Introduction
El parásito protozoario Trypanosoma brucei, es un agente causal de las enfermedades que afectan a los seres humanos (a través de brucei gambiense y Trypanosoma rhodesiense Trypanosoma brucei) y animales (a través de Trypanosoma brucei brucei) en toda el África subsahariana. Se transmite al huésped de mamífero a través de la saliva de la mosca tsé-tsé vector. Tanto humanos como la tripanosomiasis africana animales causan una carga económica grave en las regiones endémicas, y pocos fármacos están disponibles o en desarrollo para tratar cualquiera de las enfermedades. La comprensión de los mecanismos de evasión inmune es crítico para el desarrollo de fármacos para la tripanosomiasis. La variación antigénica de la densa, la variante glicoproteína de superficie (VSG) la capa que cubre el parásito es uno de los principales medios por los cuales T. brucei evade la respuesta de anticuerpos de los mamíferos. Existen aproximadamente 2000 variantes del gen VSG en el genoma tripanosoma, pero sólo uno se transcribe en un momento dado de una de ~ 15 expressitios de Sión. 'Cambio' de la VSG expresada puede ocurrir ya sea mediante la copia de un gen VSG en el sitio de expresión activa, o por la activación transcripcional de un sitio de expresión previamente silenciosa (revisado en 1).
Aunque mucho trabajo se ha dedicado a la comprensión de la variación antigénica en T. brucei, los factores que influyen en la frecuencia de conmutación son aún poco conocidos. Los estudios realizados hasta la fecha se han visto obstaculizados por el hecho de que mientras que la conmutación se produce estocásticamente in vitro, frecuencias de conmutación son muy bajos, del orden de 1 a unos 10 6 células 2. Esto hace que sea difícil de medir si un determinado factor aumenta o disminuye la frecuencia de conmutación, ya que el cambio es difícil de detectar en el primer lugar. Antes de 2009, los métodos para el aislamiento de los conmutadores en una población dada eran muy largo y laborioso. Estas células pases a través de tripanosomas ratones inmunizados contra la VSG dominante y luego, la cosecha incluidosun día más tarde 3, o contar cientos de células por inmunofluorescencia 4,5. Otra estrategia se basa en la selección para la resistencia a los medicamentos para aislar conmutadores 6. Debido a que los tripanosomas africanos cultivadas in vitro se hacen típicamente de una gran población que expresa una variante importante, y una población mucho más pequeña de conmutadores que expresan variantes alternativas, nos referimos a la variante importante en todo este documento como la VSG dominante, de partida. Al hacerlo, que de ninguna manera deseamos dar a entender que esta importante variante tiene una mayor aptitud que otras variantes en la población.
Aquí se describe un método que se puede medir de manera fiable el número de tripanosomas que expresa un VSG no dominante en una población dada en 3-4 horas. Este método es particularmente útil para cuando se quiere determinar si una manipulación genética dado o tratamiento con fármacos aumenta el número de células de conmutación en una población. En lugar de liberar a la población de células que expresan el dominante, a partir VSG través de las drogas o por medios inmunológicos, estas células son eliminadas por primera recubrimiento con perlas magnéticas acopladas al anticuerpo contra la VSG dominante y luego aislarlos en una columna magnética. La población de conmutación se recoge entonces en el flujo a través y se tiñó otra vez con un anticuerpo marcado anti-VSG fluoróforo para identificar contaminantes. La cuantificación se logra mediante la adición de un número definido de contar bolas absolutas para cada muestra de manera que la relación de perlas a células se puede determinar y se usa para cuantificar el número de conmutadores en la población 7.
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Protocol
NOTA: Durante todo el procedimiento, es necesario para mantener las células en hielo. medios fríos también deben utilizarse en todas partes.
La recolección de la muestra 1.
- Crecer Lister 427 tripanosomas cepa del torrente sanguíneo a una densidad de 0,5 - 1 millones / ml. Lo mejor es comenzar culturas con un pequeño número de parásitos. Centrifugar 50 x 10 6 células / muestra durante 10 minutos a 1.500 x g. Asegúrese de dejar 1 x 10 6 células en cultivo para su uso posterior como controles de anticuerpos positivos y negativos.
