Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av Protein Import til kloroplaster Isolerte fra Stressede Planter

Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54717
Automatic Translation
1, 1
1Department of Plant Sciences, University of Oxford

Summary

Her beskriver vi en ny metode for å studere protein import til isolerte kloroplaster under stress. Metoden er hurtig og enkel, og kan brukes til å studere konsekvensene av forskjellige stressbetingelser for kloroplast protein innførsel, og de tilsvarende reguleringsmekanismer.

Abstract

Kloroplaster er organeller med mange viktige roller i planter, som inkluderer ikke bare fotosyntesen, men en rekke andre metabolske og signaleringsfunksjoner. Videre kloroplaster er kritisk for plante responser på ulike abiotiske påkjenninger, så som saltholdighet og osmotiske belastninger. En kloroplast kan inneholde opp til ~ 3000 forskjellige proteiner, hvorav noen er kodet for av sin egen genom. Imidlertid er de fleste av chloroplast proteiner kodet i kjernen og syntetisert i cytosol, og disse proteinene må importeres til kloroplast gjennom translocons på chloroplast konvolutt membraner. Nyere studier har vist at proteinet kloroplast innførsel kan være aktivt regulert av spenning. For å undersøke biokjemisk slik regulering av protein innførsel i henhold til stressbetingelser, har vi utviklet fremgangsmåten beskrevet her som en enkel og rask fremgangsmåte som lett kan oppnås i en hvilken som helst laboratorium. I denne metoden, er plantene dyrkes under normal conditions og deretter utsatt for stressbetingelser i flytende kultur. Plantemateriale samles, og kloroplaster blir så frigjort ved homogenisering. Det urene Homogenatet separeres ved tetthetsgradient sentrifugering, slik at isolering av de intakte kloroplaster. Kloroplast utbytte vurderes av telling, og kloroplast intactness blir kontrollert under et mikroskop. For protein import analysene er renset kloroplaster inkubert med 35 S radiomerket in vitro oversatt forløper proteiner, og tidsforløpet eksperimenter er utført for å muliggjøre sammenligninger av importprisene mellom genotyper under stress forhold. Vi presenterer data generert ved hjelp av denne metoden, som viser at frekvensen av protein import til kloroplaster fra et regulatorisk mutant er spesielt forandret etter osmotiske stress forhold.

Introduction

Kloroplaster er svært rikelig organeller som finnes i grønne vev av planter. De er kjent for sin kritiske rolle i fotosyntesen, en prosess som bruker lys energi å omdanne karbondioksid til sukker og dermed støtter nesten alt liv på jorden en. I tillegg kloroplaster (og den bredere familie av relaterte organeller som kalles plas) spiller mange andre viktige roller i planter, inkludert biosyntesen av aminosyrer, lipider, pigmenter, og sensing av miljømessige signaler slik som tyngdekraften og patogen utfordring. Fotosyntese genererer reaktive oksygenarter (ROS) som biprodukter, som under visse omstendigheter har nyttige roller, men hvis overprodusert kan forårsake skadelige eller til og med letale effekter. Overproduksjon av ROS er spesielt fremmet av ugunstige miljøforhold, og dermed kloroplaster er nært knyttet til tiltak mot abiotiske påkjenninger, som for eksempel saltholdighet og osmotiske påkjenninger 2.

Chloroplasts ha en kompleks struktur. Hver kloroplast er omgitt av en dobbelt membran ytre lag som kalles konvolutten, som består av ytre og indre membraner. Internt er det en annen membransystem kalt thylakoids, der lyset reaksjoner av fotosyntesen foregår. Mellom de to membransystemer er det et vandig rom anrop stroma, som er involvert i karbon fiksering. En kloroplast kan inneholde opp til ~ 3000 ulike proteiner, og de aller fleste av disse proteinene er syntetisert i cytosol i forløperen form og må importeres til organeller gjennom dedikerte protein translocons i konvolutten membraner 1. Interessant nok har senere arbeid indikerte at kloroplast protein innførsel blir aktivt regulert, og det er i stand til å utøve en viktig grad av kontroll over kloroplasten proteome. For eksempel ble det rapportert i 2015 at protein import kan svare på abiotiske stress gjennom direkte regulering av overflod av the translocon på den ytre konvolutt membran av kloroplastene (TOC) av ubiquitin-proteasome system 3.

Ved hjelp av renset kloroplaster og in vitro syntetisert forløper proteiner, kan protein import rekonstitueres in vitro 4,5. Dermed kan in vitro metoder brukes til å vurdere satsene for import i ulike muterte planter 6, som har vært en kritisk tilnærming for analyse av antatte komponenter av protein import maskiner og for å oppdage de mekanismene bak protein import og regulering. Videre kan kloroplaster bli behandlet med ytterligere fraksjonering eller protease fordøyelsen, etter in vitro import, som kan legge til rette for studier på sub-organellar lokalisering og topologi av chloroplast proteiner 7,8.

