Summary
Her rapporterer vi en hurtig og effektiv gen redigering metode baseret på RMCE i AAVS1 locus af humane pluripotente stamceller (hPSCs), der forbedrer tidligere beskrevne systemer. Ved hjælp af denne teknik, kan isogene linjer hurtigt og pålideligt genereret for ordentlig sammenlignende undersøgelser, lette transgenese-medieret forskning med hPSCs.
Abstract
Selv med revolutionen af gen-targeting teknologier ledet af CRISPR-Cas9, genetisk modifikation af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) stadig tidskrævende. Sammenlignende undersøgelser, der bruger rekombinante linjer med transgener integreret i sikker havn loci kunne drage fordel af tilgange, der bruger stedspecifikke målrettede rekombinaser, ligesom Cre eller FLPe, som er hurtigere og mindre tilbøjelige til off-target effekter. Sådanne fremgangsmåder er blevet beskrevet, selv om de ikke i betydelig udkonkurrerer genmålretning i de fleste aspekter. Brug Zink-finger nukleaser, vi tidligere har oprettet en mester cellelinje i AAVS1 locus af hPSCs der indeholder et GFP-Hygromycin-tk udtrykker kassette, flankeret af heterotypiske FRT-sekvenser. Her beskriver vi de procedurer, til at udføre FLPe rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE) ved hjælp af denne linje. Føreren cell line transficeres med en RMCE donorvektor, som indeholder et promotorløst puromycinresistens, og med FLPe rekombinase. Anvendelse af både en positiv (Puromycin) og negative (FIAU) programvalg fører til udvælgelsen af RMCE uden tilfældige integrationer. RMCE genererer fuldt karakteriserede pluripotente polyklonale transgene linier i 15 d med 100% effektivitet. På trods af den nyligt beskrevne begrænsninger AAVS1 locus, den lethed af systemet baner vej for hPSC transgenese i isogene indstillinger, er nødvendig for sammenlignende undersøgelser, og muliggør semi-high-throughput genetiske skærme for gevinst / tab af funktion analyse, der ellers ville være meget tidskrævende.
Introduction
Målrettet genom rekombination har lettet hurtige fremskridt på mange forskningsområder. Hos mus har synergien mellem genom redigering og stamcelleforskning tilladt for en øget forståelse af den komplekse mekanisme af genfunktioner og genregulering. forventes Sådanne fremskridt i humane pluripotente stamceller (hPSCs) samt, om end i mange år, siden den første isolation af humane embryonale stamceller (hESCs), og senere menneske induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), gen redigering har udgjort en teknisk forhindring . Nylige fremskridt i genom engineering ved hjælp af målrettede nucleaser-Zink Finger nukleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talen) eller Grupperet regelmæssigt indbyrdes afstand kort palindrome gentagelser / CRISPR-associeret protein 9 (CRISPR / Cas9) har tilladt os at overvinde disse vanskeligheder, arbejder målrettet rekombination en effektiv proces 1 - 3 ud.
Specifikke loci i mOuse genom, der tillader stabil, pålidelig og allestedsnærværende transgen ekspression i fravær af skadelige effekter som Rosa26, Hprt1 eller COL1A1, er blevet vigtige redskaber i udførelsen af genetiske undersøgelser. Safe harbor loci tillader sammenlignelig analyse mellem forskellige linjer af mus i isogene sammenhænge. Dette kan ikke opnås ved anvendelse af standard vilkårlig integration fremgangsmåder, der er forbundet med kendte begrænsninger som insertionsmutagenese, dosisafhængige virkninger, eller brogede transgenekspression. Gene redigering lethed og fleksibilitet i sikker havn loci øges gennem anvendelse af stedspecifikke målrettede rekombinaser som Cre eller Flippase (FLPe), som specifikt genkender målsekvenser (loxP eller FRT henholdsvis) og katalyserer effektiv rekombination mellem identiske mål. På grund af disse egenskaber, rekombinase-medieret gen redigering under anvendelse loxP eller FRT-sekvenser i preintegrated sikker havn loci er et fælles værktøj, der anvendes i mus transtilblivelse. Foruden kassette insertion eller udskillelse medieret mellem identiske målsekvenser, anvendelse af inkompatible loxP eller FRT-steder muliggør rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE) 4.