NOTA: Este protocolo también se puede utilizar en tripanosomas aisladas a partir de sangre de animales (véase la discusión para los detalles). - Pipeta o verter fuera la mayor parte del sobrenadante (dejar alrededor de 750 l). Transferir las células a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Girar las células a 4 ° C durante 4 min a 5.200 xg en una microcentrífuga y eliminar el sobrenadante.
2. El etiquetado Magnética
- Resuspender las células en 150 l de medio de cultivo (HMI-9 wiTH suero por ejemplo) + anticuerpo anti-VSG primario a la dilución apropiada.
NOTA: El anticuerpo anti-VSG está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1:50. Es importante usar un anticuerpo primario anti-VSG que no está marcado con un fluoróforo. - células Vortex utilizando un vórtice adaptador-60 a una velocidad de 6-8 en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Se lava con 800 - 1.000 l fría HMI-9 con suero.
- Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y aspirar el sobrenadante. Se lava con 1 ml de HMI-9 con suero y girar como antes. Aspirar el sobrenadante. sedimento se vuelve a suspender en 100 l de HMI-9 con suero.
- Añadir 110 l de células activadas por la clasificación magnética microperlas (MSC). Utilice anti-ratón, anti-conejo, o perlas anti-biotina como apropiado para el anticuerpo anti-VSG primaria. Mezclar bien. células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min.
- Mientras que las células se vórtex, configurar una columna de separación / muestra magnético activado en un imán separación. Asegúrese de tener una rereceptáculo (se utiliza un tubo de centrífuga de 15 ml) en la columna para recoger el flujo continuo. La instalación del equipo en una habitación fría.
- Añadir 2 ml de HMI-9 con suero a la columna de primera. Después de cebar lugar un tubo de centrífuga de 15 ml en la columna para recoger flujo a través de cada muestra.
- Después de los 10 minutos de incubación en el paso 2.4, añadir 800-1.000 l fría HMI-9 con suero. Giran a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y retirar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido. Lavar con 1 ml de HMI-9 con suero y repetición dejando 100 l del sobrenadante.
- Flick el tubo de centrífuga vigorosamente e inspeccione visualmente el tubo para asegurarse de que el sedimento se resuspendió completamente. Añadir 1 ml de HMI-9 con suero y la pipeta hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que las células se volvieron a suspender bien.
3. Separación Magnética
- Asegúrese de que las columnas están preparados como se describe anteriormente. Aplicar las células a la columna. Suma de flujo continuo con las células que expresan el VS no dominanteG. 1 ml de medio + tripanosomas típicamente se lleva a 6 - 7 min a fluir a través de la columna.
- Lavar 2 veces con 1 ml de HMI-9 con suero y recoger de flujo continuo en el mismo tubo como en el paso 3.1.
- flujo a través Divide (3 ml) en dos tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Estas se pueden combinar más tarde o medio se pueden utilizar para aislar el ARN, etc. - Retirar la columna del imán. Añadir 3 ml de HMI-9 con suero a la columna y hundir la columna en un tubo de centrífuga de 15 ml para obtener células que expresan la partida, dominante VSG. Eliminar 300 l de material eluido para su posterior análisis. Mantener estas células en hielo.
- Para su uso como un positivo y un control negativo, una duración aproximada de 1 millón de células del cultivo a partir de células de control cada vez mayor a 37 ° C (los que no se espera que cambie con frecuencia) y pipeta de ellos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
NOTA: Las células de control positivo se tiñeron con anticuerpo marcado con fluoróforo en el paso 4.1. Negativo células de control remaen sin teñir en el resto del protocolo. - muestras de giro de flujo continuo y positivo muestra de control de anticuerpos a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante.
NOTA: Otra alícuota 300 l de células eluidas se puede utilizar como un control positivo para la tinción de anti-VSG.
4. La tinción para identificar los contaminantes y de Conmutación
- muestras de flujo a través de Resuspender las células de control positivo y en 100 l de HMI-9 con suero +, anticuerpo primario, marcada con fluoróforo anti-VSG a la dilución apropiada.