For å studere regulering av protein import av stress, har vi endret vår rutine kloroplast isolasjonsmetoden som vi vil beskriveher. Viktigere, kloroplaster ble isolert fra planter som var blitt dyrket på standard Murashige og Skoog (MS) agar medium i 8 dager og deretter overført til flytende MS-medium supplert med stressfaktor, noe som gir en forholdsvis kort, kontrollert spenning behandling. Utbyttet og kompetanse i kloroplaster isolert fra slike stress behandlet planter er kompatible med nedstrøms in vitro protein import analysen tre. I tillegg til kloroplasten isolasjonsprotokoll, gjennomgår vi rutinemetode for in vitro protein import, noe som har vist seg å være robust, og er mye brukt 3,9-12.

Protocol

1. Vekst av Arabidopsis Planter og stress behandling

  1. Fremstille 1 liter av Murashige og Skoog (MS) medium ved å tilsette 4,3 g MS basal saltblanding, 10 g sukrose, 0,5 g 2- (N-morfolino) etansulfonsyre (MES) i avionisert vann opp til 1 liter, og justere pH-verdien til 5,7 med kaliumhydroksyd (KOH). Tilsett 6 g phytoagar og autoklav i 20 minutter ved 120 ° C.
    1. Før størkning, hell medium til runde Petri plater (diameter 9 cm, høyde 1,5 cm, med 20 - 25 ml MS medium per plate). La platene tørke for ~ 1 time i en laminær hette før du lukker lokket.
  2. Plasser Arabidopsis thaliana frø inn i et 1,5 ml reagensglass for sterilisering overflate ved å tilsette 1 ml 70% (v / v) etanol inneholdende 0,02% (v / v) Triton X-100 og kontinuerlig risting i 5-10 min. For hver genotype / tilstand, forberede 10 Petri plater hver bærer ~ 100 - 150 stiklinger.
  3. Vent i ca 10 s til frøene bosette tilbunnen av røret, og deretter kaste supernatanten ved pipettering. Tilsett 1 ml 100% etanol og det hele rystes i røret igjen i 10 minutter.
  4. Forbered laminær panseret mens frøene er sterilisering. Ta en bit av filterpapir per prøve, brett den i to for å legge til rette for såing, og suge den i 100% etanol i panseret. Vent til det tørker helt ut. Legg merke til at 100% etanol blir anvendt som det fordamper raskere enn 70% etanol.
  5. Overfør frøene på filterpapir ved å pipettere anvendelse av en 1 ml pipette snitt ~ 5 mm fra den fine enden. La dem tørke, noe som bør ta ca 10 - 15 min.
  6. Sow ~ 100 - 150 steriliserte frøene jevnt på hver MS medium Petri plate, og forsegle hver plate med kirurgisk tape.
  7. Oppbevar platene opp ned ved 4 ° C i 2-4 d å oppmuntre og synkronisere spiring. Gamle frø kan trenge å bli lenger (opptil en uke) ved 4 ° C.
  8. Overfør platene til en plante vevskultur kammeret og la dem opp-opp.Dyrke planter for åtte d under en lang-dagers syklus (16 h 100 mikromol · m - 2 · s - en lys, 8 t mørkt) ved 20 ° C.
  9. For stresset behandling, når plantene er 8 d gamle, i flyten hette, overføre dem fra agar medium, ved å forsiktig skrape dem av for hånd iført etanol-sterilisert hansker, i en sterilisert flaske med væske MS medium som inneholder stressor (f.eks , 200 mM mannitol). Unngå bærer over agar medium. Dekk kolben munnen med sterilisert folie og tillater plantene å vokse under de samme betingelser som i trinn 1.8 i ytterligere 2 dager på en orbital-rystemaskin med forsiktig risting (-100 opm).

2. Å gjøre en Precursor Protein av in vitro transkripsjon / Oversettelse

Merk: Denne protokollen forutsetter bruk av Arabidopsis photosystem I-underenhet-forløperen D (pPsaD) som templat / preprotein, men metoden er kompatibel med andre.