Hos mennesker forsøger at identificere safe harbor loci er blevet udført. Musen ortologe HPRT, på trods af sin tilknytning til tab af funktion lesch-nyhans syndrom, og ROSA26 har været målet i hPSCs. HPRT blev rapporteret til hurtigt at lukke munden på transgen ekspression i ESC og ligesom ROSA26, dens evne til at opretholde transgen ekspression i terminalt differentierede celler blev ikke undersøgt 5-7. Fordi en homozygot nul mutation af CCR5 genet synes at være veltolereret i mennesker, blev dens værdi som sikker havn vurderes. CCR5 var målrettet og rapporteres at opretholde stabil transgen ekspression i forskellige humane cellelinjer, herunder økonomiske og sociale råd 8,9. Imidlertid,denne blev ikke påvist på den klonale niveau under langvarig kultur, og allestedsnærværende transgenekspression blev ikke påvist i differentierede afkom af de tre kimlag. AAVS1, den naturlige integration site af adenoassocieret virus type 2 (AAV), blev testet i hESCs samt, på grund af rapporterede modstand mod transgen lyddæmpning 10. Senere, mange grupper brugte AAVS1 locus og beskrevet stabil transgenekspression i udifferentierede hPSCs, såvel som i deres differentierede afkom af alle tre kimlag, både in vitro og in vivo 2,8,11,12. De seneste resultater alligevel nuancere disse resultater, da AAVS1 locus viste sig at udøve variabel transgen hæmning in vitro i udifferentierede hESCs og hepatocyt afkom 13.
Yderligere screening studier med anvendelse af tilfældige integration tilgange og metoder til at bestemme enkelt kopi integration til formål at finde genomic integrationssteder resistente over for transgen silencing under hPSCs ekspansion og differentiering 14,15. Samlet set indtil nu, ingen genomisk websted er blevet fuldt valideret som en sikker havn i hPSCs og deres afkom; identifikation af et passende sted til ubiquitous stabil transgenekspression, ikke kun i hPSCs men også i deres differentierede afkom in vitro og in vivo, er endnu ikke løst. Blandt alle de undersøgte loci og på trods af sine begrænsninger, forbliver AAVS1 den bedst karakteriseret og mest anvendte i stamcelleforskning.
RMCE er blevet udført i hPSCs i nogle af disse loci 6,7,14,16, hjælp meste Cre rekombinase, selv om der er tegn på, at FLPe er mere effektiv end Cre 17. I alle disse tilfælde blev en positiv lægemiddel-resistente kassette anvendes til valg af rekombinante kolonier. Selvom det lykkes, har disse procedurer ikke udgør et teknisk fremskridt i forhold til standard gene-redigering procedurer ved hjælp ZFNs, Talens eller CRISPR / Cas9, som en enkelt udvælgelsesprocedure antibiotikum udelukker ikke tilfældige integrationer og kræver koloni screening for at identificere korrekt målrettede kloner.
I denne procedure, vi beskriver fremgangsmåder til at udføre RMCE i hPSCs i AAVS1 locus ved anvendelse af en kombination af positiv (inden for den indkommende kassette) og negative (i det preintegrated kassette) markeringer, der muliggør frembringelsen af polyklonale transgene linjer i ± 15 dage sammen med 100% effektivitet og fri for tilfældige integration begivenheder. Derfor er denne metode repræsenterer fremskridt ud over aktuelt beskrevne RMCE teknologier i hPSCs.
Protocol
1. Forberedelse af FRT-holdige hPSC Master Cell Line om transfektion
- Kultur hESC / IPSC mester cellelinjer under standardprocedurer til eller fra inaktiveret Mouse Embryonale fibroblaster (iMEF) ved hjælp af embryonale eller feeder-frit iPSC medium (tabel 1). Forbered 2 (på foderautomater) eller 1 (fødefri) brønde i hPSCs i en 6-brønds plade for hver eksperimentel betingelse.
- Overhold kulturer, og når cellerne når 60-70% sammenflydning, plade resistente iMEF (iDR4). Kort beskrevet coate nødvendige brønde i en plade med 12 brønde med 0,5 ml 0,1% gelatineopløsning og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Plade 125.000 iDR4s per brønd og inkuber O / N med iMEF medium (tabel 1).
