Summary
여기에서 우리는 이전에 설명한 시스템 개선 한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 AAVS1 궤적에 RMCE에 따라 신속하고 효율적인 유전자 편집 방법을보고합니다. 이 기술을 이용하여, 동질 라인 신속하고 안정적으로 형질 전환 hPSCs 매개 연구를 용이하게 적절한 비교 연구를 위해 생성 될 수있다.
Abstract
심지어 CRISPR-Cas9, 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 유전자 변형에 의해 주도 유전자 타겟팅 기술의 혁명 아직 시간이 소요됩니다. 더 신속하고 오프 대상 효과에 덜 경향이있다 Cre 호텔 또는 FLPe 같은 사이트 별 대상 콤비 네이즈를 사용하는 방법, 혜택을 누릴 수있는 안전한 항구의 궤적에 통합 유전자와 재조합 선을 사용하여 비교 연구. 그들은 훨씬 뛰어나다 유전자의 대부분의 측면에 타겟팅하지 않지만 이러한 방법이 설명되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여, 우리는 이전에 이형 FRT 시퀀스에 의해 형벌 카세트를 표현하는 GFP - 하이 그로 마이신 - TK를 포함 hPSCs의 AAVS1 궤적에서 마스터 세포주를 만들었습니다. 여기, 우리는이 줄을 사용 FLPe 재조합 효소 중재 카세트 교환 (RMCE)을 수행하는 절차를 설명합니다. 마스터 C엘 라인은 promoterless 퓨로 마이신 저항을 포함하고 FLPe의 재조합 효소와 RMCE 기증자 벡터로 형질된다. 모두 (퓨로 마이신) 양극과 음극 (FIAU) 선택 프로그램의 응용 프로그램은 임의의 통합없이 RMCE의 선택으로 이어집니다. RMCE 100 % 효율 (15) 라 완전히 특성화 된 다 능성 클론 유전자 변형 라인을 생성합니다. (가) 최근 AAVS1 궤적의 한계를 설명에도 불구하고, 시스템의 용이성, 동종 설정에서 hPSC의 형질 전환을위한 길을 열어 비교 연구에 필요한, 그리고 그 다른 것 기능 분석의 이익 / 손실을 반 높은 처리량 유전자 화면을 수 매우 많은 시간이 소요될 수.
Introduction
표적 유전자 재조합 연구의 많은 분야에서 빠른 발전을 촉진했다. 마우스에서, 게놈 편집 및 줄기 세포 연구의 시너지 효과는 유전자 기능과 유전자 조절의 복잡한 메커니즘의 증가 이해를 허용했다. 몇 년 동안, 인간 배아 줄기 세포의 제 1 격리 (hESCs는) 및 유도 후에 인간 때문에 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 유전자 편집 기술적 장애물을 구성했지만 진척은 물론 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 예상 . 대상 클레아 제 - 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALEN), 또는를 사용하여 게놈 엔지니어링의 최근 발전 클러스터 정기적으로 팔린 드롬 반복이 / CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR / Cas9는) 우리가 이것들을 극복 할 수있는 짧은 interspaced 3 - 어려움, 효율적인 프로세스를 재조합 1을 대상으로 만들기.
제 m에서 특정 유전자좌Rosa26, Hprt1 또는 Col1A1 같은 부작용의 부재하에, 안정 신뢰성 유비쿼터스 도입 유전자의 발현을 허용 여러개의 게놈 유전자의 연구 성과에 필수적인 도구가되었다. 안전 항구의 궤적은 동종 상황에서 쥐의 다른 라인 사이의 비교 분석을 할 수 있습니다. 이것은 삽입 성 돌연변이 유발, 용량 의존적 효과 또는 잡 트랜스 식 등 공지의 한계와 연관된 표준 랜덤 통합 방법을 이용하여 달성 될 수 없다. 면책 궤적에 유전자 편집 용이성과 유연성은 구체적으로 (각각에 loxP 또는 FRT) 표적 서열을 인식하고 동일한 대상 사이의 효율적인 재결합을 촉진 Cre 호텔 또는 Flippase (FLPe) 같은 사이트 별 대상 콤비 네이즈의 사용을 통해 증가된다. 때문에 이러한 특성에 사전 통합 면책 궤적에에 loxP 또는 FRT 시퀀스를 사용하여 재조합 효소 매개 유전자 편집 트랜스 마우스에 사용되는 일반적인 도구입니다창세기. 카세트 삽입하거나 동일한 표적 서열 사이에 매개 절단 이외에 호환성은 loxP 또는 FRT 부위를 사용하는 재조합 효소 매개 카세트 교환 (RMCE) (4)을 허용한다.