Klone den kodende sekvens (CDS) av pPsaD inn i det multiple kloningssete (MCS) i pBluescript II SK-vektor (eller en hvilken som helst annen lignende vektor med en oppstrøms T7-promoter) 13. Rense plasmid (pBSK-pPsaD) ved hjelp av en DNA kit og verifisere sekvensen av DNA-sekvensering.
MERK: Alle disse trinnene ansette standard molekylære kloningsteknikker.
  • Bestem pBSK-pPsaD plasmid DNA-konsentrasjon ved bruk av et spektrofotometer innstilt til å måle absorbansen ved 260 nm. Fortynn plasmidet til en sluttkonsentrasjon på 10 ng / ul.
  • Kjøre en 20 ul PCR (for 35 sykluser) ved anvendelse av fortynnet plasmid som templat. Forbered reaksjonen som følger: 2 ul 10 x polymerase-buffer, 2 pl 2 mM dNTP, 1 pl 5 mM M13 forover-primer (5'-TGT AAA ACG ACG GCC AGT-3 '), 1 pl 5 mM M13-revers primer (5 '-CAG GAA ACA GCT ATG ACC-3'), 1 ul fortynnet pBSK-pPsaD plasmid, en U Taq-polymerase og destillert vann til å bringe totalvolumet opp til reaksjons20 mL. Bruke en standard PCR-programmet, som følger: 95 ° C, 5 min; 35 sykluser av [95 ° C, 30 sek; 56 ° C, 30 sek; 72 ° C, 30 sek); og 72 ° C, 5 min.
  • Drevet 5 ul av PCR-produktet på en 1% (w / v) agarosegel i TAE-buffer (Tris-HCl, pH 7,6, 20 mM eddiksyre, 1 mM EDTA) for å verifisere korrekt amplifikasjon av cDNA, og kvantifisere den relevante båndet i forhold til standarder for å bekrefte konsentrasjonen. Oppbevar resten av produktet ved -20 ° C for videre bruk.
  • Fremstille en 50 pl reaksjon ved anvendelse av en kanin retikulocyttlysat basert cellefritt transkripsjon / translasjon systemet kompatibelt med PCR-DNA, som følger: 40 ul retikulocyttlysat fra transkripsjons / translasjonssystem, 2,5 ul radiomerket [35S] metionin, 11 uCi / mL (spesifikk aktivitet:> 1000 Ci / mmol), 2,5 pl sterilt, destillert vann, og 5 ul pPsaD PCR-produkt (100-800 ng).
    Forsiktig: Bruk hansker, laboratorieklær og verne glasses ved håndtering av radioaktivt materiale. Overvåke og dekontaminer arbeidsflaten og utstyr. Kast alt radioaktivt avfall i en godkjent avfallsbeholder.
  • Inkuber reaksjonsblandingen i 90 minutter i et 30 ° C vannbad. Stopp reaksjonen ved å plassere prøven på is.
  • Fjern 1 pl av reaksjonen som en testprøve (det samme volum kan også tjene som en inngang for styre trinn 5.7) for bekreftelse på standard natriumdodecylsulfat polyakrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), fulgt av autoradiografi, fluorografi eller fosfor avbildning. Et godt resultat er angitt ved observasjon av en distinkt og sterkt bånd svarende til molekylvekten av pPsaD (~ 23 kD). Lagre resten av reaksjonsblandingen ved -80 ° C for videre bruk.

    • 3. Kloroplast Isolation

    1. Forbered følgende stamløsninger:
      1. Forbered Kloroplast isolasjonsbuffer (CIB, 2x): 0,6 M sorbitol, 10 mM magnesiumklorid(MgCl2), 10 mM etylenglykol tetra-eddik syre (EGTA), 10 mM etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 20 mM natriumbikarbonat (NaHCO3), 40 mM 4- (2-hydroksyetyl) piperazin-1-etansulfonsyre (HEPES) ; Juster til pH 8,0 med KOH. Forbered 2 liter 2x CIB, gjør porsjoner og holde dem ved -20 ° C for langtidslagring, eller ved 4 ° C for kortsiktig lagring. For å gjøre 1x CIB, fortynne 2x CIB 1: 1 med destillert vann; Dette kan fremstilles ferske på dagen for kloroplasten isolasjon eksperiment.
      2. Forbered HEPES-MgSO4 -Sorbitol buffer (HMS, 1x): 50 mm HEPES, 3 mM magnesiumsulfat (MgSO4), 0,3 M sorbitol; Juster til pH 8,0 med natriumhydroksyd (NaOH). Forbered 400 ml buffer, gjør porsjoner og holde dem ved -20 ° C for langtidslagring, eller ved 4 ° C for kortsiktig lagring.
    2. Gjennomføre alle følgende prosedyrer i kjølerommet eller på is. -Kjøle alle løsninger, utstyr, utstyr, og rotorer før starting.
    3. Fremstille en kontinuerlig densitetsgradient ved å blande 13 ml Percoll, 13 ml 2x CIB-buffer, og 5 mg glutation i et 50 ml sentrifugerør, og sentrifugering av blandingen ved 43 000 x g i 30 min (brems) ved 4 ° C. Etter sentrifugering håndtere rør forsiktig for å unngå å forstyrre gradient og holde den på is for senere bruk.
    4. Overfør 100 ml 1x CIB pr genotype / tilstand til en 1-liters begerglass.
      1. Fjern frøplantene fra flytende medium ved å tippe dem i en sil, og overføre dem til en annen CIB holdig beger; deretter, skylles vevet med CIB for å fjerne eventuelt resterende flytende medium før erstatte den med 100 ml frisk CIB.
    5. For homogenisering, bruker totalt 100 ml 1x CIB per prøve i fem påfølgende runder med homogenisering, hver runde ved hjelp av 20 ml frisk CIB holdt i en 50 ml beger.
      1. For den første runden av homogenisering, overføre plantevevet inn i 50 ml begerglass for hånd, slik at denforrige beholdning buffer til å renne gjennom fingrene. Prøv å bruke mesteparten av vevet i første runde, men sørg for at det er nedsenket med buffer; Hvis dette ikke er mulig, introduserer den gjenværende ubrukt vev ved den andre runden.
    6. Plasser sonde av den vevshomogenisator inn i vevet og homogenisere med to pulser av 1 - 2 s hver. Filtrer den homogenatet gjennom to lag av filtrerende stoff inn i et 250 ml sentrifugerør ved forsiktig klemme. Beholde filtratet, og overføre vev tilbake til 50 ml begerglass.
    7. Plassere en andre 20 ml CIB delmengde inn i 50 ml begerglass, og legger til en hvilken som helst gjenværende vev som ikke brukes i den første runden av homogenisering, og gjenta homogenisering og filtreringstrinn. Således gjenta trinn 3,5 og 3,6 inntil alt 100 ml CIB er blitt brukt opp (det vil si 5 porsjoner av 20 ml), og kombinere de resulterende filtrater.
    8. Sentrifuger samlet homogenat ved 1000 × g i 5 min (brems på) ved 4 ° C, og hell avsupernatanten umiddelbart etter ferdigstillelse av sentrifuge, tar seg ikke å forstyrre pelleten. Resuspender pellet i den gjenværende supernatanten igjen i røret ved forsiktig omrøring av røret på is. Ikke suspendere kraftig ved pipettering eller virvling.
    9. overføre forsiktig homogenatet på toppen av den forhåndslagde gradient kontinuerlig tetthet, ved hjelp av en Pasteur-pipette for å anvende den til veggen av mottaksrøret. Unngå å forstyrre graderingen. Sentrifuge i en svingende spannrotor-ved 7800 x g i 10 min (brems) ved 4 ° C.
      MERK: To grønne bånd kan sees i gradienten etter sentrifugering: den nedre båndet inneholder intakte kloroplaster, og det øvre bånd inneholder brutte kloroplaster.
    10. Kast den øverste båndet ved pipettering, og deretter overføre det nedre band med en Pasteur-pipette inn i en ny 50 ml sentrifugerør, beholdt et volum på opp til 8 ml pr gradient.
    11. Legg ~ 25 ml 1x HMS buffer inn i røret og snu røret to ganger to vaske Percoll fra kloroplaster. Plasser røret på nytt i den svingende spannrotor-og sentrifuger ved 1000 x g i 5 min (bremsen på) ved 4 ° C.
    12. Hell av supernatanten og forsiktig resuspender pelleten i kloroplast rest HMS igjen i røret ved forsiktig omrøring av røret på is. Legg en ekstra 100 - 300 mL av HMS ved behov (basert på størrelsen på pellet og tellingen i kapittel 4), men prøv ikke å fortynne prøven for mye.
      1. Hold kloroplaster på is. Hver gang før kloroplastene brukes til nedstrøms applikasjoner, riste røret for å resuspendere dem. Bruk alltid et kutt pipette (med en forstørret pore) for å overføre kloroplaster.