2. hPSC Transfektion af nucleofection
- Den følgende dag, præinkuberes hESC / IPSC kulturer med friske medier, herunder 10 uM Rho-associeret protein kinase (ROCK) inhibitor (Y-27632), i 1 time ved 37 ° C. Next, tage embryonale transfektion løsning fra køleskabet til at pre-varme til stuetemperatur.
- Forbered 1 ml nucleofection udpladningsmedium (tabel 1) pr nucleofection tilstand. Tag iMEF medium off brøndene, vaskes med 1 ml stuetemperatur PBS, og der tilsættes 500 pi nucleofection udpladningsmedium. Overfør de andre 500 pi til sterile 1,5 ml rør og opbevares ved 37 ° C indtil udpladning. BEMÆRK: En typisk RMCE eksperiment indeholder tre forskellige forhold med molekylære forhold mellem RMCE donor: pFLPe vektorer af 2: 0, 2: 1, og 0: 1.
- Frigør hESC / iPSC til en enkelt cellesuspension.
- Tag medierne, vaske det med 2 ml RT PBS, og der tilsættes 1 ml trypsin 0,05% eller Accutase på feeder eller feeder-fri hPSC kulturer, hhv. Inkuber i 7 (trypsin) eller og 2 - 5, (Accutase) minutter ved 37 ° C. For Accutase behandling - celler skal forblive løs, men vedlagt.
- Fjern forsigtigt pladen fra inkubatoren og uden enllowing cellerne for at frigøre, fjerne dissociationsmidlet ved aspiration. Tilsæt 1 ml af hESC medier og dissociere de løse celler ved forsigtigt at skylle mediet på pladens overflade, undgå skumdannelse. Sørg cellerne er i en enkelt cellesuspension.
- Opsamle cellerne i en ren og steril 15 eller 50 ml rør. Brøndene vaskes med 1 ml hESC medier og opsamle cellerne i den samme 15 eller 50 ml rør. Tag en 50 pi alikvot til tælling (i næste trin) under anvendelse af en celletælling enhed. Bemærk ned for lydstyrken for indsamling og beregne den samlede celle nummer. Spin ned cellerne ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Resuspender cellepelleten til en suspension af 10 6 celler / ml med PBS under anvendelse af en 5 ml serologisk pipette og forsigtig pipettering. Undgå skumdannelse. Overfør 2 ml pr eksperimentel tilstand (ca. 2 x 10 6 celler) for at rense, sterile 15 ml rør.
- Mens centrifugering, prestudse den RMCE donor- pFLPe plasmider blander i en maksimal volumen på 10 uL.
- Overfør 2,5 ug pFLPe (6,5 Kb) til en ren, steril 1,5 ml rør. Tilføj et 2: 1 molekylært forhold mellem RMCE donorvektoren 13 til pFLPe vektoren. For eksempel ca. 10 ug af en 12 Kb RMCE donorvektoren.
- Fortsæt med nucleofection, undgå skumdannelse i alle trin.
BEMÆRK: Nogle hPSC transfektionsprotokoller anvende en yderligere iMEF udtynding trin før trin 2.4. Men i praksis, iMEF er en mindre cellefraktion i det indre suspension, der ikke signifikant ændrer transfektionseffektiviteten, vil heller ikke skabe kontaminerende rekombinante celler, idet de er ikke-proliferativ. Desuden er det vigtigt at fortsætte hurtigt under transfektion processen for at øge rentabiliteten. Af disse grunde er iMEF udtynding ikke anvendt.- Fjern iDR4 plade og de 1,5 ml rør med udpladningsmediumfra inkubatoren. Ét rør ad gangen, pipetteres fra PBS forsigtigt uden at forstyrre cellepelleten. Fjern så meget som muligt. Pelleten resuspenderes med 100 pi transfektion opløsning ved forsigtigt at pipettere. Overfør cellesuspensionen til 1,5 ml rør indeholdende plasmidet mixes og blandes forsigtigt.
