Summary
Para revelar a eficácia polinizador de uma determinada espécie de planta, foram desenvolvidos vários métodos de experimentos de campo. Este estudo demonstra os métodos básicos de experimentos de campo para a ecologia da polinização usando o estudo de caso de Lycoris sanguinea var. Sanguinea e do romance mecanismo de polinização, quebrando-bud polinização.
Introduction
interações planta-polinizador são exemplos para o estudo da biologia evolutiva e ecologia. As relações mutualistas entre flores e polinizadores são pensados para ter promovido a diversificação das angiospermas 1,2 como resultado da seleção natural, embora outros fatores bióticos e abióticos também exerceram influência 3,4,5. Pensa-se também que os traços florais foram alterados para se adaptar aos polinizadores mais eficazes e para produzir mais frutos e sementes 6. Estas crenças foram construídos embora grandes estudos com base em diferentes índices, como a eficácia da polinização, que envolvem várias interpretações 7.
Plantas com flores que têm generalizadas sistemas de polinização são visitados por vários tipos de polinizadores 8. Aqui, um visitante flor foi definida como uma espécie animal que visitaram para obter uma recompensa floral e polinizadores foram definidos como visitantes florais que polinizam.Alguns desses visitantes transportar grãos de pólen da mesma espécie para os estigmas das flores visitadas e podem ser classificadas como polinizadores. Outros visitantes também podem ter algum pólen intra-específica; eles podem conduzir a menos de polinização devido a desajustes comportamentais ou morfológicas entre os polinizadores e as flores. Estas diferenças comparáveis na contribuição para a reprodução da planta poderia produzir diferentes graus de pressão seletiva sobre características florais 9 e pode causar a divergência adaptativa das plantas com flores. Portanto, embora a composição da comunidade de polinizadores ea abundância das espécies relativa são importantes 10, a avaliação precisa da eficácia de cada visitante também é fundamental para determinar a adaptação e / ou processos evolutivos das plantas.
Neste estudo, as estimativas quantitativas da eficiência dos polinizadores, definida como a produção de frutas e sementes por freqüência de visitas, foram determinados 11. a especificaçãoForam observadas ies e frequência de cada visitante floral, e foram estimados os efeitos reprodutivos nas flores visitadas. A gravação de visitas florais através de observações humanos é um método clássico em ecologia da polinização. No entanto, este método aplica uma grande carga sobre os observadores, que são obrigados a permanecer em frente das plantas e para tomar medições cuidadosas, a longo prazo. Recentemente, as tecnologias de filmagem e gravação têm se desenvolvido rapidamente, e câmeras de vídeo digital de baixo custo permitiram a introdução de gravação de vídeo para observações polinizadores 12,13. Estes métodos podem facilitar a recolha de informações básicas sobre os visitantes florais e poderia ajudar a desenvolver uma compreensão da ecologia da polinização de uma espécie de planta alvo.
No entanto, as frequências de visita dos polinizadores não estão necessariamente correlacionados com a sua eficácia polinização 7,14, e é importante para avaliar os efeitos qualitativos de cada polinizadorsobre a aptidão flor. Efetividade da polinização foi estimado através do número de grãos de pólen sobre os estigmas 15,16, 17,18 crescimento do tubo polínico e frutas e / ou produção de sementes 19,20. Ensacamento experimentos, conduzidos utilizando sacos de visitante exclusivo, são os métodos típicos para testar auto-compatibilidade, autogamia 21,22, ea presença de apomixia 23. Além disso, a avaliação da eficácia da polinização por um determinado polinizador na assemblage visitante tem sido frequentemente realizado em ambientes onde outros visitantes florais foram limitados (ou seja, uma gaiola de arame, rede, ou um saco com uma malha pequena o suficiente para excluir polinizadores maiores, que é set em plantas com flores). Por exemplo, experiências de ensacamento com pequenos sacos de malha foram conduzidos para revelar a capacidade polinização das formigas ou tripes 24,25. Além disso, as experiências de exclusão pássaro usando uma gaiola de arame ou rede têm mostrado os polinizadores efetivos da taxa Aloe26-28.
Os objetivos deste estudo foram: 1) para introduzir os métodos utilizados em trabalho anterior e 2) para melhorar estes métodos para o uso geral em outros estudos sobre os visitantes florais, as suas frequências de visita, e seus efeitos sobre a aptidão da planta Lycoris sanguinea var.. sanguinea é uma das espécies incluídas no gênero Lycoris, que é distribuído amplamente em todo o Japão e por pouco na Coreia 29 e tem em forma de funil laranja-avermelhado flores (Figura 1a). Um estudo anterior revelou que L. sanguinea var. sanguinea foi visitada por várias espécies de insetos, incluindo um não identificadas espécies de abelhas pequenas e as espécies maiores Amegilla florea 29. No entanto, não foram identificados a frequências de visitação e polinização eficácia destes visitantes. observações de polinizadores para a identificação de visitantes florais foram realizadas em primeiro lugar. Visitação por pequenas abelhas foi OBSErved em flores que não tinha ainda completamente abertos (quebrar gomos; Figuras 1b, c). Pequenas abelhas mudou rapidamente em torno das anteras undehisced nos botões da quebra e recolhido pólen usando suas mandíbulas. A hipótese foi de que as abelhas pequenas poderia ser polinizadores na fase de quebra-bud porque os intervalos entre as anteras e o estigma nas flores foram menores do que o comprimento do corpo das abelhas. Portanto, as experiências foram conduzidas de ensacamento para testar a capacidade de polinização das abelhas pequenas na fase de quebra-gema, e, adicionalmente, para examinar as estratégias de reprodução de L. sanguinea var. sanguinea. Estes botões foram ensacados após as pequenas abelhas visitados, o que permitiu uma estimativa da capacidade de polinização das abelhas. Os indivíduos foram enjaulado com botões fechados. Uma pequena gaiola de malha foi usada, através do qual apenas pequenas abelhas poderia passar, permitindo uma estimativa da eficiência de polinização de abelhas pequenas ao longo de todo o floestágio anel.
