aggiungere 110 ml di cellule magnetiche attivate ordinamento microsfere (MSC). Usa anti-topo, anti-coniglio, o perle anti-biotina come appropriato per l'anticorpo anti-VSG primaria. Mescolare bene. cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min.
- Mentre le cellule sono vortex, impostare una separazione colonna / campione magnetico attivato su un magnete di separazione. Assicuratevi di avere un receptacle (usiamo una provetta da centrifuga da 15 ml) sotto la colonna per raccogliere il flusso continuo. Sistemare il dispositivo in una stanza fredda.
- Aggiungere 2 ml di HMI-9 con il siero di colonna Prime. Dopo innesco posto un tubo da centrifuga da 15 ml sotto la colonna per raccogliere flusso continuo di ciascun campione.
- Dopo il 10 min di incubazione nel passo 2.4, aggiungere 800-1000 ml freddo HMI-9 con siero. Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l'anticorpo non legato. Lavare con 1 ml di HMI-9 con siero e ripetere lasciando 100 ml di surnatante.
- Flick la provetta vigorosamente ed ispezionare visivamente il tubo per assicurarsi che il pellet è completamente risospeso. Aggiungere 1 ml di HMI-9 con siero e pipetta su e giù per fare in modo che le cellule sono ben risospese.
3. La separazione magnetica
- Assicurarsi che le colonne sono preparati come descritto sopra. Applicare le cellule a colonna. Raccogliere flow-through con cellule esprimenti il VS non dominanteG. 1 ml di terreno + trypanosomes prende tipicamente 6 - 7 min a fluire attraverso la colonna.
- Lavare 2x con 1 ml di HMI-9 con siero raccogli flow-through nella stessa provetta come al punto 3.1.
- Dividere flow-through (3 ml) in due provette da 1,5 ml microcentrifuga.
NOTA: Questi possono essere combinati successivamente o mezzo possono essere utilizzati per isolare l'RNA, etc. - Rimuovere colonna dal magnete. Aggiungere 3 ml di HMI-9 con il siero di colonna e immergersi colonna in un tubo da 15 ml centrifuga per ottenere cellule che esprimono la partenza, dominante VSG. Togliere 300 ml di materiale eluito per una successiva analisi. Conservare queste cellule in ghiaccio.
- Per l'uso come un segnale positivo e un controllo negativo, prendere circa 1 milione di cellule dalla cultura di partenza di cellule di controllo in crescita a 37 ° C (quelli che non prevede di cambiare frequentemente) e di pipetta in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
NOTA: cellule di controllo positive saranno colorate con l'anticorpo fluoroforo marcato nel passaggio 4.1. Negativo cellule di controllo remanella macchia in tutto il resto del protocollo. - campioni Spin flow-through e campione di controllo degli anticorpi positivo a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante.
NOTA: Un'altra 300 microlitri aliquota di cellule eluite può essere usato come controllo positivo per anti-VSG colorazione.
4. La colorazione per identificare contaminanti e commutatori
- campioni flow-through Risospendere e cellule di controllo positivo in 100 ml di HMI-9 con siero + primaria,, anti-VSG anticorpi fluoroforo marcato alla diluizione appropriata.
NOTA: L'anticorpo anti-VSG marcato è fatta in casa ed utilizzato a una diluizione di 1: 1000. Il fluoroforo marcato, anti-VSG può essere dalla stessa fonte, come l'anticorpo non marcato nella separazione MACS step.There dovrebbe essere di 3 ml di campione a flusso continuo in due provette da microcentrifuga seguenti step 3.5. - Per analizzare tutte le flow-through mediante citometria di flusso, unire il pellet in due provette da microcentrifuga mentre re-susin attesa dei campioni in 100 ml di HMI-9 con siero di anticorpi anti-+ VSG. Mescolare bene.
- cellule Vortex in una camera fredda a 4 ° C per 10 min. Aggiungere 800 - 1.000 ml freddo HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante per rimuovere l'anticorpo non legato.