- Overfør celle-DNA-blandingen til Transfector kuvetten, opmærksomhed ikke at indføre bobler. Indføre kuvetten i nucleofector enhed og anvende programmet A13 (celler dyrket på foderautomater) eller F16 (feeder-fri).
BEMÆRK: Andre transfektion metoder eller nucleofector enheder kræver optimering af disse programmer eller transfektionsbetingelser. - Generobre kuvetten og under anvendelse af de engangs overførselspipetter tilgængelige i nucleofection kit, indsamle dens indhold ved at anvende 0,5 ml af klædningen medium og opsugning hele det volumen. Gennemføre dette trin hurtigt, men forsigtigt og i én bevægelse.
- Plate dråbevis i 12-well plade indeholdende iDR4 og 500 pi udpladningsmedium. Gentag trin 2.6.1 - 2.6.4 for næste eksperimentel betingelse.
- Placer dyrkningsskålen på en hylde i inkubatoren og flytte det langsomt frem og tilbage og fra side til side for at fordele den celle suspension. Inkuber det i 24 timer inden den næste Mediaskift at tillade cellerne at genvinde i nærvær af 10 uM ROCK inhibitor (Y-27632).
3. Positiv og negativ selektion af celler, der undergår RMCE
- Skift dyrkningsmedier dagligt (1 ml / brønd) og 2 - 3 D efter transfektion starte selektion med 100 ng / ml puromycin.
BEMÆRK: Optimale koncentrationer af positive og negative selektionsreagenser skal bestemmes eksperimentelt for hver nyligt genererede hPSC mester cellelinje. Udfør en kill kurve 13, ved hjælp af master cellelinje til at bestemme den lave dosis (koncentration, hvor minimal visuel toksicitet fremgår efter 7d af udvælgelse, men kulturen er ikke tilgroet), optimale dosis (den laveste koncentration, hvor alle celler er døde efter 7 d udvælgelse), og høj dosis (koncentration, der forårsagede tydelige tegn på toksicitet, at dræbe alle celler efter 2 - 3 i d) for både puromycin og Fialuridine (FIAU).- Aspirer hESC medium. Vask med 1 ml PBS. Tilføj hESC medium med 100 ng / ml puromycin.
- Observere cellevækst, således at døden og vækst er i balance. Skift medier med puromycin dagligt, efter trin 3.1.1. Når vækstrate overhaler celledød, øge koncentrationen puromycin i blokke på 25 - 50 ng / mL op til et maksimum på 250 ng / mL. Fortsæt puromycinselektion i 5 - 7 d.
- 3 - 4 d efter start puromycinselektion, omkring dag 6 efter transfektion, starte valget med 0,5 pM FIAU. Skift medierne dagligt og vedligeholde FIAU for ikke mere end 7 sammenhængende dage.
4. Udvidelse og karakterisering af RMCE Lines
- Tilføj føtalt kalveserum til cellerne i PBS indtil en slutkoncentration på 5%. Overfør cellerne til en ren FACS rør med en celle si og holde dem på is.
BEMÆRK: Cellelevedygtighed er høj i disse betingelser, så det er muligt, men ikke nødvendigt, at anvende en fluorescerende plet for ikke-levedygtige celler (f.eks 7-AAD eller PI). - Fortsæt straks til analyse i et flowcytometer celle analysator og registrere 20.000 - 30.000 begivenheder. Til analyse, sætte portene over GFP eller TDT baggrund fluorescens ved hjælp af negativ kontrolprøve WT.
- Overfør cellerne til et rent 1,5 ml rør. Spin ned ved 300 x g i 5 minutter ved stuetemperatur og aspirere supernatanten. Fortsæt til DNA-ekstraktion ved hjælp af et kommercielt kit og følg producentens anvisninger. Opbevar den tørre pellet ved -20 ° C i latER analyse.
- Forbered standard PCR-reaktioner i henhold til betingelserne i figur 3 og tabel 2 13 Run PCR prøver på en 2% agarosegel indeholdende 1x DNA gel plet ved 150 V i 15 -. 25 min. Analyser løb en gel analysator.
Representative Results
Brug AAVS1-specifikke ZNFs, var fuldt karakteriserede embryonale / IPSC mester cellelinjer indeholder heterotypiske FRT målsekvenser genereret og beskrevet 13. FRT-holdige master-cellelinier opretholdt pluripotens og genom integritet efter ZFN behandling og stabilt udtrykt GFP in vitro og in vivo. RMCE udføres ved cotransfektion af master cellelinjer med FLPe rekombinase og RMCE donor vektorer (figur 1A). RMCE vektorer indeholder identiske FRT-sekvenser til dem i AAVS1 mastercellebank linje flankerer transgenet Figur 1B overvåger RMCE hjælp af konstitutivt udtrykker TDT pZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F Efter transfektion, hPSC danne små grupper af celler jævnt fordelt over den iDR4 MEF lag, og transficeret hPSC udtrykker både GFP samt forbigående TDT (figur 1B, D2). Cellerne får lov til at komme sig i 2 - 3 id efter transfektion, før du starter valg. Positiv selektion først begyndte at bruge en lav dosis af puromycin for at favorisere RMCE donor indsættelse. Puromycin påføres forsigtigt i starten, fordi indledende massiv celledød kunne føre til enkelte celler, der undergår rekombination, hvilket gør dem ude af stand til at overleve processen. I de følgende dage, skal hæves trinvis op til den optimale dosis for at give de rekombinante celler til at vokse i små kolonier, mens de nonrecombined celler gradvist dø puromycin koncentration.
3 - 4 d efter initiering positiv selektion (omkring D 6 efter transfektion), er negativ selektion begyndt for kun at vælge for FRT-medierede rekombination begivenheder. RMCE forårsager tab af thymidinkinase (Tk) selvmordsgen og dermed følsomheden over for Fialuridine (FIAU). Negativ selektion foretages på dette sted, hvor små klynger af 2 - 4 GFP - / TDT + (RMCE) celler erstand til at modstå de optimale koncentrationer af FIAU (figur 1B, D6), forhindrer tilfældig integration, fordi der i disse begivenheder, TK-genet i AAVS1 locus forbliver upåvirket. Forekomst af samtidige FRT-medieret og vilkårlig integration er højst usandsynligt, som demonstreret ved fraværet af tilfældige integrationshændelser senere under karakterisering (figur 2B).
Den blandede RMCE GFP - / TDT + kolonier fortsætte med at vokse, mens bliver mere homogen, således at ved D9 - 10 efter transfektion nogle ikke fuldt udvalgte blandede RMCE kolonier kan findes (figur 1B). GFP - / TDT + RMCE kolonier er kun til stede, når både RMCE donor og FLPe (2: 1), på mens RMCE ikke forekommer i fravær af FLPe (2: 0). Fuld udvælgelse med FIAU indtil dag 13 - 15 efter transfektion giver anledning til en homogen GFP - / TDT + culture. RMCE giver et gennemsnit på 12,8 ± 6,8 (n = 6) Puro R / FIAU-kolonier i 15 dage 13. Flowcytometri karakterisering af nyligt genererede RMCE linje (Puro R / FIAU R RMCE kolonier samlet i en nonclonal cellepopulation) bekræfter, at 100% af cellerne præsentere RMCE GFP - / TDT + fænotype (figur 2A). Når der anvendes RMCE donorer uden konstitutiv ekspression af en fluorescerende reporter, den resulterende Puro R / FIAU R RMCE hPSC linje er homogent GFP -.
PCR karakterisering af nonclonal RMCE linje viser den fulde kassette udveksling (ingen spor af kassetten af master-cellelinien kan detekteres), og at udvælgelsen anvendte program genererer tilfældige integration-fri linjer (begge af RMCE donor og FLPe-udtrykkende vektor) (figur 2B). Disse resultater blev yderligere dokumenteret ved southern blot og desuden demonstreret vi at RMCE linjer forbliver pluripotent 13. Det gør det ikke længere nødvendigt at foretage enten genomet hele evaluering af vilkårlig integration eller pluripotens test under rutinemæssige RMCE eksperimenter. Sammenfattende benytter denne protokol, hPSC transgene cellelinier i AAVS1 locus fri for vilkårlig integration kan let genereres i 15 d med 100% effektivitet og uden behov for omfattende karakterisering.