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Protocol
NOTA: Este artigo é baseado em nosso trabalho anterior 30. Algumas partes são reimpressas com permissão da Sociedade Botânica do Japão e Springer Japão.
1. Observação de flores Visitantes
- Seleção dos Campos de observação
- Pesquisar as áreas onde os materiais vegetais são distribuídos, e selecionar os locais de estudo candidato usando recursos confiáveis, tais como livros ilustrados, revistas acadêmicas, etc. Ajuste o número de locais de estudo para atender os objetivos da pesquisa (por exemplo, uma grande variedade de locais para a comparação dos visitantes florais em todo o Japão).
- Confira os locais das populações candidatos selecionados e as distâncias de pontos de partida relevantes, tais como institutos de pesquisa e acomodações, se for necessária investigação a longo prazo.
- Estimar grosseiramente cada tamanho da população por contagem do número de indivíduos de plantas numa área de unidade. Escolha grandes populações para a experiência manipuladas usando muitos indivíduos de plantas.
- Pré-observação dos visitantes florais
- Decidir que têm como alvo indivíduos em cada área será observado durante o mesmo intervalo de tempo, dependendo das densidades populacionais. Escolha 5-10 flores recém-abertas ou quebrando botões como flores-alvo, e rejeitar aqueles degradadas que já abriram.
- Comece a observação visual para o período de um dia inteiro, porque as flores pode ser visitado por vários polinizadores em tempo diferentes gamas 31,32.
- Nas folhas de registo, gravar o nome da espécie dos visitantes florais eo tempo de cada visita por hora por flor.
- Observar atentamente se os visitantes florais tocar as anteras e / ou estigmas; se o fizerem, gravar os visitantes como polinizadores. Se os visitantes florais só visitar as flores e não toque os órgãos reprodutivos, gravá-los como visitantes.
- Usando uma rede de insetos ou aspirador feitos à mão, capturar os visitantes florais para identificar epreservá-los como espécimes (Figura 1F). Mate os visitantes presas rapidamente com acetato de etilo ou a pressão dos dedos no tórax, e preservá-los em um saco macio ou em um tubo de plástico ou caso com 100% de etanol.
- Após a observação, identificar os nomes específicos de amostras utilizando características morfológicas ou, em caso de dificuldades na identificação, solicitar a ajuda de especialistas para cada grupo taxonômico.
- Observação no Campo
- Escolha sites de pesquisa com base na sua acessibilidade, o tamanho da população e número de visitantes florais. Escolha períodos de tempo que incluem uma amostra representativa dos visitantes florais na época de floração, e determinar os períodos de observação com base em objectivos de investigação (por exemplo, para a pesquisa sobre flutuações visitação frequência de visitantes florais, longos períodos de tempo deve ser definido).
- Prepare o equipamento de gravação adequado, tais como câmeras de vídeo digitais (por exemplo, para a gravação noite, câmeras de vídeo com uma função de infravermelho devem ser usados).
- Seleccionar as flores alvo da mesma maneira como para 1.1.4.
- Fixar as câmeras de vídeo para tripés de alumínio. Defina as câmeras com tripés na frente dos indivíduos visados, aproximadamente 50 cm de distância.
- Verificar e modificar a quantidade de luz eo foco dos materiais a tela mostra das câmeras antes de filmar.
- Comece a observação visual e filmagens de vídeo ao mesmo tempo para os fusos horários apropriados estimados pelo pré-observações (no caso em apreço, com períodos de observação por mais de seis horas, em média, de aproximadamente 5:00-13:00 pm ).
- Identificar os nomes das espécies dos visitantes e polinizadores, e gravar os seus nomes e os tempos de suas visitas nas folhas de registo.
- Capturar e identificar os visitantes e polinizadores da mesma maneira como em 1.1.4.5.
- Repita os passos 1.2.1 a 1.2.7 para cada observatioperíodo n. Defina os períodos de observação com base nos objetivos da pesquisa e os dados pré-observação.
- Análise de Dados Depois de Observação
- Identificar os nomes de espécies de espécimes capturados após a observação de polinizadores, da mesma forma como em 1.1.4.6.
- Verifique os clipes de vídeo e anote os nomes de espécies e seus tempos visita da mesma forma como para a observação visual.
- Calcular as frequências de visitação por flor por hora de cada visitante floral a partir dos dados de observação e gravação de vídeo visuais. Compare estas freqüências estatisticamente entre os locais e anos de cada visitante utilizando métodos estatísticos adequados com base em estatísticas fundamentais e usando o software adequado, tais como R, SPSS, e / ou SAS 33-35 (por exemplo, uma análise de duas vias de variância (ANOVA ) com o teste de Tukey honesto diferença significativa (HSD) em software R).
2. Ensacamento e Cage Experimentos
- Os preparativos para o ensacamento e Experiências gaiola
- Para os experimentos de ensacamento, preparar sacos que têm tamanhos de malha pequenas (~ 0,5-1 mm) e usá-los para evitar completamente flor visitação (por exemplo, não-tecidos sacos de tecido foram utilizados para os experimentos de ensacamento em 2011 e 2012).
- Para os experimentos de gaiola, prepare fio ou malha de plástico placas com um diâmetro que permite aos visitantes o alvo mais pequenos para passar através mas exclui os maiores, e conectar-se estas placas de malha para formar uma gaiola. Assegure-se que não existem lacunas maiores do que o diâmetro da malha. Ajustar o tamanho e a forma de gaiolas com base nas espécies de plantas alvo e números individuais.
- Experimentos de ensacamento
- Selecione 30 indivíduos por tratamento que não têm danos causados por herbívoros ou de um ambiente severo. Para o tratamento, escolher uma única flor de cada planta individual ou usar flores individuais em uma única planta.
- saco tele alvo flores no campo após rotulando-os com fita adesiva (número de série e do alfabeto; Figura 1 g). Tenha cuidado para não tocar as anteras ou os estigmas dentro dos sacos para evitar a possibilidade de auto-polinização.
- Cuidadosamente corrigir sacos para as flores usando uma corda suave ou fio (Figura 1d).
- definir com cuidado flores individuais na posição vertical com suportes usando a corda suave ou fio para apoiar os indivíduos contra inclinação ou o colapso sob o peso dos sacos ou o vento, se necessário. Torcer ou enrolar um fio ou arame suavemente em torno da haste de uma pessoa alvo, de modo a não criar danos.
- Tratamentos em experimentos de ensacamento
- Para o tratamento "Control", anexar os rótulos para as flores alvo e realizar nenhum tratamento. Permitir que os visitantes florais de visitar livremente.
- Para o tratamento "de cruzamento", cobrem os seus botões até que eles flor, e em seguida, remover as anteras das flores ensacadas. Ponha um pouco de Pollen grãos de vários indivíduos sobre os estigmas.
- Para o tratamento "Selfing", cobrem os seus botões até que as flores abertas, e colocar pólen das mesmas flores em sua estigmas. Cobrir estas flores tratados novamente.
- Para o tratamento "Auto-auto", cobrir os botões com os sacos até o final do período de floração.
- Para o tratamento "bud Partir", identificar os botões de quebra que foram visitados e observar a entrada ou saída de pequenas abelhas (Figuras 1b, c). Retirar as anteras dos botões quebrando para evitar deposições de pólen repetida na mesma flor depois de visitação por pequenas abelhas, e saco estes botões rapidamente para evitar mais visitas.
- Para o tratamento "floração", saco dos botões até a etapa de abertura para evitar visitações na fase de quebra-bud. Depois disso, retire os sacos e permitir que os visitantes para coletar néctar e pólen.
- Para o tratamento "Bud",remover as anteras de botões fechados e outcross-los artificialmente. Saco estes botões rapidamente para evitar visitas de flores.
- Experimentos gaiola
- Cobrir os indivíduos planta alvo com gaiolas preparadas. Ajustar as posições de flores enjaulados à mão para evitar deposições de contato e de pólen entre estigmas diferente (Figura 1e).
- Para o tratamento "Cage", selecionar os indivíduos com botões fechados e colocar rótulos sobre eles para a identificação de flores selecionadas. Gaiola os indivíduos com botões marcados para rejeitar as influências desde antes da criação de gaiolas (ou seja, insectos florais não pode visitar botões fechados, e apenas os efeitos de insetos que visitam após a colocação de gaiolas pode ser estimado).
- Prenda as gaiolas firmemente no chão usando postes de ferro para impedir a entrada de visitantes entre a base gaiola e no chão.
- Análise de Dados After o ensacamento e Experiências gaiola
- Recolha todas as flores marcados no final do período de floração (Figura 1 g) por corte e separando-os dos indivíduos maternos. Preservar cada amostra marcada separadamente para evitar a sua contaminação.
- Verificar a presença ou ausência de frutificação em cada rotulados flower.Record os números de sementes de cada fruta em caso de configuração de frutas.
- Calcular a proporção de número de frutos por flor (proporção definida de frutos, definida como o número de frutas, dividido pelo número de flores) e do número de sementes por fruto maduro (razão de semente-conjunto, definido como o número de sementes dividido pelo número de óvulos) usando todos os números gravados.
- Estatisticamente comparar os rácios de fruto e semente-estabelecidas entre os tratamentos, utilizando métodos adequados e software, tais como os enumerados no 1.3.3 (por exemplo, one-way ANOVA com HSD de Tukey ou teste exato de Fisher no software R 33).
- As investigações sobre os materiais, utilizando os resultados das experiências de ensacamento
- Para testar a necessidade de animais polinizadores, estatisticamente comparar os resultados entre "Control" e "Auto-auto" tratamentos.
- Para estimar o grau de limitação de pólen, compare o "Control" e "tratamentos de fecundação cruzada".
- Para testar a auto-compatibilidade, compare o "Outcrossing" e tratamentos "autofecundação".
- As avaliações das influências do quebra-bud polinização
- Compare o "controle" e tratamentos "botão" para determinar se os estigmas das gemas quebrando são reprodutivamente maduros e se o valor do tratamento "Control" pode ser usado para o controle na fase de quebra-bud.
- Compare o "Auto-auto" e tratamentos "Quebrando Bud" para determinar se o sucesso reprodutivo de flores polinizadas com pequenas abelhas na quebrafase -bud é estatisticamente maior do que o das plantas que executam autogamia (isto é, para testar a existência de polinização quebrar broto-). Depois disso, comparar esses dois tratamentos com o "Control" para estimar as eficiências de polinização de polinização quebra-bud.
- Compare o "Breaking bud", "Gaiola", e "" tratamentos de floração para estimar as influências reprodutivas de polinização quebra-bud.
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Representative Results
Cinco populações foram selecionados para observações polinizadores. Na fase de pré-observação, visitas de várias espécies de insetos a flores de abertura e pequenas abelhas ao gomos quebrando foram confirmados. Observações florais visitante revelou que a maioria dos visitantes para todos os cinco locais de estudo eram indivíduos de pequenas espécies de abelhas japonicum Lasioglossum. O registo total de visita mostrou que os rácios de visita desta espécie foram mais do que 90% em três locais (Figura 2). Em contraste, as razões de o segundo mais frequente visitante, Amegilla florea, foram inferiores a 10% nestes domínios. Estas espécies de abelhas também tocou os estigmas de flores visitadas, e eles foram registrados como polinizadores. Outros visitantes florais frequente, tais como Episyrphus balteatus, recolhido pólen sem contato com os estigmas, e eles foram identificados como visitantes. Em um local, as análises dos dados mostraram que a visitaçãofrequências de pequenas abelhas registrados por observações visuais foram significativamente maiores do que as registradas por vídeo (Tabela 1: one-way ANOVA: Site 2: df = 1, F = 0,471, P = 0,50; Site 3: df = 1, F = 12,12 , P <0,001; site 4: df = 1, f = 1,019, P = 0,33; local a 5: df = 1, f = 1,605, P = 0,22, respectivamente).
Ensacamento de gaiola e experimentos foram conduzidos no Local 1 em 2011 e 2012. Não-tecidos sacos de tecido, com uma malhagem menor do que os tamanhos de corpo dos visitantes florais e gaiolas de arame, com uma malha maior do que as abelhas pequenas, mas menores que outros visitantes, estavam preparados. Foram observadas as visitas frequentes de pequenas abelhas às flores criadas em gaiolas, e gaiolas foram aplicadas. O resultado do tratamento "bud Partir" mostrou a capacidade de polinização das abelhas pequenas que visitam botões quebrando. Comparações de frutase conjuntos de sementes entre os tratamentos indicados no 2.4.5 revelou as características reprodutivas de Lycoris sanguinea var sanguinea, que é predominantemente polinizada animal ( "Control" versus "Auto-auto":. O teste exato de Fisher para a frutificação; P <0,001 ) com condições parcialmente limitada-pólen ( "Control" versus "Outcrossing": o teste exato de Fisher para a frutificação; P = 0,16, teste exato de Fisher para produção de sementes: P = 0,37). As comparações também sugeriu que esta planta tem auto-compatibilidade ( "Outcrossing" versus "Selfing": o teste exato de Fisher para a frutificação; P = 0,48, teste exato de Fisher para produção de sementes: P = 0,32), que era consistente com relatórios anteriores 36,37. Além disso, as comparações dos outros tratamentos sugeriu as capacidades de polinização de polinização quebra-bud em L. sanguinea var. sanguinea. O estigma desta planta é madura na fase de botão (&# 34; Controle "versus" Bud ": o teste exato de Fisher para a frutificação; P = 0,80; teste exato de Fisher para a produção de sementes: P = 0,41), e o valor de" Control "foi utilizado para as comparações no breaking- . bud estágio o tratamento "Breaking bud" mostrou um conjunto maior de frutas do que o "auto-auto" (teste exato de Fisher para a frutificação; P = 0,02), indicando a presença de deposição de pólen por pequenas abelhas para estigmas com a dissolução bud palco. no entanto, não foi possível demonstrar os avanços deste processo de polinização. os três tratamentos detalhados no 2.4.6.2 ( "Control", "auto-auto" e "Breaking bud") mostraram diferenças significativas (one-way ANOVA para a frutificação; df = 2, F = 18,46, P <0,001; one-way ANOVA para produção de sementes: df = 2, F = 3,6593, P = 0,03), mas HSD de Tukey sugeriu que quebrando-bud polinização não é muito eficaz ( "bud Partir"; vs. "Auto-auto": a frutificação: P = 0,10; produção de sementes: P = 0,03). Além disso, as comparações entre os três tratamentos em 2.4.6.3 não apresentaram diferenças significativas (ANOVA de duas vias: df = 2, F = 0,6881, p = 0,50; ANOVA de duas vias para produção de sementes: df = 2, F = 1,2376, P = 0,30).
Figura 1:.. Materiais de plantas e equipamentos experimental (a) Uma flor das espécies de plantas alvo, Lycoris sanguinea var sanguinea. (B) Um broto de ruptura. (C) Uma pequena abelha visitar os botões de quebra para recolher os grãos de pólen. (D) Um exemplo da experiência ensacamento. (E) Uma gaiola de arame cobrindo alguns botões fechados. (F) Um aspirador que foi usado principalmente para a captura de pequenas abelhas. (g Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Taxas de Visitação de Lasioglossum japonicum para flores e botões da quebra e da Amegilla florea totalmente aberta para flores abriu a relação entre esse número é baseado no trabalho anterior 25.. O visitante mais frequente foi a pequena abelha L. japonicum, ea próxima era a maior abelha A. florea. As informações para os sítios estudados é a seguinte: Site 1 = Izumi Nature Park, Chiba Pref .; Site 2 = Sonnou no Mori, Chiba Pref .; Site 3 = Sugawara Shrine, Kanagawa Pref .; Site 4 = Mannyou Nature Park, Tochigi Pref .; eSítio 5 = Kogushi Katakuri no Sato, Gunma Pref. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Comparações entre as observações visuais e gravadas em vídeo de visitantes florais em 2013. Esta tabela mostra o tempo de observação, observado o número de flores, e os números de visitação de pequenas e grandes abelhas em cada local. "Visual" e "Video" são os valores a partir de observações visuais e gravações de vídeo, respectivamente. frequências de visitação com desvios-padrão estão entre parênteses. O valor com um asterisco é significativamente diferente em comparação com o outro método de observação por ANOVA de uma via (isto é, a relação de visita de pequenas abelhas na observação visual foi significativamente maior do que a do vídeo recabos no Site 3).
Tabela 2: Os resultados do ensacamento e as experiências de gaiola em 2011 e 2012. As abreviaturas são como se segue: n = número de flores utilizados em cada tratamento; não. de frutas = número definido de frutas; não. de sementes = número set-semente; frutificação = relação definida de frutas; e sementes = relação set-semente. rácios de produção de sementes são dadas com desvios-padrão. Traços indicam sem dados.
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Discussion
observações de flores e experimentos ensacamento foram empregados neste estudo para revelar as frequências de visitação e o sucesso reprodutivo feminino de plantas, respectivamente. Em Dafni (1992) 38, o método videotape foi eficaz porque poderia gravar o momento ea duração de visitantes para análise e evitar viés do observador. No entanto, no momento, este método necessário equipamento caro, e os tempos de observação foram limitados pela vida útil da bateria. Recentemente, o custo do equipamento para produção de registos de vídeo tem vindo a diminuir, e este método tecnológico pode ser empregue em outras pesquisas de polinizadores. Neste estudo, as frequências de visitação foram significativamente diferentes entre as observações visuais e vídeo no Site 3 (Tabela 2). Isso pode ter sido causado por um excesso de observação dos visitantes florais, e erros humanos como este pode ser rejeitada. Dafni (1992) também mencionou ensacamento ou experimentos líquidas para estudar sistemas de criação 38. Não woven foram utilizados sacos de tecido, que não foram pollen- ou impermeável. L. sanguinea var. sanguinea não é uma espécie polinizada pelo vento, mas a água da chuva pode influenciar o sucesso reprodutivo de flores ensacadas. estacas de ferro foram utilizados para apoiar indivíduos com flores ensacadas do peso dos sacos molhados, mas estes fatores podem ter afetado a capacidade reprodutiva das flores. Cobrindo toda a planta por redes de insetos-exclusivo com apoiantes pode ser a melhor opção para remover esses problemas metodológicos. Além disso, as gaiolas foram usadas para a separação de espécies de abelhas, que foi o primeiro exemplo de um estudo enjaulado-planta. Este estudo demonstrou a eficácia deste método, e podemos aplicá-la a outros estudos cujos objetivos exigem a determinação da eficácia da polinização de diferentes grupos funcionais, tais como pequenas e grandes abelhas.
Estas observações polinizadores revelou que a maioria dos visitantes florais de Lycoris sanguinea sanguinea ao longo de todo o período de floração foram japonicum Lasioglossum. Para fazer observações bem sucedidos, pré-observações de materiais-alvo, em alguns locais de estudo candidatos deve ser feita, o que é descrito no Passo 1.1 na secção protocolo. Por exemplo, as identificações de alguns visitantes florais são feitas com base em observações ou fotos da câmera em um campo. Alguns visitantes florais pertenciam a grupos taxonômicos que eram difíceis de identificar em primeiro lugar, devido às suas características morfológicas indistinguíveis ou atividades que visitam rápidas, como as abelhas halictid ou esfingídeos noturnos, respectivamente. Portanto, a pesquisa preliminar sobre visitas florais podem ajudar a identificar e registrar cada visita. Para compreender totalmente a influência das condições ambientais, é importante para seleccionar locais de estudo adequado para as observações. Por exemplo, condições de chuva não são adequados para observações polinizadores porque a aparência e padrões de polinização pode mudar. E seos sites selecionados tinha flutuado em condições ambientais, não poderia ter sido dados de observação suficientes recolhidos para analisar os objetivos do estudo. Alternativamente, os resultados podem ter sido mal interpretados, devido a diferenças nas condições climatéricas que afectam a composição da comunidade polinizador 39.
Neste estudo, os visitantes florais foram examinadas por meio de observações visuais e registos vídeo (Tabela 1). Estes dois métodos têm vantagens e desvantagens. Em observações visuais, os objetos podem ser vistos de vários ângulos e pode ser observado mais especificamente. No entanto, a informação disponível sobre os objectivos é limitado porque o registro permanece apenas como notas de campo ou fotografias digitais. Em contraste, os visitantes florais podem ser repetidamente verificado usando vídeos gravados. Infelizmente, este método tende a produzir registros inadequados para análise, tais como out-of-focus e imagens insuficientemente iluminados. Em adição a estes métodos, Somtécnicas e de gravação específica têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Por exemplo, em plantas com flores com polinizadores raras, como algumas plantas de orquídeas, fotografia intervalo usando câmeras digitais é uma abordagem eficaz para a identificação de polinizadores 40. Uma câmera de vídeo digital com um sensor de detecção de movimento de vídeo pode gravar imagens nítidas do movimento de polinizadores em flores, mesmo polinizadores rapidamente em movimento durante a noite 41. Além disso, uma câmara de alta velocidade também foi usado para observar os movimentos lentos de polinizadores, tais como o contacto de cada polinizador ao estigma 42. A gravação de vídeo e fotografia digital são métodos comuns para observações de campo, e é importante para entender as características de cada método e para selecionar o mais adequado.
Os experimentos ensacamento sugeriu os graus de dependência polinizador de L. sanguinea var. sanguinea (Tabela 2). Nestes métodos, o passo críticos são a preparação dos sacos e gaiolas. Neste caso, os sacos utilizados tinham um tamanho apropriado para as flores (Figura 1D); No entanto, pode ser necessário para preparar tamanhos maiores ou redes-excluindo insectos, que pode cobrir indivíduos de plantas inteiras. O tratamento "Auto-auto" teve alguns frutos, mas uma relação de set-semente maior, e isso pode ter sido causado pelo contato entre o estigma e os sacos anexado-pólen. Tais erros podem ser evitados através de métodos apropriados para os objectivos de cada experimento. Ensacamento para as papilas quebrando mostrou a polinização por abelhas pequenas na fase de quebra-bud (Tabela 2). Pequenas abelhas tendem a lidar com os gomos de quebra para recolher o pólen mais tempo do que os outros insetos que visitaram flores de abertura. Estas diferenças de comportamento poderia sugerir que quebrando-bud polinização não tem eficiência de polinização mais elevados do que os outros processos de polinização. Para revelar estas diferenças comportamentais, o sucesso da polinização porúnica visita ou polinização eficiência de cada polinizador deve ser avaliado 43,44. Ao preparar as fechadas, botões ensacados, foi possível estimar os efeitos single-visita sobre os aspectos reprodutivos de polinização quebra-bud. Além disso, na experiência de gaiola, os botões fechados foram mantidas. Este método não pode ser utilizado para avaliar a eficácia de polinização por pequenas abelhas no apenas a fase de floração. Um método alternativo seria a de cobrir a gaiola com um pano que tem aberturas menores do que o tamanho de todos os visitantes florais até que as flores em gaiolas totalmente aberta.
Embora as experiências atuais proporcionado bons resultados, experimentos de campo revelou apenas informações limitadas sobre as interações planta-polinizador. Por exemplo, se a hipótese de que a quebra-bud polinização por abelhas pequenas poderia promover autofecundação ou polinização geitonogamous. Este processo de polinização ocorre quando pequenas abelhas se mover nos brotos quebrando. Alguns grãos de pólen puderser facilmente transportado da mesma flor para o estigma. Além disso, os intervalos de forrageamento de abelhas pequenas estimados por seus tamanhos corporais eram curtos, promovendo a intervalos curtos de dispersão do pólen 45,46. Estas previsões são difíceis de investigar usando apenas experimentos de campo, embora os movimentos de pólen entre os indivíduos podem ser rastreados usando pólen marcadas com um corante fluorescente 47,48. Por exemplo, polimorfismos ou microssatélites marcadores de tamanho de fragmentos amplificados podem ser usados para estimar se os doadores de pólen de cada semente são derivados a partir de diferentes indivíduos ou mesmos 49,50. Nos últimos anos, os movimentos de pólen entre plantas da mesma espécie foram seguidos utilizando técnicas de genotipagem de pólen único 35. Este método molecular foi utilizado para mostrar os significados para as avaliações das eficiências de polinização 36. No caso em apreço, esta técnica molecular poderia revelar as posições de chegada dos grãos de pólen de botões quebra, que MIluta indicam os graus de fluxo gênico entre quebrando botões e as flores totalmente abertas. Portanto, um plano de investigação abrangente, com base em ambos os trabalhos de campo e análises moleculares, é necessário revelar os efeitos dos polinizadores.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| recording sheet | any | NA | |
| insect net | any | NA | |
| pooter | any | NA | |
| ethyl acetate | any | NA | |
| 100% Ethanol | any | NA | |
| plastic tube | any | NA | |
| plastic case | any | NA | |
| soft bag | any | NA | |
| digital video camera(s) | any | NA | |
| tripod(s) | any | NA | |
| bags | any | NA | |
| wire or plastic mesh boards | any | NA | |
| iron wires | any | NA | |
| labeling tape | any | NA | |
| stick supporters | any | NA | |
| soft strings or wire | any | NA | |
| pincette(s) | any | NA |
References
- Dodd, M. E., Silvertown, J., Chase, M. W. Phylogenetic analysis of trait evolution and species diversity variation among angiosperm families. Evolution. 53 (3), 732-744 (1999).
- van der Niet, T., Johnson, S. D. Phylogenetic evidence for pollinator-driven diversification of angiosperms. Trends Ecol. Evol. 27, 353-361 (2012).
- Bascompte, J., Jordano, P. Plant-animal mutualistic networks: the architecture of biodiversity. Ann. Rev. Ecol. Evol Syst. 38, 567-593 (2007).
- Losos, J. B., Ricklefs, R. E. Adaptation and diversification on islands. Nature. 457, 830-836 (2009).
- Schnitzler, J., et al. Causes of plant diversification in the cape biodiversity hotspot of south africa. Syst. Biol. 60, 1-15 (2011).
- Stebbins, G. L. Adaptive radiation of reproductive characteristics in angiosperms I: pollination mechanisms. Ann. Rev. Ecol. Syst. 1, 307-326 (1970).
- Ne'eman, G., Jürgens, A., Newstrom-Lloyd, L., Potts, S. G., Dafni, A. A framework for comparing pollinator performance: effectiveness and efficiency. Biol. Rev. 85, 435-451 (2010).
- Waser, N. M., Chittka, L., Pirce, M. V., Williams, N. M., Ollerton, J. Generalization in pollination systems, and why it matters. Ecology. 77 (4), 1043-1060 (1996).
- Sahli, H. F., Conner, J. K. Visitation, effectiveness and efficiency of 15 genera of visitors to wild radish, Raphanus raphanistrum (Brassicaceae). Am. J. Bot. 94, 203-209 (2007).
- Moeller, D. A. Pollinator community structure and sources of spatial variation in plant-pollinator interactions in Clarkia xantiana. ssp. xantiana. Oecologia. 142 (1), 28-37 (2005).
- Keys, R. N., Buchmann, S. L., Smith, S. E. Pollination effectiveness and pollination efficiency of insects foraging Prosopis velutina.in south-eastern Arizona. J. Appl. Ecol. 32 (3), 519-527 (1995).
- Pedron, M., Buzatto, C. R., Singer, R. B., Batista, J. A. N., Moser, A. Pollination biology of four sympatric species of Habenaria (Orchidaceae: Orchidinae) from southern. J. Linn. Soc. 170, 141-156 (2012).
- Phillips, R. D., et al. Caught in the act: pollination of sexually deceptive trap-flowers by fungus gnats in Pterostylis (Orchidaceae). Ann. Bot. 113, 629-641 (2014).
- Mayfield, M. M., Waser, N. M., Price, M. V. Exploring the "most effective principle" with complex flowers: bumblebees and Ipomopsis aggregata. Ann. Bot. 88, 591-596 (2001).
- Herrera, C. M. Components of pollinator "quality": comparative analysis of a diverse insect assemblage. Oikos. 50, 79-90 (1987).
- Hargreaves, A. L., Weiner, J. L., Eckert, C. G. High-elevation range limit of an herb is neither caused nor reinforced by declining pollinator service. J. Ecol. 103, 572-584 (2015).
- Motten, A. F. Reproduction of Erythronium umbilicatum. (Liliaceae): pollination success and pollinator effectiveness. Oecologia. 59, 351-359 (1983).
- Betts, M. G., Hadley, A. S., Kress, W. J. Pollinator recognition by a keystone tropical plant. Proc. Natl. Acad. Sci. 112 (11), 3433-3438 (2015).
- Schemske, D. W., Horvitz, C. C. Variation among floral visitors in pollination ability: a precondition for mutualism specialization. Science. 225 (4661), 519-521 (1984).
- Spears, E. E. A direct measure of pollinator effectiveness. Oecologia. 57, 196-199 (1983).
- Sun, M., Ritland, K. Mating system of yellow starthistle (Centaurea solstitialis.), a successful colonizer in North America. Heredity. 80, 225-232 (1998).
- Suetsugu, K. Autogamous fruit set in a mycoheterotrophic orchid Cyrtosia septentrionalis. Plant Syst. Evol. 299, 481-486 (2013).
- Dupont, Y. L. Evolution of apomixis as a strategy of colonization in the dioecious species Lindera glauca. (Lauraceae). Popul. Ecol. 44, 293-297 (2002).
- Ramsey, M. Ant pollination of the perennial herb Blandfordia grandiflora (Liliaceae). Oikos. 74, 265-272 (1995).
- Moog, U., Fiala, B., Federle, W., Maschwitz, U. Thrips pollination of the dioecious ant plant Macaranga hullettii.(Euphorbiaceae) in Southeast Asia. Am. J. Bot. 89 (1), 50-59 (2002).
- Stokes, C. J., Yeaton, R. I. Population dynamics, pollination ecology and the significance of plant height in Aloe candelabrum. Afr. J. Ecol. 33, 101-113 (1995).
- Hargreaves, A. L., Harder, L. D., Johnson, S. D. Aloe inconspicua.: The first record of an exclusively insect-pollinated aloe. S. Afr. J. Bot. 74, 606-612 (2008).
- Botes, C. B., Johnson, S. D., Cowling, R. M. The birds and the bees: using selective exclusion to identify effective pollinators of African tree aloes. Int. J. Plant. Sci. 170 (2), 151-156 (2009).
- Kawano, S. Life-history monographs of Japanese plants. 13: Lycoris sanguinea.Maxim (Amaryllidaceae). Plant Spec. Biol. 24, 139-144 (2009).
- Yamaji, F., Ohsawa, A. T. Breaking-bud pollination: a new pollination process in partially opened flowers by small bees. J. Plant Res. 128 (5), 803-811 (2015).
- Sun, M., Gross, K., Schiestl, F. P. Floral adaptation to local pollinator guilds in a terrestrial orchid. Ann. Bot. 113, 289-300 (2014).
- Sletvold, N., Trunschke, J., Wimmergren, C., Ågren, J. Separating selection by diurnal and nocturnal pollinators on floral display and spur length in Gymnadenia conopsea. Ecology. 93, 1880-1891 (2012).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2014).
- IBM Statistics Version 21. , International Business Machines Corp. Boston, Mass. (2012).
- SAS Version 9.2. , SAS Institute. Cary, NC, USA. (2009).
- Ma, B., Tarumoto, I., Morikawa, T. Cytological studies on selfed plants and interspecific crosses produced in four species of genus Lycoris.(Amaryllidaceae). Sci Rep Coll Agric Osaka Pref Univ. 52, 13-18 (2000).
- Ma, B., Tarumoto, I., Nakamura, N., Kunitake, H. Production of interspecific hybrids between Lycoris incarnata.and four other Lycoris.species through embryo culture. J Japan Soc Hortic Sci. 70, 697-703 (2001).
- Dafni, A. Pollination ecology: a practical approach. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1992).
- Abrahamczyk, S., Kluge, J., Gareca, Y., Reichle, S., Michael, K. The influence of climatic seasonality on the diversity of different tropical pollinator groups. PLoS One. 6 (11), e27115 (2011).
- Suetsugu, K., Hayamizu, M. Moth floral visitors of the three rewarding Platanthera. orchids revealed by interval photography with a digital camera. J. Nat. Hist. 48, 1103-1109 (2014).
- Steen, R. Pollination of Platanthera chlorantha.(Orchidaceae): new video registration of a hawkmoth (Sphingidae). Nord. J. Bot. 30, 623-626 (2012).
- Sakamoto, R. L., Morinaga, S., Ito, M., Kawakubo, N. Fine-scale flower-visiting behavior revealed by using a high-speed camera. Behav. Ecol. Sociobiol. 66, 669-674 (2012).
- Johnson, S. D., Steiner, K. E. Generalization versus specialization in plant pollination systems. Trends Ecol. Evol. 15, 140-143 (2000).
- King, C., Ballantyne, G., Willmer, P. G. Why flower visitation is a poor proxy for pollination: measuring single-visit pollen deposition, with implications for pollination networks and conservation. Methods Ecol. Evol. 4, 811-818 (2013).
- Gathmann, A., Tscharntke, T. Foraging ranges of solitary bees. J. Anim. Ecol. 71, 757-764 (2002).
- Greenleaf, S. S., Williams, N. M., Winfree, R., Kremen, C. Bee foraging ranges and their relationship to body size. Oecologia. 153, 589-596 (2007).
- Rademaker, M. C. J., De Jong, T. J., Klinkhamer, P. G. L. Pollen dynamics of bumble-bee visitation on Echium vulgare. Func. Ecol. 11, 554-563 (1997).
- Adler, L. S., Irwin, R. E. Comparison of pollen transfer dynamics by multiple floral visitors: experiments with pollen and fluorescent. Ann. Bot. 97, 141-150 (2006).
- Krauss, S. Complete exclusion of nonsires in an analysis of paternity in a natural plant population using amplified fragment length polymorphism (AFLP). Mol. Ecol. 8, 217-226 (1999).
- Gerber, S., Mariette, S., Streiff, R., Bodenes, C., Kremer, A. Comparison of microsatellites and amplified fragment length polymorphism markers for parentage analysis. Mol. Ecol. 9, 1037-1048 (2000).
- Matsuki, Y., Isagi, Y., Suyama, Y. The determination of multiple microsatellite genotypes and DNA sequences from a single pollen grain. Mol. Ecol. 7, 194-198 (2007).
- Hirota, S. K., et al. Pollinator-mediated selection on flower color, flower scent and flower morphology of Hemerocallis.: Evidence from genotyping individual pollen grains on the stigma. PLoS One. 8 (12), e85601 (2013).
