Summary
Här beskriver vi en ny metod för att studera protein import till isolerade kloroplaster under stress. Metoden är snabb och enkel, och kan användas för att studera konsekvenserna av olika stressförhållanden för kloroplast protein import, och motsvarande regleringsmekanismer.
Abstract
Kloroplaster är organeller med många viktiga roller i växter, som omfattar inte bara fotosyntes men många andra metabola och signalfunktioner. Vidare kloroplaster är kritiska för växt svar på olika abiotisk stress, såsom salthalt och osmotiska påkänningar. En kloroplast kan innehålla upp till ca 3000 olika proteiner, varav vissa kodas av sin egen arvsmassa. Dock är majoriteten av kloroplast proteiner kodas i kärnan och syntetiseras i cytosolen, och dessa proteiner måste importeras till kloroplasten genom translocons på kloroplasten kuvert membran. Nyligen genomförda studier har visat att kloroplast proteinimport kan aktivt regleras av stress. För att biokemiskt undersöka en sådan reglering av protein import under stressförhållanden, utvecklade vi den metod som beskrivs här som en snabb och enkel procedur som lätt kan uppnås i alla laboratorier. I denna metod är växter som odlas under normala conditions och sedan utsätts för stress villkor i flytande kultur. Växtmaterial uppsamlas, och kloroplaster frigörs sedan genom homogenisering. Den råa homogenatet separeras genom densitetsgradientcentrifugering, vilket möjliggör isolering av intakta kloroplaster. Kloroplast avkastning bedöms genom att räkna, och kloroplast intactness kontrolleras under ett mikroskop. För proteinimportanalyser, är renade kloroplaster inkuberas med 35 S radiomärkt i prekursor vitro översatt proteiner, och tidsförlopp experiment genomförs för att möjliggöra jämförelser av importhastigheter mellan genotyper under stressförhållanden. Vi presenterar data som genereras med denna metod som visar att graden av protein import till kloroplaster från en reglerande mutant specifikt ändras enligt osmotiska stressförhållanden.
Introduction
Kloroplaster är mycket rikligt organ som finns i de gröna vävnader av växter. De är kända för sin avgörande roll i fotosyntesen, en process som använder ljusenergi för att omvandla koldioxid till socker och därigenom stödja nästan allt liv på jorden 1. Dessutom kloroplaster (och bredare familj av relaterade organ kallas plastider) spela många andra viktiga roller i växter, inklusive biosyntesen av aminosyror, lipider, pigment, och avkänning av signaler från omgivningen, såsom gravitation och patogen utmaning. Fotosyntes genererar reaktiva syreradikaler (ROS) som biprodukter, vilka under vissa omständigheter har användbara roller, men om överproduceras kan orsaka skadliga eller till och med dödliga effekter. Överproduktion av ROS är särskilt främjas av ogynnsamma miljöförhållanden, och därmed kloroplaster är nära knutna till svar på abiotisk stress, såsom salthalt och osmotiska påkänningar 2.
Chloroplasts har en komplex struktur. Varje kloroplast är omgivet av ett dubbelmembran yttre skikt kallas kuvertet, som består av yttre och inre membran. Internt finns det en annan membransystem kallas tylakoider, där ljusreaktioner i fotosyntesen sker. Mellan de två membransystem finns det en vattenhaltig kammare samtal stroman, som är involverat i kol fixering. En kloroplast kan innehålla upp till ~ 3000 olika proteiner, och de allra flesta av dessa proteiner syntetiseras i cytosolen i prekursorform och måste importeras till organell genom särskilda protein translocons i kuvertet membranen 1. Intressant nog har senaste arbete indikerat att kloroplast protein import aktivt regleras, och så kan utöva en betydande grad av kontroll över kloroplasten proteom. Till exempel, rapporterades det i 2015 att protein import kan svara på abiotisk stress genom direkt reglering av överflödet av the translocon vid den yttre membranhöljet av kloroplaster (TOC) vid ubiquitin-proteasom-systemet 3.
