Summary
نحن هنا الإبلاغ عن طريقة تحرير الجين السريع والفعال على أساس RMCE في موضع AAVS1 من الإنسان المحفزة الخلايا الجذعية (hPSCs) أن يحسن على النظم التي سبق وصفها. باستخدام هذه التقنية، وخطوط إسوي يمكن أن تتولد بسرعة وبشكل موثوق للدراسات المقارنة الصحيحة، وتسهيل البحوث بوساطة transgenesis مع hPSCs.
Abstract
حتى مع ثورة التكنولوجيا التي تستهدف الجينات التي كريسبر-Cas9، التعديل الوراثي للخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) قاد لا يزال الوقت طويلا. الدراسات المقارنة التي تستخدم خطوط المؤتلف مع الجينات المحورة دمجها في مواضع ملاذ آمن يمكن أن تستفيد من النهج التي تستخدم recombinases استهدفت مواقع محددة، مثل لجنة المساواة العرقية أو FLPe، والتي هي أكثر سرعة وأقل عرضة للآثار بعيدا عن الهدف. وقد وصفت هذه الأساليب، على الرغم من أنها لا كبير الجينات يتفوق تستهدف في معظم الجوانب. باستخدام nucleases الزنك، الاصبع، أنشأنا سابقا خط الخلايا الرئيسية في موضع AAVS1 من hPSCs التي تحتوي على GFP-هيغروميسين-TK التعبير كاسيت، ويحيط بها سلاسل FRT غيروي. هنا، نحن تصف الإجراءات لأداء FLPe بوساطة recombinase الصرف كاسيت (RMCE) باستخدام هذا الخط. سيد جوtransfected خط الذراع مع ناقل RMCE المانحة، والذي يحتوي على promoterless المقاومة بوروميسين، ومع FLPe recombinase. تطبيق كل من برنامج اختيار إيجابية (بوروميسين) والسالب (FIAU) يؤدي إلى اختيار RMCE دون التكامل عشوائية. RMCE يولد خطوط المعدلة وراثيا بولكلونل المحفزة السمات التي تميزت بشكل كامل في 15 د بكفاءة 100٪. وعلى الرغم من وصف مؤخرا القيود المفروضة على موضع AAVS1، وسهولة النظام تمهد الطريق لtransgenesis hPSC في إعدادات إسوي، أمر ضروري للدراسات المقارنة، وتمكن شاشات الوراثية شبه عالية الإنتاجية لتحقيق مكاسب / خسائر في تحليل الوظيفة التي لولاها يكون الوقت قد حان للغاية طويلا.
Introduction
وقد سهلت استهدفت إعادة التركيب الجينوم التقدم السريع في العديد من مجالات البحث. في الفئران، سمح التآزر بين تحرير الجينوم وأبحاث الخلايا الجذعية لزيادة فهم آلية معقدة من وظيفة الجين وتنظيم الجينات. ومن المتوقع هذا التقدم في خلايا الإنسان الجذعية المحفزة (hPSCs) وكذلك، على الرغم من أن لسنوات عديدة منذ عزل أول من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs)، ولاحق من صنع الإنسان الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، والتحرير الجين قد يشكل عقبة التقنية . التطورات الحديثة في مجال الهندسة الجينية باستخدام nucleases والزنك المستهدفة فنجر Nucleases (ZFNs)، النسخ، مثل المنشط nucleases المستجيب (TALEN)، أو مجمع interspaced بانتظام باختصار يكرر المتناوب المرتبطة كريسبر البروتين 9 (كريسبر / Cas9) سمحت / لنا للتغلب على هذه الصعوبات، مما يجعل استهدفت إعادة التركيب عملية فعالة 1-3.
مواضع محددة في مأصبحت [أوس] الجينوم التي تسمح مستقرة وموثوق بها، في كل مكان والتعبير التحوير في عدم وجود آثار سلبية مثل Rosa26، Hprt1، أو Col1A1، أدوات أساسية في أداء الدراسات الجينية. مواضع الملاذ الآمن تسمح تحليل للمقارنة بين خطوط مختلفة من الفئران في سياقات إسوي. لا يمكن أن يتحقق ذلك باستخدام أساليب التكامل عشوائي القياسية، والتي ترتبط مع القيود المعروفة مثل الطفرات إقحامي، والآثار التي تعتمد على الجرعة، أو التعبير التحوير التلون. يتم زيادة الجين التحرير سهولة ومرونة في مواضع ملاذ آمن من خلال استخدام recombinases استهدفت مواقع محددة مثل لجنة المساواة العرقية أو Flippase (FLPe)، والتي تعترف على وجه التحديد تسلسل الهدف (loxP أو FRT، على التوالي)، وتحفيز إعادة التركيب الفعال بين الأهداف متطابقة. ونظرا لهذه الخصائص، والتحرير الجينات بوساطة recombinase باستخدام loxP أو FRT تسلسل في preintegrated مواضع الملاذ الآمن هو أداة شائعة تستخدم في الماوس العابرسفر التكوين. بالإضافة إلى إدراج كاسيت أو الختان بوساطة بين تسلسل الهدف متطابقة، واستخدام loxP أو FRT مواقع تتعارض يسمح لتبادل كاسيت بوساطة recombinase (RMCE) 4.