Figur 1: Skematisk Oversigt over RMCE (A) Tidslinje af RMCE programvalg.. Venstre: master cellelinje (MCL), der huser en FRT-flankeret kassette (trekanter), der udtrykker GFP og Hygromycin-tk (forbundet af 2A selv-spaltende peptider), er transficeret ved nucleofection (NF) med FLPe-udtrykkende vektor og den RMCE donor vektor, which indeholder et promotorløst Puromycin resistensgen (splejsningsacceptor - SA- Puro R) og en variabel eksperimentel kassette (X). Til højre: ny RMCE linje (RMCEL) opnået efter afslutning af selektion med Puromycin (rød trekant) og FIAU (blå linje). (B) RMCE anvendelse af en konstitutiv TDT-udtrykkende donor og forskellige forhold mellem donor-DNA og FLPe DNA (0: 1, 2: 1, 2: 0) overvåges ved fluorescensmikroskopi (GFP - grøn fluorescens, TDT - rød fluorescens) ved forskellige tidspunkter. D 2 og 6: skala søjler repræsenterer 100 um. D 10: skala søjler repræsenterer 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Karakterisering af RMCE Lines (A) Bestemmelse af RMCE vedflowcytometri. GFP og TDT-ekspression er vist for WT linje, master cellelinje (MCL), og nyligt genererede RMCE linje på D 15 post-nucleofection anvendelse af en konstitutiv TDT-ekspressionsvektor (CAGGS TDT), eller donorer med GFP drevet af en GOOSECOID promotor (GSCp GFP, endelig endoderm markør) eller en AAT promotor (APOeAATp GFP, hepatocyt markør). (B) Bekræftelse af RMCE (5 '/ 3' JA RMCEL), fravær af mastercellebank linjens (MCL) kassette (5 '/ 3' JA MCL), og mangel på vilkårlig integration (5 '/ 3' / FLPe RI ) ved PCR ved anvendelse af de afbildede primerpar. DNA fra WT, MCL, RMCE linjer (1 - 5), donor RMCE vektor (+ RI), FLPe udtrykkende vektor, og ingen skabelon kontrol (NTC), blev anvendt. Figur modificeret fra (Ordovas et al., 2015) 13. Klik her for at se en større version af dette tal.
inden-side = "1"> 
Figur 3. Frembringelse af RMCE-egnet Master Cell Line og sammenligning af Gene Targeting med RMCE i AAVS1 Venstre:. Gene målretning anvender umodificerede WT celler, der er cotransficeret med en donor (kassette beskrevet i figur 1A til frembringelsen af master-cellelinien , MCL) og specifikke optimerede ZFNs. Processen med at gennemføre det fulde karakterisering tager op til 3 måneder. Højre: RMCE udføres ved cotransfektion af donoren med FLPe vektorer, og et fuldt karakteriseret linje genereres i 15 d. Gene målrettet effektivitet i AAVS1 er fra tidligere undersøgelser 1,2. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Media sammensætning.
| Assay | Forward | Bagside | amplikon | PCR-cyklus | ||
| 5'JA MCL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CGTTACTATGGGAACATACGTCA | 1,1 kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cyklus), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'JA MCL | TAACTGAAACACGGAAGGAG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.4 Kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cyklus), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 5'JA RMCEL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC | 1,1 kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cyklus), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' -72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'JA RMCEL | TTCACTGCATTCTAGTTGTGG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.5 Kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0,5 ºC / cyklus), 1' 30 ''] X15 - [95 ºC, 30 '' - 58 ºC, 30 '' - 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 5'RI DONOR | GTACTTTGGGGTTGTCCAG | TTGTAAAACGACGGCCAG | 0.5 Kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'RI DONOR | CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC | ACACAGGAAACAGCTATGAC | 0.5 Kb | |||
| RI FLPe | CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG | GTATGCTTCCTTCAGCACTAC | 0.65 Kb | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
Tabel 2. primersæt anvendt til PCR Genotypebestemmelse. Modificeret fra Ordovas et al. 2015 13.