Med hjälp av renade kloroplaster och prekursor vitro syntetiserade proteiner, kan protein import beredas in vitro 4,5. Således kan in vitro-metoder kan användas för att bedöma andelen import i olika muterade växter 6, vilket har varit ett kritiskt förhållningssätt för analys av förmodade komponenter av proteinet import maskiner och för att upptäcka mekanismerna bakom protein import och dess reglering. Dessutom kan kloroplaster behandlas med ytterligare fraktionering eller proteas matsmältningen, efter in vitro import, vilket kan underlätta studier av sub-organeller lokalisering och topologi av kloroplast proteiner 7,8.
För att studera regleringen av protein import av stress, har vi ändrat vår rutin kloroplast isoleringsmetod som vi kommer att beskrivahär. Viktigt var kloroplaster isolerade från växter som hade odlats på standard Murashige och Skoog (MS) agarmedium under 8 dagar och sedan överförts i flytande MS-medium kompletterat med stress, vilket ger en relativt kort, kontrollerad stress behandling. Utbytet och kompetens kloroplaster isolerade från dessa stressbehandlade plantor är kompatibla med den nedströms in vitro protein import analys 3. Förutom kloroplasten isolering protokoll presenterar vi vår rutinmetod för in vitro-protein import, som har visat sig vara robust och används ofta 3,9-12.
Protocol
1. Tillväxt av Arabidopsis växter och stress behandling
- Förbereda ett L av Murashige och Skoog (MS) medium genom att tillsätta 4,3 g MS Basal Salt Mixture, 10 g sackaros, 0,5 g 2- (N-morfolino) etansulfonsyra (MES) till avjoniserat vatten upp till 1 L, och justera pH till 5,7 med kaliumhydroxid (KOH). Lägga 6 g phytoagar och autoklav under 20 minuter vid 120 ° C.
- Innan stel, häll mediet i runda petriskålar (diameter 9 cm, höjd 1,5 cm, med 20-25 ml MS-medium per platta). Låt plattorna torka för ~ 1 timme i en huv med laminärt flöde före stängning locken.
- Placera Arabidopsis thaliana frön i ett 1,5 ml provrör för ytsterilisering genom att tillsätta 1 ml av 70% (volym / volym) etanol innehållande 0,02% (volym / volym) Triton X-100 och kontinuerligt skakning under 5-10 min. För varje genotyp / skick, förbereda 10 petriskålar vardera bär ~ 100 - 150 plantor.
- Vänta i ungefär 10 s tills fröna sedimentera tillbotten av röret, och sedan kasta supernatanten genom pipettering. Tillsätt 1 ml 100% etanol och skaka röret igen under 10 minuter.
- Förbered huv med laminärt flöde samtidigt som fröna sterilisering. Ta en bit filterpapper per prov, vik den på mitten för att underlätta sådd och dra den i 100% etanol i huven. Vänta tills den torkar ut helt. Observera att 100% etanol används som det avdunstar snabbare än 70% etanol.
- Överför fröna på filterpapper genom att pipettera med hjälp av en 1 ml pipettspets skära ~ 5 mm från den fina änden. Låt dem torka, vilket bör ta ca 10 - 15 min.
- Sugga ~ 100 - 150 steriliserade fröna jämnt på varje MS-medium Petri plattan, och försegla varje platta med kirurgtejp.
- Lagra plattorna upp och ned vid 4 ° C under 2 - 4 d för att uppmuntra och synkronisera groning. Gamla frön kan behöva stanna längre (upp till en vecka) vid 4 ° C.
- Överföra plattorna till ett växtvävnadsodlingskammaren och lämnar dem upp och upp.Odla växter för 8 d under lång dagars cykel (16 h 100 fimol · m - 2 · s - 1 ljus, 8 h mörker) vid 20 ° C.
- För stress behandling, när växterna är 8 d gammal, i flöde huva, överföra dem från agarmediet, genom att försiktigt skrapa bort dem för hand bär etanol steriliserade handskar, i en steriliserad kolv med flytande MS-medium innehållande stress (t.ex. 200 mM mannitol). Undvik att över agarmedium. Täck kolven munnen med steriliserad folie och låt växterna att växa under samma betingelser som i steg 1,8 för en ytterligare 2 d på en skakapparat med försiktig skakning (~ 100 rpm).
2. Att göra en prekursorprotein genom transkription in vitro / Translation
Obs: Detta protokoll förutsätter användning av Arabidopsis fotosystem I subenheten D föregångare (pPsaD) som mall / preprotein, men metoden är kompatibel med andra.
OBS: Alla dessa steg använder standard molekylära kloningstekniker.
Varning: Använd handskar, laboratorie kläder och säkerhets glasSES vid hantering av radioaktivt material. Övervaka och sanera arbetsytan och utrustning. Kassera allt radioaktivt avfall i en godkänd avfallsbehållare.
3. Kloroplast Isolering
- Bered följande stamlösningar:
- Förbereda Kloroplast Isolation Buffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumklorid(MgCl2), 10 mM etylenglykol tetraättiksyra (EGTA), 10 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 20 mM natriumvätekarbonat (NaHCO 3), 40 mM 4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra (HEPES) ; justera till pH 8,0 med KOH. Förbered två L 2x CIB, göra portioner och hålla dem vid -20 ° C för långtidsförvaring eller vid 4 ° C för korttidslagring. För att göra 1x CIB, späd 2x CIB 1: 1 med destillerat vatten; detta kan beredas på dagen för kloroplast isolering experiment.
- Förbereda HEPES-MgSO 4 -Sorbitol buffert (HMS, 1 x): 50 mM HEPES, 3 mM magnesiumsulfat (MgSO 4), 0,3 M sorbitol; justera till pH 8,0 med natriumhydroxid (NaOH). Förbered 400 ml buffert, göra portioner och hålla dem vid -20 ° C för långtidsförvaring eller vid 4 ° C för korttidslagring.
- Genomför alla av följande procedurer i kylrummet eller på is. Förkyla alla lösningar, anordningar, utrustning, och rotorer innan stArting.
- Förbereda en kontinuerlig densitetsgradient genom att blanda 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB-buffert, och 5 mg glutation i ett 50 ml centrifugrör, och centrifugering av blandningen vid 43000 x g under 30 min (broms av) vid 4 ° C. Efter centrifugering, hantera röret försiktigt för att undvika att störa gradienten och hålla den på is för senare användning.
- Överför 100 ml 1x CIB per genotyp / tillstånd till ett 1 L bägare.
- Ta bort plantorna från det flytande mediet genom att tippa dem i en sil, och överföra dem till en annan CIB innehållande bägare; sedan, skölj vävnaden med CIB att avlägsna eventuellt kvarvarande vätskemedium innan du byter den med 100 ml färsk CIB.
- För homogenisering använder totalt 100 ml 1x CIB per prov i fem på varandra följande omgångar av homogenisering, varje runda att använda 20 ml av färsk CIB hölls i en 50 ml bägare.
- För den första omgången av homogenisering, överför växtvävnaden in i 50 ml bägare för hand, vilket gör atttidigare innehav buffert rinna genom fingrarna. Försök att använda de flesta av vävnaden i den första omgången, men se till att den är nedsänkt med buffert; Om detta inte är möjligt, införa återstående oanvänd vävnaden vid den andra omgången.
- Placera sond av vävnadshomogenisator i vävnaden och homogenisera med två pulser av 1 - 2 s vardera. Filtrera homogenatet genom två skikt av filtrering trasa i ett 250 ml centrifugrör genom försiktig pressning. Behåll filtratet, och överföra vävnaden tillbaka till 50 ml bägare.
- Placera en andra 20 ml CIB portion i 50 ml bägare, tillsätta eventuella kvarvarande vävnad som inte används i den första omgången av homogenisering, och upprepa homogenisering och filtreringssteg. Således, upprepa steg 3,5 och 3,6 tills alla 100 ml CIB har använts (dvs, 5 portioner av 20 ml) och kombinera de resulterande filtraten.
- Centrifugera den poolade homogenatet vid 1000 x g under 5 min (bromsa) vid 4 ° C, och häll bortsupernatanten omedelbart efter slutförandet av centrifugeringen, noga med att inte störa pelleten. Återsuspendera pelleten i den återstående supernatanten kvar i röret genom försiktig omskakning av röret på is. Inte resuspendera kraftigt genom att pipettera eller vortexa.
- Försiktigt överföra homogenatet på toppen av den färdiga kontinuerlig densitetsgradient, med användning av en Pasteur-pipett för att tillämpa den via väggen hos mottagningsröret. Undvika att störa gradienten. Centrifugera i en swinging-bucket rötor vid 7800 x g under 10 min (broms av) vid 4 ° C.
OBS: Två gröna band kan ses i gradienten efter centrifugering: det undre bandet innehåller intakta kloroplaster, och det övre bandet innehåller trasiga kloroplaster. - Kassera den övre bandet genom pipettering, och sedan överföra det lägre bandet med en Pasteur-pipett till ett färskt 50 ml centrifugrör, behålla en volym av upp till 8 ml per gradient.
- Lägg ~ 25 ml 1x HMS buffert i röret och invertera röret två gånger to tvätta Percoll från kloroplaster. Placera röret igen i swinging-bucket rötor och centrifugera vid 1000 x g under 5 min (broms på) vid 4 ° C.
- Häll av supernatanten och försiktigt återsuspendera kloroplasten pelleten i de kvarvarande HMS kvar i röret genom försiktig omskakning av röret på is. Tillsätt ytterligare 100 - 300 mikroliter av HMS vid behov (baserat på storleken av pelleten och räkningen i avsnitt 4), men försök att inte späda ut provet för mycket.
- Håll kloroplasterna på is. Varje gång innan kloroplaster används för tillämpningar efter, skaka röret för att återsuspendera dem. Använd alltid en klippa pipettspets (med en förstorad por) för att överföra kloroplaster.
4. Analys av avkastningen och oskadade Chloroplasts
- Tillsätt 5 mikroliter av isolerade kloroplaster till 495 mikroliter av 1x HMS-buffert i en 1,5 ml rör, och sedan blanda försiktigt genom att vända röret för att erhålla en 1: 100 spädning.
- Place ett täckglas ovanpå räkningen kammare hemocytometer. Långsamt pipett ~ 40 - 60 mikroliter av den utspädda kloroplast suspensionen in i spalten mellan täckglaset och räknekammaren. Med hjälp av en faskontrastmikroskop med en 10X eller 20X objektiv, intakta kloroplaster titta runt och ljus och är omgivna av en gloria av ljus.
OBS: Under mikroskop, det finns en 1 mm 2 räknar med 25 stora rutor, var och en innehållande 16 små fyrkanter i mitten av räkningskammaren. - Räkna antalet kloroplaster i 10 stora kvadrater. Antalet kloroplaster per stort torg bör i genomsnitt mellan 10 och 30. Om för få eller för många kloroplaster finns, justera utspädningsfaktorn (steg 4,1 ovan) därefter, och upprepa proceduren.
- Beräkna antalet kloroplaster per ml (koncentration) enligt följande: n (det genomsnittliga antalet kloroplaster per stort torg beräknas i steg 4,3) × 25 (totalt antal stora torg) × 100 (spädningsfaktorn) × 10 4 (skalfaktor för att uttrycka data per 1 ml, eftersom volymen ovanför 25 rutor är 0,1 mm 3).
