Introduction
원생 동물 기생충, 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei는 사하라 사막 이남의 아프리카 전역 (트리파노소마 (Trypanosoma) brucei brucei를 통해)과 동물 (트리파노소마 (Trypanosoma) brucei의 gambiense 및 트리파노소마 (Trypanosoma) brucei의 rhodesiense를 통해) 인간에 영향을 미치는 질병의 원인이되는 에이전트입니다. 이것은 체체 파리 벡터의 타액을 통해 포유 동물 숙주에 전달된다. 인간과 동물 아프리카 트리파노소마 증은 모두 발병 지역에서 심각한 경제적 부담을 야기하고, 몇 가지 약물을 사용할 수 또는 두 질병을 치료하기 위해 개발에 있습니다. 면역 회피의 메커니즘을 이해하는 것은 트리파노소마 증에 대한 약물의 개발을위한 중요합니다. 기생충을 포함 밀도, 변형 표면 당 단백질 (VSG) 코트의 항원 변화는 주요 수단 중 하나입니다에 의해 T. brucei는 포유류 항체 반응을 기피한다. ~ 15 EXPRES을 VSG 유전자 약 2,000 변형은 트리파노소마 게놈에 존재하지만, 단지 하나의 하나에서 임의의 주어진 시간에 전사되는시온 사이트. 발현 VSG의 '전환'는 활성 발현 사이트에 VSG 유전자를 복사하여, 또는 (1 검토) 이전에 침묵 식 사이트의 전사 활성화에 의해 하나 발생할 수 있습니다.
많은 작업은 T.에 대한 이해 항원 변화에 헌신하고있다지만 brucei, 스위칭 주파수에 영향을 미치는 요인은 여전히 저조한 이해된다. 현재까지 연구 전환 체외에서 확률 적으로 발생하지만, 스위칭 주파수는 약 106 개 세포를 2 일 정도의 매우 낮다는 사실에 의해 저해되었다. 이 전환은 처음에 검출하기 어렵다 이후 소정 계수가 증가하거나, 스위칭 주파수를 감소 여부를 측정하는 것이 곤란한다. 2009 년 이전에, 주어진 인구 스위처를 분리하는 방법은 긴했고, 노동 집약적. 이 포함 된 지배적 인 VSG 예방 접종을 마우스를 통해 트리 파노 솜을 계대 후 수확 세포하루 이상 3, 면역 4,5에 의해 세포의 수백 계산. 약물 내성이 스위처 (6)를 분리하는 또 다른 전략은 선택에 의존한다. 시험 관내에서 재배 아프리카 트리 파노 솜은 일반적으로 하나의 주요 변형 및 대체 변형을 표현 스위처 훨씬 작은 인구를 표현하는 많은 인구로 구성되어 있기 때문에, 우리는 지배, 시작 VSG 본 논문을 통해 주요 변형을 참조하십시오. 이 과정에서 우리는 결코이 주요 변형 인구의 다른 변종보다 큰 체력을 가지고 있다는 것을 의미하고 싶습니다.
4 시간 - 여기를 확실하게 3에 주어진 집단에서 비 우세 VSG를 나타내는 트리 파노 솜의 개수를 측정 할 수있는 방법을 설명한다. 이 방법은 하나의 주어진 유전자 조작 또는 약물 치료 집단을 전환 세포의 수를 증가 여부를 확인하고자 할 때 특히 유용하다. 대신에 할 일을 발현하는 세포의 인구를 면하게의minant는 약물을 통해 VSG를 시작하거나 면역에 의해,이 세포는 먼저 자기 열을 분리 한 다음 지배적 VSG에 대해 항체에 결합 자석 구슬로 코팅에 의해 제거된다. 스위치드 인구는 플로우를 통해 수집하고, 오염 물질을 식별하기위한 형광 표지 항 VSG 항체 다시 염색된다. 정량 세포 구슬의 비를 구한 인구 7 스위처 수를 정량화하는데 사용될 수 있도록 각각의 샘플 절대 계수 비드 정의 번호를 추가함으로써 달성된다.
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Protocol
주 : 절차를 통해,이 얼음에 세포를 유지하는 것이 필요하다. 콜드 매체는 또한 전체에 사용되어야한다.
1. 샘플 수확
- 100 만 / ㎖ - 0.5의 밀도에 리스터 427 변형 혈류의 trypanosomes에 성장. 이 기생충의 소수 문화를 시작하는 것이 가장 좋습니다. 1500 x g에서 10 분 동안 50 × 106 세포 / 샘플을 스핀. 이상과 같은 긍정적이고 부정적인 항체 컨트롤을 사용하기위한 문화 1 × 10 6 세포를 남겨해야합니다.
