Summary
यहाँ हम एक तेजी से और कुशल संपादन जीन मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के AAVS1 लोकस में RMCE पर आधारित तरीका है कि पहले से वर्णित सिस्टम पर सुधार की रिपोर्ट। इस तकनीक का उपयोग करना, isogenic लाइनों को तेजी से और मज़बूती से उचित तुलनात्मक अध्ययन के लिए उत्पन्न किया जा सकता, hPSCs साथ transgenesis की मध्यस्थता अनुसंधान की सुविधा।
Abstract
यहाँ तक कि जीन को निशाना प्रौद्योगिकियों CRISPR-Cas9, मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के आनुवंशिक संशोधन के नेतृत्व में क्रांति के साथ अभी भी समय लगता है। तुलनात्मक अध्ययन है कि सुरक्षित बंदरगाह लोकी में एकीकृत transgenes के साथ पुनः संयोजक लाइनों का उपयोग जो अधिक तेजी से और कम बंद लक्ष्य प्रभाव से ग्रस्त हैं दृष्टिकोण है कि साइट विशेष को निशाना बनाया recombinases, रचनात्मक या FLPe की तरह इस्तेमाल करते हैं, से फायदा हो सकता है। इस तरह के तरीकों का वर्णन किया गया है, हालांकि वे काफी मात जीन सबसे पहलुओं में लक्षित नहीं है। जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ का उपयोग करना, हम पहले से hPSCs कि एक GFP-hygromycin-टी कैसेट व्यक्त होता है की AAVS1 लोकस में एक मास्टर सेल लाइन, heterotypic FRT दृश्यों से घिरे बनाया। यहाँ, हम FLPe recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE) प्रदर्शन करने के लिए इस लाइन का उपयोग प्रक्रियाओं का वर्णन है। मास्टर गपक्ष लाइन एक RMCE दाता वेक्टर है, जो एक promoterless puromycin प्रतिरोध होता है, और FLPe Recombinase के साथ साथ ट्रांसफ़ेक्ट है। दोनों एक सकारात्मक (puromycin) और नकारात्मक (FIAU) चयन कार्यक्रम का आवेदन यादृच्छिक एकीकरण के बिना RMCE के चयन के लिए होता है। RMCE में 100% दक्षता के साथ 15 डी पूरी तरह से विशेषता pluripotent पॉलीक्लोनल ट्रांसजेनिक लाइनों उत्पन्न करता है। बावजूद हाल ही में AAVS1 लोकस की सीमाओं का वर्णन किया है, सिस्टम में आसानी isogenic सेटिंग्स में hPSC transgenesis के लिए मार्ग प्रशस्त, तुलनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक है, और है कि अन्यथा समारोह विश्लेषण के लाभ / हानि के लिए अर्द्ध उच्च throughput आनुवंशिक स्क्रीन में सक्षम बनाता है अत्यधिक समय लगता हो।
Introduction
लक्षित जीनोम पुनर्संयोजन अनुसंधान के कई क्षेत्रों में तेजी से प्रगति की है। चूहों में, जीनोम संपादन और स्टेम सेल अनुसंधान के बीच तालमेल जीन समारोह और जीन विनियमन के जटिल तंत्र की एक वृद्धि की समझ के लिए अनुमति दी गई है। इस तरह की प्रगति, मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) के रूप में अच्छी तरह से में होने की उम्मीद है, हालांकि कई वर्षों के लिए मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के पहले अलगाव (hESCs), और बाद में मानव प्रेरित बाद से स्टेम कोशिकाओं (hiPSCs), जीन संपादन एक तकनीकी बाधा का गठन किया है । जीनोम इंजीनियरिंग में हाल के अग्रिमों लक्षित न्युक्लिअसिज़-जिंक उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALEN), या का उपयोग संकुल नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता / CRISPR जुड़े प्रोटीन 9 (CRISPR / Cas9) हमें इन पर काबू पाने के लिए अनुमति दी है कठिनाइयों, पुनर्संयोजन निशाना बनाने के लिए एक कुशल प्रक्रिया 1 - 3।
मीटर में विशिष्ट लोकीouse जीनोम कि Rosa26, Hprt1, या Col1A1 तरह प्रतिकूल प्रभाव के अभाव में स्थिर, विश्वसनीय, और सर्वव्यापी transgene अभिव्यक्ति की अनुमति है, आनुवंशिक अध्ययन के प्रदर्शन में आवश्यक उपकरण बन गए हैं। सुरक्षित बंदरगाह लोकी isogenic संदर्भों में चूहों के विभिन्न लाइनों के बीच तुलनीय विश्लेषण अनुमति देते हैं। यह मानक यादृच्छिक एकीकरण विधियों, जो इन्सर्शनल म्युटाजेनेसिस, खुराक पर निर्भर प्रभाव, या विचित्र transgene अभिव्यक्ति की तरह प्रसिद्ध सीमाओं के साथ जुड़े रहे हैं का उपयोग कर हासिल नहीं किया जा सकता है। जीन संपादन आसानी और सुरक्षित बंदरगाह लोकी में लचीलापन साइट विशेष रचनात्मक या Flippase (FLPe) की तरह निशाना बनाया recombinases, जो विशेष रूप से (loxP या FRT क्रमशः) को पहचान लक्ष्य दृश्यों और समान लक्ष्यों के बीच कुशल पुनर्संयोजन उत्प्रेरित के उपयोग के माध्यम से वृद्धि हुई है। इन विशेषताओं के कारण, recombinase की मध्यस्थता जीन preintegrated सुरक्षित बंदरगाह लोकी में loxP या FRT दृश्यों का उपयोग संपादन माउस ट्रांस में इस्तेमाल एक आम उपकरण हैउत्पत्ति। कैसेट प्रविष्टि या छांटना समान लक्ष्य दृश्यों के बीच मध्यस्थता करने के अलावा, असंगत या loxP FRT साइटों के उपयोग recombinase की मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE) 4 के लिए अनुमति देता है।
मानव में, की पहचान करने के लिए सुरक्षित आश्रय स्थलों बाहर किया गया है प्रयास करता है। माउस orthologous HPRT, हानि के समारोह Lesch-Nyhan सिंड्रोम, और ROSA26 के साथ अपने सहयोग के बावजूद hPSCs में लक्षित किया गया है। HPRT तेजी से ईएससी में transgene अभिव्यक्ति चुप्पी और ROSA26 तरह की सूचना मिली थी, में transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए अपनी क्षमता टर्मिनली विभेदित कोशिकाओं की जांच नहीं की गई थी 5 - 7। CCR5 जीन की एक homozygous अशक्त उत्परिवर्तन अच्छी तरह से मानव में सहन किया जा करने के लिए प्रकट होता है क्योंकि, सुरक्षित बंदरगाह के रूप में अपने मूल्य का आकलन किया गया था। CCR5 लक्षित और ESCs 8,9 सहित विभिन्न मानव कोशिका लाइनों में स्थिर transgene अभिव्यक्ति को बनाए रखने के लिए सूचित किया गया था। तथापि,बाद के लिए लंबी अवधि के दौरान संस्कृति प्रतिरूप स्तर पर साबित हो गया था नहीं, और सर्वव्यापी transgene अभिव्यक्ति तीन रोगाणु परतों की विभेदित संतान में प्रदर्शन नहीं कर रहा था। AAVS1, एडिनो जुड़े वायरस टाइप 2 (एएवी) के प्राकृतिक एकीकरण साइट, परीक्षण किया गया था ट्रांस्जीन को सूचना दी प्रतिरोध की वजह के रूप में अच्छी hESCs, में 10 मुंह बंद। बाद में, कई समूहों AAVS1 ठिकाना इस्तेमाल किया और अविभाजित hPSCs में स्थिर transgene अभिव्यक्ति है, साथ ही में सभी तीन रोगाणु परतों के अपने अलग-अलग संतान वर्णित है, दोनों इन विट्रो और इन विवो 2,8,11,12 में। हाल के परिणाम फिर भी इन निष्कर्षों अति सूक्ष्म अंतर के रूप में AAVS1 ठिकाना undifferentiated hESCs में और hepatocyte संतान 13 में इन विट्रो में चर ट्रांस्जीन निषेध लागू करने के लिए मिला था।
यादृच्छिक एकीकरण दृष्टिकोण और विधियों का उपयोग कर अतिरिक्त स्क्रीनिंग अध्ययन भी कॉपी Geno लगाने के उद्देश्य से एकीकरण निर्धारित करने के लिएhPSCs विस्तार और भेदभाव 14,15 दौरान mic एकीकरण साइटों ट्रांस्जीन मुंह बंद करने के लिए प्रतिरोधी। कुल मिलाकर, अब तक, कोई जीनोमिक साइट पूरी तरह से hPSCs और उनकी संतान में एक सुरक्षित बंदरगाह के रूप में मान्य किया गया है; सर्वव्यापी स्थिर transgene अभिव्यक्ति, hPSCs में भी, लेकिन इन विट्रो और इन विवो में उनकी भेदभाव संततियों में न केवल के लिए एक उपयुक्त स्थल की पहचान, हल किया जाना बना रहता है। सभी का अध्ययन किया लोकी के अलावा और अपनी सीमाओं के बावजूद, AAVS1 रहता सबसे विशेषता है और स्टेम सेल अनुसंधान के क्षेत्र में सबसे अधिक इस्तेमाल किया।
RMCE सफलतापूर्वक इन लोकी 6,7,14,16 में से कुछ में hPSCs में बाहर किया गया है, ज्यादातर Cre recombinase का उपयोग कर, भले ही ऐसे संकेत मिले हैं कि FLPe Cre 17 से अधिक कुशल है कर रहे हैं। इन सभी मामलों में, एक सकारात्मक दवा प्रतिरोध कैसेट पुनः संयोजक कालोनियों के चयन के लिए इस्तेमाल किया गया था। हालांकि सफल, इन प्रक्रियाओं के मानक gene- पर एक तकनीकी अग्रिम का गठन नहीं हैZFNs का उपयोग कर संपादन प्रक्रियाओं, TALENS या CRISPR / Cas9, के रूप में एक भी एंटीबायोटिक चयन प्रक्रिया से बाहर यादृच्छिक एकीकरण शासन और सही ढंग से लक्षित क्लोन की पहचान करने के लिए कॉलोनी स्क्रीनिंग की आवश्यकता नहीं है।
इस प्रक्रिया में, हम तरीकों RMCE hPSCs में AAVS1 लोकस में (preintegrated कैसेट के अंदर) (आने वाली कैसेट के अंदर) के सकारात्मक और नकारात्मक के संयोजन का उपयोग कर चयन है कि पॉलीक्लोनल ट्रांसजेनिक लाइनों की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं ± 15 दिनों में साथ प्रदर्शन करने का वर्णन 100% दक्षता और यादृच्छिक एकीकरण की घटनाओं से मुक्त। इसलिए, इस विधि hPSCs में वर्तमान में वर्णित RMCE प्रौद्योगिकियों परे प्रगति का प्रतिनिधित्व करता है।
Protocol
1. अभिकर्मक के लिए FRT युक्त hPSC मास्टर सेल लाइन की तैयारी
- पर या निष्क्रिय माउस भ्रूणीय fibroblasts (iMEF) hESC या फीडर मुफ्त IPSC मध्यम क्रमश: (1 टेबल) का उपयोग कर बंद मानक प्रक्रियाओं के तहत संस्कृति hESC / IPSC मास्टर सेल लाइनों। प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए 6 अच्छी तरह से थाली में 2 (फीडरों पर) या 1 (फीडर मुफ्त) hPSCs के कुओं तैयार करें।
- संस्कृतियों का निरीक्षण करें, और कोशिकाओं 60 तक पहुँचने जब - 70% confluency, थाली दवा प्रतिरोधी iMEF (iDR4)। संक्षेप में, कोट 0.1% जिलेटिन समाधान के 0.5 एमएल के साथ एक 12 अच्छी तरह से थाली की आवश्यक कुओं और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं। प्लेट अच्छी तरह से प्रति 125,000 iDR4s और सेते हे / एन iMEF मध्यम (तालिका 1) के साथ।
2. hPSC अभिकर्मक Nucleofection द्वारा
- अगले दिन, 37 डिग्री सेल्सियस पर ताजा मीडिया के साथ पूर्व सेते hESC / IPSC संस्कृतियों, सहित 10 माइक्रोन के रो जुड़े प्रोटीन काइनेज (रॉक) अवरोध (वाई 27,632), 1 घंटे के लिए। एनext, पूर्व गर्म कमरे के तापमान को करने के लिए फ्रिज में से hESC अभिकर्मक समाधान ले।
- Nucleofection चढ़ाना मध्यम (तालिका 1) nucleofection हालत प्रति के 1 एमएल तैयार करें। कुओं बंद iMEF मध्यम लो, कमरे के तापमान पीबीएस के 1 एमएल के साथ धोने, और चढ़ाना मध्यम nucleofection के 500 μL जोड़ें। बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए अन्य 500 μL स्थानांतरण और चढ़ाना तक 37 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें दुकान। नोट: 2 के pFLPe वैक्टर: 0, 2: 1, और 0: एक ठेठ RMCE प्रयोग RMCE दाता की आणविक अनुपात के साथ तीन अलग-अलग शर्तों में शामिल है 1।
- एक एकल कक्ष निलंबन में hESC / IPSC अलग करें।
- , मीडिया से दूर रखना आरटी पीबीएस के 2 एमएल के साथ इसे धोने, और क्रमशः फीडर या फीडर मुफ्त hPSC संस्कृतियों पर जोड़ने के 1 एमएल trypsin 0.05% या accutase। 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 (accutase) मिनट - 7 (trypsin) या और 2 के लिए सेते हैं। Accutase उपचार के लिए - कोशिकाओं को ढीला, लेकिन संलग्न रहना चाहिए।
- ध्यान इनक्यूबेटर से और एक के बिना थाली हटाllowing कोशिकाओं को अलग करने के लिए, आकांक्षा से हदबंदी एजेंट को हटा दें। 1 hESC एमएल मीडिया जोड़ें और धीरे थाली की सतह पर मीडिया निस्तब्धता, झाग से बचने के द्वारा ढीला कोशिकाओं को अलग कर देना। यकीन है कि कोशिकाओं को एक ही सेल निलंबन में हैं।
- एक स्वच्छ और बाँझ 15 या 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को ले लीजिए। hESC मीडिया के 1 एमएल के साथ कुओं धो लें और एक ही 15 या 50 मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा। (अगले चरण के दौरान) की गिनती एक सेल गिनती डिवाइस इस्तेमाल करने के लिए एक 50 μL विभाज्य ले लो। संग्रह की मात्रा नीचे नोट और कुल सेल नंबर की गणना। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं स्पिन।
- 10 6 कोशिकाओं पीबीएस के साथ / एमएल के एक निलंबन के लिए सेल गोली एक 5 एमएल सीरम वैज्ञानिक pipet और कोमल pipetting का उपयोग कर Resuspend। झाग से बचें। प्रयोगात्मक हालत (लगभग 2 x 10 6 कोशिकाओं) साफ करने के लिए, बाँझ 15 एमएल ट्यूबों प्रति 2 एमएल स्थानांतरण।
- centrifuging, वहीं पूर्वRMCE छाँटना donor- pFLPe plasmids 10 μL की अधिकतम मात्रा में घोला जा सकता है।
- एक साफ, बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब pFLPe (6.5 Kb) का 2.5 माइक्रोग्राम स्थानांतरण। RMCE दाता वेक्टर 13 का 1 आणविक अनुपात pFLPe वेक्टर रहे हैं: 2 जोड़े। उदाहरण के लिए, एक 12 Kb RMCE दाता वेक्टर के लगभग 10 माइक्रोग्राम।
- nucleofection के साथ आगे बढ़ें, सभी चरणों में झाग से परहेज।
नोट: कुछ hPSC अभिकर्मक प्रोटोकॉल 2.4 कदम से पहले एक अतिरिक्त iMEF कमी कदम लागू होते हैं। हालाँकि, व्यवहार में, iMEF एकल निलंबन उल्लेखनीय है कि अभिकर्मक दक्षता को बदल नहीं है में एक नाबालिग सेल अंश है, न ही यह दूषित पुनः संयोजक कोशिकाओं को बनाने के बाद से वे गैर proliferative हैं। इसके अलावा, यह अभिकर्मक प्रक्रिया व्यवहार्यता बढ़ाने के लिए तेजी से आगे बढ़ने के दौरान आवश्यक है। उन कारणों के लिए, iMEF कमी लागू नहीं है।- iDR4 प्लेट और चढ़ाना माध्यम के साथ 1.5 एमएल ट्यूबों निकालेंइनक्यूबेटर से। एक बार में एक ट्यूब, बंद पीबीएस ध्यान से सेल गोली परेशान बिना pipet। जितना संभव हो उतना निकालें। धीरे pipetting द्वारा अभिकर्मक समाधान के 100 μL के साथ गोली Resuspend। प्लाज्मिड घोला जा सकता युक्त 1.5 एमएल ट्यूब सेल निलंबन स्थानांतरण और धीरे मिश्रण।
- transfector क्युवेट करने के लिए सेल-डीएनए मिश्रण स्थानांतरण, ध्यान दे बुलबुले परिचय नहीं। Nucleofector डिवाइस में क्युवेट परिचय और कार्यक्रम A13 (फीडरों पर संवर्धित कोशिकाओं) या F16 (फीडर मुफ्त) लागू होते हैं।
नोट: अन्य अभिकर्मक तरीकों या Nucleofector उपकरणों इन कार्यक्रमों या अभिकर्मक शर्तों के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। - क्युवेट फिर से लेना और, nucleofection किट में उपलब्ध डिस्पोजेबल हस्तांतरण pipettes का उपयोग, चढ़ाना माध्यम के 0.5 एमएल लागू करने और सभी मात्रा aspirating द्वारा अपनी सामग्री इकट्ठा। इस कदम जल्दी आचरण, लेकिन धीरे और एक आंदोलन में।
- प्लेट बूंद के लिहाज से 12-W मेंपक्ष iDR4 और मध्यम चढ़ाना के 500 μL युक्त थाली। अगले प्रयोगात्मक हालत के लिए 2.6.4 - दोहराएँ कदम 2.6.1।
- इनक्यूबेटर में एक शेल्फ पर संस्कृति डिश प्लेस और यह धीरे-धीरे आगे और पीछे ले और पक्ष समान रूप से सेल निलंबन को वितरित करने के पक्ष की। यह सेते 24 घंटे अगले मीडिया परिवर्तन से पहले कोशिकाओं 10 माइक्रोन रॉक अवरोध करनेवाला (वाई 27,632) की उपस्थिति में ठीक करने के लिए अनुमति देने के लिए।
प्रकोष्ठों के 3. सकारात्मक और नकारात्मक चयन के दौर से गुजर RMCE
- दैनिक संस्कृति को बदलने मीडिया (/ अच्छी तरह से 1 एमएल), और 2 - 3 डी के बाद अभिकर्मक, 100 एनजी puromycin का / एमएल के साथ चयन शुरू करते हैं।
ध्यान दें: सकारात्मक और नकारात्मक चयन अभिकर्मकों का इष्टतम सांद्रता प्रत्येक नव सृजित hPSC मास्टर सेल लाइन के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किए जाने की जरूरत है। , एक को मार वक्र 13 प्रदर्शन करना कम खुराक (एकाग्रता, जिस पर कम से कम दृश्य विषाक्तता 7 के बाद स्पष्ट है निर्धारित करने के लिए मास्टर सेल लाइन का उपयोगचयन के डी, लेकिन संस्कृति ऊंचा हो) नहीं है, इष्टतम खुराक (सबसे कम एकाग्रता, जिस पर सभी कोशिकाओं के बाद चयन के 7 डी मर चुके हैं), और उच्च खुराक (एकाग्रता है कि स्पष्ट विषाक्तता के कारण होता है, के बाद 2 सभी कोशिकाओं को मारने - 3 डी) दोनों puromycin और Fialuridine (FIAU) के लिए।- hESC मध्यम aspirate। पीबीएस के 1 एमएल के साथ धो लें। 100 एनजी / puromycin के एमएल के साथ hESC मध्यम जोड़ें।
- सेल के विकास को ध्यान से देखें तो यह है कि मौत और विकास संतुलित कर रहे हैं। दैनिक puromycin साथ मीडिया बदलें, कदम 3.1.1 के बाद। 250 एनजी / एमएल की एक अधिकतम करने के लिए 50 एनजी / एमएल - विकास दर कोशिका मृत्यु overtakes जब 25 के ब्लॉक में puromycin एकाग्रता में वृद्धि। 7 डी - के लिए 5 puromycin चयन जारी रखें।
- 3 -, puromycin चयन शुरू होने वाले दिन 6 बाद अभिकर्मक के आसपास के बाद 4 डी, 0.5 माइक्रोन के FIAU के साथ चयन शुरू करते हैं। मीडिया दैनिक परिवर्तन और कोई और अधिक से अधिक 7 दिनों के लिए निरंतर FIAU बनाए रखें।
4. विस्तार और RMCE लाइन्स की विशेषता
- 5% की एक अंतिम एकाग्रता के लिए पीबीएस में कोशिकाओं को भ्रूण बछड़ा सीरम जोड़ें। एक सेल झरनी के साथ एक साफ FACS ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
नोट: सेल व्यवहार्यता इन परिस्थितियों में उच्च है, तो यह अलाभकारी कोशिकाओं (जैसे, 7-एएडी या पीआई) के लिए एक फ्लोरोसेंट दाग का उपयोग करना संभव है, लेकिन जरूरी नहीं है। - सेल विश्लेषक कोशिकामापी एक प्रवाह में विश्लेषण करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें और 20,000 रिकॉर्ड - 30,000 घटनाओं। विश्लेषण के लिए, गुम्मट नकारात्मक नियंत्रण नमूना का उपयोग कर GFP या TDT पृष्ठभूमि पुष्पन ऊपर फाटक निर्धारित किया है।
- एक साफ 1.5 एमएल ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण। आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर नीचे स्पिन और सतह पर तैरनेवाला aspirate। एक वाणिज्यिक किट का उपयोग डीएनए निष्कर्षण के लिए आगे बढ़ें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें। Lat के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सूखी गोली स्टोरएर विश्लेषण।
- 25 मिनट -। चित्रा 3 में स्थिति और एक 2% agarose 15 के लिए 150 वी पर 1x डीएनए जेल दाग युक्त जेल पर 2 टेबल 13 भागो पीसीआर नमूने के अनुसार मानक पीसीआर प्रतिक्रियाओं तैयार करें। एक जेल में विश्लेषक रन का विश्लेषण।
Representative Results
AAVS1 विशिष्ट ZNFs का उपयोग करना, पूरी तरह से विशेषता hESC / IPSC मास्टर सेल heterotypic FRT लक्ष्य दृश्यों से युक्त लाइनों उत्पन्न होता है और 13 में वर्णित किया गया। FRT युक्त मास्टर सेल लाइनों ZFN उपचार के बाद pluripotency और जीनोम अखंडता को बनाए रखा और स्थिरतापूर्वक इन विट्रो और इन विवो में GFP व्यक्त किया। RMCE FLPe recombinase और RMCE दाता वैक्टर (चित्रा 1 ए) के साथ मास्टर सेल लाइनों की cotransfection द्वारा किया जाता है। RMCE वैक्टर AAVS1 मास्टर सेल लाइन में लोगों ट्रांस्जीन flanking के समान FRT दृश्यों को शामिल चित्रा 1 बी RMCE अनिवार्यता से व्यक्त TDT PZ का उपयोग करते हुए नजर रखता है:।। F3-पी CAGGS tdTPH-एफ अभिकर्मक के बाद, hPSC समान रूप से भर में वितरित कोशिकाओं के छोटे समूहों के रूप में iDR4 MEF परत, और ट्रांसफ़ेक्ट hPSC दोनों GFP के साथ ही क्षणिक TDT (चित्रा 1 बी, डी 2) व्यक्त करते हैं। 3 - कोशिकाओं 2 के लिए ठीक करने के लिए अनुमति दी जाती हैघ बाद अभिकर्मक चयन शुरू करने से पहले। सकारात्मक चयन पहले के आदेश RMCE दाता प्रविष्टि के पक्ष में करने में puromycin के एक कम खुराक का उपयोग शुरू किया है। क्योंकि प्रारंभिक बड़े पैमाने पर कोशिका मृत्यु पुनर्संयोजन के दौर से गुजर एकल कक्षों के लिए ले जा सकता है puromycin शुरू में धीरे लागू किया जाता है, उन्हें प्रक्रिया जीवित करने में असमर्थ बना रही है। बाद के दिनों में, puromycin एकाग्रता चरणबद्ध क्रम में पुनः संयोजक कोशिकाओं छोटी कालोनियों के रूप में विकसित करने के लिए है, जबकि nonrecombined कोशिकाओं को धीरे-धीरे मर अनुमति देने के लिए इष्टतम खुराक अप करने के लिए उठाए जाने की जरूरत है।
3 - सकारात्मक चयन (डी 6 के बाद अभिकर्मक के आसपास) की शुरुआत के बाद 4 डी, नकारात्मक चयन आदेश FRT की मध्यस्थता पुनर्संयोजन घटनाओं के लिए केवल चयन करने के लिए में शुरू हो गया है। RMCE Fialuridine (FIAU) के प्रति संवेदनशीलता thymidine kinase (टी) आत्महत्या जीन की हानि और इस प्रकार का कारण बनता है। नकारात्मक चयन इस बिंदु पर आवेदन किया है, जिसमें 2 के छोटे समूहों - 4 GFP - / TDT + (RMCE) कोशिकाओं रहे हैंFIAU (चित्रा 1 बी, डी 6) का इष्टतम सांद्रता को झेलने में सक्षम, यादृच्छिक एकीकरण को रोकता है, क्योंकि इस तरह की घटनाओं में, AAVS1 लोकस में टी जीन अप्रभावित रहता है। एक साथ की घटना FRT की मध्यस्थता के रूप में और बाद में लक्षण वर्णन (चित्रा 2 बी) के दौरान यादृच्छिक एकीकरण की घटनाओं के अभाव के द्वारा प्रदर्शन किया यादृच्छिक एकीकरण, अत्यधिक संभावना नहीं है।
मिश्रित RMCE GFP - / TDT + कालोनियों को विकसित करने के लिए जारी है, जबकि अधिक सजातीय बनने, इसलिए डी 9 से कि - 10 के बाद अभिकर्मक, कुछ पूरी तरह से नहीं चुने गए मिश्रित RMCE कालोनियों पाया जा सकता है (चित्रा 1 बी)। जबकि RMCE FLPe के अभाव में नहीं होती है, इस्तेमाल कर रहे हैं: (1 2) - GFP / TDT + RMCE कालोनियों उपस्थित केवल जब दोनों RMCE दाता और FLPe हैं (2: 0)। जब तक दिन 13 FIAU साथ पूरी चयन - / TDT + संस्कृतियों - 15 के बाद अभिकर्मक एक सजातीय GFP को जन्म देता हैई। RMCE 15 दिनों 13 में 12.8 ± 6.8 (एन = 6) Puro आर / आर FIAU कालोनियों के एक औसत पैदावार। नव सृजित RMCE लाइन (Puro आर / आर FIAU RMCE कालोनियों एक nonclonal सेल की आबादी में संयुक्त) के लक्षण वर्णन प्रवाह cytometry पुष्टि की है कि कोशिकाओं के 100% RMCE GFP पेश - / TDT + phenotype (2A चित्रा)। जब एक फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के विधान अभिव्यक्ति के बिना RMCE दाताओं उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप Puro आर / आर FIAU RMCE hPSC लाइन ही ढंग GFP है -।
nonclonal RMCE लाइन की पीसीआर लक्षण वर्णन पूर्ण कैसेट एक्सचेंज (मास्टर सेल लाइन का पता लगाया जा सकता है की कैसेट का कोई निशान) को दर्शाता है और यह है कि चयन का प्रयोग किया कार्यक्रम यादृच्छिक एकीकरण से मुक्त लाइनों (RMCE दाता और दोनों FLPe व्यक्त उत्पन्न करता है वेक्टर) (चित्रा 2 बी)। इन परिणामों के आगे रों से साबित हो रहे थेouthern धब्बा और, इसके अलावा, हम दिखा दिया है कि RMCE लाइनों pluripotent 13 में रहते हैं। यह यह जरूरी नहीं रह या यादृच्छिक एकीकरण के दोनों जीनोम चौड़ा मूल्यांकन दिनचर्या RMCE प्रयोगों के दौरान pluripotency परीक्षण बाहर ले जाने के लिए बनाता है। सारांश में, इस प्रोटोकॉल का उपयोग, AAVS1 ठिकाना यादृच्छिक एकीकरण का मुफ्त में hPSC ट्रांसजेनिक सेल लाइनों में आसानी से 100% दक्षता के साथ 15 डी में और व्यापक लक्षण वर्णन की आवश्यकता के बिना उत्पन्न किया जा सकता है।
चित्रा 1: RMCE के योजनाबद्ध अवलोकन (ए) RMCE चयन कार्यक्रम का समय।। वाम: मास्टर सेल लाइन (एमसीएल), एक FRT-घिरे कैसेट (त्रिकोण) कि GFP और hygromycin-टी का इजहार शरण FLPe व्यक्त वेक्टर के साथ (2A आत्म cleaving पेप्टाइड्स से जुड़े हुए), nucleofection (एनएफ) द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट है और RMCE दाता वेक्टर, कजहाँ एक promoterless puromycin प्रतिरोध जीन होता है (splicing स्वीकर्ता - एसए Puro आर) और एक चर प्रयोगात्मक कैसेट (एक्स)। अधिकार: नए RMCE लाइन (RMCEL) puromycin (लाल त्रिकोण) और FIAU (नीली रेखा) के साथ चयन के पूरा होने के बाद प्राप्त की। (बी) RMCE एक विधान TDT व्यक्त दाता और दाता डीएनए और FLPe डीएनए के विभिन्न अनुपात का उपयोग (0: 1, 2: 1, 2: 0) प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा नजर रखी (GFP - हरी प्रतिदीप्ति, TDT - लाल प्रतिदीप्ति) विभिन्न पर समय के संकेत। डी 2 और 6: स्केल सलाखों 100 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। डी 10: स्केल सलाखों 200 माइक्रोन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। RMCE लाइन्स की विशेषता (ए) RMCE के दृढ़ संकल्प सेफ़्लो साइटॉमेट्री। GFP और TDT अभिव्यक्ति गुम्मट लाइन, मास्टर सेल लाइन (एमसीएल) के लिए दिखाया गया है, और एक विधान TDT-अभिव्यक्ति वेक्टर (CAGGS TDT) का उपयोग कर डी 15 के बाद nucleofection में नव सृजित RMCE लाइन, या GFP के साथ दाताओं एक GOOSECOID प्रमोटर द्वारा संचालित (GSCp GFP, निश्चित एण्डोडर्म मार्कर) या एक AAT प्रमोटर (APOeAATp GFP, hepatocyte मार्कर)। (बी) RMCE की पुष्टि (5 '/ 3' जावेद RMCEL), मास्टर सेल लाइन की (एमसीएल) कैसेट (5 '/ 3' जावेद एमसीएल), और यादृच्छिक एकीकरण की कमी की अनुपस्थिति (5 '/ 3' / FLPe आरआई ) पीसीआर द्वारा दर्शाया प्राइमर जोड़े का उपयोग कर। दाता RMCE वेक्टर (+ आरआई), FLPe व्यक्त वेक्टर, और कोई टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) का इस्तेमाल किया गया है - गुम्मट, एमसीएल, RMCE लाइनों (5 1) से डीएनए। से संशोधित चित्रा (Ordovas एट अल।, 2015) 13। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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। चित्रा 3. RMCE-उपयुक्त मास्टर सेल लाइन और जीन की तुलना AAVS1 वाम में RMCE साथ लक्ष्य निर्धारण की पीढ़ी: लक्षित जीन असंशोधित गुम्मट कोशिकाओं है कि एक दाता (कैसेट मास्टर सेल लाइन की पीढ़ी के लिए चित्रा 1 ए में वर्णित के साथ cotransfected कर रहे हैं का उपयोग करता है , एमसीएल) और विशिष्ट अनुकूलित ZFNs। इस प्रक्रिया को पूरा करने के लिए पूरा लक्षण वर्णन 3 महीने लगते हैं। अधिकार: RMCE, FLPe वैक्टर के साथ दाता की cotransfection द्वारा किया जाता है और एक पूरी तरह से विशेषता लाइन में 15 घ उत्पन्न होता है। AAVS1 में जीन को निशाना दक्षता पिछले अध्ययनों 1,2 से है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
तालिका 1. मीडिया रचना।
| परख | आगे | रिवर्स | amplicon | पीसीआर साइकिल | ||
| 5'JA एमसीएल | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CGTTACTATGGGAACATACGTCA | 1.1 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 68 डिग्री सेल्सियस (-0.5 डिग्री सेल्सियस / चक्र), 1' 30 ''] X15 - [95 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 58 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 72 डिग्री सेल्सियस, 1 '30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
| 3'JA एमसीएल | TAACTGAAACACGGAAGGAG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.4 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 68 डिग्री सेल्सियस (-0.5 डिग्री सेल्सियस / चक्र), 1' 30 ''] X15 - [95 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 58 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 72 डिग्री सेल्सियस, 1 '30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
| 5'JA RMCEL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC | 1.1 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 68 डिग्री सेल्सियस (-0.5 डिग्री सेल्सियस / चक्र), 1' 30 ''] X15 - [95 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 58 डिग्री सेल्सियस, 30 '' -72 डिग्री सेल्सियस, 1 '30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
| 3'JA RMCEL | TTCACTGCATTCTAGTTGTGG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.5 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 68 डिग्री सेल्सियस (-0.5 डिग्री सेल्सियस / चक्र), 1' 30 ''] X15 - [95 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 58 डिग्री सेल्सियस, 30 '' - 72 डिग्री सेल्सियस, 1 '30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
| 5'RI दाता | GTACTTTGGGGTTGTCCAG | TTGTAAAACGACGGCCAG | 0.5 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 60 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 72 डिग्री सेल्सियस, 30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
| 3'RI दाता | CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC | ACACAGGAAACAGCTATGAC | 0.5 Kb | |||
| आरआई FLPe | CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG | GTATGCTTCCTTCAGCACTAC | 0.65 Kb | 95 डिग्री सेल्सियस, 5 '- [95 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 60 डिग्री सेल्सियस, 30' '- 72 डिग्री सेल्सियस, 30' '] X25 - 72 डिग्री सेल्सियस, 5' | ||
तालिका 2 प्राइमर सेट पीसीआर जीनोटाइपिंग। Ordovas एट अल।, 2015 13 से संशोधित करने के लिए इस्तेमाल किया।
Discussion
सुरक्षित बंदरगाह लोकी में जीन संपादन विधियों hPSCs में transgenesis विकसित करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण रहते हैं। हालांकि AAVS1 के सुरक्षित बंदरगाह चरित्र हाल ही में कुछ अनुप्रयोगों 13,18 के लिए पूछताछ की गई है, इस ठिकाना वर्तमान में सबसे अच्छा मानव व्युत्पन्न सेल लाइनों में विशेषता बनी हुई है। hPSCs में अपनी सीमाओं के बारे में जागरूकता विश्वसनीय आंकड़े प्राप्त करने के लिए कर सकते हैं। इसलिए, AAVS1 अभी भी एक उपयोगी साइट gain- और नुकसान के समारोह के अध्ययन या कारक है कि भीतर और निर्धारित आनुवंशिक पृष्ठभूमि के बीच एक isogenic संदर्भ की आवश्यकता के inducible / विधान अभिव्यक्ति के लिए, उदाहरण के लिए, होने की उम्मीद है।
AAVS1 ठिकाना ZFNs, talen या CRISPR / Cas9 1,2,19 का उपयोग कर कई समूहों द्वारा लक्षित किया गया है। ये न्युक्लिअसिज़ काफी एक निर्धारित लोकस में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की दक्षता में वृद्धि हुई है। हालांकि, इस प्रक्रिया स्क्रीन करने के लिए और पूरी तरह से सही ढंग से लक्षित क्लोन, यादृच्छिक integ से मुक्त विशेषताएँराशन और pluripotency बनाए रखने और अखंडता जीनोम 3 महीने (अनुकूलित जीन संपादन उपकरण का उपयोग) (चित्रा 3) तक का समय लग सकता है। पिछले दो बंद लक्ष्य nuclease गतिविधि द्वारा उत्पन्न संभव म्यूटेशन की वजह से हो सकता है। RMCE यहां इस्तेमाल किया प्रणाली, हालांकि, एक बार recombinase-विशिष्ट लक्ष्य दृश्यों AAVS1 लोकस में preintegrated रहे हैं, केवल दो सप्ताह में इस उद्देश्य को प्राप्त करने के लिए एक तेजी से, कुशल, और सुरुचिपूर्ण तरीका प्रदान करता है। सकारात्मक / नकारात्मक चयन और एक उचित चयन कार्यक्रम के उपयोग RMCE द्वारा AAVS1 लोकस में जीन संपादन के सरलीकरण के लिए योगदान मुख्य कारक हैं।
