Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması

Published: October 27, 2016 doi: 10.3791/54727
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Western University

Introduction

MS kronik enflamasyon ve miyelin yönelik otoimmün yanıtı tarafından tahrik düşünülmektedir CNS nörodejenerasyon ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Zamanla miyelin ve akson kaybının bilişsel ve motor fonksiyon 1 kademeli bir düşüş ile sonuçlanır. "Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT" MSS miyelin yönelik otoimmün hastalık hayvan modelleri için bir terimdir. İnsan MS gibi, EAE tipik haliyle, bazı durumlarda, merkezi sinir sisteminin, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile karakterize edilir, demiyelinasyon 2. Ancak, herhangi bir EAE modeli kısmen insan MS benzer derecesi kullanılan türü veya suşu ve altta yatan anti miyelin otoimmün yanıtın karmaşıklığına bağlıdır.

Anti-miyelin otoimmünite deneysel çeşitli yollarla bağlı ama günümüzde en yaygın kullanılan yöntem, immünodominant CD4 taklit eden amino asitlerin kısa bir peptid ile farelere bağışıklık kazandırılması olan edilebilir 3 EAE ikna etmek için kullanılır (MOG 35-55) miyelin oligodendrosit glikoproteinin türetilen 21 amino asitli bir peptittir. Bununla birlikte, bazı deneysel amaçlar için daha büyük bir protein antijenleri ve hatta kısa bir peptit ile bağışıklık kazandırma üzerine, bu çeşitli avantajları vardır ile bağışıklık kazandırmak için arzu edilebilir ve hatta gereklidir. Bütün proteinini veya bunun spesifik bir alan adı temsil daha büyük protein antijenleri, farklı türlerde da birden fazla fare soylannda sunum için, normal olarak işleme ya da süre önce, MHC kısıtlaması nedeniyle, kısa peptidler genellikle suşu çok sınırlı aralıkta etkilidirler 4. İkinci olarak, daha büyük bir protein antijeni, antijen tanıma lenfosit daha fazla türde içeren daha karmaşık bir bağışıklık tepkisi indüklemek yerine sınırlandırıcı edebilenCD4 + T hücreleri g antijen algılama. Örneğin, B hücre reseptörleri (BCR) yoluyla B hücrelerinin bütün yerine işlenmiş protein ile doğrudan etkileşenler. Biz ve diğerleri MOG proteini 5 tanımaz MOG 35-55 bağışıklama ile aktive olduğu B hücreleri göstermiştir. B hücreleri, en son, insan MS 6 patojenik bir rol oynadığı gösterilmiştir olduğundan, otoimmün patolojisinde B hücrelerini içermektedir EAE modelleri giderek önem kazanmaktadır.

EAE uyarılması için daha büyük bir protein antijenlerinin kullanmanın avantajlarına rağmen, bu proteinler için birkaç Ticari kaynaklar orada kalır. MOG 35-55 gibi kısa peptidler çok hızlı ve nispeten düşük bir maliyetle sentezlenebilir Nitekim, MOG proteini ticari seçenekler satın almak için sınırlı ve maliyet önemli ölçüde daha fazladır. Bununla birlikte, MOG dışı alanını oluşturmak için araştırma grupları için çeşitli ekspresyon vektörleri (MOG 1-125) kendileri vardır. however, biz literatürde belirledik ifade sistemlerinin tüm beri daha verimli ifade sistemleri 7 ile yerini almış eski teknolojilere dayanmaktadır. Bundan başka, pek çok fare ya da insan MOG 8 dayanmaktadır. Farelerde otoimmünite bazı araştırmalar için, fare MOG oto dayalı bir antijen tercih edilir. Son olarak, ticari ya da sentezleme vektörü olarak Ya tespit tüm MOG tabanlı proteinler, MOG 1-125 tabanına ek amino asitleri ihtiva eden füzyon proteinleridir. Bunlar tespit koyamadık birçok fonksiyonu ile hangi yanı arıtma ve genellikle diğer dizileri için bir etiket içerir.

Bu sınırlamaları gidermek için, biz MOG proteini 5 bilinen çözülemezliğini mücadele için tioredoksin içeren bir etikete kaynaşmış fare MOG hücre dışı alanına dayalı yeni bir füzyon proteini oluşturulur. takı sekansı da saflaştırma ve bir TEV proteaz cle bir 6xHis dizisini içeriristenirse, tüm etiket dizilerinin tümüyle kaldırılmasını sağlar avage sitesi. Bu saf MOG 1-125 protein üretmek için farkında tek yöntemdir. Bol miktarda protein üretimini kolaylaştırmak için, MOG 1-125 sekansı, bakteriyel ekspresyon için kodon optimizasyonu ve MOG künye füzyon proteini, pET-32 ekspresyon sistemi içine sokulmuştur. Burada, en immünoloji laboratuarlarında mevcut olmayan özel ekipman kullanılarak, üretmek ve MOG etiketi protein ve saf MOG 1-125 arındırmak için detaylı protokol açıklar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Protein İndüksiyon

Not: Aşağıdaki adımlarda, BL21 Escherichia coli bakteri MOG künye füzyon proteini için diziyi ihtiva eden pET-32 vektörü ile dönüştürülmüş yüksek yoğunluklu olarak yetiştirilmiş ve daha sonra MOG etiket protein ifade etmek için indüklenir (referans 5 ve Şekil 1 e bakınız) . Gün yaklaşık ve alternatif durdurma noktaları protokolde belirtilmiştir unutmayın - genel zaman çizelgesi için Şekil 2'ye bakınız. Saflaştırılmış pET-32 MOG etiketi vektör DNA ile başlayan, kimyasal yetkili BL21 E. dönüştürmek için gerekli olacaktır 9 de tarif edildiği gibi, ampisilin seçimi kullanarak E. coli bakterileri. Başarılı dönüşüm sınırlama enzimleri ile sindirme ve ardından bir standart kit kullanılarak seçilen bakterilerden DNA saflaştırılması doğrulanabilir AGE1 ve Sac1 bir agaroz jeli 10 üzerinde 424 bp'lik bant üretmek için enzimleri.

    etiketi gliserol stok steril lizojeni etsuyu (LB) suyu (0.1 mg ampisilin / ml) 5 ml aşılamak ve 37 ° C, 200 rpm'de bir gece boyunca inkübe.
  1. Bir sonraki gün için hazırlık olarak bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde steril LB et suyu 500 mi ihtiva eden iki adet 1 L'lik Erlenmeyer kaplanna yerleştirin.
  2. Aşama 1.2 (nihai konsantrasyon 0.1 mg / ml ampisilin) ​​500 mi LB ihtiva eden şişelere her bir 100 mg / ml ampisilin, 500 ul ekle. LB suyu iki şişelere her bir adım 1.1 gecelik kültürün 1 ml aktarın. 37 ° C'de inkübe edilir ve 200 rpm'de 5 saat ya da 0.6 'lik bir optik yoğunluğa kadar.
  3. şişelere birinden bir 1 mi kısım alın ve ayrı bir 1.5 ml'lik bir santrifüj tüpüne transfer. 1 dakika boyunca 16,000 xg'de Pelet hücreleri ve süpernatant kaldırmak. T, 0 (ön indüksiyonlu) halinde tüp etiketleyin ve daha sonra, bakteriyel pelet koymak -20 gelecekteki, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAG C dondurucu °E) analizi (bölüm 8 ve Şekil 3).
  4. 1 M izopropil P-D-1-tiogalaktopiranosid, her kültür şişesine izopropil β-D-tiyogalaktozid (IPTG), 0.5 ml ilave edilir. gece boyunca 75 rpm'de, oda sıcaklığında ve daha sonra, 37 ° C'de, 4 saat süre ile, 200 rpm'de şişeler inkübe edin.