في الإنسان، ومحاولات لتحديد أجريت مواضع الملاذ الآمن بها. وHPRT orthologous الماوس، على الرغم من ارتباطه ليش-نيهان متلازمة فقدان وظيفة، وROSA26 استهدفوا في hPSCs. وذكرت HPRT لإسكات بسرعة التعبير التحوير في ESC، ومثل ROSA26، قدرتها على المحافظة على التعبير التحوير في عضال خلايا متباينة لم يكن التحقيق 5-7. بسبب ظهور طفرة اغية متماثل من الجين CCR5 أن تحملها جيدا في البشر، وجرى تقييم قيمته بوصفه الملاذ الآمن. وقد استهدف CCR5 وذكرت للحفاظ على التعبير التحوير مستقر في مختلف خطوط الخلايا البشرية، بما في ذلك المجالس الاقتصادية والاجتماعية 8،9. ومع ذلك،لم يثبت هذا الأخير على مستوى نسيلي خلال ثقافة على المدى الطويل، وكان لم يثبت التعبير التحوير في كل مكان في ذرية متباينة من الطبقات الجرثومية الثلاث. AAVS1، موقع التكامل الطبيعي للغدة أسوشيتد نوع الفيروس 2 (AAV)، تم اختباره في hESCs كذلك، بسبب مقاومة إبلاغ التحوير إسكات 10. وفي وقت لاحق، وتستخدم العديد من المجموعات موضع AAVS1 وصفت التعبير التحوير مستقر في hPSCs غير متمايزة، وكذلك في ذرية متباينة، من كل الطبقات الجرثومية الثلاث، سواء في المختبر والمجراة 2،8،11،12. النتائج الأخيرة على الرغم من ذلك الوضوح هذه النتائج، كما تم العثور على مكان AAVS1 إلى بذل تثبيط التحوير متغير في المختبر في hESCs غير متمايزة وفي الكبدية ذرية 13.
دراسات فرز إضافية باستخدام نهج التكامل العشوائية وأساليب لتحديد التكامل نسخة واحدة تهدف إلى إيجاد GENOمواقع التكامل هيئة التصنيع العسكري مقاومة لإسكات التحوير خلال التوسع hPSCs والتمايز 14،15. وعموما، حتى الآن، تم التحقق من صحة أي موقع الجيني الكامل باعتباره الملاذ الآمن في hPSCs وذريتها. تحديد الموقع المناسب لفي كل مكان التعبير التحوير مستقر، وليس فقط في hPSCs ولكن أيضا في السلالات متباينة في التجارب المختبرية والحية، لا يزال يتعين حلها. ومن بين جميع مواضع درس، وعلى الرغم من قصوره، يبقى AAVS1 وأفضل وصف والأكثر استخداما في بحوث الخلايا الجذعية.
وقد تم تنفيذ RMCE بنجاح في hPSCs في بعض من هذه المكاني 6،7،14،16 غالبا باستخدام recombinase لجنة المساواة العرقية، حتى لو كانت هناك دلائل تشير إلى أن FLPe هو أكثر كفاءة من لجنة المساواة العرقية 17. في كل هذه الحالات، تم استخدام واحد مقاومة إيجابية عقار كاسيت لاختيار المستعمرات المؤتلف. على الرغم من نجاح، وهذه الإجراءات لا تشكل تقدما تقنيا على مستوى gene-إجراءات التحرير باستخدام ZFNs، TALENs أو كريسبر / Cas9، وإجراءات اختيار المضادات الحيوية واحد لا يستبعد التكامل العشوائية ويتطلب فحص مستعمرة لتحديد استنساخ المستهدفة بشكل صحيح.
في هذا الإجراء، وصفنا طرق لأداء RMCE في hPSCs في موضع AAVS1 باستخدام مزيج من الموجب (داخل كاسيت واردة) والسالب (داخل الكاسيت preintegrated) التحديدات التي تسمح لتوليد خطوط المعدلة وراثيا بولكلونل في ± 15 يوما مع كفاءة 100٪ وخالية من الأحداث التكامل عشوائية. ولذلك، تمثل هذه الطريقة تقدم وراء التقنيات RMCE وصفها حاليا في hPSCs.
Protocol
1. إعداد hPSC الخط ماستر الخلية التي تحتوي على FRT لترنسفكأيشن
- ثقافة HESC / IPSC خطوط الخلايا الرئيسية في إطار الإجراءات القياسية أو إيقاف تشغيله المعطل الفأر الجنينية الخلايا الليفية (iMEF) باستخدام HESC أو خالية من تغذية IPSC المتوسطة، على التوالي (الجدول 1). إعداد 2 (على مغذيات) أو 1 الآبار (خالية من تغذية) من hPSCs في لوحة 6 جيدا لكل حالة تجريبية.
- مراقبة الثقافات، وعندما تصل خلايا 60-70٪ confluency، لوحة المقاوم للأدوية iMEF (iDR4). لفترة وجيزة، ومعطف الآبار اللازمة من لوحة 12-جيدا مع 0.5 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين واحتضان لمدة 5 دقائق على RT. لوحة 125،000 iDR4s لكل بئر واحتضان O / N مع متوسط iMEF (الجدول 1).
2. hPSC ترنسفكأيشن بواسطة Nucleofection
- في اليوم التالي، قبل احتضان HESC / ثقافات IPSC مع وسائل الإعلام الجديدة، بما في ذلك 10 ميكرومتر المرتبطة رو-بروتين كيناز (ROCK) المانع (Y-27632)، لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية. Nتحويلة، واتخاذ HESC الحل ترنسفكأيشن من الثلاجة إلى ما قبل الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 1 مل من nucleofection الطلاء المتوسطة (الجدول 1) في حالة nucleofection. خذ المتوسطة iMEF من الآبار، ويغسل مع 1 مل من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني، وإضافة 500 ميكرولتر من nucleofection تصفيح المتوسطة. نقل 500 ميكرولتر أخرى إلى العقيمة 1.5 مل أنابيب وتخزينها في 37 درجة مئوية حتى الطلاء. ملاحظة: تجربة RMCE نموذجي يحتوي على ثلاثة ظروف مختلفة مع نسب الجزيئية من الجهات المانحة RMCE: ناقلات pFLPe من 2: 0، 2: 1، و0: 1.
- فصل HESC / IPSC إلى تعليق خلية واحدة.
- خلع وسائل الإعلام، وغسله مع 2 مل من RT برنامج تلفزيوني، وإضافة 1 مل التربسين 0.05٪ أو accutase على التغذية أو خالية من تغذية الثقافات hPSC، على التوالي. احتضان لمدة 7 (التربسين) أو و2-5 (accutase) دقيقة عند 37 درجة مئوية. لعلاج Accutase - يجب أن تظل خلايا فضفاض، ولكن تعلق.
- بعناية إزالة لوحة من الحاضنة وبدونالنماذج التالية الخلايا لفصل، وإزالة عامل التفكك بواسطة الطموح. إضافة 1 مل من HESC وسائل الإعلام وفصل الخلايا فضفاضة عن طريق تنظيف بلطف وسائل الإعلام على سطح لوحة، وتجنب الرغوة. تأكد من أن الخلايا في تعليق خلية واحدة.
- جمع الخلايا في 15 أو 50 مل أنبوب نظيفة ومعقمة. غسل الآبار مع 1 مل من وسائل الاعلام HESC وجمع الخلايا في نفس 15 أو 50 مل أنبوب. اتخاذ قسامة 50 ميكرولتر لحساب (خلال الخطوة التالية) باستخدام جهاز عد الخلايا. نلاحظ انخفاض حجم جمع وحساب مجموع عدد الخلايا. تدور أسفل الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
- resuspend الكرية خلية إلى تعليق 10 6 خلية / مل مع برنامج تلفزيوني باستخدام الماصة 5 مل المصلية وpipetting لطيف. تجنب الرغوة. نقل 2 مل لكل حالة تجريبية (حوالي 2 × 10 6 خلايا) لتنظيف، معقمة 15 مل أنابيب.
- في حين الطرد المركزي، قبلخفض تدريجي لRMCE بالمانحين البلازميدات pFLPe تختلط في حجم الحد الأقصى من 10 ميكرولتر.
- نقل 2.5 ميكروغرام من pFLPe (6.5 كيلو بايت) لالعقيمة أنبوب 1.5 نظيفة، مل. إضافة 2: 1 نسبة الجزيئية للناقلات RMCE المانحة 13 إلى ناقلات pFLPe. على سبيل المثال، ما يقرب من 10 ميكروغرام من ناقلات المانحة كيلو بايت RMCE 12.
- المضي قدما nucleofection، وتجنب الرغوة في كل الخطوات.
ملاحظة: بعض البروتوكولات ترنسفكأيشن hPSC تنطبق خطوة نضوب iMEF إضافية قبل الخطوة 2.4. ومع ذلك، من الناحية العملية، iMEF هو جزء الخلية طفيفة في تعليق واحد لا يغير كثيرا كفاءة ترنسفكأيشن، كما أنه سيخلق تلويث خلايا المؤتلف لأنها غير التكاثري. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من الضروري المضي قدما بسرعة خلال عملية ترنسفكأيشن لزيادة قدرتها على البقاء. لهذه الأسباب، لا يتم تطبيق نضوب iMEF.- إزالة لوحة iDR4 وأنابيب 1.5 مل مع المتوسطة تصفيحمن الحاضنة. أنبوب واحد في وقت واحد، الماصة قبالة PBS بعناية من دون إزعاج بيليه الخلية. إزالة أكبر قدر ممكن. resuspend الكرية مع 100 ميكرولتر من محلول ترنسفكأيشن من قبل pipetting بلطف. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على خليط البلازميد وتخلط بلطف.
- نقل مزيج خلية الحمض النووي للكفيت transfector، مع إيلاء اهتمام على عدم إدخال الفقاعات. إدخال كفيت في الجهاز nucleofector وتطبيق A13 برنامج (الخلايا المستزرعة على مغذيات) أو F16 (خالية من وحدة التغذية).
قد تتطلب أساليب ترنسفكأيشن أخرى أو nucleofector أجهزة تعظيم الاستفادة من هذه البرامج أو الظروف ترنسفكأيشن: ملاحظة. - استعادة كفيت، واستخدام ماصات نقل المتاح المتاحة في عدة nucleofection، وجمع محتواه من خلال تطبيق 0.5 مل من المتوسط الطلاء والشفط كل وحدة التخزين. إجراء هذه الخطوة بسرعة، ولكن بلطف وفي حركة واحدة.
- لوحة قطرة من الحكمة في-ث 12لوحة الذراع التي تحتوي على iDR4 و 500 ميكرولتر من الطلاء المتوسطة. كرر الخطوات من 2.6.1 - 2.6.4 لحالة تجريبية المقبلة.
- مكان الطبق الثقافة على الرف في الحاضنة وتحريكه ببطء ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب لتوزيعها بالتساوي على تعليق خلية. احتضان لمدة 24 ساعة قبل تغيير وسائل الاعلام المقبل للسماح للخلايا لاسترداد في ظل وجود 10 ميكرومتر ROCK المانع (Y-27632).
3. اختيار الإيجابية والسلبية من الخلايا التي تمر RMCE
- وسائل الإعلام تغيير الثقافة يوميا (1 مل / جيد)، و2-3 د بعد ترنسفكأيشن، تبدأ مع اختيار 100 نانوغرام / مل من بوروميسين.
ملاحظة: تركيزات الأمثل من الكواشف الإيجابية والسلبية اختيار تحتاج إلى أن تحدد تجريبيا لكل خط الخلايا الرئيسية hPSC ولدت حديثا. إجراء منحنى قتل 13، وذلك باستخدام خط الخلايا الرئيسية لتحديد جرعة منخفضة (تركيز في أي الحد الأدنى سمية البصرية هي واضحة بعد 7د الاختيار، ولكن الثقافة ليست متضخمة)، الجرعة المثالية (أدنى تركيز على الذي كل الخلايا الميتة بعد 7 أيام من اختيار)، وجرعة عالية (تركيز الذي تسبب سمية واضحة، مما أسفر عن مقتل جميع الخلايا بعد 2-3 د) لكل من بوروميسين وFialuridine (FIAU).- نضح المتوسطة HESC. تغسل مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة المتوسطة HESC مع 100 نانوغرام / مل من بوروميسين.
- مراقبة نمو الخلايا بحيث الموت والنمو المتوازن. تغيير وسائل الاعلام مع بوروميسين يوميا، بعد خطوة 3.1.1. عندما يتفوق معدل النمو موت الخلايا، وزيادة تركيز بوروميسين في كتل من 25 - 50 نانوغرام / مل تصل إلى حد أقصى قدره 250 نانوغرام / مل. مواصلة اختيار بوروميسين ل5-7 د.
- 3-4 د بعد بدء اختيار بوروميسين، حول يوم 6 بعد ترنسفكأيشن، تبدأ مع اختيار 0.5 ميكرومتر FIAU. تغيير وسائل الإعلام يوميا والحفاظ على FIAU لمدة لا تتجاوز 7 أيام متواصلة.
4. التوسع وتوصيف خطوط RMCE
- إضافة مصل العجل الجنين إلى الخلايا في برنامج تلفزيوني يصل إلى تركيز النهائي من 5٪. نقل الخلايا إلى أنبوب FACS نظيفة مع مصفاة الخلية والاحتفاظ بها على الجليد.
ملاحظة: بقاء الخلية عالية في ظل هذه الظروف، ولذلك فمن الممكن، ولكن ليس من الضروري، لاستخدام وصمة عار الفلورية للخلايا غير قابلة للحياة (على سبيل المثال، 7-AAD أو PI). - الشروع فورا في التحليل في قياس التدفق الخلوي محلل خلية وتسجيل 20،000 - 30،000 الأحداث. للتحليل، تعيين بوابات فوق GFP أو TDT تنوير الخلفية باستخدام WT عينة السيطرة السلبية.
- نقل الخلايا إلى أنبوب 1.5 مل نظيف. تدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT ونضح طاف. الشروع في استخراج الحمض النووي باستخدام طقم التجارية واتباع تعليمات الشركة الصانعة. تخزين بيليه الجافة في -20 درجة مئوية لمدة اللاتتحليل إيه.
- إعداد ردود الفعل PCR القياسية وفقا للشروط في الشكل (3) والجدول 2 13 عينة تشغيل PCR على هلام الاغاروز 2٪ تحتوي على 1X وصمة عار هلام الحمض النووي في 150 V لمدة 15 - 25 دقيقة. تحليل التشغيل في محلل هلام.
Representative Results
باستخدام AAVS1 ZNFs -specific، تم إنشاء السمات التي تميزت تماما HESC / IPSC خطوط الخلايا الرئيسية التي تحتوي على غيروي تسلسل الهدف FRT ووصف 13. حافظت FRT التي تحتوي على خطوط الخلايا الرئيسية تعدد القدرات ووحدة الجينوم بعد العلاج ZFN ومستقر أعربت GFP في التجارب المختبرية والحية. يتم تنفيذ RMCE التي كتبها cotransfection من خطوط الخلايا رئيسية مع FLPe recombinase وناقلات المانحة RMCE (الشكل 1A). ناقلات RMCE تحتوي على تسلسل FRT مماثلة لتلك الموجودة في خط الخلية AAVS1 سيد المرافقة التحوير الشكل 1B تراقب RMCE باستخدام التعبير جوهري TDT أسما:. F3-P CAGGS tdTPH-F بعد ترنسفكأيشن، hPSC تشكيل مجموعات صغيرة من خلايا موزعة بالتساوي على طبقة iDR4 MEF، وtransfected hPSC تعبر عن كلا GFP وكذلك عابر TDT (الشكل 1B، D 2). ويسمح للخلايا لاستعادة ل2-3د بعد ترنسفكأيشن قبل البدء في الاختيار. اختيار إيجابية وبدأت لأول مرة باستخدام جرعة منخفضة من بوروميسين من أجل صالح RMCE الإدراج المانحة. يتم تطبيق بوروميسين بلطف في البداية، لأن الأولي موت الخلايا الضخمة يمكن أن يؤدي إلى الخلايا وحيدة تمر إعادة التركيب، مما يجعلها غير قادرة على البقاء على قيد الحياة العملية. في الأيام التالية، يحتاج تركيز بوروميسين التي ستطرح تدريجي يصل إلى الجرعة المناسبة من أجل السماح للخلايا المؤتلف أن تنمو في مستعمرات صغيرة في حين أن الخلايا nonrecombined يموت تدريجيا.
3-4 د بعد بدء اختيار إيجابية (حوالي D 6 بعد ترنسفكأيشن)، وبدأت اختيار السلبية من أجل اختيار فقط للأحداث إعادة التركيب بوساطة FRT. RMCE يسبب فقدان ثيميدين كيناز (تاكا) الجين الانتحار وحساسية Fialuridine (FIAU). اختيار السلبية تطبيق في هذه المرحلة، التي مجموعات صغيرة من 2-4 GFP - / + TDT (RMCE) الخلاياقادرة على تحمل تركيزات المثلى من FIAU (الشكل 1B، D 6)، ويمنع التكامل عشوائي، لأنه في مثل هذه الأحداث، والجينات تاكا في موضع AAVS1 لا تزال تتأثر. حدوث المتزامن FRT بوساطة والتكامل عشوائي من المستبعد جدا، كما يدل على ذلك عدم وجود أحداث التكامل العشوائية في وقت لاحق خلال توصيف (الشكل 2B).
وRMCE GFP مختلط - / + TDT المستعمرات تستمر في النمو، في حين أصبحت أكثر تجانسا، بحيث كتبها D 9-10 بعد ترنسفكأيشن، وبعض المستعمرات RMCE مختلطة اختيار يست واضحة تماما ويمكن الاطلاع (الشكل 1B). GFP - / + TDT RMCE المستعمرات موجودة فقط عندما يكون كلا المانحة RMCE وFLPe (2: 1) يتم استخدامها، في حين لا يحدث RMCE في غياب FLPe (2: 0). مجموعة كاملة مع FIAU حتى يوم 13-15 بعد ترنسفكأيشن يثير لGFP متجانسة - / + TDT الثقافيهه. RMCE ينتج في المتوسط 12.8 ± 6.8 (ن = 6) مستعمرات بورو R / R FIAU في 15 يوما 13. التدفق الخلوي توصيف خط RMCE ولدت حديثا (المستعمرات RMCE بورو R / R FIAU مجتمعة في السكان الخلية nonclonal) يؤكد أن 100٪ من الخلايا الحاضر RMCE GFP - / + TDT النمط الظاهري (الشكل 2A). عندما تستخدم الجهات المانحة RMCE دون التعبير التأسيسي مراسل الفلورسنت، خط بورو R / R FIAU RMCE hPSC الناتج متجانس GFP -.
PCR توصيف خط RMCE nonclonal يوضح تبادل كاسيت الكامل (أي أثر للكاسيت من خط الخلايا الرئيسية يمكن أن يتم الكشف عن) وأن البرنامج اختيار تستخدم يولد خطوط خالية من التكامل العشوائي (كل من الجهات المانحة RMCE وFLPe، معربا عن ناقلات) (الشكل 2B). وهذه النتائج تثبت مزيدا من الصورةوصمة عار outhern وبالإضافة إلى ذلك، أثبتنا أن خطوط RMCE تبقى المحفزة 13. وهذا يجعل من لم يعد ضروريا لتنفيذ أي تقييم الجينوم على نطاق التكامل عشوائي أو اختبار تعدد القدرات خلال التجارب RMCE الروتينية. وخلاصة القول، وذلك باستخدام هذا البروتوكول، hPSC خطوط الخلايا المعدلة وراثيا في موضع AAVS1 خالية من التكامل عشوائية يمكن أن تتولد بسهولة في 15 د بكفاءة 100٪ ودون الحاجة إلى توصيف واسعة النطاق.
الشكل 1: نظرة عامة تخطيطي RMCE (أ) الجدول الزمني للبرنامج اختيار RMCE. اليسار: خط الخلية الرئيسي (MCL)، بايواء كاسيت يحيط FRT (المثلثات) التي تعبر عن GFP وهيغروميسين-TK (ربط عن طريق 2A الببتيدات الشق الذاتي)، وtransfected من قبل nucleofection (NF) مع ناقل FLPe، معربا عن و متجه RMCE المانحة، ذوي الخوذات البيضاءالتراث الثقافي غير المادي يحتوي على promoterless بوروميسين الجينات المقاومة (الربط متقبل - SA- بورو R) وشريط تجريبي متغير (X). اليمين: خط RMCE الجديد (RMCEL) تم الحصول عليها بعد الانتهاء من التحديد مع بوروميسين (مثلث أحمر) وFIAU (الخط الأزرق). (ب) RMCE باستخدام التأسيسي TDT، معربا عن المانحة ونسب مختلفة من الحمض النووي المانحة وFLPe الحمض النووي (0: 1، 2: 1، 2: 0) رصدها بواسطة المجهر مضان (GFP - مخضر، TDT - مضان أحمر) في مختلف نقاط الوقت. وتمثل على نطاق والحانات 100 ميكرون: D 2 و 6. د 10: تمثل الحانات نطاق 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: توصيف خطوط RMCE (أ) تحديد RMCE بواسطة التدفق الخلوي. ويرد GFP والتعبير TDT للخط WT، خط الخلية الرئيسي (MCL)، وخط RMCE ولدت حديثا في D 15 بعد nucleofection باستخدام ناقلات التأسيسي TDT-التعبير (CAGGS TDT)، أو الجهات المانحة مع GFP مدفوعا المروج GOOSECOID (GSCp GFP، نهائية الأديم علامة) أو المروج AAT (APOeAATp GFP، الكبدية علامة). (ب) تأكيد RMCE (5 '/ 3 "JA RMCEL)، وغياب (مكل) كاسيت خط الخلية الماجستير (5' / 3" JA مكل)، وعدم وجود تكامل العشوائي (5 '/ 3' / FLPe RI ) بواسطة PCR باستخدام أزواج التمهيدي يصور. الحمض النووي من WT، مكل، خطوط RMCE (1-5) واستخدمت، ناقلات RMCE المانحة (+ RI)، FLPe معربا عن ناقلات، وعدم التحكم قالب (NTC). الرقم معدلة من (Ordovas وآخرون، 2015) 13. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
ضمن الصفحات = "1"> 
الشكل 3. الجيل من الخط ماستر الخلوي RMCE مناسبة ومقارنة استهداف الجينات مع RMCE في AAVS1 اليسار: يستخدم استهداف الجينات خلايا WT معدلة التي يتم cotransfected مع الجهات المانحة (كاسيت هو موضح في الشكل 1A لتوليد خط الخلايا الرئيسية ، مكل) وZFNs الأمثل محددة. عملية لاستكمال توصيف كامل يستغرق فترة تصل إلى 3 أشهر. يتم تنفيذ RMCE التي كتبها cotransfection المتبرع مع ناقلات FLPe، ويتم إنشاء خط تتميز بشكل كامل في 15 د: الصحيح. استهداف الجينات الكفاءة في AAVS1 هي من الدراسات السابقة 1،2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الجدول 1. تكوين وسائل الإعلام.
| فحص | إلى الأمام | عكسي | Amplicon | دورة PCR | ||
| 5'JA مكل | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CGTTACTATGGGAACATACGTCA | 1.1 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 68 درجة مئوية (-0.5 درجة مئوية / دورة) (1)، "30 ''] X15 - [95 درجة مئوية، 30 '' - 58 درجة مئوية، 30 '' - 72 درجة مئوية، 1 '30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
| 3'JA مكل | TAACTGAAACACGGAAGGAG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.4 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 68 درجة مئوية (-0.5 درجة مئوية / دورة) (1)،' 30 ''] X15 - [95 درجة مئوية، 30 '' - 58 درجة مئوية، 30 '' - 72 درجة مئوية، 1 '30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
| 5'JA RMCEL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC | 1.1 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 68 درجة مئوية (-0.5 درجة مئوية / دورة) (1)،' 30 ''] X15 - [95 درجة مئوية، 30 '' - 58 درجة مئوية، 30 '' -72 درجة مئوية، 1 '30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
| 3'JA RMCEL | TTCACTGCATTCTAGTTGTGG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.5 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 68 درجة مئوية (-0.5 درجة مئوية / دورة) (1)،' 30 ''] X15 - [95 درجة مئوية، 30 '' - 58 درجة مئوية، 30 '' - 72 درجة مئوية، 1 '30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
| 5'RI المانحين | GTACTTTGGGGTTGTCCAG | TTGTAAAACGACGGCCAG | 0.5 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 60 درجة مئوية، 30' '- 72 درجة مئوية، 30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
| 3'RI المانحين | CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC | ACACAGGAAACAGCTATGAC | 0.5 كيلو بايت | |||
| RI FLPe | CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG | GTATGCTTCCTTCAGCACTAC | 0.65 كيلو بايت | 95 درجة مئوية، 5 '- [95 درجة مئوية، 30' '- 60 درجة مئوية، 30' '- 72 درجة مئوية، 30' '] X25 - 72 درجة مئوية، 5' | ||
الجدول 2. مجموعات التمهيدي تستخدم لPCR التنميط الجيني. معدلة من Ordovas وآخرون، 2015 (13).
Discussion
لا تزال أساليب تحرير الجينات في مواضع الملاذ الآمن أداة أساسية لتطوير transgenesis في hPSCs. وعلى الرغم من الطابع الملاذ الآمن من AAVS1 تم مؤخرا استجواب لبعض التطبيقات 13،18، لا يزال هذا موضع حاليا أفضل وصف في خطوط الخلايا المشتقة من الإنسان. الوعي حدودها في hPSCs يمكن أن تساعد في الحصول على بيانات موثوقة. لذلك، لا يزال من المتوقع أن يكون الموقع مفيدا، على سبيل المثال، للدراسات gain- وفقدان وظيفة، أو محرض / التعبير التأسيسي من العوامل التي تتطلب سياق إسوي داخل وبين خلفيات وراثية مصممة AAVS1.
وقد استهدفت مكان AAVS1 من قبل جماعات عديدة باستخدام ZFNs، TALEN أو كريسبر / Cas9 1،2،19. هذه nucleases زيادة كبيرة في كفاءة إعادة التركيب مثلي في مكان المحدد. ومع ذلك، فإن عملية غربلة وتميز تماما استنساخ المستهدفة بشكل صحيح، وخالية من INTEG عشوائيالتموينية وللحفاظ على تعدد القدرات والجينوم النزاهة قد يستغرق ما يصل إلى 3 أشهر (باستخدام الأمثل أدوات التحرير الجينات) (الشكل 3). الأخيرين يمكن أن تسببها الطفرات المحتملة الناتجة عن النشاط نوكلياز بعيدا عن الهدف. النظام RMCE المستخدمة هنا، ومع ذلك، يوفر طريقة سريعة وفعالة، وأنيقة لتحقيق هذا الهدف في غضون أسبوعين فقط، بمجرد preintegrated تسلسل المستهدفة recombinase محددة في موضع AAVS1. استخدام إيجابية / سلبية اختيار وبرنامج اختيار المناسب هي العوامل الرئيسية التي تسهم في تبسيط التحرير الجين في موضع AAVS1 التي كتبها RMCE.