- Beräkna den faktiska avkastningen av kloroplaster genom att multiplicera koncentrationen av volymen av kloroplasten erhållna suspensionen i steg 3,12. Normalt kan mer än 50 x 10 6 kloroplaster erhållas.
5. Kloroplast Protein Import
- Bered följande stamlösningar:
- Förbered 10x HMS buffert: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO 4 och 3,0 M sorbitol; justera till pH 8,0 med NaOH. Förbered 50 ml av denna buffert, prov, och förvara vid -20 ° C för långtidsförvaring och vid 4 ° C för korttidslagring.
- Förbered Import stoppbuffert: 50 mM EDTA upplöstes i 1x HMS buffert. Förbered 50 ml av denna buffert, prov, och förvara vid -20 ° C.
- Förbereda 2x Protein laddningsbuffert: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (volym / volym) glycerol, 2% (vikt/ Volym) SDS, 0,005% (vikt / vol) bromfenolblått. Gör 50 ml och lagra vid 4 ° C. Precis före användning, tillsätt 100 | il av en M 1,4-ditiotreitol (DTT) till 900 mikroliter av buffert.
- För att köra en tidsförlopp med 3 tidpunkter, förbereda 3 rör var och en innehåller en 130 mikroliter alikvot av importstoppbuffert, och lämna dem på is. Förbered en 450 mikroliter import reaktion i ett 2 ml rör (per genotyp / skick). Tina alla ingredienser strax före användning.
- För en import reaktion, typiskt använda 10 x 10 6 kloroplaster i A mikroliter volym; till exempel om kloroplasten koncentrationen är 2,5 x 10 8 / ml, använd 40 mikroliter kloroplast upphängnings. Tre tidpunkter behöver 3 × A il (dvs 120 mikroliter i vårt exempel).
- Blanda reactions komponenter på is i följande ordning: destillerat vatten (för att göra den totala volymen 600 mikroliter), B il 10x HMS-buffert (där B = [600-3 × A] / 10, det vill säga, 48 i vårt exempel), 12 mikroliter1 M glukonsyra (kaliumsalt), 6 | il 1 M NaHCOs 3, 6 | il 20% (vikt / volym) BSA, 30 mikroliter 100 mM adenosin-5'-trifosfat magnesiumsalt (MgATP), 24 | il 250 mM metionin (inte radiomärkt ), och 30 mikroliter prekursorproteinet. Omedelbart innan import reaktionen, tillsätt 3 × En mikroliter av kloroplaster och blanda genom att försiktigt knacka på röret.
- Inkubera reaktionsröret vid 25 ° C i ett vattenbad under 100 | j, mol · m - 2 · s - 1 ljus. Ibland flick rören för att återsuspendera kloroplaster.
- För att genomföra en tidsförlopp, återkalla 130 mikroliter alikvoter från reaktionen vid de erforderliga tidpunkter inom det linjära området för import, som för pPsaD är upp till ~ 12 min (4-, 8- och 12-min tidpunkter är lämpliga I detta fall). Det linjära området perioden kan variera för olika proteiner 14. Således föreslås att testa varje enskild preprotein innan för att optimera than tidpunkter.
- Omedelbart efter tillbakadragande, överföra varje 130 mikroliter alikvot till ett rör iskall import stoppbuffert, blanda genom att försiktigt knacka på röret, och behålla alla rören på is tills tidsförloppet har avslutats.
- Centrifugera alla prover i 30 sek vid 12000 x g i en mikrofug, kassera supernatanterna genom pipettering, och återsuspendera pellets i 15 | il av 2x Protein laddningsbuffert genom att vortexa.
- Analysera alla prover plus pPsaD styringång (innehållande pPsaD motsvarande 10% av det belopp till varje import reaktion från steg 2,7) genom standard SDS-PAGE och autoradiografi, fluorografi eller fosforavbildning 15. Använd bildanalys programvara för att kvantifiera och analysera resultaten. För att ge en indikation på import effektivitet, mängden importerat protein i olika genotyper / förhållanden kan bedömas genom mätning av radioaktiviteten i samband med varje mogen band.
Representative Results
Ett exempel kloroplast protein import experiment med 3 tidpunkter visas i figur 1. PSAD är ett ~ 18 kD-komponenten av fotosystem I exponeras för stroman, med en prekursorform av ~ 23 kD 16. Psad valdes för in vitro-protein import analys här eftersom dess steady-state-nivåer är förhöjda i SP1 mutanten, i förhållande till WT, under stressförhållanden, vilket tyder på en förändring i dess effektivitet import mutanten 3. SP1 mutant bär en defekt i en viktig reglerare av kloroplast protein import maskiner - SP1 protein 3. För kloroplaster isolerade från växter som odlas under normala förhållanden, fanns det ingen uppenbar skillnad i psad import mellan SP1 och WT (data visas ej) 3. Men för att med hjälp av de metoder som beskrivs här bedöma psad import till kloroplaster isolerade från osmotisktstressutsatta plantor erhölls en klar skillnad detekteras. Medan vi observerade ackumuleringen av mogna proteinform på ett tidsberoende sätt med båda genotyper, graden av importen var betydligt lägre för WT kloroplaster än för sp1 kloroplaster (Figur 1), vilket överensstämmer med våra tidigare resultat 3, och avslöjar en viktig roll för SP1 protein i regleringen av kloroplast import av psad under stressförhållanden.
Figur 1. En Protein Import analys utförts med hjälp Kloroplaster isolerats ur växter som odlats under Osmotiska stressförhållanden. Chloroplasts isolerades från en 10 dagar gammal WT (Col-0) och en sp1 muterade Arabidopsis växter som odlas under stressförhållanden (200 mM mannitol) för 2 d. (A) Protein import genomfördes med hjälp av [35S] -Methionine-märkt pPsaD och fick fortgå under 4, 8 och 12 min före analys med SDS-PAGE och fosforavbildning. Parallellt pPsaD 10% styringång omfattande in vitro översatt protein (IVT) analyserades. Föregångaren (pre) och moget (matta) former av pPsaD anges, medan i Däremellan finns två band som sannolikt motsvarar stympade eller proteolyseras translationsprodukter eftersom deras intensitet inte ändras under tidsförloppet (*). (B) För att jämföra priser mellan import till kloroplaster från WT och SP1 växter som odlas under stressförhållanden, var intensiteten för varje band motsvarar importerad moget protein i en kvantifierad. Alla data uttrycks som procent av mängden importerat protein i kloroplaster från WT växter efter 12 min. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Vi visade nyligen att kloroplast protein import kan aktivt regleras av stress, vilket är avgörande för kloroplast funktion och växt överlevnad tre. I denna studie, att övervaka en sådan reglering, ändrade vi vår kloroplast isolering och import analys vitro förfaranden för att möjliggöra en bedömning av importkapacitet av växter som odlas under stressförhållanden. Resultaten visade en viktig roll för SP1 i kloroplast protein import förordningen.
Konventionella in vitro import analyser använda växter som odlas på standard MS agarmedium 6,17,18. I fallet med sp1 mutanten som beskrivs här, hade sådana konventionella analyser inte avslöja några skillnader i protein import i förhållande till WT 3. Dock är betydelsen av SP1 i regleringen protein import klart avslöjas när protein import bedöms under stressförhållanden med användning av de metoder som beskrivs häri (Figur 1). Även om det justay inte vara möjligt att direkt jämföra importera data från stressförhållanden analysen med de som erhållits från konventionella analyser (såsom de metoder utnyttjar växter som odlas i flytande kultur och på agarmedium, respektive), jämförelser mellan stress och icke-stressförhållanden är möjliga under förutsättning att växterna alla odlas i samma flytande odlingsmedium, med eller utan stressfaktorer.
Jämfört med stress behandling på agarmedium, är vätskekultur mer bekvämt för behandling av det stora antalet växter som behövs för in vitro import analyser. Dessutom underlättar det en enhetlig tillämpning av stress till alla växter, vilket är särskilt viktigt för kortfristiga spännings behandlingar. Den metod som presenteras här har tillämpats för att studera den osmotiska stressen med hjälp av mannitol behandling, men skulle lätt kunna anpassas till ett brett spektrum av andra stressfaktorer, t ex kortsiktiga salt stress och oxidativ stress, för vilken motsvarande stress kunde be tillämpas på samma sätt via flytande MS-medium. För andra typer av påfrestningar, föreslår vi graden av stress först optimeras; alltför svåra behandlingar kan ha negativa effekter på avkastning och / eller import kompetens isolerade organeller.
Det finns flera viktiga steg i protokollet som man bör ägna särskild uppmärksamhet, som beskrivs nedan.
Den optimala agarkoncentration för MS-medium kan skilja (0,6-0,9%, vikt / volym) beroende på tillverkare. Således, är det rekommenderat att empiriskt optimera agarkoncentration innan du börjar experiment. Mediet bör inte vara så mjuk att den håller sig till vävnaden vid skörd steg (steg 1,9), inte heller ska det vara så svårt att det hämmar växten rotutveckling. Sackaroskoncentrationen kan också justeras i enlighet med de växter som används. När man arbetar med speciellt sjuka mutanter, MS-medium kompletterat med 2-3% (vikt / volym) sackaros kan hjälpa växterna att växa bättre. när appenliggande spännings behandlingar, är det inte bra att överföra mycket gamla växter för att det flytande mediet (t ex,> 14 dagar gammal). Detta beror på att de mer utvecklade rötter äldre anläggningar är lättare skadad under överföring.
När det gäller transkriptionen / translationssystemet, det finns 2 stora system: de som är baserade på vetegroddar, och de som är baserade på kaninretikulocyt. Dessa kit kan använda olika mallar, såsom arise plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Kit är också specifika för T3, T7 och SP6 initiativtagare. Observera att satsen vi rekommenderar här är endast avsedd för användning tillsammans med PCR-produkter och T7-promotorn. Men av okänd anledning, en del radiomärkta preproteins gjorda med detta system kan inte fungera effektivt i import analys; i sådana fall kan man överväga att prova en vetegroddsextrakt system eller ett retikulocytlysat-system avsett för plasmid mallar. Man kan också förbättra resultatet av transkription / translation reverkan genom modifiering av reaktionsbetingelserna enligt tillverkarens instruktionsbok.
Det är viktigt att börja kloroplast isolering tidigt på morgonen (eller tidigt på ljuscykel av odlingskammaren) för att undvika ansamling av stärkelse inne i kloroplasterna till följd av fotosyntesen, som kan hindra isolering av intakta organeller. Kloroplasten isoleringsförfarandet måste göras snabbt utan onödiga förseningar, och isolerade kloroplasterna måste alltid förvaras kallt. Detta är att mildra effekterna av observationen att isolerade kloroplaster kommer gradvis att förlora sin livskraft, vilket inte är bra. Om du använder nyligen tinade CIB eller HMS buffert, vara noga med att blanda bufferten väl före användning för att erhålla en homogen lösning. De optimala betingelserna för homogenisering av växtmaterial har fastställts empiriskt, och kan variera om en annan vävnadshomogenisator användes.