2. Hasat MOG etiketi Protein

NOT: Bu aşamada, bakteri MOG etiketi proteinin büyük miktarlarda üretilen olacaktır. MOG etiketi hasat etmek için, bakteriler ilk olarak sonikasyon ardından Triton X-100 tampon maddesi içinde lize edilmiştir. MOG Etiket daha sonra MOG etiket protein ihtiva eden bir ham protein çözelti elde inklüzyon cisimcikleri salınır ve imidazol ve guanidin ile denatüre edilir.

  1. 1.5 adım gece boyunca kültürler birinden bir 1 ml'lik bir şişe alın ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine aktarın. 1 dakika boyunca 16,000 xg'de Pelet hücreleri ve süpernatant kaldırmak. küvet etikete T O / N (post-indüksiyon) sonra -20 gelecek SDS sayfa analizi için ° C derin dondurucuda (Şekil 3) içine bakteriyel pelet koydu.
  2. yüksek hızda santrifüj ile eşit arasında 250 ml'lik şişe uyumlu kültürleri dağıtın ve bu noktadan sonra buz üzerinde bu tutun. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 22,000 xg'de bakteri hücreleri Pelet.
  3. süpernatant atın. -20 ° C'de bakteriyel pelet saklayın veya 2.4 adıma geçin.
  4. liziz tamponu (0.1 mg / ml tavuk yumurtası lizozim,% 0.1 Triton-X (h / h), fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde) Triton X-100, 60 ul 50 mg, 120 ul ekleyerek / ml tavuk yumurtası lizozim PBS 60 mL stok çözeltisi.
  5. Süspanse liziz tamponu 30 ml'lik bir toplam adım 2.3 bakteri peletlerinin getirecek ve. yüksek hızda santrifüj edebilen bir yuvarlak tabanlı bir 50 ml tüp bu hacim aktarın. 30 dakika için 30 ° C su banyosu içinde, bu tüp yerleştirin. inkübasyon süresi boyunca, tüp sallamakhücreler iki kez tekrar süspansiyon.
  6. inkübasyondan sonra, buz üzerine tüp transferi ve sonikasyon çözüm 20 kHz, genlik% 70, nabız 3 saniye, 3 sn, ve tur başına beş bakliyat kapalı darbe. toplam altı tur için çözüm ses dalgalarına maruz ve çözüm turlarında aradaki buz üzerinde soğumasını bekleyin.
  7. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 24.000 x g'de çözelti santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve tekrar bir kez 2.5-2.7 adımları. -20 ° C'de pelet saklayın ya da 2.8 adıma geçin.
  8. NaCI 0,8766 g, Tris-HCl 0,09456 g, ve 100 ml'lik bir deney şişesine imidazol 0,01021 g ekleyerek (500 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, 5 mM imidazol, pH 7.9) tamponu hazırlayın. Hacim, 7.9 çözeltinin pH ayarı 28 mi ulaşana kadar H2O ekleyin. Daha sonra, 100 ml'lik bir çözelti aktarmak dereceli silindir ve hacim 30 mi kadar H2O ilave edin.
  9. tampon A içinde 30 ml adım 2.7 pelet yeniden süspanse edin ve 3 saat 4 ° C de, bu çözüm inkübe edilir. Bu süre içindeguanidin-HCl 17.2 gr tarttın.
  10. Adım 2.6 olarak aynı ayarları kullanarak buz üzerinde çözüm sonikasyon. Daha sonra çözeltiye guanidin-HCl, 17.2 g ekleyin. MOG etiket protein çözündürülmesi için 1 saat boyunca buz üzerinde, bu inkübe edin.
  11. 4 ° C'de 30 dakika boyunca 24.000 x g'de çözelti santrifüjleyin. Süpernatant toplayın ve protein saflaştırma kadar 4 ° C'de süpernatan saklayın.

3. Protein Saflaştırma

Not: MOG etiket protein ve elüsyon (His-tag ile) şarj nikel reçine üzerine emilme 4 tur üzerinden saflaştırılmıştır olan aşağıdaki adımlarda.

  1. Aşağıdaki Tamponlar olun:
    1. Tampon B (500 mM NaCI, 20 mM Tris-HCl, 5 mM imidazol, 6 M guanidin-HCI, pH 7.9) hazırlayın. 500 ml'lik bir deney şişesine NaCl 5.844 g, Tris-HCl 0,6304 g, imidazol 0,0681 g ve 114,64 g guanidin-HCI ekleyin. Daha sonra 190 ml ulaşana kadar H2O ilave ve 7.9 pH ayarlamak. sol aktarın250 ml dereceli silindir Katkı ve hacim 200 mi kadar H2O ilave edin.
    2. Elüsyon tamponu (500 mM NaCI, 20 mM Tris-HCI, 0.5 M imidazol, 6 M guanidin-HCI, pH 7.9) hazırlayın. 500 mL'lik bir behere NaCl 5.844 g, Tris-HCl 0,6304 g, imidazol 6.808 g ve 114,64 g guanidin-HCI ekleyin. 190 ml ulaşana kadar H2O ilave edin ve 7.9 pH ayarlamak. 250 ml çözelti, dereceli silindir aktarın ve hacim 200 ml kadar o H2 ekleyin.
    3. Şerit tamponu (500 mM NaCI, 20 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, pH 7.9) hazırlayın. 500 mL'lik bir behere NaCl 5.844 g, Tris-HCl 0,6304 g, 40 mi, 500 mM EDTA. 190 mL ulaşana kadar H2O ilave edin ve 7.9 pH ayarlamak. 250 ml çözelti, dereceli silindir aktarın ve hacim 200 ml kadar o H2 ekleyin.
    4. Şarj tamponu (0.1 M nikel sülfat) hazırlayın. 500 ml'lik behere 5,257 gr nikel sülfat ekleyin ve 190 ml ulaşana kadar (H DİKKAT 2 O ekleyin nikel kolu yoknikel sülfat kadar davlumbaz dışında sülfat) H2, O içinde çözülmüş olan. Nikel sülfat çözündükten sonra, 250 ml solüsyon dereceli silindir transferi ve hacim 200 ml'ye ulaştığı kadar o H2 ekleyin.
  2. 4,500 xg (her bir tüp içinde 5 ml) içinde santrifüj kuvvetlere dayanabilen iki konik bir 50 ml santrifüj tüpleri arasındaki nikel reçinesinin 10 ml Böl.
  3. Şarj ve nikel reçine dengelenmesi:
    1. 40 mL kadar H2O reçine ihtiva eden her tüpe ilave edilerek reçine yıkanır. Bir rocker üzerine yatay olarak tüpleri Lay ve onları 4 ° C'de 5 dakika boyunca ajitasyon edelim. Bir kez 4 ° C'de 8 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüj tüpleri tamamladı.
    2. pelet rahatsız etmemek için pipetleme süpernatant atın. Her tüpe şarj tamponu 40 ml ekleyin. Bir rocker üzerine tüpleri aktarın ve onları 4 ° C'de 15 dakika süreyle ajite edelim. Bir kez 4 ° C'de 8 dakika boyunca 4.500 x g'de santrifüj tüpleri tamamladı.
  4. İsteğe bağlı: Adım 2.11 toplanan çözünmüş protein 150 ul alın ve bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Ön inkübasyonun olarak tüp etiketleyin ve gelecekteki SDS-PAGE analizi, -20 ° C de, bu dondurma (Şekil 3, ham MOG etiketi).
  5. MOG etiketi Protein arındırmak:
    1. Aşama 3.3 nikel reçinesi içeren birinci boru (Şekil 2, tüp 1) ila (~ 40 mi eksi adım 3.4 çıkarıldı küçük bir örnek) aşama 2.11 çözünebilir proteinin tüm hacim transferi karıştırın ve bir rocker yatay yer 1 saat süre ile 4 ° C 'de.
    2. 4 ° C'de 8 dakika boyunca 4.500 x g'de tüp santrifüjleyin. Bittiği zaman, ikinci süpernatantı aktarınboru (Şekil 2, tüp 2) nikel reçinesi ve önceki aşamada tarif edildiği gibi inkübe edin. Bu arada, tüp 1 ile adım 3 altında 6 ile devam edin.
    3. Elüsyon tamponu, 40 ml bir tüp 1 'de nikel reçine yeniden süspanse edin ve 5 dakika boyunca 4 ° C' de bir rocker yatay tüp yerleştirin. Daha sonra, 4 ° C'de 8 dakika boyunca 4.500 x g'de tüp santrifüj.
    4. 'Saflaştırılmış MOG etiketi proteini' etiketli bir 250 ml'lik şişe içine yıkandı MOG etiketi protein içeren süpernatant aktarın ve 4 ° C'de bu şişeyi tutmak. Her yıkama adımı ile, bu şişede sonuçlanan süpernatant havuz.
    5. Nikel reçinesine şerit tamponu, 40 ml ilave edilir ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca, bir sallama düzeneği üzerinde yatay olarak yerleştirin.
    6. 4 ° C'de 8 dakika boyunca 4.500 x g'de tüp santrifüjleyin. Adım 3.3 listelendiği gibi süpernatant atın, sonra nikel reçine şarj edin.
    7. Bir kez adım 3.5 listelenen ikinci tüp ile ileriye taşımak, bitmiş. 4 turda toplamarzu edildiği takdirde adım 2.11 şarj nikel reçinesi ve her ne kadar protein en iyileşir elüsyon üzerinde çözündürülmüş protein emilim s, ek protein emilimi ve elüsyonunun ilave turda geri kazanılmasını sağlamıştır.
  6. emme ve elüsyon dört (veya daha fazla) mermi tamamlandıktan sonra, bir gece boyunca 4 ° C'de bir araya toplanmış saflaştınldı protein saklayın. tekrar gerekli olana kadar nikel reçinesi, 4 ° C 'de% 20 etanol çözeltisi 40 ml saklanabilir.