NOTA: El anticuerpo anti-VSG marcado está hecho en casa y se utiliza en una dilución de 1: 1000. El fluoróforo marcado, anti-VSG puede ser de la misma fuente que el anticuerpo no marcado en la separación MACS step.There debe ser de 3 ml de muestra de flujo a través de dos tubos de microcentrífuga siguientes paso 3.5. - Para analizar todo el flujo de paso por citometría de flujo, se combinan las bolitas en los dos tubos de microcentrífuga mientras que re-susen espera de las muestras en 100 l de HMI-9 con el anticuerpo anti-VSG + suero. Mezclar bien.
- células de vórtice en una habitación fría a 4 ° C durante 10 min. Añadir 800 - 1000 l fría HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante para eliminar el anticuerpo no unido.
- Lavar las células con 1 ml de HMI-9 con suero. muestras de giro a 4 ° C durante 4 minutos a 5.200 xg y eliminar el sobrenadante. Durante este último giro, centrifugar las muestras eluidas-desde el paso 3.4 y la muestra de control negativo.
- Volver a suspender todo el filtrado y muestras eluidas en: 148,5 l HMI-9 con suero, 25 l contar bolas absoluto y 1,5 l solución yoduro de propidio (175 l en total) tinción. Volver a suspender las muestras de control positivas y negativas de anticuerpos en 175 l HMI-9 con suero. Asegúrese de registrar el número de contar bolas absolutos / 25 l para el lote particular usado.
- Ejecutar todas las muestras a través de un citómetro de flujo y recoger datos. Las células muertas manchar como PI
- Calcular las frecuencias de conmutación utilizando citometría de flujo de datos.
NOTA: Para obtener instrucciones sobre cómo calcular las frecuencias de conmutación, por favor consulte el archivo suplementario Citometría de Flujo Calculations.docx y en la Tabla 1.
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Representative Results
El método aquí descrito se utilizó para demostrar que las roturas de doble hebra dentro del sitio de expresión VSG aumentado el número de conmutadores en una población 8. Aquí, mostramos los resultados representativos de una población de tripanosomas que han sido inducidos de manera similar para generar una rotura de doble cadena en el lugar de expresión. Comparamos estos tripanosomas a aquellos que no han sido inducidos para generar una rotura de doble cadena. La figura 1 muestra un resultado representativo citometría de parcelas a partir de células de la ONU-inducidos e inducidos recogidos en el flujo a través de la clasificación de células activadas por la columna magnética. Para este experimento particular, la VSG a partir dominante era VSG2. Los paneles a mano izquierda de la Figura 1A muestran hacia adelante y dispersión lateral, que permite que las puertas que se pueden extraer alrededor de los granos de conteo absolutos y las células que muestran una firma hacia adelante y dispersión lateral que es característica de las células vivas. Tenga en cuenta que las puertas puedenredactarse para incluir más celdas porque las células muertas se pueden eliminar con la tinción PI; sin embargo, la puerta debe mantenerse el mismo para todas las muestras. Los paneles de la derecha de la figura 1A muestran sólo aquellas células que caen dentro de la puerta 'en vivo' en los paneles de la izquierda. Las células que se tiñen positivamente para PI (Q1 y Q2) son las células muertas. Las células que se tiñen positivamente para la VSG dominante y negativa para PI en la Q3 son contaminantes. Las células que se tiñen negativamente tanto para PI y la VSG dominante en Q4 son células vivas que han cambiado. Se puede observar que el porcentaje de contaminantes en la Q3 es menor para aquellas células en las que se ha inducido una rotura de doble cadena. Sin embargo, los porcentajes en Q3 no se pueden usar para inferir si hay más conmutadores en una población dada. Es solamente por la comparación de la relación entre el número de células en Q4 al número de granos recogidos que se puede calcular frecuencias de conmutación. La Tabla 1 muestra los números obtenidos de la floparcelas citometría w y el método para el cálculo de los conmutadores por ciento en estas poblaciones. Estos cálculos se realizaron en 3 muestras biológicas para obtener las frecuencias de conmutación observados se muestran en la Figura 1B. El nivel de conmutación estocástico in vitro es bastante baja, tal como se calcula aquí, en un promedio de 9,53 x 10 -5, mientras que la inducción de una rotura de los resultados en 1 - 6 x 10 -3 células que han cambiado a la VSG no dominante.
Figura 1. Aislamiento y cuantificación de las poblaciones de tripanosoma conmutadas. (A) La citometría de flujo que muestra las fracciones de tripanosomas en la fracción de flujo continuo después de la selección de los no de conmutación en una de células activadas por la columna de clasificación magnética. Una población de células con un I-SCEI de doble filamento romper inducida se compara con una población de células sin un BRE inducidaak. (B) Calculado frecuencias de conmutación de células que tienen o no han sido inducidas con un I-SCEI rotura de cadena doble. El número que aparece en la gráfica representa los resultados de una prueba t de dos colas, no emparejado. Las barras de error representan SD. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo suplementario 1. Los cálculos citometría de flujo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
Tabla 1. Cálculo de las frecuencias de conmutación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
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Discussion
Con respecto a la técnica experimental, el componente más crítico del protocolo es mantener todas las muestras frío. Los tripanosomas internalizan muy rápidamente anticuerpo unido a su superficie 9, pero este proceso es dependiente de la motilidad, y no influye en el ensayo, siempre y cuando las células se mantienen a 4 ° C. Todas las muestras deben mantenerse siempre en hielo, y pipeteo debe hacerse rápidamente para minimizar la exposición al ambiente de laboratorio C 25 °. Fría HMI-9 con suero debe estar disponible al inicio del experimento y se debe mantener en hielo en todo momento. El aislamiento de los tripanosomas mediante la ejecución de ellos sobre la columna debe hacerse en una habitación fría, ya que toma 5 - 7 min para ejecutar una muestra de 1 ml a través de la columna. Si hay más muestras que las unidades de separación magnética disponibles, el aislamiento magnético se puede hacer en la secuencia, siempre que las muestras no están separados de forma activa se mantienen en hielo.
También es fundamental que las muestras sean muy bien af mixtoter del último lavado tras la incubación con las microperlas y antes del aislamiento sobre el imán. Esto se puede lograr con un movimiento rápido agresiva del tubo de centrífuga o vórtex luz. Sin pellets o grupos de células deben ser visibles antes de la adición de la muestra a la columna de separación, que se puede comprobar observando el nivel de microscopía óptica. Si grupos están presentes, el nivel de contaminación en la muestra de flujo a través de las células que expresan la VSG dominante es generalmente mucho más alta de lo deseable. Cuando se realiza el cálculo para el número de conmutadores en la muestra al final del protocolo, es importante tener en cuenta si se ha utilizado todo el flujo a través de análisis de citometría de flujo, o si se utilizó un medio. Si se utiliza sólo la mitad, el número total de conmutadores calculados debe ser multiplicado por 2.
Al retirar el sobrenadante durante las etapas de lavado, no es necesario pipetear fuera hasta la última gota, y típicamente 15 - 25 l sonla izquierda que rodea el sedimento de células. Esto es especialmente importante durante las etapas finales de la tinción y el lavado, porque en este punto gránulos rara vez se ven en las muestras de flujo continuo porque hay tan pocas células cambiaron.
Mientras que la final mancha anti-VSG se realiza típicamente con anticuerpo purificado, marcado con fluoróforo anti-VSG, la primera mancha anti-VSG antes del aislamiento magnético se puede hacer con anticuerpo purificado o suero. También hemos utilizado sobrenadante biorreactor derivado a partir de hibridomas que expresan anticuerpos anti-VSG. En cualquier caso, el material utilizado para la mancha inicial debe ajustarse para asegurar una buena separación de las células que hacen o no expresan el, VSG a partir dominante.