인간에서 안전한 항구의 궤적이 수행 된 식별을 시도합니다. 마우스 orthologous HPRT는 손실의 기능 Lesch - 니한 증후군, 및 ROSA26와의 연결에도 불구하고이 hPSCs의 대상이되고있다. HPRT 빠르게 ROSA26처럼, ESC에 유전자 발현을 침묵하고보고에서 유전자 발현을 유지하는 능력 7 - 말기 분화 세포는 5 조사되지 않았다. CCR5 유전자의 동형 접합 널 돌연변이가 아니라 인간에 허용 될 것으로 보여, 안전한 항구로 그 값은. 평가 하였다 CCR5는 목표와는 ESC 8,9 등 다양한 인간의 세포 라인에서 안정적으로 유전자 발현을 유지하는 것으로보고되었다. 하나,후자는 장기 배양 동안 클론 수준에서 입증되지 않았으며 유비쿼터스 유전자 발현은 세 가지 배엽의 분화 된 자손에서 증명되지 않았다. AAVS1, 아데노 관련 바이러스 타입 2 (AAV)의 자연 통합 사이트를 시험 하였다 형질 전환 유전자로 인해보고 된 저항뿐만 아니라 hESCs는, 10를 침묵. 이후, 많은 그룹은 시험 관내 및 생체 내 모두에서 2,8,11,12 상기 AAVS1 궤적을 사용 미분화 hPSCs 안정한 유전자의 발현뿐만 아니라, 모든 세 배엽들의 차별화 된 자손을 설명했다. AAVS1 궤적이 미분화 hESCs는 및 간세포 자손 13 체외에서 변수 유전자 억제를 발휘하는 것으로 확인되면서 최근 결과는 그럼에도 불구하고, 이러한 연구 결과를 뉘앙스.
임의의 통합 접근법과 방법을 사용하여 추가 검사 연구는 제노을 찾을 목적으로 단일 복사본 통합을 결정하는hPSCs 확장 및 분화 14,15 동안 유전자 사일런 싱에 강한 MIC 통합 사이트. 전반적으로, 지금까지 아무 게놈 사이트는 완전히 hPSCs과 그 자손에서 안전한 항구로 검증되지 않은; 유비쿼터스 안정적인 형질 전환 유전자 발현, hPSCs에서뿐만 아니라 생체 외 및 생체 내에서의 차별화 된 자손에서뿐만 아니라 적절한 사이트의 식별, 해결해야 할 남아있다. 모든 연구 궤적 중과 한계에도 불구하고, AAVS1 남아 가장 특징 및 줄기 세포 연구에 가장 많이 사용.
RMCE 성공적 FLPe Cre 호텔은 17보다 효율적이다 지시가있는 경우에도, 대부분 Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여,이 유전자좌 6,7,14,16의 일부 hPSCs에서 수행되었다. 이러한 모든 경우에서, 하나의 양의 약물 내성 카세트 재조합 콜로니의 선택을 위해 사용되었다. 성공하지만, 이러한 절차는 표준 발생원을 통해 기술 진보를 구성하지 않는다ZFNs를 사용하여 편집 절차, TALENs 또는 CRISPR / Cas9는 같은 단일 항생제 선택 절차는 임의의 통합을 배제하고 올바르게 대상으로 클론을 식별하기 위해 식민지 검사를 필요로하지 않습니다.
이 절차에서는 방법과 ± 15 일합니다 (사전 통합 카세트 내에) 클론 성 형질 전환 라인의 생성을 허용 선택 A (수신 카세트 내) 양의 조합과 음극을 이용하여 AAVS1 궤적에 hPSCs에 RMCE을 수행하도록 설명 100 % 효율 랜덤 통합 이벤트 무료. 따라서,이 방법은 hPSCs 현재 기술 RMCE 기술을 넘어 진행 상황을 나타냅니다.
Protocol
형질에 대한 FRT 함유 hPSC 마스터 세포주 1. 준비
- 또는 hESC의 지대없는 IPSC 매체, 각각 (표 1)를 사용하여 불 활성화 마우스 배아 섬유 아세포 (IMEF) 오프 표준 절차에 따라 문화 hESC의 / IPSC 마스터 세포 라인. 각 실험 조건에 대한 6 웰 플레이트에 hPSCs의 (피더)에 2 또는 1 (피더 무료) 우물을 준비합니다.
- 문화를 관찰하고 세포가 60에 도달했을 때 - 70 % 컨 플루, 판 약제 내성 IMEF (iDR4을). 간단히, 코트 필요한 0.1 % 젤라틴 용액 0.5 mL를 12- 웰 플레이트의 웰과 실온에서 5 분 동안 배양한다. 플레이트 125000 잘 당 iDR4s 및 배양 O / N IMEF 매체 (표 1)과 함께.
Nucleofection 2. hPSC 형질
- 다음 날, 37 ° C에서 1 시간 동안, 10 μM의 Rho 관련 단백질 키나제 (ROCK) 억제제 (Y-27632)를 포함하여, 새로운 미디어 hESC의 / IPSC 문화를 미리 품어. 엔내선, 실내 온도에 따뜻한 사전 냉장고에서 hESC의 형질 전환 솔루션을.
- nucleofection 조건에 따라 nucleofection 도금 매체 (표 1) 1 ㎖를 준비합니다. 실온 PBS 1 mL로 세척, 우물 떨어져 IMEF 매체를 타고, 중간 도금 nucleofection의 500 μL를 추가합니다. 멸균 1.5 ML의 튜브에 다른 500 μL를 전송하고 도금 때까지 37 ° C에 저장합니다. 참고 : 2의 pFLPe 벡터 : 0, 2 : 1, 0 : 일반적인 RMCE 실험은 세 가지 다른 RMCE 기증자의 분자 비율과 조건을 포함 하나.
- 단일 세포 현탁액에 hESC의 / IPSC를 분리합니다.
- 미디어를 벗어 RT PBS의 2 mL로 씻어, 각각 공급 또는 공급 장치가없는 hPSC 문화에 1 ML의 트립신을 0.05 % accutase를 추가합니다. 37 ° C에서 5 (accutase) 분 - 7 (트립신) 또는 2에 대한 품어. Accutase 처리 용 - 세포가 느슨하지만 연결을 유지해야합니다.
- 조심스럽게 인큐베이터에서와없이 플레이트를 분리세포를 분리하는 llowing는, 흡인에 의해 해리 에이전트를 제거합니다. 1 mL의 hESC의의 미디어를 추가하고 부드럽게 거품을 방지 판 표면에 미디어를 세척하여 느슨한 세포를 떼어 놓다. 세포는 단일 세포 현탁액에 있는지 확인합니다.
- 깨끗하고 멸균 15 또는 50 ㎖ 튜브에 세포를 수집합니다. hESC의 미디어 1 mL로 우물을 세척하고 동일한 15 또는 50 ㎖ 튜브에 세포를 수집합니다. (다음 단계들 동안) 계산 셀 카운팅 장치를 사용하는 50 μL 분취를 타고. 컬렉션의 볼륨을 참고하고 총 세포 수를 계산합니다. RT에서 5 분 동안 300 XG에 세포를 스핀 다운.
- 5 ㎖의 혈청 피펫 부드러운 피펫을 사용하여 PBS로 106 세포 / ㎖ 현탁액 세포 펠렛을 재현 탁. 발포하지 마십시오. 청소 실험 조건 (약 2 × 10 6 세포), 멸균 15 ML의 튜브 당 2 mL로 전송합니다.
- 원심 분리 동안 사전pFLPe 플라스미드 10 μL의 최대 볼륨에서 혼합 기증자 RMCE을 깎다.
- 깨끗하고 멸균 1.5 ML의 튜브에 pFLPe (6.5 이하)의 2.5 μg의를 전송합니다. pFLPe 벡터에 RMCE 기증자 벡터 (13)의 1 분자 비율 : 2를 추가합니다. 예를 들어, 12 이하 RMCE 공여체 벡터의 약 10 μg의.