4. Protein konsantrasyonunun ölçülmesi

NOT: bölüm 3. oluşturulan saflaştırılmış MOG etiketi protein miktarını ölçmek için gerekli olan daha fazla devam etmeden önce bu değer protokol sonunda proteini konsantre son hacmi belirlemek için kullanılır. Biz burada bir standart Bradford Testi açıklar. Saflaştınldı MOG etiketi proteinin konsantrasyonu seri olduğu zaman dilüe olabilme spektral emmesi ile karşılaştırılarak belirlenirBilinen konsantrasyonda sığır serum albümini (BSA), standart bir eğriye Ed MOG etiket protein.

  1. 3 L'lik bir kap içinde 23 ml buzlu asetik asit gr 8.2 sodyum asetat eklenerek 10x asetat tamponu yapmak ve daha sonra sodyum asetat çözünmesi için H2O 1.9 L ilave edin. Bir 2 L Bu çözelti dereceli silindir aktarın ve hacmi 2 L daha sonra oda sıcaklığında 2 L'lik bir şişede saklayın ulaşıncaya kadar H2O ilave edin. H2O 900 ul 10x asetat tamponu 100 ul ilave edilerek 1 x asetat tamponu için 1 ml yapmak
  2. Wells G2-8 ve G9 60 ul 1x asetat tamponu, 30 ul ekleyerek dilüsyonları için 96 oyuklu bir plaka kurulumu. H2 ve H3 1x asetat tamponu, 48 ul ekle.
  3. 1x asetat tamponu 216 ul ve de G1 ticari olarak temin edilebilen 2 mg / ml BSA standardı 54 ul ilave edin ve iyice karıştırın aşağıdaki gibi ham G BSA standardı ilk seri seyreltme ayarlayın. Iyi G2 iyi G1 210 ul ekleyin iyice karıştırın,ve sonra kuyu G3 iyi G2 180 ul ekleyin. Iyi G4 iyi G3 150 uL ekleyin iyice karıştırın ve iyi G8 kadar sonraki her kuyuya az 30 ul ekleyerek bu trendi devam etmektedir. (Eşdeğer seyreltme faktörleri listeleri için Tablo 1'e bakınız).
  4. böylece kuyu A1, B1, ve C1 ve kuyu A2, B2 ve C2 de G2 10 ul ve iyi G1 10 ul aktarılarak her seyreltme üçlü numuneler oluşturun. Bir çok kanallı pipet kullanın.
  5. , MOG etiketinin dilüsyonları kurmak kuyu H1 adım 3.6 saflaştırılmış MOG etiketi protein 60 ul ekleyin. (Bu bir 1x H1 seyreltme, H2 1/5 seyreltme ve H3 1/25 seyreltme üretir), daha sonra iyi H3 iyi H2 12 ul ekleyin, iyice karıştırın, iyi H2 iyi H1 12 ul ekleyin iyice karıştırın .
  6. Aşama 4.4 de tarif edildiği gibi, H1-H3 satır, D, E ve F ile kuyu 10 ul aktararak MOG etiketi dilüsyonları için üçlü numuneler oluşturun.
  7. protein tahlili boya 2 ml karıştırınH2O 8 ml ile reaktif konsantresi varsa, çok kanallı bir pipet kullanılarak, sıra, A, B, C, D, E ve F tüm yüklü oyuklara Bu karışımın 200 ul ekle. protein konsantrasyonu okumadan önce bir iğne kullanılarak kuyularda herhangi kabarcıklar pop.
  8. boya reaktif ekleme 10 dakika içinde, satırlar, A, B, C, D, E ve F tüm oyuklara 595 nm absorbans ölçümü
  9. 1-9 karşılık gelen pozisyonları burada kullanımı satır, A, B ve C bir standart eğri oluşturmak için 0.4, 0.35, 0.3, 0.25, 0.2, 0.15, 0.1, 0.05, 0 mg / ml BSA. Bu eğrinin dayanarak, en iyi standart eğri uyan MOG etiketinin seyreltme kullanarak MOG etiketi protein konsantrasyonu hesaplamak. Genellikle, protokol burada açıklanan kullanılarak bakteriyel kültür 1 L MOG etiketi proteininin 200 ila 250 mg olacaktır.
    NOT: MOG 1-125 protokol sonunda listelenen isteğe bağlı bölüm 7'ye buradan devam ettirmek için. Aksi takdirde, bölüm 5 geçin.

Not: Diyaliz kademeli proteinin yeniden kapatmak için izin vermek için, saflaştırılmış, denatüre MOG etiketi ihtiva eden çözeltiden guanidin kaldırmak için yapılır. MOG kendisini çok çözünmez ve bu tioredoksin etiketin mevcudiyeti ile de geliştirilmektedir da, hala çözeltinin çıkıp eğilimli olduğu gibi bakım Bu adım sırasında alınmalıdır. Bu nedenle, yeniden katlama yavaş yavaş gerçekleştirilir ve nispeten düşük bir MOG etiketi konsantrasyonda olmalıdır.