    4. Analyse av Yield og intactness av kloroplaster

    1. Tilsett 5 mL av isolerte kloroplaster til 495 ul av 1 x HMS-buffer i et 1,5 ml rør, og deretter bland forsiktig ved å vende røret for å oppnå en 1: 100 fortynning.
    2. Place et dekkglass på toppen av tellekammer hemocytometer. Sakte pipette ~ 40 - 60 pl av den fortynnede kloroplast suspensjonen inn i gapet mellom dekkglasset og tellekammer. Ved hjelp av en fase-kontrast mikroskop med en 10X eller 20X objektiv, intakte kloroplaster ser runde og lyse, og er omgitt av en glorie av lys.
      MERK: Under mikroskopet, er det en 1 mm 2 telling område med 25 store kvadrater, som hver inneholder 16 små kvadrater i midten av tellekammer.
    3. Tell antall kloroplaster i 10 store firkanter. Antallet kloroplaster per store plassen bør gjennomsnittlig mellom 10 og 30. Hvis for få eller for mange kloroplaster er til stede, justere fortynningsfaktoren (trinn 4.1 ovenfor) tilsvarende, og gjenta prosedyren.
    4. Beregn antall kloroplaster per ml (konsentrasjon) som følger: n (gjennomsnittlig antall kloroplaster per store plassen beregnet i trinn 4,3) × 25 (totalt antall store firkanter) X 100 (fortynningsfaktoren) x 10 4 (skaleringsfaktor for å uttrykke data per 1 mL, ettersom volumet over de 25 rutene er 0,1 mm 3).
    5. Beregne det faktiske utbyttet av kloroplaster ved å multiplisere konsentrasjonen av volumet av kloroplast suspensjon oppnådd i trinn 3,12. Normalt kan mer enn 50 × 10 6 kloroplaster oppnås.

    5. Kloroplast Protein Import

    1. Forbered følgende stamløsninger:
      1. Forbered 10x HMS buffer: 500 mM HEPES, 30 mM MgSO4, og 3,0 M sorbitol; Juster til pH 8,0 med NaOH. Forbered 50 ml av denne bufferen, delmengde, og oppbevar ved -20 ° C for langtidslagring og ved 4 ° C for kortsiktig lagring.
      2. Forbered Import stopp buffer: 50 mM EDTA oppløst i 1x HMS buffer. Forbered 50 ml av denne bufferen, delmengde, og oppbevar ved -20 ° C.
      3. Fremstille Protein 2x ladningsbuffer: 60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% (v / v) glycerol, 2% (vekt/ V) SDS, 0,005% (w / v) bromfenolblått. Lag 50 ml, og oppbevares ved 4 ° C. Like før bruk, tilsett 100 mL av en M 1,4-ditiotreitol (DTT) til 900 mL buffer.
    2. Hvis du vil kjøre en time-kurs med 3 tidspunkter, forberede 3 rør som hver inneholder en 130 pl prøve av importstans buffer, og la dem på is. Forbered en 450 mL import reaksjon i en 2 ml tube (per genotype / tilstand). Tine alle ingrediensene like før bruk.
      1. For en import reaksjon, bruker vanligvis 10 × 10 6 kloroplaster i A mL volum; for eksempel hvis kloroplast-konsentrasjonen er 2,5 x 10 8 / mL ved å bruke 40 ul kloroplast suspensjons. Tre tidspunktene trenger 3 × A mL (dvs. 120 mL i vårt eksempel).
      2. Bland reaksjoner komponentene på is i følgende rekkefølge: destillert vann (for å gjøre det totale volumet 600 mL), B mL 10x HMS buffer (der B = [600-3 × A] / 10, dvs. 48 i vårt eksempel), 12 mL1 M glukonsyre (kaliumsalt), 6 pl 1 M NaHCO3, 6 ul 20% (w / v) BSA, 30 pl 100 mM adenosin-5'-trifosfat magnesiumsalt (MgATP), 24 pl 250 mM metionin (ikke radiomerket ), og 30 ul forløperproteinet. Umiddelbart før du starter importen reaksjon, tilsett 3 × En mL av kloroplaster og bland ved å banke lett på røret.
    3. Inkuber i reaksjonsrøret ved 25 ° C i et vannbad under 100 umol · m - 2 * s - 1 lys. Av og flick rørene å resuspendere kloroplaster.
    4. For å gjennomføre en tidsforløpet, ta ut 130 pl aliquoter fra reaksjonsblandingen ved de ønskede tidspunkter innenfor det lineære området av import, som for pPsaD er opp til ~ 12 min (4-, 8- og 12-min tidspunkter egner i denne saken). Den lineære området Tiden kan variere for forskjellige proteiner 14. Således er det foreslått å teste hver enkelt preprotein før å optimalisere than tidspunkter.
    5. Umiddelbart etter uttak, overføre hver 130 pl prøve til et rør iskald importstans buffer, bland ved å banke lett på tube, og beholde alle rør på is inntil den tid-kurs er gjennomført.
    6. Sentrifuger alle prøvene i 30 s ved 12 000 × g i en mikro, kast supernatanten ved pipettering, og resuspender pellets i 15 mL av 2x Protein lasting buffer ved virvling.
    7. Analyser alle prøvene pluss inngangsstyre pPsaD (innehold pPsaD tilsvarende 10% av det tilsatte til hver innførsel reaksjon mengde, fra trinn 2.7) ved hjelp av standard SDS-PAGE og autoradiografi, fluorography eller fosfor bilde 15. Bruk bildeanalyse programvare for å kvantifisere og analysere resultatene. For å gi en indikasjon på import effektivitet, mengden av importert protein i forskjellige genotyper / tilstander kan bedømmes ved å måle radioaktiviteten assosiert med hver modne band.

    Representative Results

    Et eksempel kloroplast-protein innførsel eksperiment med 3 tidspunkter er vist i figur 1. PsaD er et ~ 18 kD komponenten av photosystem jeg utsatt for stroma, med en forløper form av ~ 23 kD 16. PsaD ble valgt her for in vitro-proteinanalyse import fordi dets steady-state nivået er forhøyet i SP1 mutant, i forhold til WT under stressbetingelser, noe som tyder på en endring i dens innførsel effektivitet i mutanten 3. SP1 mutant bærer en defekt i en viktig regulator av kloroplast protein import maskiner - SP1 protein tre. For kloroplaster isolert fra planter dyrket under normale forhold, var det ingen tydelig forskjell i PsaD import mellom SP1 og WT (data ikke vist) 3. Men ved hjelp av metodene beskrevet her for å vurdere PsaD import til kloroplaster isolert fra osmotiskbelastede anlegg, en klar forskjell ble detektert. Mens vi observerte akkumuleringen av det modne protein formen på en tidsavhengig måte med begge genotyper, frekvensen av import var signifikant lavere for WT kloroplaster enn for SP1 kloroplaster (figur 1), som er i overensstemmelse med våre tidligere resultater 3, og viser en viktig rolle for SP1 proteinet i å regulere kloroplast innførsel av PsaD henhold stressbetingelser.

    Figur 1
    Figur 1. En Protein Import-analyse utført ved bruk av kloroplaster Isolerte fra planter dyrket under osmotisk stress betingelser. Kloroplaster ble isolert fra en 10-dagers gammel WT (Col-0) og en sp1 mutant Arabidopsis planter dyrket under stress forhold (200 mM mannitol) i 2 dager. (A) Protein innførsel ble gjennomført ved anvendelse av [35S] -methionine-merket pPsaD og tillatt å foregå i 4, 8 og 12 minutter før analyse ved hjelp av SDS-PAGE og fosfor avbildning. Parallelt pPsaD 10% inngangsstyre omfatter in vitro translaterte protein (IVT) ble analysert. Forløperen (pre) og moden (matte) former pPsaD er indikert, mens i mellom er det to band som sannsynligvis korresponderer med avkortede eller proteolyserte translasjonsprodukter fordi deres intensitet ikke endret seg i løpet av tidsforløpet (*). (B) For å sammenligne priser på import til kloroplaster fra WT og SP1 planter dyrket under stress forhold, ble intensiteten av hvert bånd som tilsvarer importert modne protein i A kvantifisert. Alle data er uttrykt som prosentandeler av mengden importert protein i kloroplaster fra WT planter etter 12 min. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Discussion

    Vi har nylig viste at kloroplast protein import kan være aktivt regulert av stress, noe som er avgjørende for kloroplast funksjon og plante overlevelse tre. I den studien, for å overvåke en slik regulering, endret vi vår kloroplast isolasjon og in vitro import analyseprosedyrer for å muliggjøre vurdering av importkapasiteten av planter dyrket under stress forhold. Resultatene indikerte en viktig rolle for SP1 i kloroplast protein import regulering.

    Konvensjonelle in vitro import analyser bruke planter dyrket på standard MS agar medium 6,17,18. I tilfellet med den SP1 mutant som er beskrevet her, har slike konvensjonelle analyser avslørte ingen forskjeller i protein innførsel i forhold til WT 3. Imidlertid er rollen til SP1 i å regulere protein import klart frem når protein import vurderes under stress forhold ved hjelp av metodene beskrevet her (figur 1). Mens det may ikke være mulig å direkte sammenligne importere data fra den spenningsforholdene analysen med de som oppnås fra konvensjonelle analyser (som metodene anvender planter dyrket i flytende kultur og på agar medium, henholdsvis), sammenligninger mellom stress og ikke-spenningstilstander er mulige forutsatt at plantene er alle dyrket i det samme flytende kulturmedium, med eller uten stressfaktorer.

    Sammenlignet med stress-behandling på agar medium, i flytende kultur mer praktisk for behandling av et stort antall planter som trengs for in vitro import analyser. Videre er det letter ensartet anvendelse av stressor til alle planter, noe som er spesielt viktig for kortsiktige stressbehandlinger. Metoden som presenteres her er blitt anvendt for å studere den osmotisk stress ved hjelp av mannitol behandling, men kan lett tilpasses et bredt spekter av andre påkjenninger; for eksempel, kortsiktige salt stress og oksidativt stress, for hvilke de tilsvarende stressfaktorer kunne be tilsvar søkt via flytende MS medium. For andre typer påkjenninger, foreslår vi graden av stress er første optimalisert; altfor alvorlige behandlinger kan ha negative effekter på utbytte og / eller import kompetanse av de isolerte organeller.

    Det er flere viktige skritt i protokollen til som man bør være spesielt oppmerksom, som beskrevet nedenfor.

    Den optimale agar konsentrasjonen for MS-mediet kan variere (0,6 til 0,9%, vekt / volum), avhengig av produsenten. Dermed er det anbefalt å empirisk optimalisere agar konsentrasjon før du begynner eksperimenter. Mediet bør ikke være så myk at den fester seg til vevet ved høstingssteget (trinn 1.9), heller ikke bør det være så hardt at det hemmer plante rotutvikling. Sukrosekonsentrasjonen kan også justeres i henhold til de plantene som brukes. Når det arbeides med meget syke mutanter, MS-medium supplert med 2 - 3% (vekt / volum) sukrose kan bidra til plantene å vokse bedre. når appliggende spennings behandlinger, er det ikke godt å overføre meget gamle planter til det flytende medium (for eksempel> 14 dager gammel). Dette er fordi de mer utviklede røtter eldre anlegg er lettere skadet under overføring.

    Med hensyn til transkripsjons / translasjonssystem, er det 2 store systemer: de som er basert på hvetespirer, og de som er basert på kanin retikulocytt. Disse pakkene kan bruke forskjellige maler, for eksempel linearisert plasmider, unlinearized plasmider eller PCR-produkter. Pakkene er også spesifikk for T3, T7 og SP6 arrangører. Legg merke til at settet vi anbefale her er bare egnet for bruk med PCR-produkter og T7-promoter. Men av ukjente grunner, noen radiomerkede preproteiner gjort med dette systemet kan ikke fungere effektivt i import analysen; I slike tilfeller kan man vurdere å prøve en hvetekim ekstrakt system eller et retikulocyttlysat system ment for plasmidtemplater. Man kan også forbedre resultat av transkripsjon / translasjon rehandling ved å endre reaksjonsbetingelsene i henhold til produsentens håndbok.

    Det er viktig å starte kloroplast isolasjon tidlig på morgenen (eller tidlig i lys syklus av vekstkammeret), for å unngå opphopning av stivelse inne kloroplastene på grunn av fotosyntesen, som kan hindre isolering av intakte organeller. Kloroplast isoleringsprosedyren må gjøres raskt uten unødvendige forsinkelser, og de isolerte kloroplaster må alltid holdes kaldt. Dette er for å redusere mot den observasjon at isolerte kloroplastene vil gradvis miste sin levedyktighet, som ikke er bra. Hvis du bruker nylig tint CIB eller HMS buffer, sørg for å blande buffer godt før bruk for å oppnå en homogen løsning. De optimale betingelser for homogenisering av plantemateriale er etablert empirisk, og kan variere hvis en annen vevshomogenisator anvendes.

    Hvis de forskjellige plante genotyper inneholde Similär klorofyllnivåer, kan klorofyll kvantifisering brukes som en alternativ måte for å normalisere prøvene før gjennomføringen av import analyser. Klorofyll kan bestemmes spektrofotometrisk etter ekstraksjon av en prøve av de isolerte kloroplastene i 80% (v / v) vandig aceton 19,20. Men hvis importprisene på planter som viser ulike klorofyllinnhold (f.eks mutanter med anemiske fenotyper) skal sammenlignes, bruke kloroplast nummer telle til normal kloroplast prøver i import analyser. Det er spesielt viktig å resuspendere kloroplaster grundig i trinn 3.11. Utilstrekkelig resuspensjon kan forlate aggregater av kloroplaster, som vil gjøre det vanskelig å telle tall nøyaktig og dermed vil hindre riktig lasting i import reaksjoner. Hvis alvorlig aggregering er sett under mikroskop (f.eks aggregater med> 10 kloroplast sammenføyd), fortsette å riste kloroplast prøven på is inntil aggregates fjernes. Det er lettere å resuspendere kloroplaster i et mindre volum av buffer.

    Det er viktig å være klar over at protein import reaksjoner (§ 5) skal utføres med nødvendige forholdsregler på grunn av deres radioaktive natur. Nødvendige forholdsregler inkluderer: iført engangshansker, laboratorieklær og vernebriller, overvåking og dekontaminering arbeidsflaten og utstyr, og avhending av alt radioaktivt avfall i en godkjent avfallsbeholder. Også huske på at riktig osmotisk trykk er avgjørende for å opprettholde intactness av kloroplaster under import reaksjoner, og dette er hovedsakelig vedlikeholdes av HMS buffer. Fordi 10x HMS er tyktflytende, bør den først varmes opp til romtemperatur, og deretter grundig blandet, og påføres med et kutt pipette for å sikre måling av nøyaktige volumer. I import reaksjon blir kaldt metionin tilsettes for å hindre innblanding av gratis radiomerket metionin i urelaterte chloroplAST-proteiner gjennom organellar oversettelse under inkuberingstrinnet, mens BSA blir brukt for å minimalisere proteolyse ved å virke som et substrat for proteaser.

    Acknowledgments

    Dette arbeidet ble støttet av et stipend til PJ fra Bioteknologi og Biological Sciences Research Council (BBSRC; gi dommeren BB / K018442 / 1.).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Murashige and Skoog basal salt  Melford M0221
    phytoagar Melford P1003
    2-(N-morpholino) ethane sulfonic acid (MES) Melford B2002
    triton X-100 Fisher BPE151-500
    surgical tape (e.g., Micropore, 3M) 3M 1530-1
    filter paper Fisher FB59023
    Percoll Fisher 10607095
    Ethylene Glycol Tetraacetic Acid (EGTA) Sigma E4378
    ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher D/0700/53
    4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) Melford B2001
    filtration cloth (Miracloth) Calbiochem 475855
    50 mL centrifuge tube Fisher CFT-595-040M
    250 mL centrifuge bottle Fisher CFT-891-V
    Polytron (e.g., Kinematica PT10-35) Fisher 11010070
    Polytron probe (e.g., Kinematica PTA20S) Fisher 11030083
    centrifuge (e.g., Beckman Coulter Avanti JXN-26, for 50 and 250 mL tubes) Beckman Coulter B34182
    fixed-angle rotor for 250 mL bottles (e.g., JLA-16.250) Beckman Coulter 363930
    fixed-angle rotor for 50 mL tubes (e.g., JA-25.50) Beckman Coulter 363058
    swinging-bucket rotor for 50 mL tubes (e.g., JS-13.1) Beckman Coulter 346963
    radiolabeled [35S] methionine Perkin Elmer NEG072002MC
    rabbit reticulocyte lysate based cell-free translation system (TNT T7 Quick kit for PCR DNA) Promega L5540
    phase-contrast microscope (e.g., Nikon Eclipse 80i) Nikon unavailable
    haemocytometer (Improved Neubauer BS748 chamber) Hawksley Technology AC1000 0.1 mm depth, 1/400 mm2
    cover glasses VWR 16004-094 22 mm × 22 mm, thickness 0.13-0.17 mm
    1.5 mL microfuge tubes Sarstedt 72.690.001
    2 mL microfuge tubes Starlab S1620-2700
    microfuge (e.g., Eppendorf 5415D) Eppendorf unavailable
    Nanodrop 2000 spectrophotometer or similar Thermo Fisher SPR-700-310L
    gluconic acid (potassium salt) Fisher 22932-2500
    Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A7906
    MgATP Sigma A9187
    methionine Sigma M6039
    bromophenol blue Fisher B/P620/44
    glycerol Fisher G/0650/17
    SDS Fisher S/5200/53
    Tris Base  Melford B2005
    dithiothreitol (DTT) Melford MB1015
    image analysis software (e.g., Aida Image Analyzer) Raytest unavailable

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jarvis, P., Lòpez-Juez, E. Biogenesis and homeostasis of chloroplasts and other plastids. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 14 (12), 787-802 (2013).
    2. Saibo, N. J., Lourenco, T., Oliveira, M. M. Transcription factors and regulation of photosynthetic and related metabolism under environmental stresses. Ann. Bot. 103 (4), 609-623 (2009).
    3. Ling, Q., Jarvis, P. Regulation of chloroplast protein import by the ubiquitin E3 ligase SP1 is important for stress tolerance in plants. Curr Biol. 25 (19), 2527-2534 (2015).
    4. Chua, N. H., Schmidt, G. W. In vitro synthesis, transport, and assembly of ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase subunits. Basic Life Sci. 11, 325-347 (1978).
    5. Highfield, P. E., Ellis, R. J. Synthesis and transport of the small subunit of chloroplast ribulose bisphosphate carboxylase. Nature. 271, 420-424 (1978).
    6. Aronsson, H., Jarvis, P. A simple method for isolating import-competent Arabidopsis chloroplasts. FEBS Lett. 529 (2-3), 215-220 (2002).
    7. Froehlich, J. Studying Arabidopsis envelope protein localization and topology using thermolysin and trypsin proteases. Methods Mol Biol. 774, 351-367 (2011).
    8. Flores-Pérez, Ú, Jarvis, P. Isolation and suborganellar fractionation of Arabidopsis chloroplasts. Methods Mol. Biol. 1511, 45-60 (2017).
    9. Kubis, S., et al. The Arabidopsis ppi1 mutant is specifically defective in the expression chloroplast import, and accumulation of photosynthetic proteins. Plant Cell. 15 (8), 1859-1871 (2003).
    10. Kubis, S., et al. Functional specialization amongst the Arabidopsis Toc159 family of chloroplast protein import receptors. Plant Cell. 16 (8), 2059-2077 (2003).
    11. Aronsson, H., et al. Nucleotide binding and dimerization at the chloroplast pre-protein import receptor, atToc33, are not essential in vivo but do increase import efficiency. Plant J. 63 (2), 297-311 (2010).
    12. Huang, W., Ling, Q., Bédard, J., Lilley, K., Jarvis, P. In vivo analyses of the roles of essential Omp85-related proteins in the chloroplast outer envelope membrane. Plant Physiol. 157 (1), 147-159 (2011).
    13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edn. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).
    14. Aronsson, H., et al. Monogalactosyldiacylglycerol deficiency in Arabidopsis thaliana affects pigment composition in the prolamellar body and impairs thylakoid membrane energization and photoprotection in leaves. Plant Physiol. 148, 580-592 (2008).
    15. Aronsson, H., Jarvis, R. P. Rapid isolation of Arabidopsis chloroplasts and their use for in vitro protein import assays. Methods Mol. Biol. 774, 281-305 (2011).
    16. Haldrup, A., Lunde, C., Scheller, H. V. Arabidopsis thaliana plants lacking the PSI-D subunit of photosystem I suffer severe photoinhibition, have unstable photosystem I complexes, and altered redox homeostasis in the chloroplast stroma. J. Biol. Chem. 278 (35), 33276-33283 (2003).
    17. Kubis, S. E., Lilley, K. S., Jarvis, P. Isolation and preparation of chloroplasts from Arabidopsis thaliana plants. Methods Mol. Biol. 425, 171-186 (2008).
    18. Chen, X., Smith, M. D., Fitzpatrick, L., Schnell, D. J. In vivo analysis of the role of atTic20 in protein import into chloroplasts. Plant Cell. 14, 641-654 (2002).
    19. Miras, S., et al. Non-canonical transit peptide for import into the chloroplast. J. Biol. Chem. 277 (49), 47770-47778 (2002).
    20. Nada, A., Soll, J. Inner envelope protein 32 is imported into chloroplasts by a novel pathway. J. Cell Sci. 117 (17), 3975-3982 (2004).

    Tags

    Plant Biology kloroplast organelle isolasjon anlegg plastidtransittpeptid protein import stress Arabidopsis membrantransport
    Analyse av Protein Import til kloroplaster Isolerte fra Stressede Planter
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of… More

    Ling, Q., Jarvis, P. Analysis of Protein Import into Chloroplasts Isolated from Stressed Plants. J. Vis. Exp. (117), e54717, doi:10.3791/54717 (2016).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter