Summary
Här rapporterar vi en snabb och effektiv gen redigeringsmetod baserad på RMCE i AAVS1 platsen för mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) som förbättrar tidigare beskrivna system. Med användning av denna teknik kan isogena linjer snabbt och tillförlitligt som genereras för korrekt jämförande studier, underlätta transgenes-medierad forskning med hPSCs.
Abstract
Även med revolutionen gen inriktning teknik under ledning av crispr-Cas9, genetisk modifiering av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) är fortfarande tidsödande. Jämförande studier som använder rekombinanta linjer med transgener integrerade i safe harbor loci kan dra nytta av metoder som använder platsspecifika riktade rekombinaser, som Cre eller FLPe, som är snabbare och mindre benägna att off-mål effekter. Sådana metoder har beskrivits, även om de inte är avsevärt bättre än föregående genmålinriktning i de flesta aspekter. Använda zinkfinger nukleaser, tidigare har vi skapat en mästare cellinje i AAVS1 platsen för hPSCs som innehåller en GFP-Hygromycin-tk uttryckande kassetten, flankerad av hetero FRT-sekvenser. Här beskriver vi förfaranden för att utföra FLPe rekombinas-medierad kassettutbyte (RMCE) använder linjen. Befälhavaren cell linje transfekteras med en RMCE donatorvektor, vilken innehåller en promotorlös Puromycin motstånd och med FLPe rekombinas. Tillämpning av både en positiv (Puromycin) och negativa (FIAU) programval leder till valet av RMCE utan slumpmässiga integrationer. RMCE genererar helt karaktäriserade pluripotenta polyklonala transgena linjer i 15 d med 100% effektivitet. Trots den nyligen beskrivna begränsningar av AAVS1 locus, hur lätt systemet banar väg för hPSC genmodifiering i isogena inställningar, är nödvändig för jämförande studier, och möjliggör halv hög genomströmning genetiska skärmar för vinst / förlust av funktionsanalys som annars skulle vara mycket tidskrävande.
Introduction
Riktade genom rekombination har underlättat snabba framsteg inom många forskningsområden. Hos möss har samverkan mellan genomet redigering och stamcellsforskning tillåts för en ökad förståelse av den komplexa mekanismen av geners funktion och genreglering. Sådana framsteg förväntas i humana pluripotenta stamceller (hPSCs) liksom, även om många år sedan den första isoleringen av humana embryonala stamceller (hESCs), och senare mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSCs), gen redigering har utgjort en teknisk hinder . Senaste framstegen inom genomet teknik med hjälp av riktade nukleaser-zinkfinger nukleaser (ZFNs), transkriptionsaktivator liknande effektor nukleaser (talen), eller Clustered regelbundet mellanrum kort palindromiska upprepningar / crispr-associerat protein 9 (crispr / Cas9) har tillåtit oss att övervinna dessa svårigheter, vilket gör riktade rekombination en effektiv process 1-3.
Specifika loci i mouse genomet som tillåter stabil, pålitlig, och allestädes närvarande transgen expression i frånvaro av negativa effekter som ROSA26, Hprt1 eller Col1A1 har blivit viktiga verktyg i utförandet av genetiska studier. Safe harbor loci tillåter jämförbara analys mellan olika linjer av möss i isogena sammanhang. Detta kan inte åstadkommas med hjälp av standardmetoder slumpmässig integration, som är förknippade med välkända begränsningar som insättningsmutagenes, dosberoende effekter, eller brokiga transgen expression. Gene redigering lätthet och flexibilitet i safe harbor loci ökas genom användning av platsspecifika riktade rekombinaser som Cre eller Flippase (FLPe), som specifikt känner igen målsekvenser (loxP eller FRT, respektive) och katalyserar effektiv rekombination mellan identiska mål. På grund av dessa egenskaper är rekombinas-medierad gen redigering med hjälp av loxP eller FRT-sekvenser i förintegrerade safe harbor loci ett gemensamt verktyg som används i mus transuppkomst. Förutom kassett insättning eller excision förmedlad mellan identiska målsekvenser, användning av inkompatibla loxP eller FRT-ställen möjliggör rekombinas-medierad kassettutbyte (RMCE) 4.
I human har försök att identifiera säkra harbor loci har utförts. Musen ortologa HPRT, trots dess samband med förlust av funktion Lesch-Nyhan syndrom, och ROSA26 har varit inriktat på hPSCs. HPRT rapporterades snabbt tysta transgenexpression i ESC och som ROSA26, dess förmåga att upprätthålla transgenexpression i terminalt differentierade celler undersöktes inte 5-7. Eftersom en homozygot nollmutation av CCR5-genen verkar vara väl tolererad hos människa, var dess värde som trygg hamn bedömas. CCR5 riktades och rapporteras för att upprätthålla en stabil transgen uttryck i olika humana cellinjer, inklusive ESC 8,9. Dock,den senare inte visat på klonnivå under långtidsodling, och allestädes närvarande transgen uttryck inte visat i differentierad avkomma av de tre bakterieskikten. AAVS1 den naturliga platsen för adenoassocierat virus typ 2 (AAV) integration, testades i hESCs liksom, på grund av rapporterade resistens mot transgen tysta 10. Senare, många grupper använde AAVS1 lokuset och beskrivs stabil transgen expression i odifferentierade hPSCs, såväl som i sin differentierade avkomman av alla tre groddblad, både in vitro och in vivo 2,8,11,12. De senaste resultaten ändå nyansera dessa fynd, eftersom AAVS1 locus befanns utöva variabel transgen hämning in vitro i odifferentierade hESCs och i hepatocyte avkomma 13.
Ytterligare screeningstudier med slumpmässiga metoder och integrationsmetoder för att bestämma enda exemplar integration syftar till att hitta genomic integrationsställen som är resistenta mot transgen tystande under hPSCs expansion och differentiering 14,15. Totalt hittills ingen iska webbplats har helt validerats som en trygg hamn i hPSCs och deras avkomma; identifiering av en lämplig plats för ubiquitous stabil transgenexpression, inte bara i hPSCs utan också i deras differentierade avkommor in vitro och in vivo, återstår att lösa. Bland alla de studerade loci och trots sina begränsningar fortfarande AAVS1 bäst karaktäriserade och mest använda inom stamcellsforskningen.
RMCE har framgångsrikt genomförts i hPSCs i vissa av dessa loci 6,7,14,16, använder mest Cre rekombinas, även om det finns indikationer på att FLPe är mer effektiv än Cre 17. I alla dessa fall har en positiv läkemedelsresistens kassett som används för selektion av rekombinanta kolonier. Även framgångsrika, dessa förfaranden inte utgör ett tekniskt framsteg över standard gene-redigeringsförfaranden använder ZFNs, Talens eller crispr / Cas9, som en enda antibiotikum urvalsförfarande utesluter inte slumpmässiga integrationer och kräver koloni screening för att identifiera korrekt målinriktade kloner.
I detta förfarande, beskriver vi metoder för att utföra RMCE i hPSCs i AAVS1 locus med hjälp av en kombination av positiv (inom den inkommande kassett) och negativa (inom förintegrerade kassett) val som möjliggör generering av polyklonala transgena linjer i ± 15 dagar med 100% effektivitet och fri från slumpmässiga integrationshändelser. Därför representerar denna metod framsteg bortom närvarande beskrivna RMCE teknik i hPSCs.
Protocol
1. Beredning av FRT-innehållande hPSC master cellinje för transfektion
- Kultur hESC / IPSC mästare cellinjer enligt standardprocedurer på eller utanför inaktiv mus Embryonala fibroblaster (Imef) med hESC eller matare fritt iPSC medium (tabell 1). Förbereda 2 (på matare) eller 1 (feeder-fria) brunnar i hPSCs i en 6-brunnsplatta för varje experimentell betingelse.
- Observera kulturerna, och när cellerna når 60-70% konfluens, plåt läkemedelsresistent Imef (iDR4). Kortfattat, täcka de nödvändiga brunnar i en 12-brunnar med 0,5 ml 0,1% gelatinlösning och inkubera under 5 min vid RT. Plattan 125.000 iDR4s per brunn och inkubera O / N med Imef medium (tabell 1).
2. hPSC Transfektion av Nucleofection
- Följande dag, för-inkubera hESC / IPSC kulturer med färska medier, inklusive 10 pM Rho-associerat proteinkinas (ROCK) inhibitor (Y-27632), under 1 h vid 37 ° C. Next, ta hESC transfektion lösningen från kylskåpet till pre-varm till rumstemperatur.
- Förbereda 1 ml nucleofection plätering medium (tabell 1) per nucleofection skick. Ta Imef mediet utanför brunnarna, tvätta med 1 ml rumstemperatur PBS, och tillsätt 500 mikroliter av nucleofection plätering medium. Överföra de andra 500 mikroliter till sterila 1,5 ml rör och förvara dem vid 37 ° C tills plätering. OBS: Ett typiskt RMCE experiment innehåller tre olika förhållanden med molekylära förhållanden av RMCE donator: pFLPe vektorer för 2: 0, 2: 1, och 0: 1.
- Lösgöra hESC / iPSC in i en enkelcellsuspension.
- Ta bort media, tvätta den med 2 ml RT PBS, och tillsätt 1 ml trypsin 0,05% eller Accutase på matar eller matarfria hPSC kulturer, respektive. Inkubera 7 (trypsin) eller och 2-5 (Accutase) min vid 37 ° C. För Accutase behandling - celler måste förbli löst, men bifogas.
- Försiktigt bort plattan från inkubatorn och utan enllowing cellerna att lossa, ta bort dissociationsmedel genom aspiration. Tillsätt 1 ml av hESC media och dissociera de lösa cellerna genom att försiktigt spola media på plattans yta, undvika skumning. Se till cellerna är i en enkelcellsuspension.
- Samla cellerna i en ren och steril 15 eller 50 ml rör. Tvätta brunnarna med 1 ml hESC media och samla upp cellerna i samma 15 eller 50 ml rör. Ta en 50 mikroliter alikvot för att räkna (under nästa steg) med en cellräkning enhet. Anteckna volymen för insamling och beräkna den totala antalet celler. Centrifugera ner cellerna vid 300 xg under 5 min vid RT.
- Resuspendera cellpelleten till en suspension av 10 6 celler / ml med PBS med hjälp av en 5 ml serologisk pipett och försiktig pipettering. Undvik skumbildning. Överför 2 ml per experimentell betingelse (cirka 2 x 10 6 celler) för att rengöra, sterila 15 ml rör.
- Medan centrifugering, prejämföra den RMCE donor- pFLPe plasmider blandar i en maximal volym av 10 mikroliter.
- Överföra 2,5 pg av pFLPe (6,5 Kb) till en ren, steril 1,5 ml rör. Lägga till en 2: 1 molförhållande av RMCE donatorvektor 13 till pFLPe vektorn. Till exempel, cirka 10 | j, g av en 12 Kb RMCE donatorvektor.
- Fortsätt med nucleofection undvika skumning i alla steg.
OBS: Vissa hPSC transfektion protokoll tillämpa en ytterligare Imef utarmning steg före steg 2,4. Men i praktiken är Imef en mindre cellfraktion på den inre fjädring som inte signifikant ändra transfektion effektivitet, inte heller kommer det att skapa förorenande rekombinanta celler eftersom de är icke-proliferativ. Dessutom är det viktigt att snabbt under transfektion process för att öka lönsamheten. Av dessa skäl är Imef utarmning inte tillämpas.- Avlägsna iDR4 plattan och 1,5 ml rör med plätering medietfrån inkubatorn. Ett rör i taget, pipettera bort PBS försiktigt utan att störa cellpelleten. Ta bort så mycket som möjligt. Resuspendera pelleten med 100 mikroliter av transfektion lösning genom att försiktigt pipettera. Överför cellsuspensionen till 1,5 ml rör innehållande plasmiden mixar och blanda försiktigt.
- Överför cell-DNA mix till transfector kyvetten, att uppmärksamma att inte införa bubblor. Inför kyvetten i Nucleofector enheten och tillämpa program A13 (celler odlade på matare) eller F16 (feeder-fri).
OBS: Andra transfektion metoder eller Nucleofector enheter kan kräva optimering av dessa program eller transfektion förhållanden. - Återta kyvetten och, med användning av de disponibla överföringspipetter som är tillgängliga i nucleofection kit, samla in dess innehåll genom att applicera 0,5 ml av plätering medium och aspire hela volymen. Genomför detta steg snabbt, men försiktigt och i en rörelse.
- Platta droppvis i 12-well platta innehåller iDR4 och 500 mikroliter av plätering medium. Upprepa steg 2.6.1 - 2.6.4 för nästa experimentella tillstånd.
- Placera odlingsskålen på en hylla i inkubatorn och flytta den sakta fram och tillbaka och från sida till sida för att jämnt fördela cellsuspensionen. Inkubera det i 24 timmar före nästa mediaändring för att möjliggöra för cellerna att återhämta sig i närvaro av 10 pM ROCK-inhibitor (Y-27632).
3. Positiva och negativa urval av celler som genomgår RMCE
- Förändring odlingsmedia dagligen (1 ml / brunn), och 2-3 d efter transfektion, börja urval med 100 ng / ml puromycin.
OBS: Optimala koncentrationer av positiva och negativa selektionsreagens måste bestämmas experimentellt för varje nyligen genererade hPSC mastercelllinjen. Utför en kill kurva 13, med huvud cellinje för att bestämma den låga dosen (koncentration vid vilken minimal visuell toxicitet är uppenbart efter 7d val, men kulturen är inte övervuxna), optimal dos (den lägsta koncentration vid vilken alla celler är döda efter 7 d val), och hög dos (koncentration som orsakade uppenbar toxicitet, döda alla celler efter 2-3 d) för både puromycin och Fialuridine (FIAU).- Aspirera hESC medium. Tvätta med 1 ml PBS. Lägg hESC medium med 100 ng / ml puromycin.
- Observera celltillväxt så att döden och tillväxt är balanserade. Ändra media med puromycin dagligen, efter steg 3.1.1. När tillväxthastigheten overtakes celldöd, öka puromycin koncentrationen i block om 25 till 50 ng / ml upp till ett maximum av 250 ng / ml. Fortsätt puromycinselektion för 5-7 d.
- 3-4 d efter start puromycinselektion, omkring dag 6 efter transfektion, börjar valet med 0,5 iM FIAU. Ändra media dagligen och underhålla FIAU högst 7 sammanhängande dagar.
4. Expansion och karakterisering av RMCE Lines
- Lägga fetalt kalvserum till cellerna i PBS upp till en slutkoncentration av 5%. Överföra celler till en ren FACS-rör med en cellfilter och hålla dem på is.
OBS: Cellviabilitet är hög i dessa förhållanden, så det är möjligt, men inte nödvändigt, att använda en fluorescerande fläck för icke-viabla celler (t.ex., 7-AAD eller PI). - Fortsätt omedelbart analysen i en flödescytometer cell analysator och registrera 20.000 - 30.000 händelser. För analys, ställa portarna ovan GFP eller TDT bakgrund blomningstid med hjälp av negativt kontrollprov WT.
- Överföra celler till ett rent 1,5 ml rör. Centrifugera ner vid 300 xg under 5 min vid RT och aspirera supernatanten. Gå vidare till DNA-extraktion med ett kommersiellt kit och följ tillverkarens instruktioner. Lagra den torra pelleten vid -20 ° C under latER-analys.
- Förbered standard PCR-reaktioner enligt villkoren i figur 3 och tabell 2 Kör PCR prover 13 på en 2% agarosgel innehållande 1x DNA gel fläck på 150 V för 15 -. 25 min. Analysera körningen i en gel analysator.
Representative Results
Använda AAVS1 specifika ZNFs var helt karaktäriserade hESC / IPSC mästare cellinjer innehållande hetero FRT målsekvenser genereras och beskrivs 13. FRT-innehållande mästare cellinjer underhålls pluripotens och genom integritet efter ZFN behandling och stabilt uttryckte GFP in vitro och in vivo. RMCE utförs genom samtransfektion av huvud cellinjer med FLPe rekombinas och RMCE givar vektorer (figur 1A). RMCE vektorer innehåller identiska FRT-sekvenser till de i AAVS1 mastercellen linje som flankerar transgenen Figur 1B övervakar RMCE hjälp av konstitutivt uttrycker TDT pZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F Efter transfektion hPSC bilda små grupper av celler jämnt fördelade över den iDR4 MEF lagret, och transfekterade hPSC uttrycka både GFP liksom övergående TDT (Figur 1B, D2). Cellerna får återhämta sig under 2-3d efter transfektion innan val. Positiv selektion först började använda en låg dos av puromycin för att gynna RMCE givar insättning. Puromycin appliceras försiktigt i början, eftersom inledande massiv celldöd kan leda till enstaka celler som genomgår rekombination, vilket gör dem oförmögna att överleva processen. Under de följande dagarna, behöver puromycin koncentration höjas stegvis upp till den optimala dosen för att tillåta de rekombinanta cellerna att växa till små kolonier medan nonrecombined cellerna gradvis dör.
3-4 d efter påbörjad positiv selektion (cirka D 6 efter transfektion), är negativ selektion påbörjades för att välja endast för FRT-förmedlade rekombinationshändelser. RMCE orsakar förlust av tymidinkinas (Tk) självmordsgen och sålunda känsligheten för Fialuridine (FIAU). Negativ selektion anbringas på denna punkt, i vilken små kluster av 2-4 GFP - / TDT + (RMCE) celler ärtåla optimala koncentrationer av FIAU (Figur 1B, D 6) förhindrar slumpmässig integration, eftersom det i sådana händelser, tk-genen i AAVS1 locus förblir opåverkad. Förekomst av samtidig FRT-medierade och slumpmässig integration är högst osannolikt, vilket framgår av frånvaro av slumpmässiga integrationshändelser senare under benämning (Figur 2B).
Den blandade RMCE GFP - / TDT + kolonier fortsätter att växa, samtidigt som de blir mer homogent, så att av D 9-10 efter transfektion, vissa inte helt utvalda blandade RMCE kolonier kan hittas (Figur 1B). GFP - / TDT + RMCE kolonier är närvarande endast när både RMCE donator och FLPe (2: 1) används, medan RMCE inte sker i frånvaro av FLPe (2: 0). Fullt urval med FIAU fram till dag 13-15 efter transfektion ger upphov till en homogen GFP - / TDT + culture. RMCE ger ett genomsnitt på 12,8 ± 6,8 (n = 6) Puro R / FIAU ^ -kolonier i 15 dagar 13. Flödescytometri karakterisering av nyligen genererade RMCE linje (Puro R / FIAU R RMCE kolonier kombineras i en nonclonal cellpopulation) bekräftar att 100% av cellerna presenterar RMCE GFP - / TDT + fenotypen (figur 2A). När RMCE donatorer utan konstitutivt uttryck av en fluorescerande reporter används, är den resulterande Puro R / FIAU R RMCE hPSC linje homogent GFP -.
PCR karakterisering av nonclonal RMCE linjen demonstrerar den fulla kassetten utbyte (inga spår av kassetten av master cellinjen kan detekteras) och att valet program som används genererar slumpmässiga integrationsfria linjer (båda av RMCE donatorn och FLPe-uttryckande vektor) (Figur 2B). Dessa resultat ytterligare bevisas av southern blot och dessutom visade vi att de RMCE linjerna förblir pluripotenta 13. Detta gör det inte längre nödvändigt att utföra antingen genomet hela utvärdering av slumpmässig integration eller pluripotens testet under rutin RMCE experiment. I sammanfattning, användning av detta protokoll, hPSC transgena cellinjer i AAVS1 lokuset fri från slumpmässig integration kan lätt genereras i 15 d med 100% effektivitet och utan behov av omfattande karakterisering.
Figur 1: Schematisk översikt av RMCE (A) Tidslinje av RMCE ljudkälla.. Vänster: master cellinje (MCL), som hyser en FRT-flankerad kassett (trianglar) som uttrycker GFP och Hygromycin-tk (förenade genom 2A själv klyva peptider), transfekteras med nucleofection (NF) med FLPe-uttryckande vektor och den RMCE donatorvektor, which innehåller en promotorlös puromycinresistensgen (splitsningsacceptor - SA- Puro R) och en rörlig experimentell kassett (X). Höger: ny RMCE linje (RMCEL) uppnås efter fullgjorda val med Puromycin (röd triangel) och FIAU (blå linje). (B) RMCE med användning av en konstitutiv TdT-uttryck donator och olika förhållanden av donator-DNA och FLPe DNA (0: 1, 2: 1, 2: 0) övervakades genom fluorescensmikroskopi (GFP - grön fluorescens, TDT - röd fluorescens) vid olika tidpunkter. D 2 och 6: skala staplar representerar 100 nm. D 10: skala staplar representerar 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Karakterisering av RMCE Lines (A) Fastställande av RMCE avflödescytometri. GFP och TdT uttrycket visas för WT linjen, master-cellinje (MCL), och nyligen genererade RMCE linje vid D 15 post-nucleofection med användning av en konstitutiv TdT-expressionsvektor (CAGGS TDT), eller donatorer med GFP drivs av en gsc promotor (GSCp GFP, definitiv endoderm markör) eller en AAT-promotor (APOeAATp GFP, hepatocyte markör). (B) Bekräftelse av RMCE (5 '/ 3 "JA RMCEL), frånvaro av mastercellen linjens (MCL) kassett (5' / 3" JA MCL), och brist på slumpmässig integration (5 '/ 3' / FLPe RI ) genom PCR med användning av de avbildade primerpar. DNA från WT, MCL, RMCE linjer (1 - 5), givar RMCE vektor (+ RI), FLPe uttryckande vektor och kontroll utan templat (NTC) användes. Figur modifierad från (Ordovas et al., 2015) 13. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
inom-page = "1"> 
Figur 3. Generering av RMCE-lämplig högre cellinje och jämförelse av Gene Targeting med RMCE i AAVS1 vänster. Gene inriktning använder omodifierade WT celler som samtransfekterade med en donator (kassett som beskrivs i figur 1A för generering av master cellinje , MCL) och specifika optimerade ZFNs. Processen att fullfölja hela karakterisering tar upp till 3 månader. Höger: RMCE utförs genom samtransfektion av givaren med FLPe vektorer och ett fullt karakteriseras linje genereras i 15 d. Genmålsökning effektivitet i AAVS1 är från tidigare studier 1,2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Tabell 1. Media komposition.
| Analysera | Framåt | Omvänd | amplikon | PCR-cykel | ||
| 5'JA MCL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CGTTACTATGGGAACATACGTCA | 1,1 Kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ° C (-0,5 ° C / cykel), 1' 30 ''] X15 - [95 ° C, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ° C, 5' | ||
| 3'JA MCL | TAACTGAAACACGGAAGGAG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1,4 Kb | 95 ° C, 5 '- [95 ° C, 30' '- 68 ° C (-0,5 ° C / cykel), 1' 30 ''] X15 - [95 ° C, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ° C, 5' | ||
| 5'JA RMCEL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC | 1,1 Kb | 95 ° C, 5 '- [95 ° C, 30' '- 68 ° C (-0,5 ° C / cykel), 1' 30 ''] X15 - [95 ° C, 30 '' - 58 ° C, 30 '' -72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'JA RMCEL | TTCACTGCATTCTAGTTGTGG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1,5 Kb | 95 ° C, 5 '- [95 ° C, 30' '- 68 ° C (-0,5 ° C / cykel), 1' 30 ''] X15 - [95 ° C, 30 '' - 58 ° C, 30 '' - 72 ° C, 1 '30' '] X25 - 72 ° C, 5' | ||
| 5'RI GIVARE | GTACTTTGGGGTTGTCCAG | TTGTAAAACGACGGCCAG | 0,5 Kb | 95 ° C, 5 '- [95 ° C, 30' '- 60 ° C, 30' '- 72 ° C, 30' '] X25 - 72 ° C, 5' | ||
| 3'RI GIVARE | CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC | ACACAGGAAACAGCTATGAC | 0,5 Kb | |||
| RI FLPe | CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG | GTATGCTTCCTTCAGCACTAC | 0,65 Kb | 95 ° C, 5 '- [95 ° C, 30' '- 60 ° C, 30' '- 72 ° C, 30' '] X25 - 72 ° C, 5' | ||
Tabell 2. primeruppsättningar används för PCR genotypning. Modifierad från Ordovas et al., 2015 13.
Discussion
Gene redigeringsmetoder i safe harbor loci förblir ett viktigt verktyg för att utveckla genmodifiering i hPSCs. Även safe harbor karaktär AAVS1 har nyligen ifrågasatts för vissa tillämpningar 13,18, förblir detta lokus för närvarande bäst karakteriseras i cellinjer humant ursprung. Medvetenhet om dess begränsningar i hPSCs kan bidra till att få tillförlitliga uppgifter. Därför AAVS1 fortfarande förväntas vara en användbar webbplats, exempelvis för GAIN- och förlust av funktionsstudier eller inducerbara / konstitutivt uttryck av faktorer som kräver en isogen sammanhang inom och mellan bestämda genetiska bakgrunder.
Den AAVS1 locus har varit föremål för många grupper som använder ZFNs, Talen eller crispr / Cas9 1,2,19. Dessa nukleaser avsevärt öka effektiviteten av homolog rekombination i en bestämd lokus. Men för att processen skärmen och fullständigt karaktärisera korrekt riktade kloner, fria från slumpmässig integranson och bibehålla pluripotens och genom integritet kan ta upp till 3 månader (med optimerade genen redigeringsverktyg) (Figur 3). De sista två kan orsakas av möjliga mutationer som genereras av off-target nukleasaktivitet. Den RMCE system som används här, men erbjuder en snabb, effektiv och elegant metod för att uppnå detta mål på bara två veckor, en gång rekombinas specifika målsekvenser förintegrerade i AAVS1 locus. Användning av positiv / negativ selektion och ett lämpligt urval program är de viktigaste faktorerna som bidrar till förenkling av genen redigering i AAVS1 locus av RMCE.
Genotypisk karakterisering av de nya transgena linjerna har minskat avsevärt (ingen klon screening är nödvändig), och karakterisering i samband med off-target nukleasaktivitet görs onödigt på grund av specificitet FLPe för FRTS. Karakteriseringen kan också reduceras i rutin RMCE experiment genom att visa dentotal förlust av GFP uttryck från master cellinje (Figur 2A), eftersom hela kassett utbyte och brist på slumpmässig integration har redan bevisats tillräckligt av PCR (figur 2B) och Southern blot 13. Användningen av positiv / negativ selektion utgör också den huvudsakliga skillnaden jämfört med tidigare rapporter. Flera grupper som tidigare beskrivna RMCE i hPSCs, antingen i AAVS1 eller andra loci, användes endast en enda positiv selektionssteg 7,14,16. Detta utgör inte en stor teknisk fördel över gen redigering utförs med nukleaser, eftersom koloni screening måste lika utföras för att visa korrekt integrering och frånvaro av slumpmässig integration på klonnivå.
Användning av denna RMCE system flera hESC / IPSC linjer kräver preintegration av den beskrivna FRT-innehållande kassett i AAVS1 platsen för varje självständig. Men när genererade,dess snabbhet och enkelhet gör det möjligt att utveckla halv hög genomströmning genetiska skärmar i definierade isogena inställningar för program som nämns ovan som annars skulle vara tekniskt mycket tidskrävande. Dessutom är alla RMCE vektor konstrueras inom PZ AAVS1 genen inriktning vektor som används för att rikta locus med ZFNs, men Talens eller crispr / Cas9 rapporterades också. Den RMCE vektor dualitet är mycket användbar för att generera flera rader för en bestämd transgen i hPSCs med eller utan FRT. Till exempel, en träff visade framgångsrik i en bestämd genetisk skärm utförs av RMCE skulle helst måste testas i flera hPSC linjer för att bekräfta resultaten. I avsaknad av flera RMCE-lämplig mästare cellinjer, kan direkt genmålinriktning av träffen med hjälp av nukleaser utföras. Nyttan av den dubbla karaktär RMCE vektor har bevisats av vår grupp 20. I denna studie gen korrigering utförs i patient härrörFrontotemporal demens (FTD) iPSCs som bär en mutation som orsakar PROGRANULIN (PGRN) uttryck brist. Gen komplemente genom ZFNs-medierade insättning i AAVS1 lokuset av en kassett som återställde PGRN nivåer, korrigeras den felaktiga fenotyp i corticogenesis associerad med närvaron av mutationen. Dessutom var en jämförbar linje genereras av RMCE i WT hESCs att användas som kontroll för exogen PGRN uttryck.
I frånvaro av rekombinanta kolonier, ta transfektionseffektiviteten av RMCE donatorvektor. Transfektionseffektivitet överlägsna 30% ger de resultat som anges ovan. Lägre transfektionseffektivitet minskar rekombinationseffektivitet. Slutligen har RMCE systemet genererats i AAVS1 locus, men det är tillämpliga på varje annan locus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeders |
| CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
| Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F7524 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
| Matrigel, hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
| mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder-free culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder-free culture |
| Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
| Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
| Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
| FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
| Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
| pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
| RMCE donors | - | - | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
| PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
| NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
| BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
| NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |
References
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Baer, A., Bode, J. Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).
- Sakurai, K., et al. Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 38 (7), e96 (2010).
- Irion, S., et al. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange. Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).
- Simth, J. R., et al. Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration. Stem Cells. 26, 496-504 (2008).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Qian, K., et al. A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives. Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).
- Ordovás, L., et al. Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
- Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines. Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).
- Ramachandra, C. J., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors. Nucleic Acids Res. 39 (16), e107 (2011).
- Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production. Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).
- Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Raitano, S., et al. Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia. Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).