  1. Konsantrasyonu bölümünde 4 hesaplanan MOG etiket miktarına göre, 0.5 mg / ml veya daha az olana kadar diyaliz başlamadan önce, tampon B (adım 3.1 'de gösterildiği gibi yapılabilir tampon B) ile arıtıldı MOG etiket protein seyreltin.
  2. yılan derisi diyaliz tüp yaklaşık 30 cm kesin ve üç kere yılan derisinin ucunun katlanması ve hemostatla katlanmış ucu sıkma bir kilitleme hemostatla bir ucunu sabitleyin. Seyreltilmiş olan snakeskinleri doldurmakMOG etiketi proteini daha sonra açık ucundan dışarı zorlayarak yılan derisi hava kabarcıkları (tüp başına MOG etiketi protein 60 ila 90 ml arasında). Son olarak, ikinci bir kilitleme hemostat kullanarak tüp diğer ucunu mühür.
  3. Tüm MOG etiketi protein yılan derisi diyaliz tüp içine devredilmiştir kadar adımı yineleyin 5.2 diyaliz boru ek bölümler doldurun. sızıntı olmadığından emin olun.
  4. guanidin-HCl, 382,12 g tartılması ve 2 L'lik bir kap adım 4.1 yapılan 10x asetat tamponu, 100 ml ekleyerek 4 M guanidin ile 1x asetat sağlayın. Behere H2O 0.5 L ilave edin ve guanidin-HCl çözünmesi için izin verir. Bir kez çözüldü 1 L çözüm aktarmak dereceli silindir ve hacim 1 L. gerekli her 2 Snakeskin için bu tarifi tekrarlayın ulaşıncaya kadar O H 2 ekleyin.
  5. aşağıdaki şekilde diyalize uygulayın: Aşama 5.4 4 M guanidin ile 1x asetat tamponu için 1 L büyük bir kova (en az 10 L) doldurun. t yukarı bakacak şekilde yerleştirino bir manyetik karıştırma çubuğu için oda bırakarak kovaya MOG etiketi içeren diyaliz tüp, 2 bölümleri alt engelsiz dönmeye. Bir manyetik karıştırıcı plaka üzerinde bir 4 ° C odasında kova koyun ve (yani, yüksek sıvıyı taşımak için yeterli değil) yavaş dönme hızına açın:
    NOT: yavaş yavaş tampon guanidin miktarını azaltmak için aşağıdaki adımları uygulayın. Stir süreleri asgari olarak verilmiştir, ama bir gecede bırakılabilir. Diyaliz 3 gün en az alacak, ancak istenirse bu uzatılabilir. Düzenli boru sağlam olduğundan emin ve uçları sıkıca kapalı emin olmak için kontrol edin.
    1. kova oturup 4-5 saat karıştırın edelim.
    2. Her bir bölüm için 1x asetat tamponu 1 L (100 mi 10x asetat tamponu ve H2O 900 mL) ilave edilir.
    3. Tekrar 5.5.1 ve 5.5.2 kova tampon 4 L bir toplam 3 kez olmak üzere toplam yineleyin.
    4. (1 kova tampon yarısı atın ve 1x asetat tamponu, 1 L doldurun00 ml 10x asetat tamponu ve H 2 O, hiçbir guanidin) ve boru ve karıştırma çubuğu kurmak 900 ml.
    5. Bir kez tekrarla 5.5.1 ve 5.5.2 adım (örneğin kova tampon 4 L toplam olana kadar).
    6. Son olarak, yeni 1x asetat tamponu 4 L kova bütün 4 L hacmi yerine 4-5 saat boyunca karışmaya bırakıldı. En iyi sonuçlar için, protein konsantrasyonu gününde bu adımı.
    7. Dikkatle tekrar katlanmış MOG etiketi ile diyaliz tüp kaldırmak ve kova tampon atın.

6. konsantre MOG etiketi Protein

Not: Son aşamada, yeniden katlanmış MOG etiket protein depolama için çalışma seyreltisi kadar konsantre edilir. MOG etiketi çok çözünür olduğu için, 5 mg / ml aşmamalıdır. Tam Freund adjuv 1: Bu konsantrasyon genellikle 1 Karışık farelerde (EAE sağlamak için kullanıldığı, 0.4 mg / ml MOG 35-55 peptit, yaklaşık olarak eşit mol birkarınca (CFA)). protein az miktarda beyaz çökelti şeklinde çözeltiden gelmek için konsantrasyon işlemi sırasında nadir değildir. Aşırı çökelme tam bir sorundur.

  1. Bölüm 4'te hesaplanan değeri göre, 5 mg / ml 'lik bir MOG etiketi konsantrasyonu elde etmek için, istenen son hacim hesaplanır.
  2. : 1 oranında hat alüminyum folyo ile tava ve 1 polietilen glikol (PEG) 3350 ve PEG 8000 alüminyum folyo örtü. Konsantrasyon sırasında protein kümeleşmesini engellemeye yardımcı ve etkili bir cyropreservative 11'dir gibi PEG 3350 bu karışıma dahil edilir.
  3. Alüminyum folyo üstünde (iç MOG etiketi proteini ile) yılan derisi boru koyun ve PEG 8000 ile kapak oda sıcaklığında bu sit edelim ve hacim tahmini nihai hacme eşit veya bunun altında olana kadar düzenli hacmi kontrol (adımında hesaplanan 6.1), gerçek ses sonraki aşamada ölçülecektir. tava olursa, Konsantrasyon işlemi sırasında su ile doygun alüminyum folyo ve PEG 3350 ve PEG 8000 ile taze bir tava kurdu.
  4. H2O ile Snakeskin dışında yıkayıp serolojik bir pipet kullanarak ayrı bir cam şişeye MOG etiket protein aktarın. Protein hacmi doğru olduğundan emin olmak için transfer olarak hacim takip edin.
    1. birim tahmin nihai hacim altına düşmüş ise, istenen hacim elde edilene kadar, 1 x asetat tamponu ilave edin. Hacim tahmini nihai hacim üzerinde ise, diyaliz tüp içine geri MOG etiket protein aktarmak ve konsantrasyon devam (6,2-6,3 adımları).
    2. 1.5 ml tüpler (tüp başına 0.5 mi) arasında MOG etiket protein dağıtma gerekli olana kadar -80 ° C'de tüpler saklayın. 1 CFA ile: EAE ikna etmek için, bu hacim 1 karıştırın.
  5. Adım 1 alınan örnekler kullanılarak MOG etiketi proteininin ekspresyonunu doğrulamak için bir SDS-PAGE jel üzerinde çalıştırıldı.4, 2.1, 3.4, ve adım 6.4 saflaştırılmıştır MOG proteini.

TEV proteaz kullanarak MOG etiketinden 7. Yaratma MOG 1-125 (İsteğe bağlı)

NOT: Bu isteğe bağlı adım adım herhangi bir ekstra etiket sekansları olmadan MOG 1-125 gerekiyorsa, etiket dizileri TEV proteaz kullanılarak silinebilir 4. (Şekil 4) ucundan devam eder. Bildiğim kadarıyla biz farkında olarak, saf MOG 1-125 üretme yeteneğine sahip başka hiçbir ifade sistemi yoktur. Bununla birlikte, söz konusu tioredoksin etiketi olmadan MOG 1-125 derece erimez olduğu not edilmelidir ve bu arıtma ve işleme esnasında sorunlara neden olabilir ve bu nedenle deneysel nedenlerle kesinlikle gerekli etiketi kaldırabilir. Birkaç adım saf MOG 1-125 oluşturmak için gereklidir. MOG etiketi ilk TEV proteaz bölünme tamponu içine diyaliz edilir. TEV proteaz ile özümlemenin ardından, hacim ve daha sonra arıtma st yardım etmek için indirgenirEPS ardından tampon B içinde diyaliz ve His-etiketi ihtiva eden etiket dizisi nikel reçinesi kullanılarak uzaklaştırılır. Son olarak, protein, ölçülür ve saf MOG 1-125 son konsantrasyona kadar konsantre edilir.