नए ट्रांसजेनिक लाइनों के genotypic लक्षण वर्णन काफी कम है (कोई प्रतिरूप स्क्रीनिंग आवश्यक है), और बंद लक्ष्य nuclease गतिविधि के लिए जुड़े लक्षण वर्णन FRTs के लिए FLPe की विशिष्टता के कारण नगण्य प्रदान की गई है। लक्षण वर्णन भी प्रदर्शन द्वारा दिनचर्या RMCE प्रयोगों में कम किया जा सकतामास्टर सेल लाइन (2A चित्रा) से GFP अभिव्यक्ति का पूरा नुकसान है, क्योंकि पूरा कैसेट विनिमय और यादृच्छिक एकीकरण की कमी पहले से ही पर्याप्त पीसीआर (चित्रा 2 बी) के द्वारा प्रदर्शन किया गया है और दक्षिणी धब्बा 13। सकारात्मक / नकारात्मक चयन का उपयोग भी पिछली रिपोर्टों के साथ मुख्य अंतर का गठन किया। कई समूहों है कि पहले hPSCs में RMCE वर्णित है, या तो AAVS1 या अन्य स्थलों में, केवल एक ही सकारात्मक चयन कदम 7,14,16 कार्यरत हैं। यह न्युक्लिअसिज़ के साथ प्रदर्शन जीन संपादन पर एक बड़ा तकनीकी लाभ का गठन नहीं करता कॉलोनी स्क्रीनिंग समान रूप से आदेश प्रतिरूप स्तर पर सही एकीकरण और यादृच्छिक एकीकरण के अभाव का प्रदर्शन करने के लिए प्रदर्शन किया जा रहा है क्योंकि।
कई hESC / IPSC लाइनों में इस RMCE प्रणाली का प्रयोग प्रत्येक स्वतंत्र लाइन के AAVS1 लोकस में वर्णित FRT युक्त कैसेट की preintegration की आवश्यकता है। हालांकि, एक बार उत्पन्न,इसकी तीव्रता और सादगी के लिए यह संभव नहीं तो यह है कि ऊपर उल्लेख किया अनुप्रयोगों के लिए परिभाषित isogenic सेटिंग्स में अर्द्ध उच्च throughput आनुवंशिक स्क्रीन विकसित करने के लिए तकनीकी रूप से बहुत समय लगता होगा बनाता है। इसके अलावा, सभी RMCE वैक्टर PZ AAVS1 जीन को निशाना ZFNs साथ ठिकाना निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया वेक्टर के भीतर निर्माण कर रहे हैं, लेकिन TALENS या CRISPR / Cas9 भी सूचित किया गया। RMCE वेक्टर के द्वंद्व अत्यधिक साथ या बिना FRT hPSCs में एक निर्धारित ट्रांस्जीन के लिए कई लाइनों उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है। उदाहरण के लिए, एक हिट RMCE द्वारा किए गए एक निर्धारित आनुवंशिक स्क्रीन में सफल प्रदर्शन आदर्श परिणामों की पुष्टि करने के लिए कई hPSC लाइनों में परीक्षण किया जा करने की आवश्यकता होगी। कई RMCE-उपयुक्त मास्टर सेल लाइनों के अभाव में, प्रत्यक्ष जीन न्युक्लिअसिज़ का उपयोग कर हिट के लक्षित कर प्रदर्शन किया जा सकता है। RMCE वैक्टर के दोहरे चरित्र की उपयोगिता हमारे समूह 20 से सिद्ध किया गया है। इस अध्ययन में, जीन सुधार में रोगी व्युत्पन्न बाहर किया गया थाFrontotemporal मनोभ्रंश (FTD) IPSCs कि एक उत्परिवर्तन के कारण PROGRANULIN (PGRN) अभिव्यक्ति की कमी सहन। एक कैसेट कि PGRN स्तरों बहाल की AAVS1 लोकस में ZFNs की मध्यस्थता प्रविष्टि द्वारा जीन पूरक, उत्परिवर्तन की उपस्थिति के साथ जुड़े corticogenesis में दोषपूर्ण phenotype सही। इसके अतिरिक्त, एक तुलनीय लाइन गुम्मट hESCs में RMCE द्वारा उत्पन्न बहिर्जात PGRN अभिव्यक्ति के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा था।
पुनः संयोजक कालोनियों के अभाव में, RMCE दाता वेक्टर के अभिकर्मक दक्षता की जाँच करें। अभिकर्मक 30% करने के लिए बेहतर क्षमता ऊपर संकेत परिणाम निकलेगा। लोअर अभिकर्मक क्षमता पुनर्संयोजन दक्षता में कमी। अंत में, RMCE प्रणाली AAVS1 लोकस में उत्पन्न किया गया है, लेकिन यह किसी भी अन्य ठिकाना लिए लागू है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeders |
| CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
| Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F7524 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
| Matrigel, hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
| mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder-free culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder-free culture |
| Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
| Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
| Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
| FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
| Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
| pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
| RMCE donors | - | - | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
| PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
| NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
| BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
| NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |
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