- 모든 단계에서 거품 방지, nucleofection를 진행합니다.
참고 : 일부 hPSC 형질 전환 프로토콜 단계 2.4 전에 추가 IMEF 고갈 단계를 적용합니다. 그러나, 실제로, IMEF 크게 형질 전환 효율을 변경하지 않는 한 서스펜션에있는 작은 세포 분획은 없으며 비 증식하기 때문에 그것은 오염 재조합 세포를 생성합니다. 또한, 생존을 증가시키는 형질 전환 과정에서 빠르게 진행하는 것이 필수적이다. 이러한 이유로, IMEF 고갈이 적용되지 않습니다.- 도금 매체와 iDR4 판과 1.5 ㎖의 튜브를 제거인큐베이터에서. 한 번에 하나의 튜브는, 세포 펠렛을 방해하지 않고 조심스럽게 PBS를 피펫. 가능한 한 많이 제거합니다. 부드럽게 피펫 팅하여 형질 용액 100 μL로 펠렛을 재현 탁. 플라스미드의 혼합물을 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 부드럽게 혼합한다.
- 거품을 소개하지주의를 기울이고의 transfector 큐벳에 세포 DNA 믹스를 전송합니다. 프로그램 A13 (피더에 배양 세포) 또는 F16 (피더 무료)을 nucleofector 장치에 큐벳을 소개하고 적용 할 수 있습니다.
참고 : 다른 형질 전환 방법이나 nucleofector 장치는 이러한 프로그램 또는 형질 전환 조건의 최적화가 필요할 수 있습니다. - nucleofection 키트에 사용할 일회용 전달 피펫을 사용하여, 큐벳을 다시 작성 도금 배지 0.5ml의 적용과 모든 부피를 흡입하여 그 내용을 수집한다. 조심스럽게 한 운동, 빨리이 단계를 실시한다.
- 플레이트 드롭 현명 12 승iDR4 중간 도금 500 μL를 포함하는 엘 플레이트. 다음 실험 조건 2.6.4 - 반복 2.6.1 단계를 반복합니다.
- 인큐베이터 내의 선반 상에 배양 접시를두고 균등 세포 현탁액을 분배 측면을 천천히 앞뒤로 이동 편. 다음 미디어 변경 전 24 시간은 세포가 10 μM의 ROCK 저해제 (Y-27632)의 존재에 복구 할 수 있도록 그것을 품어.
3. 긍정적이고 부정적인 선택 세포 겪고 RMCE
- 매일 변경 배양 배지 (/ 잘 1 ㎖) 및 2-3 D 포스트 형질은 100 ng의 퓨로 마이신의 / mL로 선택을 시작합니다.
주 : 양성 및 음성 선택 시약의 최적 농도가 각각 새롭게 생성 hPSC 마스터 세포주 실험적으로 결정되어야한다. 최소한 육안 독성 7 후에 명백한되는 저용량 (농도를 결정하는 마스터 세포주를 사용하여 명 곡선 (13)을 수행하여선택의 D하지만 문화가 자란되지 않음), 최적의 용량 (모든 셀이 선택 7 일 이내 후에 죽은있는 최저 농도) 및 고용량 (분명 독성을 야기 농도,이 후 모든 세포를 죽이는 - 3 일) 퓨로 마이신 및 Fialuridine (FIAU) 모두.- hESC의 매체를 기음. PBS 1 mL로 씻는다. 100 NG / 퓨로 마이신의 mL로 hESC의 매체를 추가합니다.
- 죽음과 성장이 균형 있도록 세포의 성장을 관찰한다. 단계 3.1.1 다음, 매일 퓨로 마이신과 미디어를 변경합니다. 250 NG / ㎖에서 최대 50 NG / ㎖ - 성장률은 세포 사멸을 추월하는 경우, (25)의 블록 퓨로 마이신의 농도를 증가시킨다. 7 일 이내 - 5 퓨로 마이신 선택을 계속합니다.
- 3-4 D 6 일 후 형질 주위에, 퓨로 마이신 선택을 시작한 후, 0.5 μM FIAU와 선택을 시작합니다. 매일 미디어를 변경하고 이하 7 연속 일 동안 FIAU을 유지한다.