Om de olika växt genotyper innehåller Similar klorofyllnivåer, kan klorofyll kvantifiering användas som ett alternativt sätt att normalisera proverna innan de utför import analyser. Klorofyll kan bestämmas spektrofotometriskt efter extraktion av ett prov av de isolerade kloroplaster i 80% (vol / vol) vattenlösning av aceton 19,20. Men om import andelen växter som visar olika klorofyllinnehåll (t.ex. mutanter med chlorotic fenotyper) skall jämföras, använd kloroplast antal räknar att normalisera kloroplasten prover i import analyser. Det är särskilt viktigt att resuspendera kloroplaster grundligt i steg 3,11. Otillräcklig resuspension kan lämna aggregat av kloroplaster, som gör det svårt att räkna siffror korrekt och därmed kommer att hindra korrekt belastning i importreaktioner. Om svår aggregering ses under mikroskop (t.ex. aggregat med> 10 kloroplast sammanfogas) fortsätter att skaka kloroplasten provet på is tills aggregates avlägsnas. Det är lättare att resuspendera kloroplaster i en mindre volym av buffert.
Det är viktigt att vara medveten om att proteinimport reaktioner (§ 5) måste utföras med lämpliga försiktighetsåtgärder på grund av deras radioaktiva natur. Nödvändiga försiktighetsåtgärder inkluderar: bär engångshandskar, laboratorie kläder och skyddsglasögon, övervakning och dekontaminering arbetsyta och utrustning, och ta hand om allt radioaktivt avfall i en godkänd avfallsbehållare. Tänk också på att rätt osmotiska trycket är avgörande för att upprätthålla intactness av kloroplaster under import reaktioner, och det är främst upprätthålls av HMS buffert. Eftersom 10x HMS är trögflytande, bör det först värmas upp till RT, och sedan blandas ordentligt, och appliceras med ett snitt pipettspets för att säkerställa mätning av exakta volymer. I import reaktionen kall metionin adderad för att hämma inkorporering av fri radiomärkt metionin till orelaterade chloroplAST proteiner genom organeller översättning under inkubationssteget, medan BSA används för att minimera proteolys genom att fungera som ett substrat för proteaser.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag till PJ från bioteknik och Biological Sciences Research Council (BBSRC, bevilja ref BB / K018442 / 1.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige and Skoog basal salt | Melford | M0221 | |
| phytoagar | Melford | P1003 | |
| 2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) | Melford | B2002 | |
| triton X-100 | Fisher | BPE151-500 | |
| surgical tape (e.g., Micropore, 3M) | 3M | 1530-1 | |
| filter paper | Fisher | FB59023 | |
| Percoll | Fisher | 10607095 | |
| Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) | Sigma | E4378 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher | D/0700/53 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Melford | B2001 | |
| filtration cloth (Miracloth) | Calbiochem | 475855 | |
| 50 mL centrifuge tube | Fisher | CFT-595-040M | |
| 250 mL centrifuge bottle | Fisher | CFT-891-V | |
| Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) | Fisher | 11010070 | |
| Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) | Fisher | 11030083 | |
| centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) | Beckman Coulter | B34182 | |
| fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) | Beckman Coulter | 363930 | |
| fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) | Beckman Coulter | 363058 | |
| swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) | Beckman Coulter | 346963 | |
| radiolabeled [35S] methionine | Perkin Elmer | NEG072002MC | |
| rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) | Promega | L5540 | |
| phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) | Nikon | unavailable | |
| haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) | Hawksley Technology | AC1000 | 0.1 mm depth, 1/400 mm2 |
| cover glasses | VWR | 16004-094 | 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm |
| 1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 2 mL microfuge tubes | Starlab | S1620-2700 | |
| microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) | Eppendorf | unavailable | |
| Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar | Thermo Fisher | SPR-700-310L | |
| gluconic acid (potassium salt) | Fisher | 22932-2500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| MgATP | Sigma | A9187 | |
| methionine | Sigma | M6039 | |
| bromophenol blue | Fisher | B/P620/44 | |
| glycerol | Fisher | G/0650/17 | |
| SDS | Fisher | S/5200/53 | |
| Tris Base | Melford | B2005 | |
| dithiothreitol (DTT) | Melford | MB1015 | |
| image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) | Raytest | unavailable |
References
- Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
- Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
- Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
- Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
- Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
- Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
- Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
- Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
- Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
- Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
- Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
- Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
- Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
- Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
- Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
- Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
- Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
- Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
- Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).
