Introduction
נהלי התערבות כלילית לגרום לפגיעה בדפנות כלי דם משמעותית עקב שיבוש קיר רובד כלי. התוצאה restenosis, תסחיף היקפי שתלי וריד, וחוסר ההמשכיות של לומן כלילית 1-4. כדי למנוע סיבוכים אלה, אסטרטגיה מבטיחה תהיה לכסות את פני השטח של כלי הדם באתר אנגיופלסטיקה, אשר יהיה פוטנציאל לעכב restenosis, להקטין סיכונים מן הרציפות של לומן כלי, ולמנוע תסחיף היקפי. מחקרים קודמים לעומת סטנטים מתכת חשופים כדי סטנט-שתלי עם תוצאות חיוביות-שתל סטנט 5. החוקרים השתמשו כמה חומרים כדי לייצר ממברנות לכיסוי סטנטים. זה כולל חומרים סינטטיים כמו פוליאתילן tetraphthalate (PET), polytetrafluoroethylene (PTFE), פוליאוריטן (PU), סיליקון או רקמות כלים עצמיות לייצור סטנטים מכוסים 6-9. חומר שתל אידיאלי לכיסוי סטנט צריך להיות thromboresistant, הלא biodegradable, וצריך לשלב עם רקמה מקורית ללא התפשטות מוגזמת ודלקת 10. חומר השתל המשמש לכיסוי סטנט צריך גם לקדם את הריפוי של השתל-סטנט.
-שתל סטנט נמצא בשימוש נרחב לטיפול לקוארקטציה אב עורקים, מפרצות מדומה של עורק התרדמה, fistulae arteriovenous, הידרדר וריד שתלי, וגדול מפרצת מוחית ענקית. אבל את הפיתוח של שתלי סטנט קליבר קטנים הוא מוגבל על ידי היכולת לשמור על פרופיל נמוך וגמישות, אשר מסייע בפריסה של שתלי-סטנט 11-14. פו הוא פולימר אלסטומרי עם חוזק מכאני טוב שהנו תכונה רצויה להשגה על פרופיל נמוך וגמישות טובה 15,16. בנוסף בעל עבירות טובות, סטנט-שתלי צריך גם לקדם ריפוי endothelialization מהירים. PU מכוסה סטנט-שתלים הוכיחו biocompatibility הטוב ומשופרי endothelialization 17. יש חוקריםבעבר ניסה endothelialize PU מכוסה שתלי סטנט ידי זריעת אותם עם תאי אנדותל 17. Electrospinning של פו ליצור מטריצת nanofiber הוכח להיות טכניקה יקרה לייצור כלי דם שתלי 18,19. קיומו של nanofibers המחקה את הארכיטקטורה של מטריקס יליד ידוע גם כדי לקדם את התפשטות תאי אנדותל 20,21. Electrospinning גם מאפשר שליטה על עובי החומר 22. שתל כלי דם קליבר קטן עשויים PU נחקר לקדם ריפוי באמצעות שינויים כגון ציפוי פני שטח, קרישת דם, ואת מדכא את התפשטות תאים. כל השינויים הללו נועדו לתווך קבלת מארח ולקדם ריפוי שתל 23.
הקבוצה שלנו פיתחה סטנט מתכת חשופה בלון להרחבה אשר ניתן לפרוס במודלים של בעלי חיים 24-26. השילוב של רשת פוליאוריטן electrospun וכדורoon סטנט להרחבה אפשר לנו ליצור סטנט-שתלי להרחבת בלון קליבר הקטן. רוב סטנט-שהתלי הזמין כרגע הציגו דרך עורק הירך בעת ביצוע הליך התערבותית, אך רק מעטי סטנטים מסחריים מכוסים ניתן הציגו 1 גודל צרפתי גדול יותר מזו הנדרשת בלון בלתי מנופח 27. במחקר זה פיתחנו סטנט-שתל וסקולרית קטן קליבר ידי encapsulating סטנט בלון להרחבה בין שתי שכבות של פו electrospun אשר ניתן יהיה להעביר את עורק כלילי באמצעות קטטר מדריך לצרפתית רגילה 8-9 בהליך התערבותית מלעורית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Electrospinning של פוליאוריתן על Mandrel אספן
- כן mandrel עבור electrospinning
- ממס כ -8 מיליליטר של ביולוגית, באיכות מזון, חומר תמיכה מסיס במי גליל סיים (כ 9 מ"מ קוטר ו -110 מ"מ עמוק) ב 155 מעלות צלזיוס באמצעות תנור.
- טובלים בקוטר 3 מ"מ ו -100 מ"מ mandrel נירוסטה ממושכות להשיג ציפוי של חומר תמיכה על פני השטח של mandrel. לפני הטבילה, למקם את mandrels בתנור ב 155 מעלות צלזיוס למשך כ 15 דקות כדי להעלות את הטמפרטורה של פני שטח mandrel שעוזר להרטיב את המשטח עם חומר התמיכה המותך.
- תן mandrel טבול להתקרר כ 140 מעלות צלזיוס בעוד שחומר התמיכה המותך מבצר ויוצרי ציפוי דק אחיד על פני שטח mandrel. במהלך תהליך הקירור, לתלות את mandrel אנכית כך הכבידה גורם לחומר תמיכה עודף לטפטף מעל. ציפוי זה מאפשר קלהסרת השתל-סטנט מוגמר mandrel.
- התקנה של אספן mandrel של מערכת electrospinning (כפי שמוצג באיור 1)
- יישר את מערבל המעבדה אופקי ולהתחבר מוט פלסטיק אשר יחזיק את mandrel הנירוסטה בקצה השני בתוך במנדף.
- ממיסים את החומר תמיכה מהקצה של mandrel ידי השריית רק קצה של mandrel במים כדי להתאים את מוט התמיכה פלסטיק בסוף mandrel. תמיכת מוט תמיכת הפלסטיק בסוף חינם של mandrel לסייע סיבוב אחיד של אספן mandrel.
- השתמש ברגים סט של מוטות תמיכה פלסטיק כדי לאבטח את mandrel נירוסטה למנוע החלקה במהלך electrospinning.
- הארקת אספן mandrel ידי הצמדת חוט קרקע בצורת U אל mandrel הנירוסטה. השתמש גומי O- טבעות כדי להחזיק את חוט הקרקע לצדדים של mandrel.
- סטיםng את מערכת שחול פוליאוריטן נוזלית של מערכת electrospinning
- מערבבים dimethylacetamide (DMA) עם 25% (m / v) פוליאוריטן (PU) פתרון המניות לקבל 15% (m / v) PU ב DMA פתרון (למשל, להוסיף 6 מ"ל של DMA עד 9 מ"ל של 25% פתרון PU).
זְהִירוּת! לעבוד בתוך במנדף עם ציוד מגן אישי נכון. - ממלאים מזרק זכוכית 5 מ"ל עם מחט נירוסטה בקצה הקהה (spinneret) עם 15% פתרון PU.
- לתכנת את משאבת מזרק כדי למתוח 0.01 מ"ל / דקה מבוסס על הקוטר הפנימי של המזרק.
- הר את המזרק עם spinneret על משאבת מזרק אופקית עם קצה המחט כ 20 ס"מ מן אספן mandrel. לבודד את המזרק מן החלקים המוליכים של המזרק לשאוב באמצעות יריעות גומי כדי למנוע קשתית חשמל.
- חבר את מחולל מתח גבוה אל spinneret של המזרק באמצעות קליפ תנין.
- מערבבים dimethylacetamide (DMA) עם 25% (m / v) פוליאוריטן (PU) פתרון המניות לקבל 15% (m / v) PU ב DMA פתרון (למשל, להוסיף 6 מ"ל של DMA עד 9 מ"ל של 25% פתרון PU).
- הפעל את משאבת מזרק 0.01 מ"ל / דקה רוטהte mandrel עם מערבל מעבדה רץ במהירות איטית (למשל, 50 סל"ד).
- למרוח הפרש מתח של 20 ק ברחבי spinneret ואת mandrel האספן. nanofibers PU יתחיל הפקדה על mandrel סיבוב שכבה דקה תהיה גלויה בתוך מספר דקות. ודא במנדף כבוי ופליטה סגורה כדי למנוע אובדן של nanofibers electrospun.
2. Electrospinning א-שתל סטנט
- nanofibers Electrospin פו על mandrel מסתובב במשך שעה 2. ליצור צינור אחיד (כמוסבר בשלב 1).
- הסר את mandrel מן מוט פלסטיק מחובר מערבל מעבדה להתקין סטנט מתכת חשופה. הפעל במנדף ופתוח פליטה לפני הסרת mandrel על מנת להבטיח כי שריד אד ממס יוסר.
- חלק את הנירוסטה להרחבת בלון סטנט 26 על צינור electrospun למיקום רצוי. זה עשוי להיות נחוץ כדי להרחיב את הסטנט מעט אז זה SLIps על מבלי לפגוע בצינור electrospun.
- מסלסלים את הסטנט לוודא כי הסטנט מוגדר בחוזקה על חומר הצינור על mandrel ולא משוחרר מספיק כדי להחליק. זה גם יעזור למנוע delamination של שכבות הפנימיות וחיצוניות.
- טען את mandrel עם צינור סטנט שוב על מוט הפלסטיק של מערבל מעבדה electrospinning השכבה החיצונית של-שתל סטנט.
- nanofibers Electrospin עבור 3 שעות כמוסבר בשלב 1 כדי להמציא מחדש את השכבה החיצונית של-שתל סטנט.
- לאחר electrospinning החיצוני מאוחר יותר, circumferentially לחתוך את החומר PU כ 1 מ"מ מקצות סטנט באמצעות אזמל.
- משרים את mandrel עם שתל סטנט במים deionized לפזר את החומר תמיכה מן mandrel אשר תשחרר את השתל סטנט מ mandrel. חלף עם מים מתוקים לפי צורך כדי לפזר את חומר התמיכה לחלוטין.
- לאחר חומר התמיכה נמס, להסיר בעדינות את שתל סטנט מ tהוא mandrel ולאפשר לו להתייבש. שקול השריית סטנט-שתל הסיר במים deionized לפזר כל חומר תמיכה הנותרים לפני המאפשר לייבוש באוויר.
3. בדיקה של שתלי סטנט מיוצרים
- חלק את-שתל סטנט על בלון trifold 3 מ"מ.
- מסלסל את-שתל סטנט על הבלון באמצעות יד שנערכה crimping כלי.
- בדוק סטנט-שתל crimped באמצעות מיקרוסקופ עבור crimping אחידה וכל סימנים אחרים של כישלון כמו delamination או לנקב של חומר כיסוי בגלל עיוות סטנט.
- הרחב את שתל סטנט לקוטר תוכנן של 3 מ"מ על ידי pressurizing בלון trifold עם מכשיר אינפלציה ומים. שוב, לבחון סטנט-שתל המורחב להרחבה אחידה סימנים של כישלון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התקנת electrospinner שלנו (איור 1) הביאה nanofibers פוליאוריטן באיכות גבוהה (איור 2). A-שתל סטנט מיוצר על ידי electrospinning שכבה פנימית של פוליאוריטן על גבי mandrel, מחליק סטנט מתכת חשוף מעל שכבה זו, ועל electrospinning שכבה חיצונית שנייה של פוליאוריטן (איור 3). nanofibers פוליאוריתן הם electrospun בשיעור של 50 מיקרומטר / hr, שתוצאתה השכבה הפנימית של 100 מיקרומטר ו השכבה החיצונית של 150 מיקרומטר על שתלי-סטנט. Electrospinning באמצעות הפרוטוקול המובא כאן תוצאת שכבות פוליאוריטן nanofibrous אחידות (איור 4). לחיצה וההרחבה הקטן קליבר סטנט-השתל שהתקבל הראתה כי מכשירים אלה מסוגלים להיות פרוסים בעזרת בלון trifold סטנדרטי ללא crimping אחידה ולא סימני כשל חומר (איור 5).
יור 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,731 / 54731fig1.jpg "/>
איור 1. סכמטי של electrospinning ההליך. Nanofibers המופק spinneret נאספים על mandrel מסתובב. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
סריקה איור 2. במיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) תמונות של nanofibers פוליאוריטן. SEM תמונות של חומר פוליאוריטן nanofibrous תערוכות חוקיים nanofibers באקראי (א) הגדלה 5,000X ו- (ב) הגדלה 10,000X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
igure 3 "src =" / files / ftp_upload / 54,731 / 54731fig3.jpg "/>
צעדי איור 3. בודה-שתל סטנט. (א) שכבה פנימית electrospun של סטנט-שתל, (ב) בלון סטנט להרחבה טעון על שכבת electrospun, (ג) שכבה חיצונית electrospun של סטנט-שתלתי, (ד), שתל סטנט לחתוך לאורך על mandrel, ו- (ה), שתלתי סטנט עם שכבות פנימיות וחיצוניות על שכבות nanofibrous PU. כל חטיבה בסולם מייצג 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. תמונות מיקרוסקופיות של שכבות פוליאוריטן electrospun על mandrel נירוסטה. (א) mandrel ללא שכבת nanofibrous, (ב >) שכבת פוליאוריטן nanofibrous על mandrel לאחר 2 שעות של electrospinning, ו- (ג) nanofibrous שכבת פוליאוריטן על mandrel אחרי 5 שעות של electrospinning. הפיקוח של שכבות פוליאוריטן תערוכות עובי אחיד לאורך mandrel בזמנים שונים של electrospinning. כל חטיבה בסולם מייצג 0.5 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. בדיקה של שתל סטנט עבור לחיצה ו הרחבה. (א) סטנט-שתל crimped על בלון trifold 3 מ"מ, (ב) סטנט-שתל התרחב בקוטר תוכנן, ו (ג) סטנט-שתל crimped והרחיב. כל חטיבה בסולם מייצגת 0.5 מ"מ.g5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass syringe | Air Tite | 7.140-33 | Syringe for spinneret |
| Graduated cylinder 5 ml | Fisher Scientific | 08-552-4G | 5 ml pyrex graduated cylinder about 9 mm diameter and 11 cm long |
| High voltage generator | Bertan Accociates, Inc. | 205A-30P | Used to apply voltage difference across spinneret and collector |
| Laboratory mixer with rpm control | Scilogex | SCI-84010201 | Available from various laboratory equipment suppliers |
| Polyurethane | DSM | BioSpan SPU | Biospan Segmented Polyurethane |
| Rubber sheet | McMaster Carr | 1370N11 | Used to insulate syringe during electrospinning |
| Stainless steel mandrel | N/A | N/A | Manufactured |
| Stainless steel needle | Hamilton | 91018 | Used as spinneret in electrospinning |
| Support material | EnvisionTec | B04-HT-DEMOMAT | Biocompatible water soluble material |
| Syringe Pump | Harvard Apparatus | 55-3333 |
References
- Elsner, M., et al. Coronary stent grafts covered by a polytetrafluoroethylene membrane. Am. J. Cardiol. 84 (3), 335-338 (1999).
- Störger, H., Haase, J. Polytetrafluoroethylene-Covered Stents: Indications, Advantages, and Limitations. J. Interv. Cardiol. 12 (6), 451-456 (1999).
- Moreno, P. R., et al. Macrophage infiltration predicts restenosis after coronary intervention in patients with unstable angina. Circulation. 94 (12), 3098-3102 (1996).
- Briguori, C., Sarais, C., Colombo, A. The polytetrafluoroethylene-covered stent: a device with multiple potential advantages. Int. J. Cardiovasc. Interv. 4 (3), 145-149 (2001).
- Qureshi, M. A., Martin, Z., Greenberg, R. K. Endovascular management of patients with Takayasu arteritis: stents versus stent grafts. Semin. Vasc. Surg. 24 (1), 44-52 (2011).
- Ahmadi, R., Schillinger, M., Maca, T., Minar, E. Femoropopliteal arteries: immediate and long-term results with a Dacron-covered stent-graft. Radiology. 223 (2), 345-350 (2002).
- Geremia, G., et al. Experimental arteriovenous fistulas: treatment with silicone-covered metallic stents. AJNR. Am. J. Neuroradiol. 18 (2), 271-277 (1997).
- Saatci, I., et al. Treatment of internal carotid artery aneurysms with a covered stent: experience in 24 patients with mid-term follow-up results. AJNR. Am. J. Neuroradiol. 25 (10), 1742-1749 (2004).
- Stefanadis, C., et al. Stents Wrapped in Autologous Vein: An Experimental Study1. J. Am. Coll. Cardiol. 28 (4), 1039-1046 (1996).
- Palmaz, J. C. Review of polymeric graft materials for endovascular applications. J. Vasc. Interv. Radiol. 9, 7-13 (1998).
- Bruckheimer, E., Dagan, T., Amir, G., Birk, E. Covered Cheatham-Platinum stents for serial dilation of severe native aortic coarctation. Catheter Cardiovasc. Interv. 74 (1), 117-123 (2009).
- Tzifa, A., et al. Covered Cheatham-platinum stents for aortic coarctation: early and intermediate-term results. J. Am. Coll. Cardiol. 47 (7), 1457-1463 (2006).
- Kuraishi, K., et al. Development of nanofiber-covered stents using electrospinning: in vitro and acute phase in vivo experiments. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 88 (1), 230-239 (2009).
- Pant, S., Bressloff, N. W., Limbert, G. Geometry parameterization and multidisciplinary constrained optimization of coronary stents. Biomech. Model Mechanobiol. 11 (1-2), 61-82 (2012).
- Muller-Hulsbeck, S., et al. Experience on endothelial cell adhesion on vascular stents and stent-grafts: first in vitro results. Invest. Radiol. 37 (6), 314-320 (2002).
- Sarkar, S., Salacinski, H. J., Hamilton, G., Seifalian, A. M. The mechanical properties of infrainguinal vascular bypass grafts: their role in influencing patency. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 31 (6), 627-636 (2006).
- Shirota, T., Yasui, H., Shimokawa, H., Matsuda, T. Fabrication of endothelial progenitor cell (EPC)-seeded intravascular stent devices and in vitro endothelialization on hybrid vascular tissue. Biomaterials. 24 (13), 2295-2302 (2003).
- Grasl, C., et al. Electrospun polyurethane vascular grafts: in vitro mechanical behavior and endothelial adhesion molecule expression. J. Biomed. Mater. Res. A. 93 (2), 716-723 (2010).
- Kidoaki, S., Kwon, I. K., Matsuda, T. Structural features and mechanical properties of in situ-bonded meshes of segmented polyurethane electrospun from mixed solvents. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. 76 (1), 219-229 (2006).
- Stegemann, J. P., Kaszuba, S. N., Rowe, S. L. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials. Tissue Eng. 13 (11), 2601-2613 (2007).
- Sankaran, K. K., Subramanian, A., Krishnan, U. M., Sethuraman, S. Nanoarchitecture of scaffolds and endothelial cells in engineering small diameter vascular grafts. Biotechnol. J. 10 (1), 96-108 (2015).
- Gibson, P., Schreuder-Gibson, H., Rivin, D. Transport properties of porous membranes based on electrospun nanofibers. Colloid Surf., A. 187, 469-481 (2001).
- Zdrahala, R. J. Small caliber vascular grafts. Part II: Polyurethanes revisited. J. Biomater. Appl. 11 (1), 37-61 (1996).
- Uthamaraj, S., et al. Design and validation of a novel ferromagnetic bare metal stent capable of capturing and retaining endothelial cells. Ann. Biomed. Eng. 42 (12), 2416-2424 (2014).
- Tefft, B. J., et al. Cell Labeling and Targeting with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles. J. Vis. Exp. (105), e53099 (2015).
- Uthamaraj, S., et al. Ferromagnetic Bare Metal Stent for Endothelial Cell Capture and Retention. J. Vis. Exp. (103), e53100 (2015).
- de Giovanni, J. V. Covered stents in the treatment of aortic coarctation. J. Interv. Cardiol. 14 (2), 187-190 (2001).
- Hans, F. J., et al. Treatment of wide-necked aneurysms with balloon-expandable polyurethane-covered stentgrafts: experience in an animal model. Acta. Neurochir. (Wien). 147 (8), 871-876 (2005).
- Hasan, A., et al. Electrospun scaffolds for tissue engineering of vascular grafts. Acta. Biomater. 10 (1), 11-25 (2014).