참고 :이 프로토콜은 동물의 피 (자세한 내용은 설명을 참조)에서 분리 trypanosomes에 사용할 수 있습니다. - 피펫 또는 상층 액의 대부분을 부어 (약 750 μl를 떠나). 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 세포를 전송합니다.
- 미세 원심에서 5,200 XG에서 4 분 동안 4 ° C에서 세포를 스핀과 상층 액을 제거합니다.
2. 자기 라벨링
- 를 Resuspend 세포 150 ㎕를 배지에서 (HMI-9 위스콘신적절한 희석 예를 들어 제 혈청) + 기본 안티 VSG 항체.
참고 : 안티 - VSG 항체 집에서 만든 1시 50분의 희석에 사용된다. 이는 형광으로 표지되지 않은 기본 항 VSG 항체를 사용하는 것이 중요하다. - 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에서 8 - 속도 6에서 소용돌이 어댑터-60을 사용하여 소용돌이 세포. 1000 μl의 차가운 HMI-9 혈청 - 800 씻으십시오.
- 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 원심과 뜨는을 대기음. 혈청 1ml를 HMI-9로 세척하고, 상기 회전. 뜨는을 대기음. 혈청와 HMI-9 100 ㎕의를 Resuspend 펠릿.
- (MSC) 마이크로 비드를 정렬 자기 활성화 셀의 110 μl를 추가합니다. 기본 안티 VSG 항체에 적절한 항 - 마우스, 항 - 토끼, 또는 안티 - 비오틴 구슬을 사용합니다. 잘 섞다. 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에 소용돌이 세포.
- 세포가 텍싱하는 동안, 분리 자석에 하나의 자기 활성화 분리 컬럼 / 샘플을 설정합니다. 재를해야합니다컬럼 아래 ceptacle (우리는 15 mL의 원심 분리 튜브를 사용하여)를 통해 유동을 수집한다. 추운 방에서 장치를 설정합니다.
- 주요 항목에 대한 혈청 HMI-9의 2 ML을 추가합니다. 흐름을 통해 각각의 샘플에서 수집 열에서 15 ML의 원심 분리기 튜브 장소를 프라이밍 후.
- 단계 2.4에서 10 분 부화 후, 800-1,000 μl의 차가운 HMI-9 혈청을 추가합니다. 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 원심과 뜨는을 제거 언 바운드 항체를 제거합니다. 혈청 및 반복 상층 액 100 μl를 떠나와 HMI-9의 1 ㎖로 세척 할 것.
- 적극적으로 시각적으로 원심 분리기 튜브를 가볍게 펠렛 완전히 재현 탁되어 있는지 확인하기 위해 튜브를 검사합니다. 세포가 잘 재현 탁되어 있는지 확인 위아래로 혈청 피펫 HMI-9의 1 ML을 추가합니다.
3. 자기 분리
- 상술 한 바와 같이 열 준비가 끝났다되어 있는지 확인합니다. 열에 셀을 적용합니다. 세포를 비 - 지배적 인 VS를 표현하는 관류 모아서컬럼을 통과하기 위해 7 분 - G. 1 매체 ml의 + 트리 파노 솜은 일반적으로 6 걸립니다.
- 워시 1 ml의 HMI-9 혈청과 함께 배와 단계 3.1에서와 같이 흐름을 통해 동일한 튜브를 수집합니다.
- 나누기 관류 (3 mL) 중 두 가지를 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에.
주의 : 이러한 나중에 결합 될 수 있거나 절반 등의 RNA를 분리하는데 사용될 수있다 - 자석에서 열을 제거합니다. 열에 혈청 HMI-9 3 ㎖를 추가하고 시작, 지배 VSG를 발현하는 세포를 얻기 위해 15 ㎖의 원심 분리기 튜브에 열을 뛰어. 나중에 분석을 위해 용출 물질의 300 μl를 제거합니다. 얼음이 세포 보관하십시오.
- 양성 및 음성 대조군으로 사용하기 위해, 37 ℃에서 성장 대조군 세포의 시작 배양에서 약 1 백만 셀을 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브로하고 피펫 (그 자주 전환 할 것으로 예상되지 않음).
참고 : 양성 대조군 세포 단계 4.1에서 형광 표지 항체로 염색됩니다. 대조군 세포 REMA프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 흠이다. - 스핀 흐름을 통해 샘플 및 5,200 XG에 4 분 4 ° C에서 긍정적 인 항체 제어 샘플 및 상층 액을 제거합니다.
주 : 용출 다른 셀 300 μL 분취 안티 VSG 염색에 대한 양성 대조군으로 사용할 수있다.
4. 염색은 오염 물질 및 스위처를 확인하는
- 재현 탁 플로우 스루 샘플 100 ㎕ HMI -9- 적절한 희석 혈청 + 일차, 형광 표지 된, 항 VSG 항체 양성 대조군 세포.
참고 : 표지 항 VSG 항체 집에서 만든 1의 희석에 사용됩니다 : 1000. 형광 표지는, 안티 VSG는 step.There 단계 3.5 다음과 같은 두 가지의 microcentrifuge 튜브의 흐름을 통해 샘플의 3 ㎖ 있어야 MACS 분리에 레이블이없는 항체와 같은 소스에서 할 수있다. - 다시 SUS 동안 두 마이크로 원심 튜브의 펠렛을 결합, 유동 세포 계측법에 의해 관통 흐름 모두를 분석100 ㎕ HMI-9 세럼 + 안티 VSG 항체의 샘플을 보류. 잘 섞다.
- 10 분 동안 4 ° C에서 추운 방에 소용돌이 세포. 1000 μl의 차가운 HMI-9 혈청 - 800을 추가합니다. 4 분 4 ° C에서 회전 샘플 상층 액 5,200 XG에 제거는 언 바운드 항체를 제거합니다.
- 혈청와 HMI-9의 1 ml의 세포를 씻으십시오. 4 분 4 ° C에서 회전 샘플 상층 액 5,200 XG에 제거합니다. 이 마지막 스핀 동안 단계 3.4과 음성 대조군 시료에서 용출-샘플을 스핀 다운.
- 148.5 μL HMI-9 혈청 25 ㎕를 절대 계산 구슬과 1.5 μL 프로피 디움 요오드 용액 (175 μl의 총을) 염색 : 모든 흐름 통해 용출 샘플을 재현 탁. 175 μL에 긍정적이고 부정적인 항체 제어 샘플을 재현 탁 HMI-9 혈청. 절대 계산 비즈 / 사용되는 특정 많은 25 μL의 수를 기록해야합니다.
- 사이토의 흐름을 통해 모든 샘플을 실행하고 데이터를 수집합니다. PI로 얼룩 죽은 세포
- 데이터 유동 세포 계측법을 사용하여 스위칭 주파수를 계산합니다.
주 : 스위칭 주파수를 계산하는 방법에 대한 자세한 내용은 보충 파일을 참조하십시오 유동 세포 계측법 Calculations.docx 표 1.
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Representative Results
여기에 기재된 방법은 인구 8 스위처의 수를 증가 VSG 발현 사이트 내에서 해당 이중 가닥 나누기를 입증 하였다. 여기서는 마찬가지로 발현 부위에 이중 가닥 브레이크를 생성하도록 유도 된 트리 파노 솜의 인구에서 대표적인 결과를 나타낸다. 우리는 이중 가닥 휴식을 생성하는 유도되지 않은 것과 이러한 trypanosomes에 비교. 1은 흐름을 통해 자기 활성화 셀 정렬 열에서 수집-유엔 유도 유도 된 세포에서 플롯 세포 계측법 대표 흐름을 보여줍니다. 이 특정 실험 지배적 시작 VSG는 VSG2했다. 도 1a의 좌측 패널은 앞으로 보여 게이트 살아있는 세포의 특징 인 전방 및 측면 산란 서명을 보여 절대 계산 구슬과 세포 주위에 그려 질 수 있도록 측면 산란. 참고 게이트 수죽은 세포를 PI 염색법으로 제거 할 수 있기 때문에 더 많은 세포를 포함하는 그릴; 그러나, 상기 게이트는 모든 샘플에 대해 동일하게 유지되어야한다. 그림 1A의 오른쪽 패널은 왼쪽 패널의 '라이브'게이트 내에 만 셀을 보여줍니다. PI (Q1과 Q2)에 대해 긍정적으로 얼룩 세포는 죽은 세포이다. Q3에 PI에 대한 긍정적 지배적 VSG에 대한 부정적인 얼룩 세포는 오염 물질이다. 모두 PI와 4 분기의 지배적 VSG에 대한 부정적 얼룩 세포 전환 한 살아있는 세포이다. 하나는 Q3에서 오염 물질의 비율은 이중 가닥 브레이크 유도 된 그 세포에 대한 낮다는 것을 관찰 할 수있다. 그러나, Q3의 비율은 주어진 모집단 더 스위처가 있는지 여부를 추정하기 위해 사용될 수 없다. 그것은 오직 하나의 스위칭 주파수를 계산할 수 수집 비드의 수 Q4 세포 수의 비율을 비교한다. 표 1은 FLO에서 얻은 수치를 나타낸다w 계측법 플롯과 방법은 이들 개체군의 백분율 스위처를 계산한다. 이러한 계산은도 1B에 표시된 관찰 스위칭 주파수를 획득하기 위해 3 생물학적 시료에서 수행 하였다. 도미넌트가 아닌 VSG로 전환 한 6 × 10-3 세포 - 1 브레이크 결과를 유도하면서, 9.53 X 10-5 평균 여기 계산 체외 스토캐스틱 전환 수준은 매우 낮다.
그림 1. 분리 및 전환 트리파노소마 인구의 정량화. (A) 자기 활성화 셀 정렬 열에 비 스위처의 선택 다음 흐름을 통해 부분에 trypanosomes에의 분수를 보여주는 유동 세포 계측법. 유도 I-SCEI 이중 가닥 휴식과 세포의 인구는 유도 BRE없이 세포의 인구와 비교된다AK. (B)이 있거나 I-SCEI 이중 가닥 브레이크로 유도되지 않은 셀 스위칭 주파수를 계산. 플롯 수는 양측, 짝 t 검정의 결과를 나타낸다. 오류 바 SD를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1. 유동 세포 계측법 계산. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
표 스위칭 주파수 1. 계산. 이 테이블의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
실험 방법에 대하여, 프로토콜의 가장 중요한 요소는 차가운 모든 샘플을 유지하고있다. 트리 파노 솜은 매우 빠르게 그 표면 (9)에 결합 된 항체를 내재화하지만,이 프로세스는 운동성 의존하고, 셀 4 ° C에서 유지되는 한 상기 분석에 영향을 미치지 않는다. 모든 샘플은 항상 얼음에 보관해야하고, 피펫은 25 ° C 랩 환경에의 노출을 최소화하기 위해 신속하게 수행해야합니다. 콜드 HMI -9- 혈청은 실험의 시작에서 사용할 수 있어야하고 얼음에 걸쳐 유지되어야한다. 컬럼을 통해 1 ml의 샘플을 실행하는 데 7 분 - 그것은 5 걸립니다 열 이상을 실행하여 trypanosomes에의 분리, 추운 방에서 수행해야합니다. 가능한 자기 분리 장치보다 샘플이있는 경우 적극적으로 분리되지 않는 샘플을 얼음에 보관 될 때, 자기 격리만큼 순차적으로 수행 될 수있다.
이 샘플이 잘 혼합 된 AF 것이 또한 중요하다자석의 마이크로 비드 전에 분리에 함께 배양 한 다음 마지막으로 세척 터. 이는 원심 분리 튜브 또는 광 텍싱 적극적 긋기 의해 달성 될 수있다. 세포의 어떠한 펠렛 또는 덩어리 전에 광학 현미경 수준에서보고 확인할 수 있습니다 분리 컬럼에 시료를 첨가 볼 수 없습니다. 덩어리가 존재하는 경우, 지배 VSG를 발현하는 세포의 관류 시료 오염의 수준은 일반적으로 바람직한 것보다 훨씬 높다. 프로토콜의 끝에서 샘플 스위처 수에 대한 계산을 수행 할 때, 모든 관류는 유세포 분석을 위해 사용되었는지 여부를 고려하는 것이 중요하거나 반 사용되었는지. 절반 만이 사용 된 경우, 스위처 계산들의 총 수는 2로 곱해질 것이다.
세척 단계에서 상등액을 제거 할 때마다 마지막 한 방울을 피펫 필요는없고, 일반적으로 15-25 μL은세포 펠렛을 둘러싸 떠났다. 이 때문에 몇 가지 세포를 전환하기 때문에이 시점에서 펠릿은 거의 흐름을 통해 샘플에서 볼 수없는 때문에, 염색 및 세탁의 최종 단계 중 특히 중요하다.
최종 항 VSG 얼룩은 통상적으로 정제, 형광 표지 항 VSG 항체로 수행되지만, 종래의 자기 분리의 첫 번째 항 VSG 염색은 정제 된 항체 또는 혈청으로 수행 될 수있다. 우리는 또한 안티 VSG 항체를 발현하는 하이 브리 도마에서 유래 생물 반응기의 상층 액을 사용했다. 그럼에도 불구하고, 초기 얼룩에 사용되는 재료는 수행하거나 지배, 시작 VSG을 표현하지 않는 세포의 좋은 분리를 보장하기 위해 적정해야합니다.
이 지배적 VSG를 발현하는 세포로 오염 될 관류의 세포 집단에 대한 전형적인 것이다. 이 오염을 최소화해야하지만 인구가 발현하는 세포의 완전히없는 상태가 될 때까지, 우리의 경험은 드물다지배적 VSG를 보내고. 이 분리 절차를 통과 한 세포 과정을 통해 없었던 것과 같은 항 VSG 항체 등의 밝은 착색되지 않도록주의하는 것이 중요하다. 우리는 두 가지가이 차이를 설명 할 수 있다는 가설. 첫 번째는 트리 파노 솜 회전하는 VSG 흘림 리드 것으로하고, 상기 분리 과정에 관여하는 많은 스핀있다. 이 최종 반 VSG 얼룩에 대한 신호의 세기를 감소시키는 것으로 예상된다. 두번째 프로토콜의 첫 단계는 일차 항 VSG 항체 염색을 포함한다는 것이다. 이 첫번째 단계에서 사용되는 항체가 인식하는 에피토프와 동일한 또는 최종 염색에 상기 항체에 의해 인식되는 에피토프를 폐색하는 경우, 하나의 신호의 세기가 단지 하나의 항체가 사용 된 경우보다 더 낮을 것으로 기대된다. 이러한 이유로 양으로 염색 셀로부터의 신호가 대략 두되도록 최종 단계에서 사용되는 항체를 적정하는 것이 중요음 스테인드 셀에 대한보다 높은 크기 순서. 이러한 방식으로, 양으로 염색 한 셀로부터의 신호의 강도를 상기 분리 과정을 거친 세포에서 감소되는 경우에도, 이들 양성 세포는 여전히 잘 유동 세포 계측법 플롯상의 음성 세포로부터 분리한다. 자동 보상이 사용되는 경우, 단일 오염 제어 샘플을 제조한다. 우리가 생성 한 항체는 메모리얼 슬로 언 암 센터 monocolonal 항체 시설에서 구입할 수 있습니다. 우리는 표지 된 모노클로 날 IgG 항체를 사용하여 최상의 성공이 있었다. 우리는 폴리 클로 날 VSG 항체와 프로토콜을 수행했지만, 폴리 클로 날 항체는 때때로 너무 모노클로 날 항체가 바람직하다 다른 VSGS을 인식 할 수 있습니다. VSG ID는 VSG 3'UTR과 접합 리더에서 보존 된 서열의 증폭에서 생성 시퀀싱 VSG cDNA의에 의해 결정될 수있다. 특정 항체는 이전에 전환에 고립 된 특이성에 대한 테스트 할 수 있습니다방금 설명한 바와 같이 VSG 아이덴티티 세포로 결정되었다.
여기에 제시된 프로토콜은 다수의 이점을 갖는다. 그것은 나중에 분석을위한 스위처를 분리하고 특정 인구에 스위처의 수를 정량화 모두 사용할 수 있습니다. 또한, 한 항체가 변형 가능한 한, 관심있는 특정 변형을 분리하는데 사용될 수있다. 또한 적혈구 제조사의 프로토콜에 따라 항 Ter119 코팅 자성 비드를 이용하여 제거가 제공 또한 동물에서 분리 된 트리 파노 솜을 사용하여이 프로토콜을 수행 할 수있다. 우리는 필요한 trypanosomes에 수의 하한을 테스트하지 않은,하지만 우리는 성공적으로 2.5 사용하여 프로토콜을 수행 한 - 혈액 250 μL에서 1000 만 trypanosomes에 있습니다. 마지막으로, 프로토콜은 주어진 집단에서의 스위칭 주파수를 얻는 것이 변동 분석과 함께 사용될 수있다.
분리 과정은 매우 F이고AST, 복용 3 - 개시로부터 4 시간은 샘플들의 수에 따라 완료하고, 따라서 약물 내성 마커를 포함하는 생쥐 또는 특별한 균주 전에 접종을 요구 이전의 방법보다 효율적으로한다. 이 방법은 시작 VSG에 대한 항체가 있지만, 요구되는 사실에 의해 제한된다. 이러한 시약없이, 상기 VSG-SEQ와 같은 다른 방법 VSGS 주어진 인구 (10)에 표시되고있는 측정하는보다 적절한 선택이 될 수있다.
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Acknowledgments
우리는 트리파노소마 생물학에 대한 일반적인 조언 조지 크로스를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 또한 DS, MRM에 NSF 대학원 연구 활동 (DGE-1325261)와 FNP에 대한 NIH / NIAID (허가 번호의 AI085973)에 빌과 멜린다 게이츠 재단 GCE 보조금에 의해 지원되었다. 우리는 I-SCEI 유전자 및 인식 사이트를 포함하는 균주의 사용 갈라드리엘 오두막집 - 광부 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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