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Biology

तनावग्रस्त संयंत्रों से पृथक क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन आयात का विश्लेषण

Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54717
Automatic Translation
1, 1
1Department of Plant Sciences, University of Oxford

Summary

यहाँ हम तनाव के तहत पृथक क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन आयात अध्ययन करने के लिए एक नई विधि का वर्णन है। विधि तेजी से और सीधा है, और क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात के लिए अलग तनाव की स्थिति का परिणाम है, और इसी नियामक तंत्र का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Abstract

क्लोरोप्लास्ट पौधों में कई महत्वपूर्ण भूमिका है, जो न केवल प्रकाश संश्लेषण, लेकिन कई अन्य चयापचय और संकेत कार्यों में शामिल हैं के साथ अंगों कर रहे हैं। इसके अलावा, इस तरह के क्लोरोप्लास्ट लवणता और आसमाटिक तनाव के रूप में विभिन्न अजैविक दबावों, संयंत्र प्रतिक्रिया के लिए महत्वपूर्ण हैं। एक क्लोरोप्लास्ट ~ 3000 विभिन्न प्रोटीन, जिनमें से कुछ अपने स्वयं के जीनोम से इनकोड किया गया है अप करने के लिए हो सकता है। हालांकि, क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन का बहुमत नाभिक में इनकोड किया गया है और cytosol में संश्लेषित, और इन प्रोटीनों क्लोरोप्लास्ट लिफाफा झिल्ली पर translocons के माध्यम से क्लोरोप्लास्ट में आयात करने की जरूरत है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से तनाव द्वारा विनियमित किया जा सकता है। biochemically तनाव की स्थिति के तहत प्रोटीन आयात के इस तरह के नियमन की जांच करने के लिए, हम विधि यहाँ एक त्वरित और सरल प्रक्रिया है कि आसानी से किसी भी प्रयोगशाला में प्राप्त किया जा सकता है के रूप में वर्णित विकसित की है। इस विधि में, पौधों सामान्य conditio के तहत बड़े हो रहे हैंएनएस और फिर तरल संस्कृति में तनाव की स्थिति से अवगत कराया। संयंत्र सामग्री एकत्र किया जाता है, और क्लोरोप्लास्ट तो homogenization द्वारा जारी किया जाता है। कच्चे तेल की homogenate घनत्व ढाल centrifugation द्वारा अलग किया जाता है, बरकरार क्लोरोप्लास्ट के अलगाव को सक्षम। Chloroplast उपज गिनती द्वारा मूल्यांकन किया है, और क्लोरोप्लास्ट intactness एक खुर्दबीन के नीचे की जाँच की है। प्रोटीन आयात assays के लिए, शुद्ध क्लोरोप्लास्ट विट्रो अनुवाद अग्रदूत प्रोटीन में 35 एस radiolabeled के साथ incubated रहे हैं, और समय पाठ्यक्रम प्रयोगों तनाव की स्थिति के तहत जीनोटाइप के बीच आयात दरों की तुलना सक्षम करने के लिए आयोजित की जाती हैं। हम इस पद्धति जो बताते हैं कि एक नियामक उत्परिवर्ती प्रोटीन से आयात की दर क्लोरोप्लास्ट में विशेष रूप से आसमाटिक तनाव की स्थिति के तहत बदल दिया है का उपयोग कर उत्पन्न डेटा प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

क्लोरोप्लास्ट अत्यधिक प्रचुर मात्रा में अंगों कि पौधों की हरी ऊतकों में मौजूद हैं। वे प्रकाश संश्लेषण में उनकी महत्वपूर्ण भूमिका है, एक प्रक्रिया प्रकाश ऊर्जा का उपयोग करता है कि चीनी के लिए कार्बन डाइऑक्साइड बदलने और इस प्रकार पृथ्वी पर 1 लगभग सभी के जीवन का समर्थन करने के लिए अच्छी तरह से जाना जाता है। इसके अलावा, क्लोरोप्लास्ट (और संबंधित अंगों प्लास्टिडों बुलाया के व्यापक परिवार) पौधों में कई अन्य महत्वपूर्ण भूमिकाओं, अमीनो एसिड, लिपिड, पिगमेंट के biosynthesis, और जैसे गुरुत्वाकर्षण और रोगज़नक़ चुनौती के रूप में पर्यावरण के संकेतों के संवेदन सहित खेलते हैं। प्रकाश संश्लेषण, जो कुछ निश्चित परिस्थितियों में उपयोगी भूमिका है द्वारा उत्पादों के रूप में प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) उत्पन्न करता है, लेकिन अगर overproduced हानिकारक या भी घातक प्रभाव हो सकता है। आरओएस के overproduction विशेष रूप से पर्यावरण पर प्रतिकूल परिस्थितियों से पदोन्नत किया है, और इस तरह क्लोरोप्लास्ट बारीकी से इस तरह लवणता और आसमाटिक तनाव 2 के रूप में अजैविक दबावों, के लिए प्रतिक्रियाओं से जुड़ी हैं।

चौधरीloroplasts एक जटिल संरचना है। प्रत्येक क्लोरोप्लास्ट बाहरी और भीतरी झिल्ली के होते हैं जो एक डबल झिल्ली बाहरी परत लिफाफा कहा जाता है, से घिरा हुआ है। आंतरिक रूप से, वहाँ एक और झिल्ली प्रणाली thylakoids, जहां प्रकाश संश्लेषण के प्रकाश प्रतिक्रियाओं जगह ले कहा जाता है। दोनों के बीच झिल्ली सिस्टम एक जलीय डिब्बे कॉल स्ट्रोमा, जो कार्बन निर्धारण में शामिल किया जाता है। एक क्लोरोप्लास्ट अप ~ 3,000 से अलग प्रोटीन शामिल कर सकते हैं, और इन प्रोटीनों के विशाल बहुमत के अग्रदूत के रूप में cytosol में संश्लेषित कर रहे हैं और लिफाफा झिल्ली 1 में समर्पित प्रोटीन translocons के माध्यम से organelle में आयात करने की जरूरत है। दिलचस्प है, हाल ही में काम संकेत दिया है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से नियंत्रित किया जाता है, और इसलिए क्लोरोप्लास्ट proteome पर नियंत्रण का एक महत्वपूर्ण स्तर लागू करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, यह 2015 में सूचना मिली थी कि प्रोटीन आयात वीं की बहुतायत के प्रत्यक्ष विनियमन के माध्यम से अजैव तनाव का जवाब कर सकते हैंक्लोरोप्लास्ट (टीओसी) यूबीक्यूटिन-एंटीबॉडी प्रणाली 3 से की बाहरी झिल्ली लिफाफे पर ई translocon।

शुद्ध क्लोरोप्लास्ट का प्रयोग और इन विट्रो संश्लेषित अग्रदूत प्रोटीन में, प्रोटीन आयात विट्रो 4,5 में पुनर्गठन किया जा सकता है। इस प्रकार, इन विट्रो तरीकों अलग उत्परिवर्ती पौधों 6, जो प्रोटीन आयात मशीनरी के ख्यात घटकों के विश्लेषण के लिए और तंत्र प्रोटीन आयात और उसके विनियमन अंतर्निहित खोज के लिए एक महत्वपूर्ण दृष्टिकोण से किया गया है में आयात की दर का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, क्लोरोप्लास्ट आगे विभाजन या प्रोटीज पाचन, इन विट्रो आयात के बाद, जो उप organellar स्थानीयकरण और क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन 7.8 के टोपोलॉजी पर अध्ययन की सुविधा कर सकते हैं के साथ कार्रवाई की जा सकती है।

तनाव से प्रोटीन आयात का विनियमन का अध्ययन करने के लिए, हम अपनी दिनचर्या क्लोरोप्लास्ट अलगाव विधि को संशोधित किया है के रूप में हम वर्णन करेंगेयहाँ। महत्वपूर्ण बात है, क्लोरोप्लास्ट पौधों है कि 8 दिनों के लिए मानक Murashige और Skoog (एमएस) मध्यम अगर पर हो गई थी और फिर तरल एमएस माध्यम तनाव के साथ पूरक में स्थानांतरित कर, एक अपेक्षाकृत कम, नियंत्रित तनाव उपचार उपलब्ध कराने से अलग थे। उपज और इस तरह के तनाव का इलाज पौधों से अलग क्लोरोप्लास्ट की योग्यता विट्रो प्रोटीन आयात परख 3 में नीचे की ओर के साथ संगत कर रहे हैं। क्लोरोप्लास्ट अलगाव प्रोटोकॉल के अलावा, हम इन विट्रो प्रोटीन आयात, जो मजबूत साबित हो गया है और व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है 3,9-12 के लिए हमारी दिनचर्या तरीका मौजूद है।

Protocol

1. Arabidopsis पौधों के विकास और तनाव उपचार

  1. 1 एल विआयनीकृत जल अप करने के लिए एमएस बेसल नमक के मिश्रण का 4.3 जी, 10 ग्राम सूक्रोज, 0.5 ग्राम 2- (एन morpholino) ईथेन सल्फोनिक एसिड (एमईएस) जोड़कर Murashige और Skoog (एमएस) के माध्यम से 1 एल तैयार है, और समायोजित पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड के साथ 5.7 पीएच (KOH)। 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए phytoagar और आटोक्लेव के 6 ग्राम जोड़ें।
    1. solidification से पहले, गोल पेट्री प्लेटों में मध्यम (व्यास 9 सेमी, ऊंचाई 1.5 सेमी, 20 के साथ - प्रति प्लेट 25 एमएल एमएस मध्यम) डालना। प्लेटों पलकों बंद करने से पहले एक लामिना का प्रवाह हुड में ~ के लिए 1 घंटे सूखे की अनुमति दें।
  2. 70% के 1 एमएल (वी / वी) 0.02% (वी / वी) ट्राइटन X-100 युक्त और लगातार 5-10 मिनट के लिए मिलाते हुए इथेनॉल जोड़कर सतह नसबंदी के लिए एक 1.5 एमएल टेस्ट ट्यूब में Arabidopsis thaliana के बीज रखें। 150 पौध - प्रत्येक जीनोटाइप / स्थिति के लिए, 10 पेट्री प्लेटों एक नौका में 100 ~ तैयार करते हैं।
  3. के बारे में 10 एस के लिए जब तक प्रतीक्षा करने के लिए व्यवस्थित बीजट्यूब के नीचे, और फिर pipetting द्वारा सतह पर तैरनेवाला त्यागें। 100% इथेनॉल के 1 एमएल जोड़ें, और 10 मिनट के लिए फिर ट्यूब हिला।
  4. जबकि बीज स्टरलाइज़ रहे हैं लामिना का प्रवाह हुड तैयार करें। नमूना प्रति फिल्टर पेपर का एक टुकड़ा ले लो, आधे में गुना की बुआई की सुविधा के लिए, और हुड में 100% इथेनॉल में लेना। जब तक यह पूरी तरह से बाहर सूख जाता है रुको। नोट के रूप में यह 70% इथेनॉल की तुलना में अधिक तेजी से उड कि 100% इथेनॉल प्रयोग किया जाता है।
  5. 1 एमएल पिपेट टिप कटौती ~ 5 ठीक छोर से मिमी का उपयोग कर pipetting द्वारा फिल्टर पेपर पर बीज स्थानांतरण। 15 मिनट - उन्हें सुखाने के लिए है, जो लगभग 10 से लेना चाहिए की अनुमति दें।
  6. समान रूप से 150 निष्फल बीज प्रत्येक एमएस माध्यम पेट्री थाली पर, और सर्जिकल टेप के साथ एक थाली सील - बोना ~ 100।
  7. प्लेटों स्टोर उल्टा के लिए 2 से 4 डिग्री सेल्सियस पर नीचे - 4 घ को प्रोत्साहित करने और अंकुरण सिंक्रनाइज़ करने के लिए। पुराने बीज अब 4 डिग्री सेल्सियस पर (एक सप्ताह तक) रहने की जरूरत हो सकती है।
  8. एक प्लान्ट टिशू कल्चर चैम्बर के लिए प्लेटों के स्थानांतरण और उन्हें उल्टा तक छोड़ दें।एक लंबे दिन के चक्र के तहत 8 घ के लिए पौधों को विकसित (16 एच 100 μmol · एम - 2 · एस - 1 प्रकाश, 8 घंटे अंधेरे) 20 डिग्री सेल्सियस पर।
  9. तनाव उपचार, जब पौधों, 8 डी पुराने हैं प्रवाह हुड में के लिए, अगर मध्यम से उन्हें स्थानांतरित धीरे उन्हें हाथ से बंद scraping इथेनॉल निष्फल दस्ताने पहने हुए तनाव युक्त तरल एमएस माध्यम की एक निष्फल फ्लास्क में, द्वारा (जैसे , 200 मिमी mannitol)। अगर मध्यम पर ले जाने से बचें। कवर निष्फल पन्नी के साथ कुप्पी मुंह और पौधों कोमल झटकों (~ 100 आरपीएम) के साथ एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर के लिए एक अतिरिक्त 2 डी कदम 1.8 में के रूप में एक ही परिस्थितियों में विकसित करने के लिए अनुमति देते हैं।

2. इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा एक अग्रदूत साबित प्रोटीन बनाना / अनुवाद

नोट: इस प्रोटोकॉल मैं डी अग्रदूत (pPsaD) टेम्पलेट / preprotein रूप सबयूनिट Arabidopsis photosystem का उपयोग हो जाती है, लेकिन विधि दूसरों के साथ संगत है।

PBlueScript द्वितीय एसके वेक्टर (या एक नदी के ऊपर T7 प्रमोटर के साथ किसी भी इसी तरह की अन्य वेक्टर) 13 के कई क्लोनिंग साइट (एमसीएस) में pPsaD की कोडिंग अनुक्रम (सीडीएस) क्लोन। प्लाज्मिड (pBSK-pPsaD) एक डीएनए अलगाव किट का उपयोग कर शुद्ध और डीएनए अनुक्रमण द्वारा अनुक्रम की पुष्टि करें।
नोट: ये सभी कदम मानक आणविक क्लोनिंग तकनीक को रोजगार।
  • pBSK-pPsaD प्लास्मिड डीएनए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर 260 एनएम पर absorbance को मापने के लिए सेट का उपयोग कर एकाग्रता का निर्धारण। 10 एनजी / μL के अंतिम एकाग्रता के लिए प्लाज्मिड पतला।
  • एक 20 μL पीसीआर (35 चक्र के लिए) टेम्पलेट के रूप में पतला प्लाज्मिड का उपयोग कर चला। प्रतिक्रिया तैयार इस प्रकार है: 2 μL 10 × पोलीमर्स बफर, 2 μL 2 मिमी dNTPs, 1 μL 5 मिमी M13 आगे प्राइमर (5'-टीजीटी एएए ACG ACG जीसीसी AGT-3 '), 1 μL 5 मिमी M13 रिवर्स प्राइमर (5 '-CAG GAA एसीए GCT ATG एसीसी-3'), 1 μL पतला pBSK-pPsaD प्लाज्मिड, 1 यू Taq पोलीमर्स, और आसुत जल तक कुल प्रतिक्रिया मात्रा बनाने के लिए20 μL। इस प्रकार के रूप में एक मानक पीसीआर कार्यक्रम का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट; [95 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड के 35 चक्र; 56 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड; 72 डिग्री सेल्सियस, 30 सेकंड); और 72 डिग्री सेल्सियस, 5 मिनट।
  • एक 1% पर पीसीआर उत्पाद के 5 μL चलाएं (w / v) TAE बफर (Tris एचसीएल, पीएच 7.6, 20 मिमी एसिटिक एसिड, 1 मिमी EDTA) में agarose जेल सीडीएनए का सही प्रवर्धन सत्यापित करें, और प्रासंगिक यों की मानकों के बैंड रिश्तेदार एकाग्रता पुष्टि करने के लिए। आगे अनुप्रयोगों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उत्पाद के बाकी स्टोर।
  • एक 50 μL प्रतिक्रिया एक खरगोश reticulocyte lysate आधारित सेल मुक्त / प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली पीसीआर डीएनए के साथ संगत का उपयोग कर, इस प्रकार तैयार: / प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली से reticulocyte lysate 40 μL, 2.5 μL radiolabeled [35 एस] methionine, 11 μCi / एमएल (विशिष्ट गतिविधि:> 1,000 सीआइ / mmol), 2.5 μL बाँझ आसुत जल, और 5 μL pPsaD पीसीआर उत्पाद (100 - 800 एनजी)।
    सावधानी: दस्ताने, प्रयोगशाला कपड़े और सुरक्षा glas पहनेंसत्र जब रेडियोधर्मी सामग्री से निपटने। मॉनिटर और काम की सतह और उपकरणों शुद्ध करना। एक अनुमोदित अपशिष्ट कंटेनर में सभी रेडियोधर्मी कचरे के निपटान के।
  • एक 30 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 90 मिनट के लिए प्रतिक्रिया सेते हैं। बर्फ पर नमूना रखकर प्रतिक्रिया बंद करो।
  • (समान मात्रा भी कदम 5.7 के लिए एक इनपुट नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं) एक परीक्षण के नमूने के रूप में प्रतिक्रिया मानक सोडियम सल्फेट dodecyl जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस पृष्ठ) autoradiography, fluorography या भास्वर इमेजिंग द्वारा पीछा किया पर सत्यापन के लिए की 1 μL निकालें। एक अच्छा परिणाम एक विशिष्ट और मजबूत बैंड pPsaD (~ 23 केडी) की आणविक वजन करने के लिए इसी का अवलोकन ने संकेत दिया है। आगे अनुप्रयोगों के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया के बाकी स्टोर।

    • 3. Chloroplast अलगाव

    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार:
      1. 0.6 एम sorbitol, 10 मिमी मैग्नीशियम क्लोराइड: Chloroplast अलगाव बफर (सीआईबी, 2x) तैयार(2 MgCl), 10 मिमी एथिलीन ग्लाइकोल Tetraacetic एसिड (EGTA), 10 मिमी ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA), 20 मिमी सोडियम बाइकार्बोनेट (NaHCO 3) 40 मिमी 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic एसिड (HEPES) ; KOH के साथ 8.0 पीएच को समायोजित करें। 2x सीआईबी के 2 एल, या तैयार aliquots बनाने के लिए और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने, लघु अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर। आसुत जल के साथ 1;: 1x सीआईबी बनाने के लिए, 2x सीआईबी 1 पतला इस हौसले क्लोरोप्लास्ट अलगाव प्रयोग के दिन पर तैयार किया जा सकता है।
      2. HEPES-MgSO 4 -Sorbitol बफर (एचएमएस, 1x) तैयार: 50 मिमी HEPES, 3 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट (MgSO 4), 0.3 एम सोर्बिटोल; सोडियम हाइड्रोक्साइड (NaOH) के साथ 8.0 पीएच को समायोजित करें। बफर के 400 एमएल तैयार aliquots बनाने के लिए और लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखने के लिए, या अल्पकालिक भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. ठंडे कमरे में या बर्फ पर निम्नलिखित प्रक्रियाओं के सभी आचरण। सेंट पहले समाधान, उपकरणों, उपकरण, और रोटार के सभी Precoolarting।
    3. 13 मिलीलीटर Percoll, 13 एमएल 2x सीआईबी बफर, और एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में 5 मिलीग्राम glutathione मिश्रण, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट (ब्रेक बंद) के लिए कम से 43,000 × छ मिश्रण centrifuging द्वारा एक सतत घनत्व ढाल तैयार करें। centrifugation के बाद, देखभाल के साथ संभाल ट्यूब ढाल परेशान करने से बचने और बाद में उपयोग के लिए बर्फ पर रखने के लिए।
    4. एक 1 एल बीकर जीनोटाइप / हालत प्रति 1x सीआईबी के 100 एमएल के स्थानांतरण।
      1. उन्हें एक चलनी में ढोने से तरल माध्यम से पौध निकालें, और उन्हें एक और सीआईबी युक्त बीकर में स्थानांतरण; फिर, ताजा सीआईबी के 100 एमएल के साथ यह जगह पहले किसी भी अवशिष्ट तरल माध्यम दूर करने के लिए सीआईबी के साथ ऊतक कुल्ला।
    5. homogenization के लिए, एक 50 एमएल बीकर में आयोजित ताजा सीआईबी के 20 एमएल का उपयोग दौर homogenization के लगातार पांच राउंड, प्रत्येक में 100 1x एमएल नमूना प्रति सीआईबी की कुल उपयोग करें।
      1. homogenization के पहले दौर के लिए, हाथ से 50 एमएल बीकर में संयंत्र के ऊतकों हस्तांतरण की अनुमतिपिछले पकड़े बफर अपनी उंगलियों के माध्यम से पलायन करने के लिए। पहले दौर में ऊतक का सबसे अधिक उपयोग करने के लिए प्रयास करें, लेकिन यकीन है कि यह बफर के साथ डूब जाता है बनाने के लिए; अगर यह संभव नहीं है, दूसरे दौर में शेष अप्रयुक्त ऊतक परिचय।
    6. ऊतक homogenizer की जांच के ऊतकों में रखें और 1 के दो दालों के साथ homogenize - 2 एस प्रत्येक। कोमल फैलाएंगे द्वारा एक 250 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में छानने का काम कपड़े के दो परतों के माध्यम से homogenate फ़िल्टर। छानना रखें, और ऊतक 50 एमएल बीकर को वापस हस्तांतरण।
    7. एक दूसरा 20 एमएल सीआईबी विभाज्य 50 एमएल बीकर में रखें, homogenization के पहले दौर में इस्तेमाल नहीं किसी भी शेष ऊतक जोड़ने, और homogenization और छानने का काम चरणों को दोहराएँ। इस प्रकार, दोहराने 3.5 और 3.6 सीआईबी के 100 एमएल तक इस्तेमाल किया गया है (यानी, 20 एमएल के 5 aliquots), और जिसके परिणामस्वरूप filtrates गठबंधन के सभी जब तक कदम।
    8. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट (पर ब्रेक) के लिए 1,000 × छ जमा homogenate, और टपकनासतह पर तैरनेवाला तुरंत centrifugation के पूरा होने के बाद, देखभाल करने के गोली परेशान नहीं। अवशिष्ट सतह पर तैरनेवाला धीरे बर्फ पर ट्यूब आंदोलन से ट्यूब में छोड़ दिया में गोली Resuspend। pipetting या vortexing द्वारा सख्ती resuspend मत करो।
    9. धीरे premade निरंतर घनत्व ढाल के शीर्ष पर homogenate हस्तांतरण, प्राप्त ट्यूब की दीवार के माध्यम से इसे लागू करने के लिए एक पाश्चर विंदुक का उपयोग। ढाल को परेशान करने से बचें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट (ब्रेक बंद) के लिए कम से 7,800 × छ एक झूलते बाल्टी रोटर में अपकेंद्रित्र।
      नोट: दो हरी बैंड centrifugation के बाद ढाल के रूप में देखा जा सकता है: निचले बैंड बरकरार क्लोरोप्लास्ट होता है, और ऊपरी बैंड टूटी क्लोरोप्लास्ट में शामिल है।
    10. pipetting द्वारा शीर्ष बैंड त्यागें, और फिर एक ताजा 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में एक पाश्चर विंदुक के साथ निचले बैंड हस्तांतरण, ढाल प्रति अप करने के लिए 8 एमएल की मात्रा को बनाए रखना है।
    11. ~ 1x एचएमएस के 25 एमएल ट्यूब में बफर जोड़ने और ट्यूब दो बार पलटना टीओ क्लोरोप्लास्ट से Percoll धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट (पर ब्रेक) के लिए कम से 1,000 × छ झूल बाल्टी रोटर और सेंट्रीफ्यूज में फिर ट्यूब रखें।
    12. सतह पर तैरनेवाला डालो और ध्यान से अवशिष्ट धीरे बर्फ पर ट्यूब आंदोलन से ट्यूब में छोड़ दिया एचएमएस में क्लोरोप्लास्ट गोली resuspend। यदि आवश्यक हो तो (गोली के आकार और धारा 4 में गिनती के आधार पर) एचएमएस के 300 μL, लेकिन बहुत ज्यादा नमूना कमजोर करने के लिए नहीं की कोशिश - एक अतिरिक्त 100 जोड़े।
      1. बर्फ पर क्लोरोप्लास्ट रखें। प्रत्येक समय से पहले क्लोरोप्लास्ट, बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं उन्हें resuspend करने के लिए ट्यूब हिला। हमेशा क्लोरोप्लास्ट हस्तांतरण करने के लिए एक कट विंदुक टिप (एक बढ़े ताकना के साथ) का उपयोग करें।

    4. यील्ड और क्लोरोप्लास्ट की intactness का विश्लेषण

    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 495 1x की μL एचएमएस बफर करने के लिए अलग क्लोरोप्लास्ट के 5 μL जोड़ें, और फिर ट्यूब एक 1 को प्राप्त करने के लिए inverting द्वारा धीरे मिश्रण: 100 कमजोर पड़ने।
    2. पीएलएरुधिरकोशिकामापी की गिनती चैम्बर के शीर्ष पर एक कवर गिलास सीई। धीरे धीरे पिपेट ~ 40 - कवर कांच और उनकी गिनती के कक्ष के बीच की खाई में पतला क्लोरोप्लास्ट निलंबन के 60 μL। एक 10X या 20X उद्देश्य के साथ एक चरण विपरीत माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, अक्षत क्लोरोप्लास्ट दौर और चमकदार लग रही है और प्रकाश की एक प्रभामंडल से घिरे हैं।
      नोट: माइक्रोस्कोप के तहत, वहाँ 25 बड़े चौराहों, मतगणना कक्ष के केंद्र में प्रत्येक युक्त 16 छोटे वर्गों के साथ एक 1 मिमी 2 गिनती क्षेत्र है।
    3. 10 बड़े चौराहों में क्लोरोप्लास्ट की संख्या की गणना। बड़े वर्ग प्रति क्लोरोप्लास्ट की संख्या 10 और 30 के बीच भी कुछ या बहुत सारे क्लोरोप्लास्ट मौजूद हैं, कमजोर पड़ने कारक (ऊपर 4.1 कदम) को समायोजित तदनुसार, और प्रक्रिया को दोहराना चाहिए।
    4. इस प्रकार के रूप एमएल (एकाग्रता) प्रति क्लोरोप्लास्ट की संख्या की गणना: एन (बड़े 4.3 चरण में गणना की प्रति वर्ग क्लोरोप्लास्ट की औसत संख्या) × 25 (बड़े चौराहों की कुल संख्या) × 100 (कमजोर पड़ने कारक) 10 4 (स्केलिंग कारक, 1 मिलीलीटर प्रति डेटा को व्यक्त करने के बाद 25 चौकों ऊपर मात्रा 0.1 मिमी 3) ×।
    5. कदम 3.12 में प्राप्त क्लोरोप्लास्ट निलंबन की मात्रा से गुणा करके एकाग्रता क्लोरोप्लास्ट की वास्तविक उपज की गणना। आम तौर पर, 50 से अधिक × 10 6 क्लोरोप्लास्ट प्राप्त किया जा सकता है।

    5. Chloroplast प्रोटीन आयात

    1. निम्नलिखित स्टॉक समाधान तैयार:
      1. 10x एचएमएस बफर तैयार: 500 मिमी HEPES, 30 मिमी MgSO 4, और 3.0 sorbitol एम; NaOH के साथ पीएच 8.0 करने के लिए समायोजित करें। लंबी अवधि के भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर इस बफर, विभाज्य, और दुकान के 50 एमएल तैयार है और छोटी अवधि के भंडारण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर।
      2. 50 मिमी EDTA 1x एचएमएस बफर में भंग: आयात रोकने के बफर तैयार करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर इस बफर, विभाज्य, और दुकान के 50 एमएल तैयार करें।
      3. 2x प्रोटीन लोड हो रहा है बफर तैयार: 60 मिमी Tris एचसीएल, पीएच 6.8, 10% (वी / वी) ग्लिसरॉल, 2% (w/ V) एसडीएस, 0.005% (w / v) bromophenol नीला। 50 एमएल, और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान बनाओ। बस उपयोग करने से पहले, 1 एम बफर के 900 μL करने के लिए 1,4-dithiothreitol (डीटीटी) के 100 μL जोड़ें।
    2. 3 समय अंक के साथ एक समय पाठ्यक्रम चलाने के 3 ट्यूबों प्रत्येक आयात रोकने के बफर के 130 μL विभाज्य युक्त तैयार है, और बर्फ पर उन्हें छोड़ने के लिए। एक 2 मिलीलीटर ट्यूब में एक 450 μL आयात प्रतिक्रिया (प्रति जीनोटाइप / स्थिति) तैयार करें। सभी अवयवों गला लें बस से पहले का उपयोग करने के लिए।
      1. एक आयात प्रतिक्रिया के लिए, आम तौर पर एक μL मात्रा में 10 × 10 6 क्लोरोप्लास्ट का उपयोग करें; उदाहरण के लिए, यदि क्लोरोप्लास्ट एकाग्रता, 2.5 × 10 8 / एमएल है 40 μL क्लोरोप्लास्ट निलंबन का उपयोग करें। तीन समय अंक 3 × एक μL की आवश्यकता होगी (यानी, हमारे उदाहरण में 120 μL)।
      2. इस क्रम में बर्फ पर मिक्स प्रतिक्रियाओं घटक: आसुत जल (कुल मात्रा 600 μL बनाने के लिए), बी μL 10x एचएमएस बफर (जहां बी = [600-3 × एक] / 10, यानी, 48 हमारे उदाहरण में) 12 μL1 एम gluconic एसिड (पोटेशियम नमक), 6 μL 1 एम NaHCO 3, 6 μL 20% (w / v) बीएसए, 30 μL 100 मिमी एडेनोसाइन 5'-triphosphate मैग्नीशियम नमक (MgATP), 24 μL 250 मिमी methionine (radiolabeled नहीं ), और 30 μL प्रोटीन अग्रदूत। इसके तत्काल बाद आयात प्रतिक्रिया शुरू करने से पहले, 3 × क्लोरोप्लास्ट के एक μL जोड़ें और धीरे ट्यूब दोहन से मिश्रण।
    3. 2 · एस - - 1 प्रकाश 100 μmol · मीटर के तहत एक पानी के स्नान में 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया ट्यूब सेते हैं। कभी कभी क्लोरोप्लास्ट resuspend ट्यूब झटका।
    4. एक समय पाठ्यक्रम का संचालन करने के लिए, आयात के रैखिक रेंज है, जो pPsaD के लिए करने के लिए ~ 12 मिनट (4, 8 और 12 मिनट का समय अंक उपयुक्त हैं निर्भर है के भीतर आवश्यक समय अंक पर प्रतिक्रिया से 130 μL aliquots वापस लेने इस मामले में)। रैखिक सीमा अवधि अलग प्रोटीन 14 के लिए भिन्न हो सकते हैं। इस प्रकार, यह टी अनुकूलन करने से पहले प्रत्येक व्यक्ति preprotein परीक्षण करने के लिए सुझाव दिया हैवह समय अंक।
    5. इसके तत्काल बाद वापसी पर, ठंडा आयात रोकने के बफर की एक ट्यूब के लिए प्रत्येक 130 μL विभाज्य हस्तांतरण धीरे ट्यूब दोहन से मिश्रण है, और जब तक समय पाठ्यक्रम पूरा हो चुका है बर्फ पर सभी ट्यूबों बरकरार रहती है।
    6. अपकेंद्रित्र एक microfuge में 12,000 × छ पर 30 एस के लिए सभी नमूनों, pipetting द्वारा supernatants त्यागें, और vortexing द्वारा 15 2x की μL प्रोटीन लोड हो रहा है बफर में resuspend छर्रों।
    7. सभी नमूनों प्लस pPsaD इनपुट नियंत्रण (राशि प्रत्येक आयात प्रतिक्रिया के लिए जोड़ा के 10% के बराबर pPsaD युक्त, कदम 2.7 से) मानक एसडीएस पृष्ठ और autoradiography, fluorography या भास्वर इमेजिंग 15 से विश्लेषण। यों और परिणामों का विश्लेषण करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें। आयात दक्षता का एक संकेत प्रदान करने के लिए, अलग जीनोटाइप में आयातित प्रोटीन की मात्रा / शर्तों प्रत्येक परिपक्व बैंड के साथ जुड़े रेडियोधर्मिता मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है।

    Representative Results

    3 समय अंक के साथ एक उदाहरण क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात प्रयोग चित्र 1 में दिखाया गया है। Psad, photosystem के एक ~ 18 केडी घटक मैं स्ट्रोमा से अवगत कराया है ~ 23 केडी 16 का पूर्वाभ्यास फार्म के साथ। Psad यहाँ इन विट्रो प्रोटीन आयात परख के लिए चुना गया था क्योंकि इसके स्थिर राज्य स्तरों SP1 उत्परिवर्ती, गुम्मट के सापेक्ष में बुलंद कर रहे हैं, तनाव की स्थिति के तहत, उत्परिवर्ती 3 में इसके आयात दक्षता में एक बदलाव का सुझाव दे। SP1 प्रोटीन 3 - SP1 उत्परिवर्ती प्रोटीन क्लोरोप्लास्ट मशीनरी आयात का एक महत्वपूर्ण नियामक में एक दोष रहता है। सामान्य परिस्थितियों में बड़े पौधों से अलग क्लोरोप्लास्ट के लिए, वहाँ SP1 और गुम्मट के बीच psad आयात में कोई स्पष्ट अंतर था (नहीं दिखाया डेटा) 3। हालांकि, यहाँ वर्णित विधियों का उपयोग कर osmotically से अलग क्लोरोप्लास्ट में psad आयात आकलन करने के लिएजोर देकर कहा कि पौधों, एक स्पष्ट अंतर पाया गया। हम दोनों जीनोटाइप के साथ एक समय पर निर्भर तरीके से परिपक्व प्रोटीन फार्म का संचय मनाया, वहीं आयात की दर काफी SP1 क्लोरोप्लास्ट (चित्रा 1) है, जो हमारे पिछले परिणामों 3 के साथ संगत है के लिए की तुलना गुम्मट क्लोरोप्लास्ट के लिए कम हो गया था, और पता चलता है तनाव की स्थिति के तहत psad के क्लोरोप्लास्ट आयात को विनियमित करने में SP1 प्रोटीन के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका है।

    आकृति 1
    चित्रा 1. एक प्रोटीन आयात परख आसमाटिक तनाव की स्थिति। क्लोरोप्लास्ट एक 10 दिन पुरानी डब्ल्यूटी (कर्नल-0) से अलग थे तहत बड़े पौधों से पृथक क्लोरोप्लास्ट और एक SP1 उत्परिवर्ती Arabidopsis पौधों तनाव की स्थिति के अधीन हो का उपयोग किया (200 मिमी mannitol) 2 डी के लिए। (ए) प्रोटीन आयात का उपयोग किया गया था [35 एस] -methionine लेबल pPsaD और एसडीएस पृष्ठ और भास्वर इमेजिंग द्वारा विश्लेषण से पहले 4, 8 और 12 मिनट के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दी। समानांतर में, pPsaD 10% इनपुट इन विट्रो में शामिल नियंत्रण अनुवाद प्रोटीन (IVT) विश्लेषण किया गया था। अग्रदूत (पूर्व) और परिपक्व (मैट) pPsaD के रूपों संकेत कर रहे हैं, दो बैंड की संभावना है कि छोटा या proteolyzed अनुवाद उत्पादों के अनुरूप देखते हैं, जबकि बीच में क्योंकि उनकी तीव्रता समय पाठ्यक्रम (*) के दौरान बदलाव नहीं किया। (बी) तनाव की स्थिति के अधीन हो WT और SP1 पौधों से क्लोरोप्लास्ट में आयात की दरों की तुलना करने के लिए, प्रत्येक बैंड ए में आयातित परिपक्व प्रोटीन के लिए इसी की तीव्रता मात्रा निर्धारित किया गया था। सभी डेटा 12 मिनट के बाद गुम्मट पौधों से क्लोरोप्लास्ट में आयातित प्रोटीन की मात्रा के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

    Discussion

    हमने हाल ही में पता चला है कि क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात सक्रिय रूप से तनाव है, जो क्लोरोप्लास्ट समारोह और संयंत्र अस्तित्व 3 के लिए महत्वपूर्ण है के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। कि अध्ययन में, इस तरह के नियमन पर नजर रखने के लिए, हम क्रम में तनाव की स्थिति के तहत बड़े पौधों के आयात क्षमता के आकलन के सक्षम करने के लिए हमारे क्लोरोप्लास्ट अलगाव और इन विट्रो आयात परख प्रक्रियाओं में संशोधित किया। परिणाम क्लोरोप्लास्ट प्रोटीन आयात नियमन में SP1 के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका का संकेत दिया।

    परंपरागत इन विट्रो आयात assays मानक एमएस अगर मध्यम 6,17,18 पर बड़े पौधों का उपयोग करें। SP1 उत्परिवर्ती यहाँ वर्णित के मामले में, इस तरह के पारंपरिक assays के गुम्मट से 3 में प्रोटीन आयात रिश्तेदार कोई मतभेद का खुलासा नहीं किया। हालांकि, प्रोटीन आयात को विनियमित करने में SP1 की भूमिका स्पष्ट रूप से पता चला जब प्रोटीन आयात तनाव की स्थिति के तरीकों के साथ साथ वर्णित (चित्रा 1) का उपयोग कर के तहत मूल्यांकन किया जाता है। जबकि यह मीटरप्र सीधे नहीं है (जैसा कि तरीकों में क्रमश: तरल संस्कृति में और अगर मध्यम पर बड़े पौधों को रोजगार) पारंपरिक assays से प्राप्त उन लोगों के साथ तनाव की स्थिति परख से आयात डेटा की तुलना करने के लिए संभव हो सकता है, तनाव और गैर तनाव की स्थिति के बीच तुलना संभव है कि प्रदान की जाती हैं पौधों सब एक ही तरल संस्कृति के माध्यम में बड़े हो रहे हैं, के साथ या तनाव के बिना।

    अगर मध्यम पर तनाव के उपचार के साथ तुलना में, तरल संस्कृति में इन विट्रो आयात assays के लिए आवश्यक पौधों की बड़ी संख्या के इलाज के लिए और अधिक सुविधाजनक है। इसके अलावा, यह सभी पौधों को तनाव है, जो अल्पकालिक तनाव उपचार के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है की वर्दी आवेदन की सुविधा। यहाँ प्रस्तुत विधि mannitol उपचार का उपयोग कर आसमाटिक तनाव का अध्ययन करने के लिए लागू किया गया है, लेकिन आसानी से अन्य तनाव की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; उदाहरण के लिए, अल्पकालिक नमक तनाव और oxidative तनाव है, जिसके लिए इसी तनाव ख सकता है के लिएई इसी तरह तरल एमएस माध्यम के माध्यम से आवेदन किया। तनाव के अन्य प्रकारों के लिए, हम सुझाव है कि तनाव की डिग्री पहला अनुकूलित है; पीढ़ी गंभीर उपचार उपज और / या अलग-थलग अंगों के आयात क्षमता पर प्रतिकूल प्रभाव पड़ सकता है।

    प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम है जो एक के रूप में नीचे विस्तृत, विशेष ध्यान देना चाहिए रहे हैं।

    (- 0.9%, w / वी 0.6) निर्माता के आधार पर एमएस माध्यम के लिए इष्टतम अगर एकाग्रता अलग कर सकते हैं। इस प्रकार, यह अनुभव से प्रयोगों के शुरू होने से पहले अगर एकाग्रता का अनुकूलन करने की सिफारिश की है। मध्यम बहुत नरम है कि यह कटाई कदम (कदम 1.9) पर ऊतक से चिपक नहीं होना चाहिए, न तो यह इतना कठिन है कि यह संयंत्र जड़ विकास को रोकता होना चाहिए। सुक्रोज एकाग्रता भी इस्तेमाल पौधों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। जब विशेष रूप से बीमार म्यूटेंट के साथ काम कर रहे हैं, एमएस मध्यम 2 के साथ पूरक - 3% (w / v) सुक्रोज पौधों बेहतर विकसित करने के लिए मदद मिल सकती है। जब एप्लिकेशनतनाव उपचार झूठ बोल रही है, यह तरल माध्यम (जैसे,> 14 दिन पुरानी है) करने के लिए बहुत पुराने पौधों के हस्तांतरण के लिए अच्छा नहीं है। इसका कारण यह है पुराने पौधों की जड़ों को और अधिक विकसित और अधिक आसानी से transferral के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं।

    गेहूं के बीज के आधार पर उन लोगों के, और खरगोश reticulocyte उन पर आधारित: / प्रतिलेखन अनुवाद प्रणाली के संबंध में, वहाँ 2 प्रमुख प्रणालियों रहे हैं। ये किट ऐसे linearized plasmids, unlinearized plasmids, या पीसीआर उत्पादों के रूप में विभिन्न टेम्पलेट्स, उपयोग कर सकते हैं। किट भी T3, T7, और SP6 प्रमोटरों के लिए विशिष्ट हैं। ध्यान दें कि किट हम यहाँ की सिफारिश पीसीआर उत्पादों और T7 प्रमोटर के साथ उपयोग के लिए ही उपयुक्त है। हालांकि, अज्ञात कारणों के लिए, कुछ radiolabeled इस प्रणाली के साथ बनाया preproteins कुशलता से आयात परख में काम नहीं कर सकता; ऐसे मामलों में, एक एक गेहूं के बीज निकालने प्रणाली या एक reticulocyte lysate प्रणाली प्लाज्मिड टेम्पलेट्स के लिए बने कोशिश कर विचार कर सकते हैं। एक भी प्रतिलेखन / अनुवाद पुन के परिणाम में सुधार कर सकते हैंनिर्माता की पुस्तिका के अनुसार प्रतिक्रिया की स्थिति को संशोधित करके कार्रवाई की।

    (या विकास कक्ष के प्रकाश चक्र में प्रारंभिक) के क्रम में प्रकाश संश्लेषण के कारण क्लोरोप्लास्ट, जो बरकरार अंगों के अलगाव बाधा कर सकते हैं अंदर स्टार्च के संचय से बचने के लिए यह सुबह में क्लोरोप्लास्ट अलगाव शुरू करने के लिए महत्वपूर्ण है। क्लोरोप्लास्ट अलगाव की प्रक्रिया के किसी भी अनावश्यक देरी के बिना जल्दी से किया जा सकता है, और अलग क्लोरोप्लास्ट हमेशा ठंडा रखा जाना चाहिए। इस अवलोकन कि क्लोरोप्लास्ट पृथक धीरे-धीरे उनकी व्यवहार्यता, जो अच्छी बात नहीं है खो देंगे खिलाफ कम करने के लिए है। नव thawed सीआईबी या एचएमएस बफर का उपयोग करते हैं, तो उपयोग करने से पहले अच्छी तरह से बफर मिश्रण करने के लिए एक सजातीय समाधान प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित हो। संयंत्र सामग्री के homogenization के लिए इष्टतम स्थितियों अनुभव से स्थापित किया गया है, और यदि एक अलग ऊतक homogenizer प्रयोग किया जाता है भिन्न हो सकते हैं।

    विभिन्न संयंत्र जीनोटाइप simila होते हैंआर क्लोरोफिल के स्तर, क्लोरोफिल की मात्रा का ठहराव आयात assays आयोजित करने से पहले नमूनों को सामान्य करने के लिए एक वैकल्पिक मार्ग के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। क्लोरोफिल spectrophotometrically 80% में पृथक क्लोरोप्लास्ट का एक नमूना की निकासी के बाद निर्धारित किया जा सकता है (वी / वी) जलीय एसीटोन 19,20। हालांकि, अगर पौधों का आयात दर अलग क्लोरोफिल सामग्री दिखा (जैसे, chlorotic phenotypes के साथ म्यूटेंट) की तुलना में जा रहे हैं, आयात assays में क्लोरोप्लास्ट नमूनों को सामान्य करने की गिनती क्लोरोप्लास्ट नंबर का उपयोग करें। यह अच्छी तरह से कदम 3.11 में क्लोरोप्लास्ट resuspend करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। अपर्याप्त मेजबान क्लोरोप्लास्ट है, जो यह मुश्किल संख्या सही गिनती करने के लिए कर देगा का समुच्चय छोड़ दें और इस प्रकार आयात प्रतिक्रियाओं में सही लोडिंग में बाधा होगी सकता है। गंभीर एकत्रीकरण माइक्रोस्कोप के नीचे देखा जाता है (जैसे, समुच्चय के साथ> 10 क्लोरोप्लास्ट एक साथ शामिल), aggregat जब तक बर्फ पर क्लोरोप्लास्ट नमूना मिलाते जारीतों हटा रहे हैं। यह बफर की एक छोटी मात्रा में क्लोरोप्लास्ट resuspend करने के लिए आसान है।

    यह जानते हैं कि प्रोटीन आयात प्रतिक्रियाओं (धारा 5) अपने रेडियोधर्मी स्वभाव की वजह से उचित सावधानियों के साथ आयोजित किया जाना चाहिए होना जरूरी है। आवश्यक सावधानियों में शामिल हैं:, डिस्पोजेबल दस्ताने, प्रयोगशाला कपड़े और सुरक्षा चश्मा पहने नजर रखे हुए है और काम की सतह और उपकरण decontaminating, और एक अनुमोदित अपशिष्ट कंटेनर में सभी रेडियोधर्मी कचरे के निपटान। यह भी ध्यान है कि सही आसमाटिक दबाव आयात प्रतिक्रियाओं के दौरान क्लोरोप्लास्ट की intactness को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है में रखने के लिए, और इस मुख्यतः एचएमएस बफर द्वारा बनाए रखा है। क्योंकि 10x एचएमएस चिपचिपा है, यह पहली बार आरटी को गरम किया जाना चाहिए, और फिर अच्छी तरह से मिला, और एक कट विंदुक टिप का उपयोग सटीक संस्करणों की माप सुनिश्चित करने के लिए आवेदन किया। आयात प्रतिक्रिया में, ठंड methionine असंबंधित chloropl में मुक्त radiolabeled methionine के समावेश को बाधित करने के लिए जोड़ा जाता हैऊष्मायन चरण के दौरान organellar अनुवाद के माध्यम से एएसटी प्रोटीन, जबकि बीएसए proteases लिए एक सब्सट्रेट के रूप में अभिनय से प्रोटियोलिसिस कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है।

    Acknowledgments

    इस काम के जैव प्रौद्योगिकी और जैव विज्ञान अनुसंधान परिषद से पी.जे. के लिए एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (बीबीएसआरसी, रेफरी अनुदान बी बी / K018442 / 1।)।

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Murashige and Skoog basal salt  Melford M0221
    phytoagar Melford P1003
    2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) Melford B2002
    triton X-100 Fisher BPE151-500
    surgical tape (e.g., Micropore, 3M) 3M 1530-1
    filter paper Fisher FB59023
    Percoll Fisher 10607095
    Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) Sigma E4378
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher D/0700/53
    4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Melford B2001
    filtration cloth (Miracloth) Calbiochem 475855
    50 mL centrifuge tube Fisher CFT-595-040M
    250 mL centrifuge bottle Fisher CFT-891-V
    Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) Fisher 11010070
    Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) Fisher 11030083
    centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) Beckman Coulter B34182
    fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) Beckman Coulter 363930
    fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) Beckman Coulter 363058
    swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) Beckman Coulter 346963
    radiolabeled [35S] methionine Perkin Elmer NEG072002MC
    rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) Promega L5540
    phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) Nikon unavailable
    haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) Hawksley Technology AC1000 0.1 mm depth, 1/400 mm2
    cover glasses VWR 16004-094 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm
    1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72.690.001
    2 mL microfuge tubes Starlab S1620-2700
    microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) Eppendorf unavailable
    Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar Thermo Fisher SPR-700-310L
    gluconic acid (potassium salt) Fisher 22932-2500
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906
    MgATP Sigma A9187
    methionine Sigma M6039
    bromophenol blue Fisher B/P620/44
    glycerol Fisher G/0650/17
    SDS Fisher S/5200/53
    Tris Base  Melford B2005
    dithiothreitol (DTT) Melford MB1015
    image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) Raytest unavailable

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    References

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    तनावग्रस्त संयंत्रों से पृथक क्लोरोप्लास्ट में प्रोटीन आयात का विश्लेषण
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    Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of… More

    Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants. J. Vis. Exp. (117), e54717, doi:10.3791/54717 (2016).

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