  1. 1.861 g EDTA, 44.4 g Tris-HCI, ve 2 L'lik bir behere 26.5 g Tris eklenmesiyle 10x TEV yarılma tamponu (500 mM Tris-HCI, 5 mM EDTA) içinde 1 L sağlayın. Hacmi daha sonra EDTA çözündürülmesi için 8 pH ayarlamak 990 ml ulaşana kadar H2O ekleyin. 1 L çözelti silindir mezun Transferi ve O. H 2 kullanarak 1 L hacim getirmek
  2. 0.5 mg aşama 3,6 MOG etiket protein seyreltilir / 4. Aktarım yılan derisi diyaliz tübü seyreltilmiş MOG etiketi proteininin 120 mi tarif edildiği gibi bir bölümü için hesaplanan protein miktarına göre tampon B (adım 3.1 de tarif edilen ayni tamponu) kullanılarak ml adımlara 5.3 5.2. Hacim ancak MOG etiketi proteinin tüm yarmak için gerekli TEV proteaz miktarı substa olacak kadar ölçeklendirilebilirntial.
  3. Adım 7.1 yapılan 10x TEV bölünme tamponu ile 10x asetat tamponu değiştirmek dışında, adım 5.5 listelenen diyaliz protokolü izleyin.
  4. Yeni 250 ml cam şişe, TEV bölünme tampon şimdi, MOG etiketi aktarın ve diyaliz artan hacmi izlemek. Şişeye ilave her 2.85 ml MOG etiket protein başına β-merkapto-etanol 1 ul ekleyin. MOG etiketi proteininin her 50 mg (5 mg / ml stok TEV çözelti) TEV proteaz en az 1 mg ekle (TEV proteaz 1:10 TEV kadar eklenebilir: MOG protein oranı) ile oda sıcaklığında inkübe edin, en az 72 saat süre ile ışıktan korundu.
    Not: TEV proteaz inkübasyonun sonunda beyaz çökeltiler cam şişenin altındaki görülmelidir.
  5. proteinler, protein cam şişe yapışmasını çökeltileri önlemek için eriyene kadar diyaliz tüp protein aktarmadan önce, çözüm guanidin-HCl ekleyin. 150 ul aktarınBu 1.5 ml mikrosantrifüj tüp çözüm ve "TEV ile MOG" olarak tüp etiketleyin. gelecekteki SDS-PAGE analizi için -20 ° C'da, çözelti saklayın.
  6. adımlara 5.3 5.2 listelendiği gibi diyaliz tüp içine adım 7.5 sıvının bütün aktarın. H 2 O 2 L ile büyük bir kova doldurun ve kovaya diyaliz tüp yerleştirin. Işık, gece boyunca karıştırılarak, 4 ° C 'de, bu inkübe edin. Bu adım protein konsantrasyonu hızla ortaya çıkması ve protein saflaştırma engel olacak çözümden EDTA kaldırarak başlamak için izin guanidin sulandırmak için önemlidir.
  7. çözeltinin son hacmi ~ 40 mi 6.2 6.3 (sadece PEG 8000 kullanımı hariç) bu adımların listelenen diyaliz tübüne protein konsantre edilir. H2O ile diyaliz tüpüne yıkayın ve kalan PEG 8000 de boruya bağlı çıkarın. Hacimdeki bu azalma mümkün nikel Re içeren 50 ml'lik bir tüp içine dijeste edilen proteinin tamamı uyacak halegünah, aşama 3,5 açıklandığı gibi.
  8. Tampon B Sindirilmiş olan protein dialyze:
    1. tampon B, 1 L (29.22 gr NaCl, 3,152 g Tris-HCI, 0,3405 g imidazol, guanidin-HCl, 573,18 g, pH 7.9) ile büyük bir kova doldurun.
    2. (Adım 5.5 daha ayrıntılı olarak anlatıldığı gibi), bir karıştırma mıknatısı ile birlikte kova adım 7.7 sindirilen protein ihtiva eden snakeskin yerleştirin. yavaş karıştırın ayarlanmış bir heyecan plaka üzerinde bir 4 ° C soğuk odaya kova koyun ve Snakeskin 5 veya daha fazla saat diyaliz izin verir.
    3. kova boşaltın ve tampon B bir 1 L ile doldurulması ve bunun yavaş karışmasına ayarlanmış bir karıştırma plakası üzerinde 4 ° C soğuk oda oturup Snakeskin 5 ya da daha fazla saat boyunca diyaliz olmasına izin verin.
  9. Yarılan etiket dizileri çözeltide MOG 1-125 bırakarak, nikel reçine bağlayıcı olacaktır önemli fark, 3. bölümünde ayrıntılı olarak MOG 1-125 proteinin saflaştırılması gerçekleştirin. Yine, arınma 4 tur olacakAynı birimde gerçekleştirilir, ancak bu durumda amaç, saflığını geliştirmek için yerine mümkün olduğunca protein kurtarmak. Şekil 4'e bakınız.
    1. Adım 3.1 listelenen protein saflaştırma tamponlar yapmak
    2. Adım 3.3 açıklandığı gibi nikel reçinesi her iki tüpleri şarj edin.
    3. Etiketi içeren nikel reçineden elüat atılır esastır dışında, aşama 3,5 ayrıntılı protokol ile MOG 1-125 saflaştınlır ise, (gelecekteki SDS-PAGE analizi için, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde eluat 150 ul devam) MOG 1-125 ihtiva eden çözelti, nihai ürün olarak tutulmaktadır.
  10. Bölüm 4'te tarif edildiği gibi MOG 1-125 proteini konsantrasyonunu ölçmek:
    1. adımlarda 4.2 ve 4.4 açıklandığı gibi BSA standart eğri dilüsyonları ayarlayın.
    2. Adımlarda 4.5 ve 4.6 açıklandığı gibi MOG 1-125 dilüsyonları ayarlayın. Alternatif olarak, daha geniş bir dizi üretmek için değerli olabilirseyreltileri (örneğin 1x, 1/2, 1/4 ve 1/8) arasında. 1x asetat tamponu ve buna göre MOG 1-125 hacimleri ayarlayın.
    3. 4.7 4.9 adımlarda açıklandığı gibi Bradford Testi gerçekleştirmek ve üretilen MOG 1-125 miktarını hesaplayın. beklenen verim yaklaşık olarak 4 mg veya daha fazla bir proteindir.
  11. Bölüm 5'de tarif edilen şekilde, diyaliz ile guanidin kademeli uzaklaştırılarak MOG 1-125 yeniden katlayın.
  12. 5 mg / ml MOG etiketine ekimolar olan 2.24 mg / ml olmalıdır bölüm 6. nihai konsantrasyon tarif edildiği gibi MOG 1-125 protein konsantre edilir.

8. SDS-PAGE jel MOG etiketi Üretim ve Saflık Onay için

Not: Örnekler adım 1.4, 2.1, 3.4 alınan ve 6.4 MOG etiket üretimi ve saflık teyit etmek için standart SDS-PAGE ile analiz edilir. Bu adım, MOG etiket veya MOG 1-125, ya nihai saflaştırma işleminden sonra yapılmalıdır.