- Lavare le cellule con 1 ml di HMI-9 con siero. campioni Spin a 4 ° C per 4 minuti a 5200g e rimuovere il surnatante. Durante questo ultimo giro, spin down the-campioni eluiti dal punto 3.4 e il campione di controllo negativo.
- Risospendere tutto il flusso-through e campioni eluiti in: 148,5 ml HMI-9 con siero, 25 microlitri conteggio sfere assoluto e 1,5 ml ioduro di propidio colorazione soluzione (175 ml in totale). Risospendere campioni di controllo degli anticorpi positivi e negativi in 175 ml HMI-9 con siero. Assicurarsi di registrare il numero di conteggio sfere assoluti / 25 ml per il lotto usati.
- Eseguire tutti i campioni attraverso un citofluorimetro e raccogliere i dati. Le cellule morte macchiare come PI
- Calcola le frequenze con citometria a flusso di dati di commutazione.
NOTA: Per le istruzioni su come calcolare frequenze di commutazione, si prega di fare riferimento al file supplementare citometria a flusso Calculations.docx e Tabella 1.
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Representative Results
Il metodo descritto qui è stato utilizzato per dimostrare che le interruzioni doppio filamento all'interno del sito espressione VSG aumentato il numero di switchers in una popolazione 8. Qui, vi mostriamo i risultati rappresentativi di una popolazione di tripanosomi che sono stati indotti in modo simile per generare un doppio filamento Break presso il sito di espressione. Confrontiamo questi trypanosomes a quelli che non sono stati indotti a generare una pausa doppio filamento. La Figura 1 mostra il flusso rappresentante citometria trame da cellule non-indotte e indotte raccolti nel flow-through dalla colonna di ordinamento delle cellule attivate magnetica. Per questo particolare esperimento il VSG a partire dominante era VSG2. I pannelli di sinistra della figura 1A mostrano in avanti e scatter laterale, che consente di porte da trarre intorno alle perle di conteggio assoluto e le cellule che mostrano una firma in avanti e scatter laterale che è caratteristico di cellule vive. Si noti che Gates puòessere disegnato per includere più cellule perché le cellule morte possono essere eliminati con PI colorazione; tuttavia, il cancello deve essere mantenuto lo stesso per tutti i campioni. I pannelli di destra della figura 1A mostrano solo quelle cellule che rientrano nel cancello 'Live' sui pannelli a sinistra. Le cellule che macchiano positivamente per PI (Q1 e Q2) sono le cellule morte. Le cellule che macchiano positivamente per il VSG dominante e negativo per PI in Q3 sono contaminanti. Le cellule che macchiano negativamente sia per PI e il VSG dominante nel Q4 sono cellule vive che hanno cambiato. Si può osservare che la percentuale di contaminanti in Q3 è inferiore per quelle cellule dove una rottura doppio filamento è stata indotta. Tuttavia, le percentuali in Q3 non possono essere utilizzate per dedurre se ci sono più commutatori in una data popolazione. Solo confrontando il rapporto tra il numero di celle in Q4 al numero di perline collezionati che si può calcolare frequenze di commutazione. Tabella 1 mostra i numeri ottenuti dal flotrame citometria W e il metodo per calcolare gli switcher per cento in queste popolazioni. Questi calcoli sono stati effettuati su 3 campioni biologici per ottenere le frequenze di commutazione osservate mostrata in Figura 1B. Il livello di commutazione stocastico in vitro è piuttosto basso, come calcolato qui a una media di 9,53 x 10 -5, mentre induce un risultato pausa in 1 - 6 x 10 -3 cellule che sono passati alla VSG non dominante.
Figura 1. L'isolamento e la quantificazione di Switched trypanosome popolazioni. (A) citometria a flusso che mostra frazioni della trypanosomes nella frazione di flusso passante seguente selezione dei non commutatori su una colonna di ordinamento di cellule attivate magnetica. Una popolazione di cellule con un indotto I-SCEI rottura doppio filamento viene confrontato con una popolazione di cellule senza bre indottaak. (B) Calcolato frequenze di commutazione per le cellule che sono o non sono stati indotti con un I-SCEI rottura a doppio filamento. Il numero sulla trama rappresenta i risultati di un test T spaiato a due code. Le barre di errore rappresentano SD. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Supplemental file 1. Calcoli citometria a flusso. Cliccate qui per scaricare questo file.
Tabella 1. Calcolo delle frequenze di commutazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
Rispetto alla tecnica sperimentale, il componente più critico del protocollo è mantenere tutti i campioni fredda. Trypanosomes molto rapidamente internalizzare anticorpo legato alla loro superficie 9, ma questo processo è motilità dipendente, e non influenzano il dosaggio finché le cellule sono mantenuti a 4 ° C. Tutti i campioni devono essere sempre tenuti in ghiaccio, e pipettaggio dovrebbero essere fatte rapidamente per ridurre al minimo l'esposizione all'ambiente C di laboratorio di 25 °. Freddo HMI-9 con il siero dovrebbe essere disponibile all'inizio della sperimentazione e dovrebbe essere tenuto in ghiaccio per tutto. Isolamento dei trypanosomes eseguendoli sulla colonna deve essere fatto in una stanza fredda, in quanto richiede 5 - 7 min per eseguire una campione 1 ml attraverso la colonna. Se ci sono più campioni di unità di separazione magnetica disponibili, isolamento magnetico può essere fatto in sequenza, finché campioni non attivamente separati vengono tenuti in ghiaccio.
E 'anche importante che i campioni siano molto ben af mistater l'ultimo lavaggio dopo l'incubazione con le microsfere e prima di isolamento sul magnete. Questo può essere realizzato muovendo aggressiva della provetta o vortex luce. N pellet o grumi di cellule devono essere visibili prima dell'aggiunta del campione alla colonna di separazione, che può essere controllato osservando il livello di microscopia ottica. Se grumi sono presenti, il livello di contaminazione del campione flusso continuo di cellule che esprimono il VSG dominante è solitamente molto superiore desiderabile. Quando si esegue il calcolo per il numero di commutatori nel campione al termine del protocollo, è importante prendere in considerazione se tutto il flusso continuo è stato utilizzato per l'analisi citofluorimetrica, o se metà è stata utilizzata. Se è stata utilizzata solo la metà, il numero totale di commutatori calcolati deve essere moltiplicato per 2.
Quando si rimuove il surnatante durante le operazioni di lavaggio, non è necessario pipetta fuori ogni ultima goccia, e tipicamente 15 - 25 microlitri sonosinistra che circonda il pellet di cellule. Ciò è particolarmente critico durante le fasi finali di colorazione e lavaggio, perché a questo punto pellet vengono raramente nei campioni flow-through perché ci sono così pochi commutati cellule.
Mentre la finale macchia anti-VSG viene tipicamente eseguita con purificata, anticorpo anti-VSG fluoroforo marcato, il primo anti-macchia VSG prima dell'isolamento magnetico può essere fatto con l'anticorpo purificato o siero. Abbiamo usato anche bioreattore surnatante derivato da ibridomi che esprimono anticorpi anti-VSG. Indipendentemente, il materiale utilizzato per la macchia iniziale deve essere titolato per assicurare una buona separazione delle cellule che fanno o non esprimono dominante, VSG partenza.
È tipico per la popolazione di cellule nel flusso continuo di essere contaminati con cellule esprimenti il VSG dominante. Mentre questa contaminazione dovrebbe essere minimo, nella nostra esperienza è raro che la popolazione sia completamente privo di cellule esprimonoing il VSG dominante. E 'anche importante notare che le cellule che sono passati attraverso la procedura di isolamento non si colorano con la luminosità con anti-VSG anticorpi come quelli che non sono passati attraverso la procedura. Ipotizziamo che due cose potrebbero tenere conto di questa differenza. La prima è che la filatura tripanosomi porta a spargimento di VSG, e ci sono molti giri coinvolti nella procedura di isolamento. Questo sarebbe previsto per diminuire l'intensità del segnale per la finale macchia dell'anti-VSG. La seconda è che il primo passo del protocollo prevede colorazione con un anticorpo anti-VSG primario. Se gli epitopi riconosciuti dagli anticorpi utilizzati in questa prima fase sono uguali o occludono gli epitopi riconosciuti dagli anticorpi nella macchia finale, ci si aspetterebbe l'intensità del segnale deve essere inferiore se fosse impiegato un solo anticorpo. Per questo motivo è importante per titolare l'anticorpo che viene utilizzato nella fase finale, tale per cui il segnale da una cella positivamente macchiato è approssimativamente dueordini di grandezza superiore a quello di una cella macchiato negativamente. In questo modo, anche se l'intensità del segnale da una cellula colorazione positiva è ridotta in cellule che hanno subito la procedura di isolamento, queste cellule positive sarà comunque ben separato dalle cellule negative del terreno citometria a flusso. Se si utilizza l'auto-compensazione, i campioni di controllo macchia singoli dovrebbero essere preparati. Gli anticorpi che abbiamo generato sono disponibili per l'acquisto presso il Memorial Sloan Cancer Center monoclonali struttura anticorpale. Abbiamo avuto il miglior successo con l'utilizzo di anticorpi IgG monoclonale non marcato. Abbiamo effettuato il protocollo con anticorpi policlonali VSG, ma anticorpi policlonali può talvolta riconoscere altri VSGs anticorpi monoclonali così sono preferiti. VSG identità può essere determinata da cDNA sequenziamento VSG generato da amplificazione di sequenze conservate nel VSG 3'UTR e il leader impiombato. Un anticorpo particolare può essere testato per la specificità in precedenza isolato commutatacellule Chi è VSG identità è stata determinata come appena descritto.
Il protocollo qui presentato ha una serie di vantaggi. Può essere utilizzato sia per isolare commutatori per un'analisi successiva e per quantificare il numero di commutatori in una data popolazione. Può anche essere utilizzata per isolare una particolare variante di interesse, fintanto che un anticorpo è disponibile per tale variante. E 'anche possibile effettuare questo protocollo utilizzando trypanosomes isolati da animali, a condizione che i globuli rossi vengono eliminate con perline anti-Ter119 rivestito-magnetici secondo il protocollo del produttore. Non abbiamo testato il limite inferiore per il numero di tripanosomi richiesti, ma abbiamo eseguito con successo il protocollo utilizzando 2,5 - 10 milioni di tripanosomi da 250 ml di sangue. Infine, il protocollo può essere utilizzato in combinazione con analisi fluttuazione per ottenere la frequenza di commutazione in una data popolazione.
La procedura di isolamento è molto fAST, prendendo 3 - 4 ore dall'inizio alla fine a seconda del numero di campioni, e quindi è più efficiente rispetto ai metodi precedenti che richiedevano prima immunizzazione dei topi o ceppi specializzati contenenti marcatori di resistenza ai farmaci. Il metodo è limitato dal fatto che sono richiesti anticorpi contro il VSG partendo, tuttavia. Senza tali reagenti, un metodo alternativo, come VSG-Seq potrebbe essere una scelta più appropriata per valutare quale VSGs vengono espressi in una data popolazione 10.
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Acknowledgments
Vorremmo riconoscere George Cross per consigli generali sulla biologia trypanosome. Questo lavoro è stato supportato anche da un Bill e Melinda Gates Foundation GCE concessione per DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1.325.261) per MRM e un NIH / NIAID (grant # AI085973) al FNP. Ringraziamo Galadriel Hovel-Miner per l'uso del ceppo che contiene il sito del gene e il riconoscimento I-SCEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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- Lamont, G. S., Tucker, R. S., Cross, G. A. Analysis of antigen switching rates in Trypanosoma brucei. Parasitology. 92 (Pt 2), 355-367 (1986).
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- Turner, C. M., Barry, J. D. High frequency of antigenic variation in Trypanosoma brucei rhodesiense infections. Parasitology. 99 (Pt 1), 67-75 (1989).
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- Engstler, M., Pfohl, T., et al. Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes. Cell. 131 (3), 505-515 (2007).
- Mugnier, M. R., Cross, G. A. M., Papavasiliou, F. N. The in vivo dynamics of antigenic variation in Trypanosoma brucei. Science. 347 (6229), 1470-1473 (2015).