Es típico que la población de células en el flujo a través de estar contaminados con células que expresan el VSG dominante. Mientras que esta contaminación debe ser mínimo, en nuestra experiencia, es raro que la población sea totalmente desprovista de células expresaning la VSG dominante. También es importante tener en cuenta que las células que han pasado por el procedimiento de aislamiento no se manchan tan intensamente con el anticuerpo anti-VSG como los que no han sido a través del procedimiento. Nuestra hipótesis es que dos cosas podrían explicar esta diferencia. La primera es que los tripanosomas hilado determina la descamación de la VSG, y hay muchos giros que intervienen en el procedimiento de aislamiento. Esto era de esperar para disminuir la intensidad de la señal para la final mancha anti-VSG. La segunda es que la primera etapa del protocolo implica la tinción con un anticuerpo anti-VSG primaria. Si los epítopos reconocidos por el anticuerpo utilizado en esta primera etapa son los mismos que o ocluyen los epítopos reconocidos por el anticuerpo en la mancha final, sería de esperar que la intensidad de la señal sea menor que si se utiliza un solo anticuerpo. Por esta razón, es importante para titular el anticuerpo que se utiliza en la etapa final, de manera que la señal de una célula positivamente manchado es aproximadamente dosórdenes de magnitud mayor que el de una célula teñida negativamente. De esta manera, incluso si la intensidad de señal de una célula con tinción positiva se reduce en las células que se han sometido al procedimiento de aislamiento, estas células positivas todavía será bien separado de las células negativas en la trama de citometría de flujo. Si se utiliza la auto-compensación, las muestras de control de manchas individuales deben estar preparados. Los anticuerpos que hemos generado están disponibles para su compra en las instalaciones de anticuerpos del Centro de Cáncer Sloan monocolonal Memorial. Hemos tenido el mejor éxito con el uso de anticuerpos IgG monoclonal no marcado. Hemos llevado a cabo el protocolo con anticuerpos policlonales VSG, pero los anticuerpos policlonales de vez en cuando podemos reconocer otros VSG se prefieren los anticuerpos monoclonales así. identidad VSG se puede determinar por secuenciación de cDNA VSG generada a partir de la amplificación de secuencias conservadas en la VSG 3'UTR y el líder empalmado. Un anticuerpo particular puede hacerse la prueba de especificidad en aislados previamente conmutadalas células que la identidad VSG se ha determinado como se acaba de describir.
El protocolo que se presenta aquí tiene una serie de ventajas. Se puede utilizar tanto para aislar conmutadores para su posterior análisis y para cuantificar el número de conmutadores en una población dada. También se puede utilizar para aislar una variante particular de interés, siempre que un anticuerpo está disponible para que la variante. También es posible llevar a cabo este protocolo usando tripanosomas aisladas de animales, a condición de que las células rojas de la sangre se eliminan usando perlas anti-Ter119 recubierto magnéticos de acuerdo con el protocolo del fabricante. No hemos probado el límite inferior para el número de tripanosomas necesarios, pero hemos realizado con éxito utilizando el protocolo de 2,5 - 10 millones tripanosomas de 250 l de sangre. Finalmente, el protocolo se puede utilizar en conjunción con el análisis de fluctuación para obtener la frecuencia de conmutación en una población dada.
El procedimiento de aislamiento es bastante fast, teniendo 3-4 hr de principio a fin en función del número de muestras, y por lo tanto es más eficiente que los métodos anteriores que requerían la inmunización previa de ratones o cepas especializadas que contienen marcadores de resistencia a fármacos. El método está limitada por el hecho de que se requieren anticuerpos contra el VSG de partida, sin embargo. Sin tales reactivos, un método alternativo, como VSG-ss podría ser una opción más apropiada para medir los cuales VSG se expresan en una población dada 10.
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Acknowledgments
Nos gustaría reconocer Cruz de San Jorge de asesoramiento general sobre la biología tripanosoma. Este trabajo también fue apoyado por una beca de la CME Fundación Bill y Melinda Gates para DS, un NSF Graduate Research Fellowship (DGE-1325261) para MRM y un NIH / NIAID (subvención # AI085973) para FNP. Agradecemos a Galadriel Hovel-Miner para el uso de la cepa que contiene el gen y el reconocimiento del sitio I-SCEI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| unlabeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| fluorophore labeled anti-VSG antibody | n/a | n/a | VSG antibody is made in house |
| HMI-9 media | n/a | n/a | HMI-9 is made in house |
| Propidium Iodide | BD Pharmingen | 556463 | |
| CountBright absolute counting beads | Thermofisher Scientific | C36950 | |
| LD columns | Miltenyi Biotech | 130-042-901 | |
| MACS magnet | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| MACS magnetic separator | Miltenyi Biotech | 130-042-302 | |
| vortex adapter-60 | ThermoFisher scientific | AM10014 | |
| flow cytometer | Coulter | n/a | |
| flow cytometer analysis software | FloJo | n/a |
References
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