Discussion
Gene redigering metoder i safe harbor loci fortsat et vigtigt redskab til at udvikle transgenese i hPSCs. Selv safe harbor karakter AAVS1 nylig er blevet afhørt for nogle applikationer 13,18, i øjeblikket forbliver dette locus bedst kendetegnet ved human-afledte cellelinjer. Bevidsthed om sine begrænsninger i hPSCs kan hjælpe med at få pålidelige data. Derfor forventes fortsat AAVS1 at være et nyttigt websted, for eksempel til GAIN- og tab-of-funktion studier eller inducerbare / konstitutiv ekspression af faktorer, der kræver en isogen sammenhæng inden for og mellem bestemte genetiske baggrunde.
Den AAVS1 locus er blevet ramt af mange grupper bruger ZFNs, talen eller CRISPR / Cas9 1,2,19. Disse nukleaser øge effektiviteten af homolog rekombination i en bestemt locus. Men for at processen screene og fuldt ud at karakterisere korrekt målrettede kloner, fri for tilfældige integration og til at opretholde pluripotens og genome integritet kan tage op til 3 måneder (ved hjælp af optimerede gen redigeringsværktøjer) (Figur 3). De sidste to kan være forårsaget af mulige mutationer genereret af off-target nukleaseaktivitet. Det RMCE system, der anvendes her, men tilbyder en hurtig, effektiv og elegant metode til at opnå dette mål i kun to uger, når rekombinase-specifikke målsekvenser er preintegrated i AAVS1 locus. Anvendelse af positiv / negativ selektion og en passende programvalg er de vigtigste faktorer, der bidrager til en forenkling af gen redigering i AAVS1 locus af RMCE.
Genotypisk karakterisering af nye transgene linjer reduceres betydeligt (ingen klonal screening er nødvendig), og karakterisering forbundet til off-target nukleaseaktivitet gøres undværes på grund af den særlige FLPe for FRTS. Karakteriseringen kan også reduceres i rutinemæssige RMCE eksperimenter ved at demonstrerefuldstændig tab af GFP-ekspression fra master-cellelinie (figur 2A), fordi fuld kassette udveksling og mangel på vilkårlig integration er allerede blevet tilstrækkeligt påvist ved PCR (figur 2B) og Southern blot 13. Brugen af positiv / negativ selektion udgør også den største forskel med tidligere rapporter. Flere grupper, der tidligere beskrevne RMCE i hPSCs, enten i AAVS1 eller andre loci, anvendes kun et enkelt positivt selektionstrin 7,14,16. Dette udgør ikke en væsentlig teknisk fordel i forhold gen redigering udført med nukleaser, fordi koloni screening skal lige udført for at demonstrere korrekt integration og fravær af tilfældig integration på klonale niveau.
Brug af dette RMCE systemet i multiple hESC / IPSC linjer kræver preintegration af den beskrevne FRT-holdige kassette i AAVS1 locus i hver uafhængig linie. Men når der genereres,sin hurtighed og enkelhed gør det muligt at udvikle semi-high throughput genetiske skærme i definerede isogene indstillinger for programmer, der er nævnt ovenfor, der ellers ville være teknisk meget tidskrævende. Desuden er alle de RMCE vektorer konstrueres i pZ AAVS1 gen-targeting vektor, der anvendes til at målrette af stedet med ZFNs, men Talens eller CRISPR / Cas9 blev også rapporteret. Den RMCE vektoren dualitet er meget nyttigt at generere flere linjer til en bestemt transgen i hPSCs med eller uden FRT. For eksempel er en hit demonstreret succes i en bestemt genetisk skærm udført af RMCE ville ideelt set skal testes i flere hPSC linjer for at bekræfte resultaterne. I fravær af multiple RMCE-egnet mester cellelinier, kan direkte genmålretning af hit hjælp nukleaser udføres. Anvendeligheden af den dobbelte karakter af RMCE vektorer er blevet bevist af vores gruppe 20. I denne undersøgelse blev gen korrektion udført i patient-afledteFrontallapsdemens (FTD) iPSCs der bærer en mutation forårsager PROGRANULIN (PGRN) udtryk mangel. Gene komplementation af ZFNs-medieret indsættelse i AAVS1 locus i en kassette, restaureret PGRN niveauer, korrigeret det defekte fænotype i corticogenesis forbundet med tilstedeværelsen af mutationen. Desuden blev en sammenlignelig linje genereret af RMCE i WT hESCs til anvendelse som kontrol for exogen PGRN ekspression.
I mangel af rekombinante kolonier, kontrollere transfektionseffektiviteten af RMCE donorvektoren. Transfektionseffektiviteten overlegen til 30% udbytte resultaterne angivet ovenfor. Lavere transfektionseffektiviteten falde rekombinationseffektivitet. Endelig er RMCE systemet blevet genereret i AAVS1 locus, men det gælder for alle andre locus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeders |
| CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
| Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F7524 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
| Matrigel, hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
| mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder-free culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder-free culture |
| Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
| Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
| Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
| FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
| Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
| pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
| RMCE donors | - | - | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
| PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
| NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
| BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
| NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |
References
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat. Biotechnol. 29 (8), 731-734 (2011).
- Hockemeyer, D., et al. Efficient targeting of expressed and silent genes in human ESCs and iPSCs using zinc-finger nucleases. Nat. Biotechnol. 27 (9), 851-857 (2009).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Baer, A., Bode, J. Coping with kinetic and thermodynamic barriers: RMCE, an efficient strategy for the targeted integration of transgenes. Curr. Opin. Biotechnol. 12 (5), 473-480 (2001).
- Sakurai, K., et al. Efficient integration of transgenes into a defined locus in human embryonic stem cells. Nucleic Acids Res. 38 (7), e96 (2010).
- Irion, S., et al. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25 (12), 1477-1482 (2007).
- Di Domenico, A. I., Christodoulou, I., Pells, S. C., McWhir, J., Thomson, A. J. Sequential genetic modification of the hprt locus in human ESCs combining gene targeting and recombinase-mediated cassette exchange. Cloning Stem Cells. 10 (2), 217-230 (2008).
- Lombardo, A., et al. Site-specific integration and tailoring of cassette design for sustainable gene transfer. Nat. Methods. 8 (10), 861-869 (2011).
- Lombardo, A., et al. Gene editing in human stem cells using zinc finger nucleases and integrase-defective lentiviral vector delivery. Nat. Biotechnol. 25 (11), 1298-1306 (2007).
- Simth, J. R., et al. Robust , Persistent Transgene Expression in Human Embryonic Stem Cells Is Achieved with AAVS1-Targeted Integration. Stem Cells. 26, 496-504 (2008).
- DeKelver, R. C., et al. Functional genomics, proteomics, and regulatory DNA analysis in isogenic settings using zinc finger nuclease-driven transgenesis into a safe harbor locus in the human genome. Genome Res. 20 (8), 1133-1142 (2010).
- Qian, K., et al. A simple and efficient system for regulating gene expression in human pluripotent stem cells and derivatives. Stem Cells. 32 (5), 1230-1238 (2014).
- Ordovás, L., et al. Efficient Recombinase-Mediated Cassette Exchange in hPSCs to Study the Hepatocyte Lineage Reveals AAVS1 Locus-Mediated Transgene Inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
- Du, Z. -W., Hu, B. -Y., Ayala, M., Sauer, B., Zhang, S. -C. Cre recombination-mediated cassette exchange for building versatile transgenic human Embryonic Stem Cells lines. Stem Cells. 27, 1032-1041 (2009).
- Papapetrou, E. P., et al. Genomic safe harbors permit high β-globin transgene expression in thalassemia induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29 (1), 73-78 (2011).
- Ramachandra, C. J., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange at the AAVS1 locus in human embryonic stem cells using baculoviral vectors. Nucleic Acids Res. 39 (16), e107 (2011).
- Takata, Y., Kondo, S., Goda, N., Kanegae, Y., Saito, I. Comparison of efficiency between FLPe and Cre for recombinase-mediated cassette exchange in vitro and in adenovirus vector production. Genes to Cells. 16 (7), 765-777 (2011).
- Mizutani, T., Li, R., Haga, H., Kawabata, K. Transgene integration into the human AAVS1 locus enhances myosin II-dependent contractile force by reducing expression of myosin binding subunit 85. Biochem. Biophys. Res. Commun. 465 (2), 270-274 (2015).
- Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
- Raitano, S., et al. Restoration of progranulin expression rescues cortical neuron generation in an induced pluripotent stem cell model of frontotemporal dementia. Stem Cell Reports. 4 (1), 16-24 (2015).