RMCE 라인 4. 확장 및 특성
- 5 %의 최종 농도까지 PBS에서 세포를 소 태아 혈청을 추가한다. 셀 스트레이너와 깨끗한 FACS 튜브에 세포를 전송하고 얼음에 보관하십시오.
주 : 세포 생존율이 높은 상태이므로 비 생존 세포 (예를 들어, 7 AAD 또는 PI)에 대한 형광 염색을 사용하는 것이 가능하지만, 필요하지 않다. - 세포 분석기 사이토 흐름 분석을 즉시 진행하고 20,000 기록 - 30,000 이벤트를. 분석의 경우, WT 음성 대조군 샘플을 사용하여 GFP 또는 TDT 배경 개화 위의 게이트를 설정합니다.
- 깨끗한 1.5 ML의 튜브에 세포를 전송합니다. RT에서 5 분 300 XG에 스핀 다운 및 뜨는을 대기음. 상용 키트를 사용하여 DNA 추출을 진행하고 제조업체의 지침을 따르십시오. 위도 -20 ° C에서 건조 펠렛을 저장어 분석.
- 25 분 -. 15, 150 V에서 1X DNA 겔 얼룩을 함유 한 2 % 아가 로스 겔에서도 3의 조건으로 표 2 (13), 실행 PCR 시료에 따른 표준 PCR 반응을 준비한다. 겔 분석기에서 실행을 분석합니다.
Representative Results
AAVS1 특이 ZNFs을 사용하여, 이형 FRT의 표적 서열을 함유하는 완전한 특성화 hESC의 / IPSC 마스터 세포주 생성, 13에 설명되었다. FRT 함유 마스터 세포주 ZFN 처리 후에 능성 게놈 무결성을 유지하고 안정 관내 및 생체 내 GFP를 발현. RMCE는 FLPe 재조합 효소 및 RMCE 도너 벡터 (도 1a)와 마스터 세포주에 cotransfection에 의해 수행된다. RMCE 벡터는 트랜스 측부 AAVS1 마스터 세포주 것과 동일 FRT 서열을 포함하고도 1B는 구조적으로 발현 TDT PZ를 사용 RMCE 모니터링 :.. F3-P CAGGS tdTPH-F는 형질 감염 후 hPSC 고르게 분산시켜 세포의 소그룹 형태 iDR4 MEF 층 및 형질 hPSC 모두 GFP뿐만 아니라 과도 TDT (도 1b, D (2))을 표현한다. 3 - 세포 2 복구 할 수 있습니다선택을 시작하기 전에 D 후 형질 전환. 긍정적 인 선택 첫째 RMCE 기증자 삽입을 선호하기 위해 퓨로 마이신의 낮은 복용량을 사용하여 시작됩니다. 초기 대량 세포사가 재결합을받은 단셀을 초래할 수 있기 때문에 퓨로 마이신 프로세스 생존하기가없는 만들기 시작에서 완만하게 적용된다. 다음 날에, 퓨로 마이신 농도는 세포 nonrecombined 서서히 죽게 동안 재조합 세포의 작은 콜로니로 성장할 수 있도록하기 위하여 최적의 투여 량을 단계적으로 제기 할 필요가있다.
3-4 D (D 6 후 형질 주위에) 긍정적 인 선택을 개시 한 후, 음의 선택은 FRT 중재 재조합 이벤트 만 선택하기 위해 시작된다. RMCE가 티미 딘 키나제 (TK) 자살 유전자의 손실 때문에 Fialuridine (FIAU) 감도 발생. 이때 적용된 음성 선별, 여기서이 작은 클러스터 - 4 GFP - / + TDT (RMCE) 세포는이러한 이벤트에서 AAVS1 궤적에서 TK에 유전자가 영향을받지 남아 있기 때문에 FIAU (그림 1B, D 6)의 최적 농도를 견딜 수, 임의의 통합을 방지 할 수 있습니다. 동시 발생 FRT는 매개 나중에 특성 (도 2b) 중 임의의 통합 이벤트 부재에 의해 입증 된 바와 같이 임의의 통합은 매우 낮다.