    <li> H2O 2 ml Tris-HCl, 1.576 g ekleyerek 2x SDS-PAGE yükleme tamponu yapmak ve 6.8 pH ayarlanır. Tris-HCl çözeltisi içine 0.4 g SDS ekleyin ve hacim 7 ml ulaşana kadar sonra H 2 O ekleyin.
  1. O zaman adım 8.1 yapılan çözeltiye Bu 1 ml ilave H2O 10 ml mavi bromofenol 0.2 g ekleyin. Son olarak, 2x SDS-PAGE yükleme tamponu tamamlamak için 2 gliserol ilave edin. Bu çözelti saklarken, 4 ° C'de tutun ve en fazla 3 ay ışıktan korumak.
  2. Adımlarda 1.4 ve 2.1 gibi adımlar oda sıcaklığında 3.4 ve 6.4 çözünebilir MOG etiketi proteinden bakterilerin dondurulmuş alikotları çözülme.
  3. Protein tuz giderme sütununa, her biri 60 ul ekleyerek adım 3.4 ve 6.4 toplanan çözeltilerinden tuzları çıkarmak. Üreticinin talimatlarını takip proteinleri arındırın.
  4. Aşama 8.2 yapılan çözeltinin 1 ml β-merkapto-etanol 20 uL ekleyin. İki bac bu 40 ul ekleyinarteryal Aşama 8.3 peletler ve adım 8.4 den tuzdan arındırılmıştır proteinlere 60 ul ve 10 dakika boyunca 95 ° C de, bu inkübe edin.
  5. Tris 5 g, 28.8 gr glisin ve 1 gr SDS dışarı tartarak 1x SDS Sayfa çalışan tampon yapın. 1 L'lik bir şişeye bu ekleyin ve her eritmek için 500 mL H2O ilave edin. Eridiği zaman hacmi 1 L. ulaşana kadar, bir 1 L çözelti dereceli silindir transferi ve H2O ile doldurun
  6. daha sonra jel aygıtına 1x SDS-PAGE çalışan tampon eklemek jel tertibatında% 12 poliakrilamid jel oluşturma çalışma tamponu pelte kuyu en üstünde olacak şekilde. kuyulara beş kez her bir tampon çalışan 50 ul pipetleme jel kuyu yıkayın.
  7. Yük ilk 10 kuyuya protein merdiven ul ve kuyu ayırmak için adım 8.5 haşlanmış çözümleri 10 ul ekleyin. 60 dakika boyunca 115 V jel çalıştırın.
  8. aparat jel çıkarın ve küçük bir kaba aktarın. conta doldurunSaf H2O 100 ml İç ve 8 dakika boyunca yavaş yavaş dönen bir platform konteyneri aktarın. 8 dakika sonra, su dökümü ve H2O ile iki kez daha fazla jel yıkama
  9. Konteynerden H 2 O dökümü ve konteyner hızlı leke reaktif 100 ml ekleyin. Bu, bir gecede yavaş dönen bir platform üzerinde oturmak alüminyum folyo ile kaplayın izin verin.
  10. Hızlı leke reaktifi dökümü ve konteynere H2O yaklaşık 100 ml. Bu 8 dakika süreyle dönen bir platform üzerinde oturmak için izin verin. H 2 O Damper ve iki kez H2O yıkama tekrarlayın.
  11. Görüntü Coomassie mavi lekeler için bir görüntüleyici kullanılarak jel. Bir grup etrafında 31.86 kDa (MOG etiket protein) ve 63.72 kDa (MOG etiket dimerleri) bir sönük bant arayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Saflaştırma işlemi tamamlandıktan sonra, örnekler adım 1.4, 2.1, 3.4 toplanır ve adım 6.4 son ürün, bir protein jeli (Şekil 3A) üzerinde çalıştırılmalıdır. MOG etiketi ilk T O / N numunede 31.86 kDa bandı olarak görünür, ancak 0 T, ve nihai saf ürün tek bant olmalıyım. MOG etiket protein doğru olarak katlandığında olup olmadığını test etmek için, MOG etiket protein FACS ile MOG-protein spesifik B hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. 1 etiketleme fare lenfosit ile: His-etiketi ve bir floresan etiketli tertier anti-IgG 1 antikoru karşı yönlendirilen bir sekonder antikoru ile birlikte MOG etiketinin 1000 seyreltme, MOG özgü B hücreleri (Şekil 3B) tespit edilebilir. Seçenek olarak ise, MOG etiketi doğrudan arka plan boyama azaltmak için florofor konjüge edilebilir (ikincil ve üçüncül antikorlara bağlanma B hücrelerinden elde edilen)MOG özgü B hücreleri tanımlamak için referans 5'te tarif. Bu hücreler normal olarak çok az 5 olduğu gibi, vahşi tip farelerde MOG bağlayıcı B hücreleri tespit çalışırken bu gereklidir. IgH MOG fareler uygun bir kappa hafif zincir ile eşleştirilmiş, MOG için özgüllüğünü veren bir ağır zincir Knockin var. MOG etiketinin bağlayıcı IgH MOG B hücreleri arasında geliştirilmiştir, bu Bu protokol, uygun bir şekilde katlanmış antijen oluşturur onaylar. Önemlisi, IgH MOG B hücreleri MOG etiketi T ve B hücre otoimmünitesini hem uyardığını teyit MOG yönettiği EAE 12 modellerinde otoimmün patoloji katkıda bulunur.

Bölüm 5'de tarif edildiği gibi protein yeniden kapatmak için diyaliz başlamadan önce, Tablo 1 'de bölümünde bir Bradford tahlili 4. Örnek sonuçları gösterilmektedir tarif edildiği gibi, bir Bradford tahlili kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmek için gerekli olan Şekil 5'te özetlenmiştir.

Şekil 6'da gösterildiği gibi, saf MOG 1-125 üretimi nihayetinde MOG 1-125 ve etiket dizisi içine MOG etiketi proteininin bölünmesi ile sonuçlanır MOG etiketi proteine TEV proteaz ilavesi ile gerçekleştirilir. Daha sonra, nikel reçinesi saflaştırma MOG kaldırır etiket, etiket dizisi ve Şekil 6'da gösterildiği gibi, sonuçta saf MOG 1-125 elde TEV proteaz yabancı maddeler.

Şekil 1
Şekil 1: MOG etiketi proteini (Dang ark 5 izniyle burada Duplicated..).. Doğrusal bir yapı ve amino asit ve MOG künye füzyon proteininin DNA dizileri. Fare MOG hücre dışı etki alanı için DNA dizisidir (MOG1-125, mavi alt dizisi)) bakteriler (siyah ekspresyon için kodon-optimize edilmiştir. Bu dizi, tioredoksin ve MOG protein 13,14 bilinen çözünmezlik karşı koymak için bir S-Etiketi ihtiva eden bir etiket, bir N-terminal füzyon, hem de saflaştırma 15 bir 6X His Etiket oluşturmak için bir vektör içine sentezlenerek sokulmuştur. Bir TEV proteaz bölünme sitesi etiketi dizilerinden MOG 1-125 ayırır. Alternatif bir konsensüs TEV bölünme siteyi olmayan tüm MOG amino asitler kaldırılması 16 sonuçlarını kullanarak glutamin-164 ve glisin-165 arasındaki bölünme TEV-aracılı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: Saf MOG etiketi proteini üretmek için gerekli adımların bakış için.MOG etiketi proteini üretmek, MOG etiketi proteini ifade bakteriler daha sonra bir gecede kültürden sonra bölüm 1'de listelenen IPTG kullanılarak MOG etiketini ifade etmek uyarılan yüksek yoğunluklara yetiştirilen bakteriler parçalanır ve peletleme bir dizi içeren protein fraksiyonu adımları vardır Daha sonra ham protein fraksiyonundan saflaştırılır bölüm 2. MOG etiketinde listelendiği gibi bölüm 3. bir kısmı listelenen MOG etiketini içeren cisimcikler, ücret nikel reçine ve MOG etiket protein elüsyon üzerine emilim dört döngüleri yoluyla ayıklanır bir araya getirilmiş, sonra eluat MOG etiketi protein veriminin ve eluat kalan belirlemek için, bir Bradford tahlili için alınır bölümlerine 4'te listelenen ve 5. Son olarak, protein, konsantre edilir olarak birkaç gün boyunca asetat tamponu içinde diyaliz edilir 5 mg nihai bir konsantrasyona kadar PEG 3350 ve PEG 8000 kullanılarak / ml B tespit MOG etiketinin verim dayalı6. bölümde listelenen radford tahlil tüm süreç parantez içinde gösterilen her adım için başlangıç ​​gün, 10 gün en az alabilir. Ancak, alternatif stop ve start noktaları protokolde listelenir ve adımlar istenirse zaman daha büyük bir miktarda yayılmış olabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3:. MOG etiketi proteini ve aktivitesinin değerlendirilmesi saflaştırılması (a) gösterilen bir protein saflaştırma prosedürü boyunca çeşitli noktalarından toplandı ve SDS-PAGE jel üzerinde protein örnekleri vardır. T = 0 (1.4 adım toplanan) protein indüksiyon öncesinde BL21 bakteri, T O protein ekspresyonu / N = BL21 bakteri sonrası indüksiyon (toplananAdım 2.1), Ham MOG etiketi = eritilen MOG etiketi, protein adım 3.4 toplanan protein saflaştırma (), Saf MOG etiketi = MOG etiketi, protein aşamasında 6.4 toplanan saflaştırma (sonra) önce. Vahşi tip C57BL / 6 fareleri ya MOG protein 7,17 özgü bir immünoglobulin ağır zincir ifade IgH MOG fare ya lenf düğümlerinden CD19 POS CD4 negatif naif B hücrelerine MOG etiketi protein bağlanma (B) akış sitometrisi kullanılarak değerlendirildi . MOG etiketi-spesifik B hücreleri ikincil anti-His etiket antikoru ve floresan üçüncül bir anti-IgG 1 antikoru ile takip edilerek MOG etiketi lenf düğümü hücresi lekelenmesi yoluyla teşhis edildiler. C57BL / 6 veya IgH MOG farelerden alınan hücrelerin boyanması IgH MOG hücrelerinin bir MOG etiketi floresan eksi bir (FMO) kontrol leke ile birlikte gösterilir. Lütfen cBu rakamın büyük halini görmek için buraya yalamak.