يتم تقليل التوصيف الوراثي للخطوط المعدلة وراثيا الجديدة بشكل ملحوظ (أي فحص نسيلي ضروري)، وتوصيف المرتبطة بالنشاط نوكلياز بعيدا عن الهدف يتم تقديم الاستغناء عنها نظرا لخصوصية FLPe لFRTs. ويمكن أيضا أن يتم تخفيض توصيف في التجارب RMCE الروتينية من قبل مما يدل علىخسارة كاملة للتعبير GFP من خط الخلية الرئيسي (الشكل 2A)، لأن الصرف كاسيت الكامل وعدم الاندماج عشوائي سبق أن أثبتت بما فيه الكفاية من قبل PCR (الشكل 2B) واللطخة الجنوبية (13). يشكل استخدام إيجابية / سلبية اختيار أيضا الفرق الرئيسي مع التقارير السابقة. العديد من الجماعات التي سبق وصفها RMCE في hPSCs، سواء في AAVS1 أو غيرها من مواضع، استخدمت فقط مجموعة مختارة خطوة إيجابية واحدة 7،14،16. هذا لا يشكل ميزة التقنية الرئيسية على تحرير الجين يؤديها مع nucleases، لفحص مستعمرة لابد من تنفيذها على قدم المساواة من أجل إظهار التكامل الصحيح وغياب التكامل عشوائية على مستوى نسيلي.
استخدام هذا النظام RMCE في عدة HESC خطوط / IPSC يتطلب preintegration من وصف FRT التي تحتوي على الكاسيت في موضع AAVS1 كل سطر مستقل. ومع ذلك، ولدت مرة واحدة،سرعة وبساطته يجعل من الممكن لتطوير شاشات الوراثية شبه عالية الإنتاجية في إعدادات إسوي المحددة لتقديم الطلبات المذكورة أعلاه التي لولاها يكون الوقت قد حان للغاية من الناحية الفنية المستهلكة. وبالإضافة إلى ذلك، هي التي شيدت جميع ناقلات RMCE داخل ناقلات استهداف الجين أسما AAVS1 استخدامها لاستهداف موضع مع ZFNs، ولم يبلغ عن TALENs أو كريسبر / Cas9 أيضا. ازدواجية متجه RMCE هي مفيدة للغاية لتوليد خطوط متعددة لالتحوير العزم في hPSCs مع أو بدون FRT. على سبيل المثال، ضربة واحدة أثبتت نجاحا في شاشة الوراثية الحثيثة التي يبذلها RMCE سيحتاج مثالي لفحصها في خطوط hPSC متعددة لتأكيد النتائج. في غياب العديد من خطوط الخلايا الماجستير-RMCE مناسبة، الجين المباشر استهداف للضرب باستخدام nucleases يمكن أن يؤديها. وقد ثبت فائدة الطابع المزدوج للناقلات RMCE مجموعتنا 20. في هذه الدراسة، تم إجراء تصحيح الجين في المستمدة المريضالخرف الجبهي الصدغي (الخرف الجبهي الصدغي) iPSCs التي تحمل طفرة مسببة PROGRANULIN (PGRN) نقص التعبير. تكامل الجينات التي الإدراج بوساطة ZFNs في موضع AAVS1 من الكاسيت الذي أعاد مستويات PGRN، تصحيح النمط الظاهري عيب في corticogenesis المرتبطة جود طفرة. بالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء خط مماثل من قبل RMCE في hESCs WT لاستخدامها لمراقبة التعبير PGRN خارجي.
في حالة عدم وجود المستعمرات المؤتلف، والتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن من ناقلات RMCE المانحة. الكفاءة ترنسفكأيشن متفوقة على 30٪ تسفر عن النتائج المشار إليها أعلاه. الكفاءة ترنسفكأيشن أقل انخفاض كفاءة إعادة التركيب. وأخيرا، تم إنشاء نظام RMCE في موضع AAVS1، ولكن ذلك ينطبق على أي مكان آخر.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeders |
| CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
| Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F7524 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
| Matrigel, hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
| mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder-free culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder-free culture |
| Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
| Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
| Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
| FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
| Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
| pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
| RMCE donors | - | - | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
| PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
| NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
| BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
| NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |
References
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Baer, A., Bode, J. Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).
- Sakurai, K., et al. Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 38 (7), e96 (2010).
- Irion, S., et al. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange. Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).
- Simth, J. R., et al. Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration. Stem Cells. 26, 496-504 (2008).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Qian, K., et al. A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives. Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).
- Ordovás, L., et al. Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
- Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines. Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).
- Ramachandra, C. J., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors. Nucleic Acids Res. 39 (16), e107 (2011).
- Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production. Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).
- Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Raitano, S., et al. Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia. Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).
