Introduction
O parasita protozoário, o Trypanosoma brucei, é um agente causador de doenças que afetam os seres humanos (via Trypanosoma brucei gambiense e Trypanosoma brucei rhodesiense) e animais (via Trypanosoma brucei brucei) em toda a África Sub-Sahariana. Ele é transmitido para o hospedeiro mamífero através da saliva do vector mosca tsé-tsé. Ambos Humana e tripanossomíase Africano Animal causar uma carga económica grave em regiões endêmicas, e poucas drogas são disponíveis ou em desenvolvimento para o tratamento de qualquer doença. Compreender mecanismos de evasão imunitária é crítico para o desenvolvimento de drogas para a tripanossomíase. A variação antigênica do revestimento denso, Variante glicoproteína de superfície (VSG) que cobre o parasita é um dos meios primários pelos quais T. brucei evita a resposta do anticorpo de mamífero. Cerca de 2000 variantes do gene VSG existem no genoma tripanossoma, mas só um é transcrito em qualquer momento a partir de uma de ~ 15 expresSites SION. 'Comutação' da VSG expresso pode ocorrer quer por cópia de um gene de VSG no local de expressão activa, ou por activação da transcrição de um local de expressão anteriormente silenciosos (revisto em 1).
Embora muito trabalho foi dedicado à compreensão variação antigênica em T. brucei, os fatores que influenciam a freqüência de comutação são ainda pouco compreendidos. Estudos até à data têm sido dificultados pelo fato de que, enquanto a comutação ocorre estocasticamente in vitro, freqüências de chaveamento são muito baixos, da ordem de 1 a cerca de 10 6 células 2. Isso torna difícil para medir se um fator dadas aumenta ou diminui frequência de comutação, uma vez que a mudança é difícil de detectar, em primeiro lugar. Antes de 2009, os métodos para isolar switchers em uma dada população foram longo e trabalhoso. Estas células Passaging tripanossomas através de ratinhos imunizados contra o VSG dominante e em seguida colhem incluídosum dias mais tarde três, contando ou centenas de células por imunofluorescência 4,5. Outra estratégia baseia-se na seleção para resistência a drogas para isolar switchers 6. Porque tripanossomas africanos cultivadas in vitro são geralmente composta de uma população grande expressando uma variante importante, e uma população muito menor de switchers que expressam variantes alternativas, referimo-nos à grande variação ao longo deste artigo como o, VSG começando dominante. Ao fazê-lo, nós, de modo algum pretendo afirmar que este importante variante tem maior aptidão do que outras variantes na população.
Aqui nós descrevemos um método que pode medir de forma confiável o número de tripanossomas expressando um VSG não dominante numa dada população em 3-4 horas. Este método é particularmente útil para quando se quer determinar se um dado manipulação genética ou tratamento medicamentoso aumenta o número de células ligadas em uma população. Em vez de libertar a população de células que expressam a fazerminant, começando VSG através de drogas ou por meios imunológicos, estas células são eliminadas por primeiro revestindo-os com pérolas magnéticas acopladas a anticorpos contra a VSG dominante e em seguida isolá-los sobre uma coluna magnética. A população ligado é então recolhido no fluxo de passagem e coradas novamente com um anticorpo marcado com fluoróforo anti-VSG para a identificação de contaminantes. A quantificação é conseguida através da adição de um número definido de pérolas de contagem absoluta de cada amostra de modo que a razão de pérolas para células pode ser determinada e utilizada para quantificar o número de comutadores na população 7.
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Protocol
NOTA: Durante o procedimento, é necessário manter as células no gelo. media frias também devem ser utilizados por toda parte.
Colheita 1. Amostra
- Crescer Lister 427 tripanossomas tensão da corrente sanguínea até uma densidade de 0,5 - 1 milhão / ml. É melhor iniciar culturas com um pequeno número de parasitas. Girar 50 X 10 6 células / amostra durante 10 min a 1500 x g. Certifique-se de deixar 1 x 10 6 células em cultura para mais tarde usar controles de anticorpos como positivos e negativos.
NOTA: Este protocolo também pode ser usado em tripanossomas isolados de sangue animal (ver discussão para mais detalhes). - Pipeta ou deitar fora a maior parte do sobrenadante (deixar cerca de 750 mL). Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Girar as células a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg numa microcentrífuga e remover o sobrenadante.
2. Etiquetagem Magnética
- Ressuspender as células em 150 ul de meio de cultura (HMI-9 with soro, por exemplo) + anticorpo anti-VSG primário na diluição apropriada.
NOTA: O anticorpo anti-VSG é feita em casa e usado numa diluição de 1:50. É importante a utilização de um anticorpo anti-VSG primário que não é marcado com um fluoróforo. - Vortex células utilizando um vórtice adaptador-60 a uma velocidade de 6 - 8 numa sala fria a 4 ° C durante 10 min. Lavar com 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro.
- Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e o sobrenadante aspirado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e rodar como acima. Aspirar o sobrenadante. Ressuspender o sedimento em 100 ul de HMI-9 com soro.
- Adicionar 110 ul de células magnético ativado triagem microesferas (MSC). Use anti-rato, anti-coelho, ou grânulos anti-biotina, conforme apropriado para o anticorpo anti-VSG primária. Misture bem. células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min.
- Enquanto as células são vortex, configure uma separação coluna / amostra magnética ativado em um ímã separação. Certifique-se de ter um receptacle (usamos um tubo de centrífuga de 15 ml) na coluna para recolher o fluxo de passagem. Configurar o aparelho em uma sala fria.
- Adicionar 2 ml de HMI-9 com soro à coluna prime. Após o condicionamento lugar um tubo de centrífuga de 15 ml, sob a coluna para recolha de escoamento a partir de cada amostra.
- Após os 10 minutos de incubação na etapa 2.4, adicione 800-1.000 ul frio HMI-9 com soro. Centrifugação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado. Lava-se com 1 ml de HMI-9 com soro e repetir deixando 100 l de sobrenadante.
- Flick o tubo de centrífuga vigorosa e inspeccionar visualmente o tubo a certeza de que o pelete é ressuspenso completamente. Adicionar 1 ml de HMI-9 com soro e pipeta-se para baixo e para certificar-se que as células ressuspensas são bem.
3. Separação Magnética
- Certifique-se de que as colunas são preparados como descrito acima. Aplicar células de coluna. Recolha de fluxo com células que expressam o VS não-dominanteG. 1 ml de meio + tripanossomas tipicamente leva 6-7 min a fluir através da coluna.
- Lavar 2x com 1 ml de HMI-9 com soro e recolher o fluxo através do mesmo tubo como no passo 3.1.
- Divide escoamento (3 mL) em dois tubos de microcentrifugação de 1,5 ml.
NOTA: Estes podem ser combinados mais tarde ou meia pode ser usado para isolar o ARN, etc. - Remover coluna de ímã. Adicionar 3 ml de HMI-9 com soro à coluna e mergulhar coluna para um tubo de centrífuga de 15 ml para se obter células que expressam a partida, VSG dominante. Retirar 300 ul de material fluido para análise posterior. Manter essas células em gelo.
- Para utilização como um positivo e um controlo negativo, demora aproximadamente 1 milhão de células a partir da cultura inicial de células de controlo em crescimento a 37 ° C (aqueles não esperado para mudar frequentemente) e pipeta-os para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: células de controlo positivo serão coradas com anticorpo marcado com fluoróforo na etapa 4.1. As células de controlo negativo Remana imaculada em todo o resto do protocolo. - amostras de spin fluxo e amostra de controlo de anticorpos positivo a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante.
NOTA: Outra alíquota de 300 ul de células eluídas pode ser utilizado como um controlo positivo para a coloração anti-VSG.
4. A coloração para a identificação de contaminantes e comutadores
- amostras de fluxo através Ressuspender as células de controlo positivo e em 100 ul de HMI-9 com soro + primário, anti-VSG anticorpo, marcado com fluoróforo na diluição apropriada.
NOTA: O anticorpo anti-VSG marcado é feito em casa e usado numa diluição de 1: 1000. A marcado com fluoróforo, anti-VSG pode ser a partir da mesma fonte que o anticorpo não marcado na separação MACS step.There deve ser de 3 ml de amostra por escoamento em dois tubos de microcentrifugação seguintes passo 3.5. - Para analisar a totalidade do fluxo através de citometria de fluxo, combinar as pelotas em dois tubos de microcentrifugação durante a re-SUSenquanto se aguardam as amostras em 100 l de HMI-9 com anticorpos séricos + anti-VSG. Misture bem.
- células de vórtice em uma sala fria a 4 ° C durante 10 min. Adicionar 800 - 1.000 l fria HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 x g e remover o sobrenadante para remover o anticorpo não ligado.
- Lave as células com 1 ml de HMI-9 com soro. amostras de rotação a 4 ° C durante 4 min a 5200 xg e remover o sobrenadante. Durante esta última rotação, girar os-amostras eluídas a partir do passo 3.4 e a amostra de controlo negativo.
- Ressuspender todos escoamento e amostras eluídas em: 148,5 ul HMI-9 com soro, 25 uL grânulos de contagem absoluta e 1,5 ul de solução de iodeto de propídio (175 ul total) coloração. Ressuspender amostras de controlo de anticorpos positivos e negativos em 175 ul HMI-9 com soro. Certifique-se de anotar o número de contas de contagem absolutos / 25 ul para o lote específico utilizado.
- Executar todas as amostras através de um citômetro de fluxo e recolher dados. células mortas da mancha o PI
- Calcular as frequências utilizando citometria de fluxo de dados de comutação.
NOTA: Para obter instruções sobre como calcular as frequências de comutação, consulte o arquivo suplementar Citometria de Fluxo Calculations.docx e Tabela 1.
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Representative Results
O método aqui descrito foi utilizado para demonstrar que as quebras de cadeia dupla no interior do local de expressão VSG aumentou o número de comutadores numa população 8. Aqui, mostramos resultados representativos de uma população de tripanossomas que têm sido igualmente induzidos para gerar uma ruptura de fita dupla no local expressão. Nós comparar estes tripanossomas para aqueles que não tenham sido induzidas a gerar uma ruptura de fita dupla. A Figura 1 mostra o fluxo representante citometria de parcelas de células un-induzidos e induzidos recolhidos no fluxo através da coluna de separação de células activadas magnético. Para esta experiência particular, a VSG começando dominante era VSG2. Os painéis do lado esquerdo da Figura 1A mostram dispersão frontal e lateral, que permite que portas, para ser desenhada em torno dos grânulos de contagem absolutos e células que exibem uma assinatura de dispersão frontal e lateral que é característico de células vivas. Note-se que pode portõesser desenhada para incluir mais células, porque as células mortas pode ser eliminado com coloração de PI; No entanto, a porta deve ser mantida a mesma para todas as amostras. Os painéis do lado direito da Figura 1A mostrar apenas as células que se enquadram dentro do portão 'Live' nos painéis do lado esquerdo. As células que coram positivamente para o PI (Q1 e Q2) são células mortas. As células que coram positivamente para a VSG dominante e negativamente para o PI no Q3 são contaminantes. As células que coram negativamente tanto para PI eo VSG dominante no Q4 são células vivas que tenham mudado. Pode-se observar que o percentual de contaminantes no Q3 é menor para as células, onde foi induzida a ruptura de fita dupla. No entanto, as percentagens em Q3 não pode ser usada para inferir se há mais comutadores numa dada população. É só por comparação da razão entre o número de células em Q4 com o número de esferas recolhidas que se pode calcular as frequências de comutação. A Tabela 1 mostra os números obtidos a partir do Floparcelas citometria W e o método para calcular os comutadores por cento nestas populações. Estes cálculos foram realizados em 3 amostras biológicas para obter as frequências de comutação observados apresentados na Figura 1B. O nível de comutação estocástica in vitro, é bastante baixa, como aqui calculado com uma média de 9,53 x 10 -5, enquanto induz uma ruptura resulta em 1 - 6 x 10 -3 células que tiver mudado para a VSG não-dominante.
Figura 1. Isolamento e Quantificação de Populações de tripanosomas comutada. (A) A citometria de fluxo que mostra fracções de tripanossomas na fracção de fluxo após a selecção de não-comutadores numa coluna de separação de células activada magnética. Uma população de células com um I-SCEI ruptura de fita dupla induzida é comparado com uma população de células sem um BRE induzidaak. (B) Calculado frequências de comutação para células que têm ou não foram induzidas com uma quebra de cadeia dupla I-SCEI. O número no gráfico representa os resultados de um teste T desemparelhado de duas caudas. As barras de erro representam SD. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Suplementar arquivo 1. Cálculos citometria de fluxo. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
Tabela 1. Cálculo de Frequências de comutação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
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Discussion
No que diz respeito à técnica experimental, o componente mais importante do protocolo é manter todas as amostras frias. Tripanossomas internalizar muito rapidamente anticorpo ligado à sua superfície 9, mas este processo é dependente da motilidade, e não influencia o ensaio, enquanto as células são mantidas a 4 ° C. Todas as amostras devem sempre ser mantidos em gelo, e pipetagem deve ser feito rapidamente para minimizar a exposição ao ambiente C laboratório 25 °. Frio HMI-9 com soro deve estar disponível no início do experimento e deve ser mantido no gelo por toda parte. O isolamento dos tripanossomas por executá-los através da coluna deve ser feito num quarto frio, uma vez que leva 5 - 7 min para correr uma amostra de 1 ml através da coluna. Se há mais amostras do que as unidades de separação magnética disponíveis, o isolamento magnético pode ser feito em sequência, desde que as amostras não sendo activamente separados são mantidos em gelo.
É também extremamente importante que as amostras de ser muito bem misturado after a última lavagem após incubação com as microesferas e antes do isolamento sobre o ímã. Isto pode ser realizado por um movimento súbito agressiva do tubo de centrifugação ou vórtex luz. Nenhuma sedimento ou aglomerados de células deve ser visível antes da adição da amostra para a coluna de separação, o que pode ser verificado, olhando para o nível de microscopia de luz. Se estão presentes aglomerados, o nível de contaminação da amostra por escoamento de células que expressam a VSG dominante é geralmente muito maior do que seria desejável. Ao realizar o cálculo para o número de comutadores na amostra no final do protocolo, é importante ter em conta o facto de todo o fluxo de passagem foi utilizada para análise por citometria de fluxo, ou seja metade foi utilizada. Se foi usada apenas a metade, o número total de switchers calculados devem ser multiplicados por 2.
Ao remover o sobrenadante, durante os passos de lavagem, não é necessário pipetar para fora até a última gota, e tipicamente 15 - 25 são ulesquerda em torno do sedimento de células. Isto é especialmente crítico durante os estágios finais de coloração e lavagem, porque neste momento pelotas são raramente visto nas amostras de fluxo-through porque há tão poucas células comutada.
Enquanto a última mancha anti-VSG é tipicamente realizada com o anticorpo purificado, marcado com fluoróforo anti-VSG, a primeira mancha anti-VSG antes do isolamento magnético pode ser feita com o anticorpo purificado ou soro. Temos também utilizado sobrenadante biorreator derivada de hibridomas que expressam anticorpos anti-VSG. Independentemente disso, o material utilizado para a coloração inicial deve ser ajustada para garantir uma boa separação de células que expressam ou que não a, começando a VSG dominante.
É típico para a população de células no fluxo de passagem a ser contaminado com células que expressam o VSG dominante. Enquanto esta contaminação deve ser mínima, em nossa experiência, é raro que a população a ser completamente desprovida de células expressaming da VSG dominante. É também importante notar que as células que passaram através do procedimento de isolamento, não manchar como brilhantemente com anticorpo anti-VSG como aqueles que não tenham sido através do procedimento. Nossa hipótese é que duas coisas poderiam ser responsáveis por esta diferença. A primeira é que a fiação tripanossomas conduz à disseminação da VSG, e existem muitas rotações envolvidas no procedimento de isolamento. Isto seria esperado para diminuir a intensidade do sinal para a mancha final de anti-VSG. A segunda é que o primeiro passo do protocolo envolve a coloração com um anticorpo anti-VSG primária. Se os epítopos reconhecidos pelo anticorpo utilizado neste primeiro passo são os mesmos que ou ocluir os epítopos reconhecidos pelo anticorpo na mancha final, seria de esperar que a intensidade do sinal a ser menor do que se se utilizasse apenas um anticorpo. Por esta razão, é importante para titular o anticorpo que é utilizado no passo final, de tal modo que o sinal a partir de uma célula coradas positivamente é aproximadamente doisordens de grandeza maior do que para uma célula corada negativamente. Desta forma, mesmo que a intensidade de sinal a partir de uma célula coradas positivamente é diminuída em células que foram submetidas ao procedimento de isolamento, estas células positivas vai ainda ser bem separada das células negativas para o lote de citometria de fluxo. Se auto-compensação está sendo usado, amostras de controlo de manchas individuais devem estar preparados. Os anticorpos que temos gerados estão disponíveis para compra a partir do Memorial Sloan Cancer Center monocolonal instalação de anticorpos. Tivemos o melhor sucesso com o uso de anticorpos IgG monoclonal não marcado. Efetuamos o protocolo com anticorpos policlonais VSG, mas os anticorpos policlonais podem ocasionalmente reconhecer outros VSGs anticorpos monoclonais assim são os preferidos. VSG identidade pode ser determinada por sequenciação de cDNA gerada a partir de VSG amplificação de sequências conservadas na VSG 3'UTR e o spliced leader. Um anticorpo particular pode ser testado quanto à especificidade sobre previamente isolado ligadocélulas que a identidade VSG foi determinada como descrito.
O protocolo aqui apresentado tem um número de vantagens. Pode ser usado tanto para isolar os comutadores para análise posterior e para quantificar o número de comutadores numa dada população. Ele também pode ser usado para isolar uma variante particular de interesse, desde que um anticorpo que está disponível para a variante. É também possível levar a cabo este protocolo utilizando tripanossomas isolados a partir de animais, desde que as células vermelhas do sangue são eliminadas utilizando esferas revestidas anti-Ter119-magnéticas de acordo com o protocolo do fabricante. Nós não testamos o limite inferior para o número de tripanossomas necessárias, mas temos realizado com sucesso o protocolo usando 2,5 - 10 milhões tripanossomas a partir de 250 mL de sangue. Finalmente, o protocolo pode ser utilizado em conjunto com a análise de variação para se obter a frequência de comutação numa dada população.
O procedimento de isolamento é bastante fAST, tendo 3-4 horas do início ao fim, dependendo do número de amostras, e, portanto, é mais eficiente do que os métodos anteriores que requeriam a imunização de ratinhos antes ou estirpes especializados que contêm marcadores de resistência a drogas. O método é limitado pelo facto de que os anticorpos contra a VSG partida são necessárias, no entanto. Sem esses reagentes, um método alternativo, como VSG-seq pode ser uma escolha mais adequada para avaliar quais VSGs estão sendo expresso em uma determinada população 10.
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Acknowledgments
Nós gostaríamos de agradecer George Cross para o conselho geral sobre a biologia do tripanossoma. Este trabalho também foi apoiado por uma Fundação Bill e Melinda Gates concessão GCE para DS, a NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM e um NIH / NIAID (concessão # AI085973) para FNP. Agradecemos Galadriel Hovel-Miner para o uso da estirpe contendo o local de gene e reconhecimento I-SCEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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