10 후 형질 전환, 일부하지 완전히 선택 혼합 RMCE 식민지 (그림 1B) 찾을 수 있습니다 - 혼합 RMCE의 GFP -보다 균일되는 동안 D 9 있도록 / TDT + 식민지는 계속 증가. RMCE가 FLPe의 부재하에 발생하지 않는 상태에서 사용된다 : (1 2) - GFP / TDT + RMCE 콜로니 RMCE 공여체 및 FLPe 양 때만 존재 (2 : 0). 하루 13까지 FIAU와 전체 선택 - / TDT + cultur - 15 후 형질이 균일 한 GFP가 발생한다이자형. RMCE 15 일 13에서 12.8 ± 6.8 (N = 6) 순수하지 않아 R / FIAU R 식민지의 평균을 산출한다. / TDT + 표현형 (그림 2A) - 새로 생성 된 RMCE 라인 (A nonclonal 세포 인구에 결합 된 순수하지 않아 R / FIAU R의 RMCE 식민지)의 특성 유동 세포 계측법은 세포의 100 %가를 RMCE GFP 제시 확인합니다. 형광 기자의 구성 적 표현없이 RMCE 기증자를 사용하는 경우, 그 결과 순수하지 않아 R / FIAU R RMCE hPSC 라인은 균일 GFP입니다 -.
nonclonal RMCE 라인 PCR 특성화 전체 카세트 교환 (검출 할 수있는 마스터 세포주 카세트의 흔적)를 보여주고 사용 선택 프로그램 RMCE 공여체 및 두 FLPe 발현 (임의의 통합없이 라인을 생성하는 벡터) (그림 2B). 이러한 결과는 상기의 입증했다outhern 오하고, 또,이 RMCE 라인 능성 13 남아 있는지 보여 주었다. 이것은 더 이상 필요 랜덤 통합 게놈 전체 평가 또는 루틴 RMCE 실험 동안 능성 테스트를 수행하지 할 수있다. 요약하면,이 프로토콜을 이용하여, 임의의 통합 무료 AAVS1 궤적에 hPSC 형질 전환 세포주 용이 100 % 효율 15 (D) 및 폭 넓은 특성의 필요없이 발생 될 수있다.
그림 1 : RMCE의 도식 개요 RMCE 선택 프로그램의 (A) 타임 라인.. 왼쪽 : 마스터 세포주 (MCL)와, FRT-측면 카세트 GFP 및 하이 그로 마이신 - TK 표현 (삼각형)을 숨겨은 FLPe 발현 벡터로 nucleofection (NF)에 의해 형질 전환된다 (2A 자기 절단 펩티드로 연결) 및 RMCE 기증자 벡터, 어ICH는 promoterless 퓨로 마이신 내성 유전자가 포함 (스 플라이 싱 억 셉터 - SA- 순수하지 않아 R) 및 가변 실험 카세트 (X). 오른쪽 : 퓨로 마이신 (빨간색 삼각형)와 FIAU (파란색 선)와 선택이 완료 후의 새로운 RMCE 라인 (RMCEL). (B) RMCE 구성 적 TDT 발현 도너와 공여 DNA와 FLPe DNA 다른 비 사용 (0 : 1, 2 : 1, 2 : 1) 형광 현미경에 의해 모니터를 (GFP - 녹색 형광 TDT - 적색 형광) 다른시를 시점. D 2, 6 : 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. D 10 : 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 :. RMCE 라인의 특성 (A) 결정 RMCE의를하여유동 세포 계측법. GFP 및 TDT 식은 WT 라인 마스터 세포주 (MCL)에 대해 도시하고, 새롭게 생성 RMCE 라인 D 15 이후 nucleofection에서 항시 TDT 발현 벡터 (CAGGS TDT)를 사용하거나 GFP와 도너가 GOOSECOID 프로모터에 의해 구동되고 (GSCp GFP, 최종 내배엽 마커) 또는 AAT 프로모터 (APOeAATp GFP, 간세포 마커). RMCE의 (B) 확인 (5 '/ 3'JA RMCEL) 마스터 세포주의 (MCL) 카세트 (5 '/ 3'JA MCL), 랜덤 통합 부족 부재 (5 '/ 3'/ FLPe RI )는 PCR에 의해 묘사 된 프라이머 쌍을 사용. , 기증자 RMCE 벡터 (+ RI), FLPe 발현 벡터,없이 템플릿 컨트롤 (NTC)를 사용 하였다 - RMCE 라인 (5 1) WT, MCL에서 DNA. 에서 수정 된 그림 (Ordovas 등. 2015) 13. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
= "1"> 페이지 내에서 
. AAVS1 왼쪽에서 RMCE으로 타겟팅 RMCE-적합한 마스터 세포주 및 유전자의 비교 그림 3. 세대 : 유전자 타겟팅은 마스터 세포 라인의 세대도 1a에 기술 된 기증자 (카세트와 동시 형질 감염된되어 수정되지 않은 WT 세포를 사용 , MCL) 및 특정 최적화 ZFNs. 이 과정은 전체 특성화 3 개월까지 소요 완료합니다. 오른쪽 : RMCE는 FLPe 벡터와 도너에 cotransfection에 의해 수행되고, 완전히 특징 선 15 (D)에서 생성된다. AAVS1에서 유전자 대상으로 효율이 이전의 연구 1,2에서입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 미디어 조성물.
| 시험 | 앞으로 | 역 | 앰플 리콘 | PCR주기 | ||
| 5'JA MCL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CGTTACTATGGGAACATACGTCA | 1.1 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / 사이클), 1'30 ''] X15 - [95 ºC, 30 ''- 58 ºC, 30 ''- 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'JA MCL | TAACTGAAACACGGAAGGAG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.4 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / 사이클), 1'30 ''] X15 - [95 ºC, 30 ''- 58 ºC, 30 ''- 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 5'JA RMCEL | CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC | CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC | 1.1 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / 사이클), 1'30 ''] X15 - [95 ºC, 30 ''- 58 ºC, 30 ''-72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'JA RMCEL | TTCACTGCATTCTAGTTGTGG | AAGGCAGCCTGGTAGACA | 1.5 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 68 ºC (-0.5 ºC / 사이클), 1'30 ''] X15 - [95 ºC, 30 ''- 58 ºC, 30 ''- 72 ºC, 1 '30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 5'RI 기증 | GTACTTTGGGGTTGTCCAG | TTGTAAAACGACGGCCAG | 0.5 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
| 3'RI 기증 | CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC | ACACAGGAAACAGCTATGAC | 0.5 이하 | |||
| RI FLPe | CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG | GTATGCTTCCTTCAGCACTAC | 0.65 이하 | 95 ºC, 5 '- [95 ºC, 30' '- 60 ºC, 30' '- 72 ºC, 30' '] X25 - 72 ºC, 5' | ||
PCR 유전자형. Ordovas 등. 2015 년 13 수정에 사용되는 표 2. 프라이머 세트.
Discussion
면책 궤적에 유전자 편집 방법은 hPSCs에 형질 전환을 개발하기 위해 필수적인 도구 남아있다. AAVS1의 면책 문자가 최근 일부 응용 프로그램 13,18에 대해 의문을 제기되었지만,이 궤적은 현재 가장 잘 인간 유래 세포주 특징으로 남아있다. hPSCs에서 그 한계의 인식은 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수 있습니다. 따라서 AAVS1 여전히 이득 - 및 기능 상실 연구 또는 내부와 결정된 유전 배경 간의 동종 컨텍스트 요구 요인 유도 / 구성 적 발현, 예를 들면, 유용한 사이트가 될 것으로 예상된다.
AAVS1의 궤적은 ZFNs, TALEN 또는 CRISPR / Cas9 1,2,19를 사용하여 여러 그룹의 대상이되고있다. 이러한 클레아 크게 결정된 유전자좌에 상 동성 재조합의 효율을 증가시킨다. 그러나, 처리는 선별하고 완전히 랜덤 INTEG 프리 올바르게 표적 클론을 특성화배급과 다 능성을 유지하고 (최적화 된 유전자 편집 도구를 사용하여) 3 개월 (그림 3)까지 걸릴 수 있습니다 무결성을 게놈. 마지막 두 개는 오프 - 타겟 클레아 제 활성에 의해 발생 가능한 변이에 의해 발생 될 수있다. 여기서 사용 RMCE 시스템 그러나 특이 적 재조합 효소 표적 서열은 AAVS1 궤적에 사전 통합되면, 두 주에서이 목적을 달성하기 위해 신속하고 효율적인 우아한 방법을 제공한다. 양 / 음 선택과 적절한 선택 프로그램의 사용은 RMCE에 의해 AAVS1 궤적에 유전자 편집의 간소화에 기여하는 주요 요인이다.
새로운 유전자 변형 라인의 유전자형 특성이 크게 (더 클론 선별이 필요하지 않습니다) 감소하고, 오프 대상 클레아 제 활성에 관련된 특성으로 인해 FRTS에 대한 FLPe의 특이성으로 비용 소비 렌더링됩니다. 특성화도를 보여줌으로써 루틴 RMCE 실험에서 감소 될 수있다전체 카세트 교환 및 랜덤 통합 부족이 이미 충분히 PCR (도 2b)에 의해 증명 되었기 때문에 마스터 세포주 (도 2A)에서 GFP 발현의 완전한 손실 및 서던 블랏 13. 양성 / 음성 선별의 사용은 이전 보고서와의 주요 차이점을 구성한다. 이전 AAVS1 다른 궤적에서든 hPSCs RMCE에서 설명한 여러 그룹은 단일 양성 선별 공정을 사용 7,14,16. 콜로니 스크리닝 클론 동등 수준에서 정확한 통합 랜덤 통합의 부재를 증명하기 위하여 수행 될 수 있기 때문 클레아 수행 유전자 편집 위에 중요한 기술적 장점을 구성하지 않는다.
여러 hESC의 / IPSC 라인이 RMCE 시스템의 사용은 각각의 독립적 인 라인의 AAVS1 궤적의 설명 FRT 함유 카세트의 사전 통합이 필요합니다. 그러나, 한 번 생성,그 신속성과 단순성은 가능한 기술적으로 매우 시간이 소모 될 것이다, 그렇지 않으면 그 위에서 언급 한 응용 프로그램에 대한 정의 동종 설정에서 세미 높은 처리량 유전자 화면을 개발 할 수 있습니다. 또한, 모든 RMCE 벡터는 ZFNs 함께 궤적을 타겟팅하는데 사용되는 PZ AAVS1 유전자 타겟팅 벡터 내에 구성되어 있지만 TALENs 또는 CRISPR / Cas9도보고되었다. RMCE 벡터의 이중성은 또는 FRT없이 hPSCs의 결정 형질 전환 유전자에 대한 여러 줄을 생성하는 것이 매우 유용하다. 예를 들어, 하나의 히트 이상적 결과를 확인하기 위해 여러 hPSC 라인에서 테스트 될 필요 RMCE 의해 수행 결정된 유전 화면 성공적 보였다. 다중 마스터 RMCE-적합한 세포주의 부재에서, 뉴 클레아 제를 이용하여 조회 대상의 직접적인 유전자가 수행 될 수있다. RMCE 벡터의 이중 성격의 유틸리티는 우리 그룹 (20)에 의해 입증되었습니다. 이 연구에서 유전자 보정 환자 유래 행했다측두엽 치매 (FTD) PROGRANULIN (PGRN) 식 결핍을 일으키는 돌연변이를 부담 iPSCs. PGRN 수준을 회복 카세트의 AAVS1 궤적에 ZFNs 매개 삽입에 의한 유전자 보완은 돌연변이의 존재와 관련된 corticogenesis의 결함 표현형을 수정했습니다. 또한, 비교 선 PGRN 외인성 발현 제어로서 사용되는 WT의 hESCs는 RMCE에 의해 생성 하였다.
재조합 콜로니 없으면, RMCE 공여체 벡터의 형질 감염 효율을 확인한다. 30 % 우수한 형질 전환 효율은 상기 나타낸 결과를 얻었다. 낮은 형질 감염 효율, 재결합 효율을 감소시킨다. 마지막 RMCE 시스템은 AAVS1 궤적 생성되었지만, 다른 어떤 궤적에 적용 가능하다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeders |
| CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
| L-Glutamine, 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
| 2-Mercaptoethanol, 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Gibco | 11140-035 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
| Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
| DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma Aldrich | F7524 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
| Matrigel, hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
| mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder-free culture |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder-free culture |
| Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
| Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
| Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
| FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
| Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
| pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
| RMCE donors | - | - | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
| PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
| Agarose | Sigma | A9539 | |
| SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
| Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
| NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
| BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
| NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |
References
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