Şekil 4,
Şekil 4: adımların Bakış MOG 1-125 oluşturmak için MOG etiketi proteinden. protokolün adım 3,5 açıklandığı gibi MOG etiketi eluatının topladıktan sonra, MOG etiket protein TEV proteaz bölünme tamponu içine diyaliz edilir. Diyaliz işlemi tamamlandıktan sonra, TEV proteaz MOG 1-125 proteine MOG etiketinin yarılması sonucu MOG etiketi çözeltisine ilave edilir. ayrıştırma solüsyonu hacmi daha sonra indirgendi ve protein saflaştırma öncesinde tampon B içinde diyaliz edilir. bölme çözeltisinden safsızlıklar şarj nikel reçinesi ve sonuçta saf MOG çözeltisi içinde ortaya çıkan yabancı maddelerden elüsyonu üzerinde emilme dört ardışık mermi ile ekstre edilmiştir < sub> 1-125. MOG 1-125 protein konsantrasyonu, Bradford tahlili ile belirlenir ve protein diyaliz yoluyla birkaç gün boyunca katlanır. Diyaliz tamamlandıktan sonra, MOG 1-125 protein 2.24 mg konsantre / ml PEG 3350 ve PEG Bu protokol 7. bölümünde ayrıntılı olarak tartışılmaktadır 8000. kullanarak bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5,
Şekil 5: MOG etiketinin konsantrasyonunu belirlemek için, bir Bradford tahlili standart eğri Örnek Tablo 1 'den alınan protein. BSA standardı okumaları 595 nm'de optik yoğunluk dayalı MOG etiketi konsantrasyonunun hesaplanması için bir lineer regresyon formül elde etmek üzere çizilmiştir.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54727/54727fig5large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6:. TEV MOG etiketi proteininin bölünmesi ve MOG 1-125 sonraki saflaştırma gösterilen protein örnekleri MOG 1-125 arasında bir SDS-PAGE jel Gösteren arıtılmadan çalışan saf MOG etiketi = MOG etiket protein bölünmesini TEV önce (toplanır. TEV proteaz ile MOG etiketinin inkübasyon 72 saat sonra toplandı / TEV = Protein fraksiyonu w adım 6.4), MOG etiketinde (MOG 1- sırasında nikel reçine bağlı kaldı adım 7.5), Elüsyon = Protein fraksiyonu toplanan (adım 7.9 toplanan) 125 arıtma protokolü, Saf MOG 1-125 = MOG1-125 Protein saflaştırma (adım 7.12 toplanan sonra). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

BSA (mg / ml) 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
1,079 0.998 0.948 0.853 0,769 0.699 0.583 0.493 0.373
1,071 1.014 0.95 0.854 0.777 0.681 0.579 0.484 0.375
1,069 1.017 0.944 0.848 0.781 0.592 0.494 0.374
MOG etiketi seyreltme 1 1/5 1/25
1.327 1.013 0.493
1,332 1.063 0.491
1.367 1.088 0.488

Tablo 1: MOG etiket protein konsantrasyonunu belirlemek için, bir Bradford tahlili ile ilgili Örnek değerler BSA Dilu.Bilinen konsantrelerde leri MOG etiket protein sonrası saflaştırma seyreltileri son MOG etiket protein konsantrasyonunu belirlemek için kullanılır, Şekil 5'te gösterilen standart eğri saptanması için kullanılır. Satır 595nm ölçülen optik yoğunluk içeren ve her satır, her belirtilen konsantrasyonda 3 replicate toplam bir tekrar eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, MOG etiket protein ve nasıl MOG işareti proteiniyle saf MOG 1-125 oluşturmak için üretimi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol standardı His-tag bazlı protein saflaştırma yöntemleri, hem de eski MOG bazlı protein 15 oluşturulması için daha önce tarif edilen protokol ile ilgili hem de dayanır. Burada tarif edilmemiş olsa da, MOG etiketi proteinin birincil kullanımı protein antijeni ile bağışıklık kazandırma yoluyla EAE oluşturmaktır. EAE MOG işareti proteiniyle uyumlu fare, indüklenir açıklayan bir protokol, referans 3 bulunabilir. Biz daha önce MOG etiketi türetilen MOG etiketi veya MOG 1-125 ile bağışıklama sadece standart MOG 35-55 peptit ile karşılaştırıldığında daha yüksek spinal kord inflamasyon ve demiyelinizasyon ile MSS otoimmün hastalık, ama aynı zamanda patojenik IgH MOG B hücreleri tha uyardığını göstermiştirt MOG proteini MOG etiketi veya MOG 1-125 cevaben bir germinal merkez yanıt üretmek için aktive edilir tanımak, ancak 35-55 5 MOG değil. Bu nedenle, MOG etiketi ile bağışıklama gerçekten uygun bir anti-MOG B hücre tepkisine neden yok.

MOG etiket protein (His-tag ile) şarj nikel reçine üzerine emme ve elüsyon yoluyla saflaştırılır. Çünkü daha önceki adımda oluşturulan proteinin büyük miktarda, emme ve elüsyon çok turlu protein en toplanması için gereklidir. En az 4 Mermi 50 mi borular reçine uygun bir hacmi kullanılarak halinde proteininin büyük bir kısmı izole etmek için gerekli olduğunu bulduk. Eğer arzu edilirse, protokol emme tur sayısını azaltmak için daha fazla veya daha büyük boru ve daha fazla nikel reçine kullanmak için skalalandırılabilir. Seçenek olarak ise, nikel sütunlu yüksek basınçlı sıvı kromatografi (HPLC) etkili bir His-etiketli proteinleri 18 <arındırabilir/ sup> ve gerçekten biz HPLC verimli MOG etiketi proteini (yayınlanmamış gözlemler) arındırmak bulduk. HPLC birçok standart immünoloji laboratuarları için erişilebilir olmadığı gibi, burada listelenen protokol ortak laboratuvar ekipmanı kullanılarak yapılması tasarlanmıştır. Onun-tag arıtıma ek olarak, MOG etiket proteini 14 tercih edilirse S-etiket arıtma protokolleri ile uyumlu bir S-etiketi içermiyor.

MOG (en çok insan veya sıçan) göre rekombinant proteinler, daha önce 8 tarif edilmiştir. Bu yana Escherichia coli bakteri protein büyük miktarlarım üretebilmektedir kuvvetli transkripsiyonel promoterler tarafından tahrik sistemleri ile ikame edilmiş eski ekspresyon sistemleri dayanmaktadır. Bizim MOG etiketi sentezleme sistemi MOG proteini 19 in-house üretimi için mevcut sistemlere göre önemli ölçüde daha etkilidir pET-32a (+) vektörü, verimli T7 promotörünü kullanır. Ancak, should Burada anlatılan MOG etiketi, protein fare MOG dayalı olduğu unutulmamalıdır. İnsan MOG protein ile bağışıklık kazandırıldıktan sıçangil MOG 8 ile uyarılan hastalığın göre farklı özelliklere sahip farelerde EAE indüklediği gösterilmiştir. Bundan başka, sıçan MOG bazı durumlarda 20 Farelerde fare MOG daha imünojenik olabilir. Bu nedenle, bazı deneysel amaçlar fare tabanlı MOG etiketi için ideal olmayabilir. Biz daha iyi, bazı amaçlara uygun olabilir daha MOG etiketi proteinin birkaç farklı versiyonunu üretme sürecinde olan ve burada tarif edilen saflaştırma protokolü bu hepsi için çalışacaktır. Bu arada, nikel reçinesine emilmesi için bir 6X His Etiket dahil burada tarif edilen saflaştırma protokolü sürece diğer MOG sentezleme sistemleri ya da hatta diğer proteinler için çalışabilir olması mümkündür. Bununla birlikte, söz konusu tioredoksin etiketi olmadan, daha yüksek konsantrasyonlarda MOG protein çözünürlüğünün bir sorun olabilir, ve tabii ki ge mümkün olmayacaktır nerate bu kadar saf MOG 1-125 MOG etiketi sistemine özgüdür.

Diyaliz yoluyla önce protein refolding için MOG etiketi, protein konsantrasyonu ölçüm Bu arıtma protokolü başarısı için esastır. konsantrasyonu çok yüksek ise, protein agrega ve çözüm dışında yerine bireysel proteinlerin içine katlanır düşebilir. Bu diyaliz tübü altındaki oluşturucu beyaz çökelti diyaliz protokolü esnasında görülür. Bu oluştuğunu ise, 6 M guanidin ile tekrar MOG etiketi protein çözülür ve protein konsantrasyonu ölçmek. Hiçbir çökeltiler ml / 0.5 mg oluşturmalıdır olarak yeniden diyalize başlamak ml / 0.5 mg protein sulandırmak. MOG 1-125 için, çökeltiler, protein son derece erimez olduğu gibi meydana beklenebilir. Bu proteinin yeterince diyaliz öncesi seyreltildi koşuluyla MOG 1-125 katlanmasını etkilemez bulduk.

etkin bir şekilde saf MOG 1-125 içine o TEV proteaz yeterli miktarda kullanmak önemlidir. TEV proteazlar eski sürümleri kendini bölünme yoluyla etkisiz hale getirildiği 21 ancak daha modern versiyonları muzdarip MOG etiketi proteinini bölebilir TEV proteaz için nt "> çözünmeme referans 22 de tarif edildiği gibi ticari olarak temin edilebilen TEV proteaz pahalıya mal olabilir yana, üretim ve arıtma TEV proteaz tavsiye edilir. TEV proteaz inaktivasyon öncesinde MOG etiketi proteininin yeterli bir bölünme elde etmek için yeterli TEV proteaz eklemek için önemlidir, böylece 22 verir. kullanırken saf fare MOG deneyleri için 1-125 protein, proteinin yüksek ölçüde çözünmeyen ve çözeltiden çökelebilir ve bu nedenle geniş bir karışık kullanımdan önce gerektiğine dikkat etmek önemlidir.

Özetle, burada üretim ve MOG etiketi proteinin büyük miktarlarda arıtılması için basit bir protokol tanımlanmıştır. FurthermCevher, bizim MOG etiketi proteine TEV proteaz bölünme sitesinin ilavesi gerekirse saf MOG 1-125 oluşturmak için bir fırsat sağlar. MOG etiket protein, anti-miyelin otoimmün B hücreleri ve MOG etiketi -kaynaklı EAE B hücresi aracılı patolojileri 5 içerir tarafından tanınan ve bağlanmış olan. Bu nedenle, MOG etiket protein EAE ikna etmek için protein antijeni yaygın kullanımını sınırlayan en önemli engelleri ortadan kaldırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BL21 E. coli- pet32-MOGtag Kerfoot lab These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request.
LB broth miller Bioshop LBL407.1
Ampicillin bio basic AB0028 Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C.
IPTG Bioshop IPT002.5 Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C.
Chicken-egg lysozyme Bioshop LYS702.10 Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C.
Triton-X100 Sigma T-8532
Phosphate buffered saline life technologies 20012-027 Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient.
Sodium chloride Bioshop SOD004.1
Tris-HCl Bioshop TRS002.1
Imidazole Bioshop IMD508.100
Guanidine-HCl Sigma G3272 The quality must be greater than 98% purity.
0.5 M EDTA bioshop EDT111.500
Nickel (II) sulfate Bioshop NIC700.500
His bind resin EMD Millipore 69670-3 Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C
Anhydrous ethanol Commercial Alcohols P016EAAN Dilute with water as needed.
Glacial acetic acid Bioshop ACE222.1
Sodium acetate trihydrate Bioshop SAA305.500
bovine serum albumin standard bio-rad 500-0206
Bio-rad protein assay dye reagent concentrate bio-rad 500-0006
Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate Fisher scientific BP120-500
Tris-base Bioshop TRS001.1
7000 MW Snakeskin dialysis tubing Thermoscientific 68700
2-mercaptoethanol Sigma M3148-25ml This reagent should not be handled outside of a fume hood.
AcTEV protease lifetechnologies 12575-015 Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17
Polyethyleneglycol 3350 Bioshop PEG335.1
polyethyleneglycol 8000 Bioshop PEG800.1
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate ebioscience 44-2404-21
Sonicator Fisher scientific FB-120-110
Eon microplate spectrometer Biotek 11-120-611 This equipment uses the Gen5 data analysis software.
Gen5 data analysis software BioTek
sodium dodecyl sulphate Bioshop SDS001
bromophenol blue Bioshop BRO777
Glycerol Bioshop GLY001
Protein desalting columns Thermoscientific 89849
Glycine Bioshop GLN001
precast 12% polyacrylamide gel bio-rad 456-1045
Rapid stain reagent EMD Millipore 553215
Gel dock EZ imager bio-rad 1708270
White Light Sample Tray bio-rad 1708272  Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains
Protein ladder bio-rad 1610375

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
  2. Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
  3. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  4. Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
  5. Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
  6. Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
  7. Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
  8. Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
  9. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  10. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , Cambridge, MA. (2016).
  11. Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
  12. Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
  13. LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
  14. Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
  15. Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
  16. Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
  17. Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
  18. Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
  19. Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
  20. Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
  21. Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
  22. Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).

Tags

Immunology Sayı 116 deneysel otoimmün ensafalomiyelitis EAE miyelin oligodendrosit glikoprotein MOG protein saflaştırma Neuroimmunology fare protein üretimi çok merkezli skleroz MS otoimmünite B hücresi
Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot,… More

Jain, R. W., Dang, A. K., Kerfoot, S. M. Simple and Efficient Production and Purification of Mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein for Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Studies. J. Vis. Exp. (116), e54727, doi:10.3791/54727 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter