Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Bestemmelse af den relative celleoverfladen og Total ekspression af rekombinante Ion Channels anvendelse af flowcytometri

Published: September 28, 2016 doi: 10.3791/54732
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1
1Département de Physiologie Moléculaire et Intégrative, Montreal Heart Institute Research Centre, 2Département de Microbiologie, Infectiologie, Immunologie, Centre de recherche de l'Hôpital Maisonneuve-Rosemont

Summary

Nedarvede hjertearytmier er ofte forårsaget af mutationer, som ændrer overfladen tilførsel af ét eller flere ionkanaler. Her, tilpasser vi flowcytometri assays til tilvejebringelse af en kvantificering af den relative totale og celleoverfladeprotein ekspression af rekombinante ionkanaler udtrykkes i Tsa-201 celler.

Introduction

Dette dokument indeholder en pålidelig analyse for at rapportere den relative celleoverfladeekspression af membranproteiner såsom ionkanaler udtrykkes i rekombinante celler under anvendelse af eksisterende flowcytometri teknologi. Lonkanaler er poredannende membranproteiner, der er ansvarlige for kontrollen elektriske signaler ved gating strømmen af ​​ioner gennem cellemembranen. De klassificeres ved aktivering mekanisme, natur, og selektivitet ion arter i transit gennem pore, hvor de er lokaliseret. På de cellulære og væv niveauer, de makroskopiske ionstrømme gennem ionkanaler er et produkt af biofysiske (gating og gennemtrængning), biokemisk (fosforylering), og biogenese (syntese, glykosylering, menneskehandel, og nedbrydning) egenskaber 1. Hver af disse processer er unik for hver type af ionkanaler og er optimeret til at opfylde den fysiologiske rolle af ionkanalen. Derfor ændringer i nogen af ​​disse finjusterede processer gennem enarvet eller en genetisk modifikation, der ofte omtales som "channelopathy", kan være skadelig for cellehomeostase. Det er vigtigt at understrege, at levere den "rigtige" mængde af ionkanaler ved celleoverfladen er kritisk for cellehomeostase. Selv små stigninger (gain-of-funktion) og små fald (tab af funktion) i ion-kanal aktivitet har potentiale til at forårsage en alvorlig patologi gennem et helt liv. Defekter i celleoverflade levering af modne ionkanaler er en vigtig determinant i talrige kanalopatier, såsom cystisk fibrose (CFTR ionkanal) 2 og hjertearytmier af langt QT-syndrom formular (kardiale kalium kanaler) 3.

Kanalopatier er forbundet med hjertestop pludselig død 4. Den nuværende verdensomspændende forekomsten af alle hjerte-kanalopatier menes at være mindst 1: 2,000-1: 3.000 pr person 5 og er ansvarlige for omkring halvdelen af pludselig arytmisk hjertedød cases 6. Dysfunktion i hjertets spændingsstyret natrium-, kalium-, calcium- og selektive ionkanaler er kendt for at spille en central rolle i denne proces. L-typen Ca V 1.2 spændingsstyret calciumkanal til at iværksætte et synkroniseret hjertemusklen sammentrækning. Den kardielle L-typen Ca V 1.2 kanal er en multi-subunit proteinkompleks består af de vigtigste poredannende Ca V α1 underenhed og Ca V ß og Ca V α2δ1 hjælpestoffer underenheder 7-12. Bemærk, at den fuldtallige ekstra underenheder er nødvendig for at producere funktionelle Ca V 1.2 kanaler på plasmamembranen og dynamiske samspil mellem disse underenheder er vigtigt at støtte den normale elektriske funktion af hjertet 13. Ca V ß fremmer celleoverfladeekspression af Ca V 1.2 kanaler gennem en ikke-kovalent nanomolær hydrofob interaktion 14. Co-ekspressionen af Ca V α2δ1 subunit with Ca V SS-bundet Ca V α1 stimulerer spidsstrøm ekspression (5 til 10 gange) og fremmer kanal aktivering ved mere negative spændinger. Gain-of-function mutationer af det poredannende underenhed Ca V 1.2 er blevet forbundet med en form for ventrikulære arytmier kaldet langt QT-syndrom 15 henviser en masse punktmutationer i de tre vigtigste underenheder danner L-typen Ca V 1.2 kanals er blevet identificeret hos patienter, der lider af arytmier af den korte QT-syndrom formular 16,17. Ion-kanaler er membranproteiner, der kan undersøges ud fra et biokemisk synspunkt (protein kemi) eller ved hjælp af elektrofysiologiske værktøjer (strøm-genererende maskiner) og ofte ved hjælp af disse komplementære metoder. Elektrofysiologi, især hel-celle patch-fastspænding, er en egnet fremgangsmåde til at belyse funktionen af ionkanaler 15, men kan ikke løse modifikationer i protein- handel fra ændringer i deres biofysiskeegenskaber. Proteinkemi har imidlertid ofte begrænset anvendelse på grund af den relativt lave ekspression af store membranproteiner i forhold til mindre opløselige proteiner. Robuste high-throughput metoder ved hjælp af fluorescens udlæsning skal udvikles for at specifikt defekter i protein biogenese forårsager ændringer i celleoverfladeekspression af ionkanaler.

Flowcytometri er en biofysisk teknologi ansat i celletælling, sortering, biomarkør opdagelse, og protein engineering 18. Når en prøve opløsning af levende celler eller partikler injiceres i et flowcytometer cellerne bestilt i en enkelt strøm, der kan probes ved maskinens detektionssystem (figur 1). Den første flowcytometer instrument produceret i 1956 19 detekteres kun en parameter, men moderne flowcytometre har flere lasere og fluorescensdetektorer der tillader detektion af mere end 30 fluorescerende parametre 20,21.Filtre og spejle (emission optik) lede lysspredning eller fluorescerende lys af celler til et elektronisk netværk (fotodiode og detektorer), der konverterer lyset i forhold til dets intensitet. Digitale data analyseres ved anvendelse af specialiseret software og den primære output vises som et punktdiagram 21.

figur 1
Figur 1:. Biofysiske principper for flowcytometri sortering Enkelte celler skubbes gennem en dyse under højt tryk i en strøm af sheath fluid, som bevæger dem på en eller flere laser forespørgselssignaler point. Lysstrålen afbøjes af de passerende celler og opsamlet i den fremadgående retning (Forward Scatter, FCS) lys sendes til en fotodiode, der konverterer lyset til et signal proportionalt med størrelsen af ​​cellen. Lyset indsamles også i en 90 ° vinkel i forhold til laser stien og sendes til detektorerne (også kaldet fotomultiplikatorer (PMT)).Dette lys er ført gennem dikroiske spejle, der tillader påvisning af sidespredningen signal (SSC), som afspejler granulering i cellerne, og de fluorescerende emissioner, hvis exciterede fluorochromer er til stede i cellen. Tre detektorer (grøn, gul og rød) er repræsenteret med forskellige bølgelængde båndpasfiltre, muliggør samtidig påvisning af forskellige fluorochromer. De forskellige signaler digitaliseret af en ekstern computer og konverteres til data, der vil blive analyseret for at kvantificere egenskaber cellerne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Den high-throughput kapacitet flowcytometre blev udnyttet til at kvantificere relative membran ekspression af rekombinant vildtype og handel-deficient spændingsstyret L-typen Ca V 1.2 kanaler og tilknyttede underenheder i levende celler. cDNA-konstruktioner coding for proteinerne blev dobbelt mærkede samtidig at en ekstracellulær ikke-fluorescerende epitop, kan detekteres af en uigennemtrængelig fluorescerende konjugeret antistof og et intracellulært fluorofor, der er konstitutivt fluorescerende. Både den ekstracellulære epitop, indsættes i en ekstracellulær løkke af proteinet, og det intracellulære fluorofor, indsættes efter den C-terminale ende, omregnes med proteinet. I denne serie af forsøg blev Ca V α2δ1 protein manipuleret til at udtrykke en ekstracellulær hemagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) detekteres af en uigennemtrængelig FITC (fluorescein isothiocyanat) -konjugeret anti-HA og mCherry som den iboende intracellulære fluorofor. At bestemme den relative celleoverfladeekspression niveau mCherry-Ca V α2δ1 HA-mærket protein blev rekombinante celler, der udtrykker fusionsproteinet høstes efter transfektion, og farvet med FITC-konjugeret monoklonalt muse-anti-HA-epitopmærke Antibody (figur 2). FITC er en organisk fluorescerende forbindelse, der er betydeligt mindre end enzym journalister, og derfor ikke så tilbøjelige til at forstyrre biologisk funktion. mCherry- Ca V α2δ1-HA overudtrykt i Tsa-201cells, producerer en signifikant 3-log stigning i FITC fluorescens og mCherry fluorescens på todimensionale plots 22. Da HA-epitopen ligger i den ekstracellulære del af proteinet, fluorescensintensiteten for FITC opnået i nærvær af intakte celler afspejler den relative indeks for celleoverfladeekspression af HA-mærket protein. Tilgængeligheden af ​​HA-epitopen i konstruktionerne systematisk valideres ved måling af FITC signal efter celle permeabilisering. Denne foranstaltning tjener også til at bekræfte den normaliserede total protein udtryk, da de relative fluorescensintensiteter for FITC estimeret i permeabiliserede celler er kvalitativt sammenlignelig med de relative fluorescens værdier for mCherry målt under permeabiliserede og ikke-permeabiliseres betingelser 22,23. Det er vigtigt at bemærke, at den iboende fluorescensspektret forskydes mod højere værdier efter permeabilisering, men at den eneste værdi, der rapporteres er ændringen i fluorescensintensitet i sammenligning med kontrolgruppen konstruktionen. Relative ændringer i fluorescensintensitet for test konstruktioner estimeres ved brug af ΔMean Fluorescence Intensity (ΔMFI) værdier for hver fluoroforen (mCherry eller FITC). Eksperimenter er designet til at måle fluorescensintensiteten af ​​testen konstruktionen i forhold til fluorescensintensitet kontrol konstrukt udtrykkes under de samme betingelser for at begrænse eksperimentelle variationer i den iboende fluorescens fra fluoroforen-konjugerede antistof. To membranproteiner lykkedes undersøgt ved anvendelse af dette assay: det poredannende underenhed af L-typen spændingsstyret calciumkanal Ca V 1.2 14,22 og i en anden serie afeksperimenter, den ekstracellulære ekstra Ca V α2δ1 subunit 22,23. Den følgende protokol blev anvendt til at bestemme celleoverfladeekspression af Ca V α2δ1 underenhed af hjerte- L-typen Ca V 1.2 kanal under kontrolbetingelser og efter mutationer påvirker den posttranslationelle modifikation af ionkanalen. Under standardiserede forsøgsbetingelser, celleoverfladen fluorescens af FITC øger kvasi-lineært med ekspressionen af cDNA, der koder for mCherry-Ca V α2δ1-HA-proteiner (figur 5 fra henvisning 22).

Figur 2
Figur 2:. Skematisk fremstilling af total og membran mærkning i flowcytometri forsøgsprotokollen Ordningen skitserer nogle af de vigtigste skridt, der er nødvendige for at kvantificere den relative totale og celleoverfladen ekspression af rekombinante ionkanaler ved flow cytometri. Celler transficeret med dobbelt-mærket konstruktion mCherry-Ca V α2δ1-HA i Tsa-201-celler (1) og farvet før eller efter permeabilisering (2). Multiparameter data er erhvervet i et flowcytometer (3) for multivariat analyse (4). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Dobbelt Tagged DNA konstruktioner

  1. Indsæt HA-epitopen (YPYDVPDYA) i det ekstracellulære linker med Ca V α2δ1 mellem D676 og R677 ved site directed mutagenese (figur 3B) 20. Brug Forward primer gccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACC og Reverse primer acatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTC.
  2. Subklone cDNA-sekvensen af den mærkede HA Ca V α2δ1 i den mammale pmCherry-N1 ekspressionsvektor designet til at udtrykke proteinet fusioneret til N-terminalen af mCherry mellem SacI og Sall-stederne (figur 3B) 20.
    BEMÆRK: Passende kanal funktion skal afprøves med kontrol konstruktion ved hjælp af standard elektrofysiologiske metoder 24.

2. Liposommedieret Transient transfektion (30 min, Alle trin udføres under Laminar Flow Hood)

  1. Dag 1: Plate halv million af TSA-201 celler (eller HEKT) i35 mm dyrkningsskåle med 2 ml Dulbeccos høj-glucose minimum essential medium (DMEM-HG) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin (PS) dyrkningsmedium. Tæl celler under anvendelse af en standard hæmacytometer. Vurdere cellelevedygtighed fra en fraktion af celleprøven ved hjælp trypanblåt. Plate nok celler til at nå 90% konfluens ved transfektion.
  2. Dag 2: Skift dyrkningsmedium med 2 ml frisk forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium uden PS.
  3. For hver transfektion prøve, forberede to 1,5 ml rør. I røret 1, fortyndes 4 pg DNA i 250 pi reduceret serummedium. I røret 2, bland 10 pi af liposommedieret transfektion reagenset med 250 pi serum-reduceret dyrkningsmedium. Bland forsigtigt transfektionsreagens før brug.
  4. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Kombiner indholdet af røret 1 og røret 2, bland forsigtigt og inkuberes i mindst 20 min ved stuetemperatur.
  6. Tilføj liposomerne / DNA komplekser til dyrkede celler og forsigtigt rock kultur parabol at blande.
  7. Der inkuberes ved 37 ° C under 5% CO2-atmosfære i 24 timer.

3. Farvning af celler til flowcytometri (3 timer)

  1. Forbereder celleprøver
    1. Dag 3: Fjern mediet fra dyrkningsskålen omhyggeligt og vask af cellerne med 400 pi foropvarmet (37 ° C) 0,05% trypsin-1x EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre).
    2. Der tilsættes 400 pi trypsin-EDTA og inkuberes skålen ved 37 ° C under 5% CO2-atmosfære i 5 minutter for at tillade celler at løsne sig fra skålen.
    3. Stop enzymfordøjelse ved tilsætning af 1 ml kold dyrkningsmedium uden PS og udvaske alle cellerne fra overfladen ved pipettering forsigtigt 4-5 gange. Undgå over-fordøjelse og over-pipettering at reducere celledød.
    4. Saml celler i 1,5 ml rør og placere straks på is. Brug iskolde opløsninger og holde cellerne ved 4 ° C for at forhindre internaliseringaf overflade-antigener. Falde belysning at begrænse fotoblegning af det fluorescerende signal.
    5. Centrifugerør ved 400 xg i 5 minutter ved 4 ° C. aspireres og kassér supernatanten forsigtigt.
    6. Re-suspendere pellet i 1 ml phosphatpufret saltvand 1x (PBS) for at forberede en enkelt celle suspension.
    7. Kort Vortex rørene meget forsigtigt og gentage trin 3.1.5 og 3.1.6 til helt at fjerne dyrkningsmediet.
    8. Resuspender pellet i 600 pi 1x PBS og justere cellekoncentrationen til mindst 3 x 10 6 celler / ml.
    9. Opdele cellerne i to nye 1,5 ml rør til ekstracellulær og intracellulær farvning. Medtag passende kontroller til at skelne specifik farvning fra ikke-specifik farvning.
      BEMÆRK: isotypekontrolantistof hjælper vurdere niveauet for baggrunden farvning og bør ideelt matche hver primært antistof er værtsart, isotype og fluorophor. Brug isotypekontrol og konjugeret antistof på sammeproteinkoncentration.

tabel 1
Tabel 1: Flow-cytometri prøver til eksperiment kontrol ikke permeabiliseres og permeabiliseres celler Hvert forsøg skal indeholde følgende negative kontroller:. (1) ikke-transficerede celler (uden antistof, med isotype eller med det konjugerede antistof). (2) Transficerede celler med proteinet af interesse subklonet i et plasmid uden konstitutiv fluorescerende intracellulære fluorochrom (pCMV Ca V α2δ1-HA) eller med den dobbelt mærkede konstruktion (pmCherry-Ca V α2δ1 og inkuberet uden antistof, med isotypen eller med det konjugerede antistof). Enkelt farve kontroller anvendes til erstatning af fluorokrom emission overlap. De samme kontroller køres til ikke-permeabiliserede og permeabiliseres betingelser i hver række eksperimenter.

  1. Celleoverfladefarvning af intaktelevende celler
    1. Aliquot 1 x 10 6 celler / 100 pi i 1,5 ml rør.
    2. Tilsæt FITC-konjugeret monoklonalt anti-HA-antistof ved 5 ug / ml og, vortex før inkubation af cellerne på en vippeplatform (200 rpm) i mørke ved 4 ° C i 45 minutter.
      BEMÆRK: Den optimale koncentration af antistof blev bestemt i præliminære titreringsforsøg (figur 4).
    3. Fjerne cellerne fra det mørke og tilsæt 900 pi 1x PBS / rør. Centrifuger ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    4. Aspirere supernatanten og resuspender pellet i 1 ml 1x PBS, vortex og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    5. Gentag vask (trin 3.2.4) to gange for at fjerne eventuelt ubundet antistof. Hvis der anvendes et ukonjugeret primært antistof, inkuberes med det passende sekundære antistof.
    6. Efter den sidste vask resuspenderes cellerne i 500 pi 1x PBS og overfør enkelt cellesuspension i 5 ml flowcytometri rør. Hold cellens i mørke ved 4 ° C indtil køre prøven.
    7. Kør prøverne på et flowcytometer. For de bedste resultater, analysere cellerne på flowcytometeret snarest muligt og senest 24 timer efter.
  2. Intracellulær Farvning: Fiksering, Permeabilisering, og farvning
    1. Aliquot 1 x 10 6 celler / 100 pi i 1,5 ml rør og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    2. Kassér supernatanten og resuspender cellerne i 100 ul fiksering-permeabilisering løsning direkte fra lager.
    3. Der inkuberes i mørke ved 4 ° C i 20 min.
    4. Tilsæt 100 pi frisk fremstillet 1x permeabilisering-vaskebuffer (fortyndet 10x permeabilisering-vaskepuffer i destilleret H2O). Vortex og sediment-celler under anvendelse af en bordcentrifuge ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    5. Aspirer og kassér supernatanten.
    6. Gentag trin 3.3.4 og 3.3.5.
    7. Tilføj FITC-konjugeret monoklonalt anti-HA-antistof ved 5pg / ml i 100 pi 1x permeabilisering-vaskebuffer, og vortex før inkubering celler i mørke ved 4 ° C i 30 minutter.
      BEMÆRK: intracellulær farvning udføres ved at følge samme procedure som den, der anvendes for celleoverfladefarvning. Saponin-medieret celle permeabilisering er imidlertid et hurtigt reversibel proces, og det er derfor vigtigt at erstatte 1x PBS med 1x Perm / Wash buffer til at holde cellerne i den konstante tilstedeværelse af saponin under intracellulær farvning.
    8. Fjerne cellerne fra det mørke og tilsættes 100 pi permeabilisering-vaskepuffer. Centrifuger ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    9. Aspirer omhyggeligt supernatanten og resuspender pellet i 100 pi permeabilisering-vaskepuffer, vortex og centrifugeres ved 400 xg i 5 min ved 4 ° C.
    10. Gentag vask (trin 3.3.9) endnu en gang for at fjerne eventuelt ubundet antistof.
    11. Efter den sidste vask resuspenderes cellerne i 500 pi 1x PBS og overføre syndenGLE cellesuspensionen til 5 ml flowcytometri rør. Holde cellerne i mørke ved 4 ° C indtil injektion af prøven i flowcytometeret.
    12. Kør prøverne på et flowcytometer. Kør de faste prøver på cytometret så hurtigt som muligt, men ikke senere end 1 uge efter farvning. Kør ikke-permeabiliserede og permeabiliserede celler på samme dag.

4. flowcytometri

  1. Flowcytometer Cell Sorter Daglig Setup
    1. Tænd for flowcytometri software. Før eksperimentere, kalibrere og opsætning flowcytometeret celle sorteringsanlæg for at sikre optimal instrument ydeevne (dvs. laser og optik klarer specifikation, laseren og flow celle er korrekt justeret) ved hjælp af instrument setup perler.
    2. Brug 100 um dyse med 20 psi kappe tryk.
      BEMÆRK: Dysen behøver ikke at blive ændret på en bænk flowcytometer.
    3. Indstil cytometret flow rate i henhold til fremstillingssektorenER specifikation. Overordentlig høje strømningshastigheder vil falde følsomhed ved detektion af ændringer i fluorescens.
    4. Vælg blå (488 nm at ophidse fluorescein Isothiocayanate eller FITC) og gul-grøn (561 nm at ophidse mCherry) lasere. Saml FITC og mCherry fluorescens niveauer med et 530/30 nm og med en 610/20 nm båndpasfilter hhv.
    5. Anskaf den forward scatter (FCS) versus sidespredning (SSC) dot plot for ufarvede celler ved hjælp af lineær skala. Juster hver detektorens amplifikation at visualisere celler i nederste venstre kvadrant af dot plot.
  2. Prøvelæsning af intakte ikke-permeabiliserede celler
    1. Indstil P1gate for levende ikke-permeabiliserede celler ved afgrænse en fri form omkring cellerne, der skal analyseres eksklusive cellerester og celleaggregater, hvilket begrænser fluorescenssignalet til intakte celler.
      BEMÆRK: Levende / døde udelukkelse farvestoffer kan anvendes til at lette gate placering på levende celler. Indstil 10.000 begivenheder til at optagei indstilling gate P1. Sæt denne til et større antal hændelser, hvis nødvendigt.
    2. Erhverve mCherry versus FITC to-parameter kontur plot til påvisning baseline autofluorescens af ufarvede celler. Brug bi-logaritmisk skala for at vise negative værdier og forbedre opløsning mellem befolkningerne 25. Juster hver detektor spænding for at indstille de ufarvede negative celler i den nedre del af de første ti enheder af log fluorescensintensitet plots.
    3. Erhverve alle intakte ikke-permeable prøver ved hjælp af indstillinger, der er etableret i 4.1.5 og 4.1.6 og indsamle FSC, SSC og signaler i fluorescens detektorer.
    4. Eksport og gemme * .fcs filer, der skal anvendes til analyse under anvendelse af flowcytometri analyse software.
  3. Prøve Aflæsning af permeabiliserede celler
    1. Flyt P1 porten til at vælge levende celler i de permeabiliserede prøver og justere FSC og SSC spænding som vist i 4.1.5 og 4.1.6.
    2. Erhverve alle permeabiliserede prøver og indsamle FSC, SSC ennd signaler i fluorescens detektorer.
    3. Eksport og gemme * .fcs filer, der skal anvendes til analyse under anvendelse af flowcytometri analyse software.
  4. Dataanalyse
    1. Start flowcytometri analyse software og import * .fcs filer gemt i 4.2.4 og 4.3.3.
    2. Klik på første prøve, der er anført i arbejdsområdet vinduet. Et nyt vindue opkaldt efter røret ID-nummeret åbnes automatisk. Start gating proces i plot af SSC versus FSC. Tegn en port (P1) ved hjælp af Ellipse ikonet omkring levende celler og fjerne eventuelle rester, døde celler, eller aggregater, som har forskellig forward scatter og side scatter end levende celler
    3. For at tegne de to-parameter kontur plot af mCherry (y-aksen) versus FITC (x-aksen) fluorescensintensitet af de levende celler, skal du klikke først på x-aksen og vælg FITC-En kanal og derefter klikke på y aksen og vælg PE-mCherry-En kanal. Klik på ikonet "Quad" for at placere kvadrant markør på kanten af ​​enutofluorescent celler i hver fluorescens kanal.
      BEMÆRK: Porten sat omkring FITC og mCherry positive celler er P2 port. Fluorescensen negative cellepopulation benævnt P3 gate. Se Figur 5 for repræsentative gating metode, der anvendes i denne artikel.
    4. Vælg P2 og P3 porte, og klik på "Tilføj Statistik" ikonet i det oprindelige arbejdsområde vinduet. Klik på "Count" (antal positive celler) og klik på "Mean" (Middel Fluorescens Intensiteten af ​​hver fluorokrom) eller "Median" (Median Fluorescence intensitet hver fluorokrom) statistik blandt listen over indstillinger. Klik på "Tilføj Statistics" ikonet igen. Alle disse værdier overføres automatisk til det oprindelige arbejdsområde vinduet.
      BEMÆRK: "betyde" bruges kun hvis fluorescensintensiteten følger en normalfordeling. I alle andre tilfælde, skal du klikke på "Median" fanen. MFI således kunne henvise til Mean Fluorescence Intensity eller Median Fluorescence Intensitet.
      BEMÆRK: Det næste skridt er at anvende Gates parametre og statistik til alle prøver sonderet af cytometret.
    5. I arbejdsområdet vinduet, bruge musen til at trække og slippe porte og statistik parametre på linie mærket alle prøver.
    6. Generere en batch rapport af todimensionelle kontur plots (mCherry vs FITC) og histogrammer (celletal versus fluorescensintensitet) for ikke-permeabiliserede og permeabiliserede celler (figur 6A - B).
    7. Fra de statistikker, der genereres i trin 4.4.4, beregne den gennemsnitlige fluorescensintensitet (MFI) for hver fluorokrom for de farvede celler. Fra denne værdi, trække MFI-værdi opnået fra ufarvede celler at kvantificere overfladen og samlede ekspression af proteinet af interesse.
    8. Rapporter de ΔMFI værdier for hver fluoroforen (mCherry og FITC) (Figur 6C - D). Normalisere ΔMFI målt for Ca BEMÆRK: Den absolutte værdi af fluorescensintensitet kunne variere kraftigt afhængigt af batch af antistoffer og de tekniske evner hver lab arbejdstager, hvorfor det er nødvendigt at normalisere fluorescensintensiteten af ​​mutant konstruktion ved hjælp af WT konstruktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikel beskrives en pålidelig protokol til at kvantificere totale og celleoverfladen af ​​rekombinante ionkanaler udtrykt i Tsa-201cells af en tofarvet flowcytometri assay. Som et eksempel blev den relative celleoverfladen og totalt protein ekspression kvantificeres for Ca V α2δ1subunit. For at udføre den tofarvede flowcytometri assay blev Ca V α2δ1 dobbelt mærkede at udtrykke en ekstracellulær ikke-fluorescerende epitop HA, der kan påvises ved en anti-HA FITC-konjugeret antistof og en konstitutiv fluorescerende intracellulær mCherry fluorofor. Den excitation og emission spektre for FITC og mCherry viser, at FITC er begejstret med 88% effektivitet ved 488 nm laser, men effektiviteten falder til 0% med 561 nm laser. Den mCherry viser 63,9% af den maksimale fluorescens ved excitation med 561 nm laser, men kun 7,6% med 488 nm laser (figur 3). Den excitation og emission spectra for begge fluoroforer udviser optimal lys indsamling og minimal overlapning med de forskellige lasere og filtre valgt. Flowcytometri assays kunne give kvantitative oplysninger om den relative ekspression af membranproteiner fra en stor cellepopulation så længe MFI for den givne fluorochrom er direkte proportional med det protein ekspression af Ca V α2δ1 på hver celle i stedet for antallet af fluorescerende celler. Dette indebærer anvendelse af en koncentration af fluorescens-konjugeret antistof ud over mætning. Titreringskurven for det anti-HA FITC-konjugeret antistof-binding til Ca V α2δ1 (figur 4) viser tre faser. Mens ingen fluorescens blev påvist i den første fase, fluorescensintensiteten steg eksponentielt med stigende antistofkoncentration i den anden fase. Efter mætningspunktet (tredje fase), forøgelse af koncentrationen af ​​antistoffet har ingen virkning på den relative fluorescens Intensity (RFI) FITC. Den anti-HA FITC-konjugeret antistof mætningspunkt blev fastsat til 5 pg / ml, hvilket sikrer, at koncentrationen af ​​det konjugerede-antistoffet ikke er begrænsende for MFI under forsøgene.

Den mærkede Ca V α2δ1was udtrykt i TSA-201cells og flowcytometri blev udført i nærvær af FITC-konjugeret anti-HA i ikke-permeabiliserede celler (figur 5). Passende kontroller (tabel 1) blev analyseret på flowcytometeret der attributter xy værdier til hver celle passerer gennem laserstrålen. Fordelingen celle er visualiseret på dot plots (figur 5A). FCS / SSC dot plots bekræfter, at fremstillingen af celleprøver indeholder en enkelt cellesuspension med høj levedygtighed (figur 5Ba). Den valgte port for levende celler (P1) udgør 75% af det samlede antal analyserede celler. Det totale protein ekspression of Ca V α2δ1 i Tsa-201 celler blev anset for at være proportional med den mCherry fluorescens. Som set i mCherry versus FITC kontur plots og histogrammer (Figur 5BB - BC) 47 2% TSA-201-celler transficeret med pmCherry-Ca V α2δ1-HA blev fundet at ekspression af signifikant mCherry fluorescens samt vise betydelig FITC fluorescens som følge af bindingen til den eksterne HA-mærke af Ca V α2δ1 i ikke-permeabiliserede celler. Negative kontrolforsøg udføres uden antistof eller med isotypen viser, at FITC kun binder eller hovedsagelig til de positivt transficerede celler.

Denne protokol blev anvendt til at karakterisere rollen af N-glycosylering på total og celleoverfladeekspression af Ca V α2δ1 i Tsa-201cells 23. Eksperimenter blev udført i ikke-permeabiliserede celler til at vurdere celleoverfladeekspressionog i permeabiliserede celler at vurdere det samlede proteinekspression samt bekræftelse tilgængeligheden af ​​HA-epitopen. Relativ udtryk for Ca V α2δ1 blev beregnet baseret på MFI estimeret for hver fluoroforen (mCherry eller FITC). ΔMFI værdier for mutanterne blev normaliseret til den maksimale målte værdi samme dag for mCherry-Ca V α2δ1-HA WT udtryk under de samme betingelser. Dette er vigtigt at tage højde for variationer over tid i den absolutte fluorescensintensiteten af ​​anti-HA FITC konjugeret antistof. Som det ses i figur 6A, den ΔMFI for FITC i ikke-permeabiliserede celler var stærk for WT og 4xNQ konstruere men tæt på baggrundsfluorescensen niveauet for 16xNQ konstruktionen indikerer, at proteinet er næsten fraværende fra plasmamembranen. Assays udført efter celle permeabilisering, viste, at total protein ekspression af 16xNQ konstruktionen blev også signifikant reduceret, om detblev udledes af FITC fluorescens i permeabiliserede celler eller fra den konstitutive mCherry fluorescens målt i ikke-permeabiliseret og i permeabiliserede celler (figur 6C - D). Som det ses i figur 6B, de cellulære autofluorescens niveauer steg efter celle permeabilisering, hvilket forhindrer sammenligning af de absolutte fluorescens værdier mellem intakte ikke-permeabiliserede og permeabiliserede celler. Den ΔMFI fluorescens målt for mCherry var ens for både ikke-permeabiliserede og permeabiliserede celler der betyder, at permeabilisering løsning ikke ændrer den relative fluorescens signal mCherry. Mutationer af N-glycosyleringssteder var forbundet med et fald i fluorescens-intensiteten for mCherry støtter den offentliggjorte observation, at proteinet biogenese / stabilitet blev reduceret 23. I denne række eksperimenter, den relative fluorescens signal for FITC målt i permeabiliserede celler viste sig at be endnu mindre end den relative signal for mCherry antyder, at N-type glycosylering status af proteinet kunne påvirke fluorescensintensiteten detekteres af FITC-konjugeret anti-HA-antistof i det ekstracellulære domæne. Helt ændringerne i den relative fluorescens af FITC Før Efter celle permeabilisering tilvejebringe en pålidelig parameter for at kvantificere proteinekspression.

Figur 3
Figur 3: FITC og mCherry danner et passende par fluorokromer for tofarvede cytometri analyser Excitation (tomme kurver) og emission spektre (fyldte kurver) for FITC ophidset med 488 nm blå laser (Aa) og mCherry ophidset med 561 nm gul-. grøn laser (Ab). FITC og mCherry fluorescens blev indsamlet med en 530/30 nm og en 610/20 nm bandpass filtrerer hhv. Bølgelængden af ​​de forskellige lasere (farvede vertikale linjer) og filtrene (farvede rektangler) er valgt for optimal lys indsamling og minimal overlapning. (B) Skematisk fremstilling af mCherry-Ca V α2δ1-HA-proteinet. Ca V α2δ1 blev dobbelt tagged at udtrykke en ekstracellulær ikke-fluorescerende epitop HA, der kan påvises ved en anti-HA FITC-konjugeret antistof og en konstitutiv fluorescerende intracellulær mCherry fluorokrom. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Titrering af anti-HA FITC-konjugeret monoklonalt antistofbinding til Ca V α2δ1 TSA-201-celler blev transient transficeret med pmCherry-Ca V & # 945; 2δ1-HA og inkuberet med en række anti-HA FITC-konjugerede eller isotype antistoffer. Kun FITC signal, der analyseres i dette panel. (A) Single-parameter histogrammer viser det relative antal celler på y-aksen og FITC fluorescensintensitet på x-aksen for anti-HA FITC-konjugeret antistof koncentrationsinterval (0,01-20 ug / ml). (B) Delvis log graf for anti-HA FITC-konjugeret antistof som en funktion af MFI på FITC. Den titreringskurve blev monteret ved hjælp af One site Bindende ligning med en tendenslinje værdi R2 = 0,99561. Titrering udført for isotype antistof viste ingen fluorescens som forventet. Koncentrationerne fra 0,001 til 0,01 mg / ml ikke kan skelnes fra baggrundsstøj. Klik her for at se en større version af dette tal.

1 "> Figur 5
Figur 5: Repræsentativ flowcytometri analyse af ikke-permeabiliserede TSA-201cells transficeret med pmCherry-Ca V α2δ1-HA (A) Skematisk repræsentation af gating-strategi anvendes i flowcytometrianalyse prøve.. Data blev analyseret efter erhvervelsen med den relevante software. Den første gating strategi udnytter en forward scatter (FSC) og sidespredning (SSC) dot plot for at vise en port (P1) omkring levende celler og fjerne eventuelle rester, døde celler, eller aggregater, som har forskellig forward scatter og side scatter end levende celler . To-parameter kontur afbildninger af mCherry (y-aksen) versus FITC (x-aksen) fluorescensintensitet blev vist for P1 befolkning. Rektangulære porte blev placeret på kanten af ​​den autofluorescens af celler til at vælge den positive population P2 (FITC og mCherry) og den negative befolkning P3. Niveauet af fluorescens til than celler i regionen P2 og P3 blev visualiseret under anvendelse efterfølgende celletal versus FITC eller mCherry fluorescensintensitet single-parameter histogrammer. Et skift i fluorescensintensiteten på y- og x-aksen giver en pålidelig indeks for den samlede og membranen ekspression af Ca V α2δ1 hhv. Intensiteten af ​​fluorescenssignalet forøges som funktion af antallet af fluorokrom-molekyler. (Ba) Repræsentant FCS / SSC dot grunde til hver tilstand som anført. I alt 10.000 hændelser blev erhvervet til analyse. Den ellipse port (P1) er tegnet af øjet omkring levende celler eksklusive events med lav FSC (døde celler) eller høje SSC (aggregater). (Bb) Repræsentative to-parameter kontur afbildninger af mCherry (y-aksen) versus FITC (x-aksen) fluorescensintensitet. Gates blev placeret på kanten af autofluorescens af cellerne til at adskille populationer af FITC-mCherry positive celler (P2 gate ) og negative fluorescerende celler (P3). (Bc) Single-parameter histogrammer for relativ count (eller% af max) celler versus fluorescensintensitet (FITC eller mCherry). Fordelingen af fluorescensintensiteten målt for celler i P2 gate (fluorescens-positive celler) er vist i gråt, og fordelingen af fluorescensintensitet for celler til stede i P3 gate (fluorescens-negative celler) vises som en overlejring i et gennemsigtig grå plot. Som det ses, fluorescensintensiteten var stærk for både mCherry og FITC indikerer, at Ca V α2δ1 er godt udtryk og klart til stede på cellemembranen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6: Samtidige mutationer af N -glycosylation sites forstyrret celleoverflade expression af Ca V α2δ1. Stabile TSA-201 Ca V p3 celler blev transient transficeret samtidig med pCMV-Ca V 1,2 vægt og pmCherry-Ca V α2δ1-HA WT eller mutanter. Ikke-permeabiliserede (A) og permeabiliserede celler (B) blev farvet med anti-HA FITC-konjugeret antistof som beskrevet ovenfor. Repræsentative to-parameter kontur plots af mCherry versus FITC fluorescens (venstre paneler) og histogram plots af fordelingen af fluorescensintensiteten for anti-HA FITC konjugeret antistof-farvning (højre paneler) er vist for N -glycosylation mutanter (NQ) efter afbrydelse af fire steder (4xNQ: N92Q / N184Q / N468Q / N876Q) og 16 steder (16xNQ: N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q / N986Q) i intakte ikke-permeabiliseres eller NP-celler (A) og i permeabiliserede eller P-celler (B). Den distribution af fluorescensintensiteten målt for celler i P2 gate (fluorescens-positive celler) er vist i gråt, og fordelingen af fluorescensintensitet for celler til stede i P3 gate (fluorescens-negative celler) vises som en overlejring på en gennemsigtig grå plot. Som det ses i (B), de autofluorescens niveauer steg efter celle permeabilisering. Fluorescensintensiteten for FITC måles for alle transficerede permeabiliserede celler forøget (set som en højre-forskydning på x-aksen) viser, at alle transficerede HA-mærket Ca V α2δ1 proteiner blev farvet og detekteres af anti-HA FITC-antistof. (C) Søjlediagram viser den normaliserede MFI målt i nærvær af FITC i intakt ikke-permeabiliserede (overfladeekspression) eller permeabiliserede celler (total ekspression). Den relative fluorescens densitet blev målt i triplikater for hver betingelse (30.000 celler) og i tre forskellige batches af celler transfected over en periode på 1 måned fremme dataene er vist som middelværdien ± SEM for 90.000 celler for hver betingelse. Den maksimale fluorescensintensitet blev nået mellem 24 og 36 timer efter transfektion. De ΔMFI værdier for FITC målt i intakte ikke-permeabiliserede celler blev anvendt som et indeks for celleoverfladeekspression af Ca V α2δ1-HA, og ΔMFI værdier for FITC målt i permeabiliserede celler afspejler det totale protein-ekspression (celleoverfladen og intracellulært protein ekspression ). ΔMFI for FITC blev beregnet ved at fratrække FITC fluorescens intensiteten af ​​FITC-negative celler (P3) fra fluorescensintensiteten den FITC positive celler (P2). Samme metode blev anvendt til at beregne ΔMFI for mCherry. MFI-værdier blev normaliseret til det maksimale målte værdi samme dag for mCherry-Ca V α2δ1-HA WT. (D) Bar graf viser den normaliserede ΔMFI mCherry målt i ikke-permeabiliseret eller permeabiliserede celler (total ekspression). Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± SEM Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne flowcytometri-baseret assay blev anvendt med succes til måling af relativ total og celleoverflade- niveauerne af fluorescens-mærkede poredannende og tilhørende underenheder af spændingsafhængige calciumkanaler 14,22,26. Det er bedst anvendes i forbindelse med undersøgelse af virkningen af ​​genetiske mutationer og kræver således, at den iboende fluorescens intensiteten af ​​den fluorescens-mærkede mærket vildtype-konstruktionen være mindst 10 til 100 gange større end for fluorescensintensiteten af ​​den fluorescens-mærkede umærket konstrukt . I dette særlige eksempel mCherry-Ca V α2δ1-HA-konstruktionen beskrevet heri gav et større signal til støjforhold og et større dynamikområde end hvad blev målt for den tidligere offentliggjorte Ca V 1.2-HA og Ca V 2.3-HA-konstruktioner. Der er mange tænkelige grunde til. Det kan spekuleres, at det lokale miljø af HA-epitopen i det ekstracellulære domæne af Ca V &# 945; 2δ1 protein maksimerer signal-støjforhold af FITC-konjugeret anti-HA-antistof.

Desuden er det vigtigt at huske på, at denne metode ikke giver en absolut værdi af antallet af proteiner på celleoverfladen. Den relative udtryk for mærkede konstruktion kræves for at opnå funktionel kanal udtryk kan opnås alligevel ved at udføre side om side patch-clamp og flowcytometri eksperimenter under de samme betingelser som vist i figur 7 i henvisning 22. Ud fra disse data kan det anslås, at toppen strømtæthed, en global mål for ionkanalaktivitet, øges generelt som en funktion af overfladen ekspression af det mærkede Ca V α2δ1 underenhed. Den største begrænsning i denne aktuelle celleoverfladeekspression assay er, at det ikke kan anvendes på dette tidspunkt til studiet af endogene ionkanaler. Dette skyldes det faktum, at nogle kommercielt tilgængelige antistofferer kendt for specifikt at binde til forudsagte eksterne domæner af ionkanaler. Det kræver således genetisk manipulation af den primære sekvens af proteinet, der skal undersøges udtrykkes i en udifferentieret rekombinant cellelinie, såsom TSA-201 celler.

Kritiske trin i optimeringen af ​​assayet: Identifikationen af ​​den passende par fluoroforer, valget af den eksterne epitop, og lokaliseringen af ​​indsættelsesstedet er afgørende for succesen af ​​denne metode, fordi indsættelsen af ​​epitopen ikke bør gribe ind i proteinfunktion. Forskellige fluoroforen kombinationer blev testet. To eksterne epitoper: hæmagglutinin (HA) epitop (YPYDVPDYA) og bungarotoxin-binding-site epitop (WRYYESSLEPYPD) 27 og tre uigennemtrængelige fluorescerende konjugerede antistoffer blev evalueret, nemlig FITC (fluorescein isothiocyanat) -, R-phycoerythrin -, og de PE-Cy7- konjugeret-antistoffer. Desuden mere end 10 forskellige indsættelselokaliteter til eksterne HA epitop blev testet inden Ca V α2δ1. I indsættelsen af ​​epitopen, der kræver steddirigeret mutagenese og rekombinante DNA-teknikker, anbefales det at udforme mindst tre sæt af primere inden for samme region. Med 9 rester, HA-epitopen er en af ​​de mindre epitoper for hvilke der findes kommercielt tilgængelige fluorescerende-konjugerede antistoffer, men succesraten for at indsætte 27 nukleotider er lavere end for punktmutation. Tetracysteine motiver (resterne Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys) er 2-rest mindre end HA-epitopen men fluorescein arsenical hairpin bindemiddel er membranpermeerende og ikke egnet til analyse af membranbundne proteiner 28. Indledende eksperimenter blev udført med to intracellulære fluorophorer mCherry og grønt fluorescerende protein (GFP). Tre kriterier blev anvendt til at skelne den vellykkede par fluoroforer med ionkanaler: 1) emission spektre af de fluoroforer behovikke at overlappe (se referencer 20,21 for detaljer); 2) ekspression af det mærkede konstrukt genererer funktionelle ionkanal i rekombinante celler som er valideret af standard elektrofysiologiske metoder; og 3) ekspression af kontrol-konstruktionen frembringer en robust fluorescerende udlæsning. Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt, for eksempel hvis insertion af fragmentet eller fluoroforen forstyrrer kanal funktion, må man gå tilbage til udgangspunktet og ændre enten insertionsstedet af den ydre epitop og / eller indsættelsesstedet af fluoroforen. En linker af 5-glutaminrester mellem C-terminalen af ​​proteinet og fluorophoren kan bidrage til at forbedre proteinfunktion. Derudover kan det hjælpe at isætte en ekstern epitop i store løkker, som ikke vides at spille en kritisk rolle i proteinfunktion og / proteinglycosylering. Man skal også være opmærksom på mindre tekniske aspekter.

Succesraten af ​​liposommedieret transffdeling i Tsa-201 celler kunne reduceres efter indsættelsen af de to epitoper inden Ca V α2δ1. foreslås det derfor at rekalibrere transfektionseffektiviteten med de hidtil ukendte DNA-konstruktioner. Dette sker, fordi indsættelsen af ​​en 30 kDa-protein ændrer molekylvægten af ​​DNA'et. Man kunne modificere DNA til liposomer forhold til 1: 2 til 1: 3 om nødvendigt eller inkuber cellerne ved 37 ° C i en længere periode (24-72 timer). Det er vigtigt at vælge den rigtige formulering til permeabilisering af cellerne. De fleste hjemmelavede løsninger appraised til dette projekt viste sig at bevirke, at cellerne aggregerer og tilstoppe flowcytometeret.

Bremse lyseksponering mens farvning af cellen med fluoroforen konjugeret antistof er vigtigt at begrænse fotoblegning og tab af signal. For at minimere fluorescerende baggrund, er det vigtigt at centrifugere overskuddet af konjugeret antistof før brug. Endelig er det af yderste vigtighed at analysere than celler på flowcytometeret snarest muligt som og senest 24 timer efter. Holde de farvede celler natten over ved 4 ° C vil sandsynligvis reducere signalet og forringe celleoverlevelse. Variationer i den iboende fluorescens fra fluoroforen-konjugerede antistof fra batch til batch diktere, at fluorescensintensiteten af ​​testen konstruktionen skal rapporteres som en funktion af fluorescensintensiteten af ​​kontrol-konstruktionen udtrykkes under identiske eksperimentelle betingelser.

For at opnå en samlet godt signal-støj-forhold, anbefales det at minimere celle pipettering at reducere celledød og til forsigtigt at opblande cellerne, således at en 3 x 10 6 celler / ml injiceres i flowcytometeret. Pas, at en højere koncentration celle vil reducere cellens flow og kunne tilstoppe flowcytometeret. På den anden side vil en lavere cellekoncentration kræver en længere behandlingstid. Man kan således have at indstille koncentrationen afhængig af type af celler, der skal analyseres.

Alternative assays: Yderligere metoder sættes ind for at dokumentere forekomsten af ​​ionkanaler ved celleoverfladen plasmamembranen fald i fire store kategorier: 1) Konfokal imagografimetoder udnytter den høje affinitet interaktion mellem fluoroforen-konjugerede antistoffer og målproteinet; 2) Protein kemiteknikker hvilende på kovalent modifikation af målproteinet ved biotinyleringsbetingelserne reagenser; 3) Elektrofysiologiske foranstaltninger af ikke-stationære støj analyse; og 4) fotoaffinitetsmærkning af målproteinet med radioaktive prober. I tilfælde af spændingsstyret calciumkanal, fotoaffinitetsmærkning med tritieret (±) - [3H] PN 200-100, en høj-affinitetsligand af dihydropyridin familien blev udbredt i 1980'erne 31. Det er fortsat en yderst følsom analyse, men involverer manipulation af radioaktivt materiale 31, som er faldet ud af mode efter fremkomstenaf meget følsomme fluorescens og luminescens sonder især med yngre efterforskere. Desuden er det umuligt at måle ionkanalaktivitet i nærvær af antagonisten, således at sammenhængen mellem overfladeekspression og funktion er uden for rammerne af denne fremgangsmåde. I den anden ende af den eksperimentelle kontinuum, ikke-stationære støj analyse af ionkanaler kræver høj kvalitet gigaseal patch-clamp optagelser med stabil baseline for minut-lange optagelser. Med denne fremgangsmåde kan man udvinde antallet af åbne ionkanaler i en enkelt celle fra hældningen af den grafiske afbildning støjvariansen som en funktion af den gennemsnitlige strøm målt på et givet potentiale 32-34. Det viser de samme staffage af standard elektrofysiologiske metoder. Det er en arbejdskrævende og lav throughput metode, der kræver desuden en god fortrolighed med spektralanalyse 32-34, ikke et dagligt syn i cellebiologer. Desuden er denne type analysis identificerer antallet af aktive ionkanaler (i den åbne tilstand), som kan være anderledes end antallet af totale proteiner på membranen. Mærkning af celleoverfladeproteiner med biotin reagenser er et relativt effektivt redskab til at identificere proteiner, der findes i plasmamembranen. Denne metode udnytter covalent modifikation af membranproteiner ved biotin og yderligere med høj affinitet og høj specificitet ikke-kovalent binding af biotin til membran-impermeabel streptavidin eller avidin molekyler. Denne tilgang er kvalitativt, men er hæmmet eller begrænset af kvantificering spørgsmål jævnligt forbundet med at afsløre proteiner ved hjælp af Western blot teknik. Konfokal afbildning og dets derivater er almindeligt anvendt til at dokumentere co-lokalisering af membranproteiner med celleoverfladen 35. Kvalitativ plasmamembran isolation fortsat er mulig ved anvendelse af differentialcentrifugering teknikker med eller uden saccharosegradient 36. Som i den ovenfor beskrevne flowcytometri ASSAy, det er afhængig af den meget specifikke interaktion mellem målproteinet og en fluorofor-konjugeret antistof. Samlet indre refleksion fluorescens billeddannelse i særdeleshed, er en kraftfuld metode, der kunne rapportere distribution og molekylær opførsel af enkelte ionkanaler på membranens overflade 37,38. Udlæsningen er absolut iøjnefaldende, men er stadig en lav-throughput små mængder tilgang. Alle disse analyser har deres videnskabelige værdi. Den high-throughput flowcytometri-baserede assay er overlegen i forhold til udlæsning reproducerbarhed og kvantificerbare målinger men kræver let adgang til multi-laser flowcytometri celle sorteringsanlæg, der er en del af core faciliteter i store institutioner. Fluorescens-baserede pladelæsere billigere og mere tilgængelige, men signal-støj-forhold opnåede målt med de samme konstruktioner under de samme eksperimentelle betingelser var signifikant lavere skyldes i vid udstrækning til en højere fluorescens baggrund. Udgifter fluoroforen-konjugeret ettibodies kan også tages med i overvejelserne især på grund af antallet af egnede kontroleksperimenter, der skal behandles med test- konstruktionerne. Variationer over samme tema omfatter ændrer det fluorescerende farvestof antistof til cost-effektive peberrod peroxidase eller alkalisk fosfatase enzym reporter antistoffer, som enzymaktivitet kan analyseres ved kemiluminescens 29,30.

Konklusion: To-color fluorescens assays blev udviklet for at estimere den relative celleoverfladeekspression af rekombinante proteiner udtrykt i dyrkede celler under anvendelse flowcytometre. Selvom kun to fluorescerende parametre blev anvendt i denne aktuelle assay flowcytometri kan underkastes den samtidige detektion af mere end 30 fluorescerende prober på en enkelt celle, hvilket viser den høje fleksibilitet af denne fremgangsmåde. Denne high-throughput ultrasensitiv assay kan tilpasses til at undersøge effekten af genetiske mutationer 22,26 eller posttranslationelle modifications 23, samt at studere den farmakologiske profil af chaperoner til overfladen handel med membranproteiner teknikker 39. Drivkraften bag denne protokol opstod fra behovet for at evaluere isoleret virkningen af ​​genetiske mutationer på membranen udtryk for ionkanaler i rekombinante celler. Det er dog vigtigt at bemærke, at sværhedsgraden af mutant kanal dysfunktion hos model-cellelinjer ikke altid korrelerer med sværhedsgraden af kliniske symptomer hos mutationsbærere 5 delvis fordi en kombination af mutationer i forskellige alleler kan være påkrævet for at udløse pludselig hjertedød 40 , 41. I den forbindelse kan dette assay ses som at give en hurtig første trin tilnærmelse af studere enkelte eller multiple mutationer i et enkelt gen forbundet med tab-af-funktion-mutationer 22. Det er dog sandsynligt at forestille i fremtiden virus-medieret ekspression af de samme konstruktioner i differentierede celler af cardiomyocyte afstamning. Samlet set i forhold til andre billeddannende eller luminescerende teknikker, flowcytometer sorteringsanlæg håndtere levende celler i suspension og rapport fluorescensintensitet en homogen cellepopulation. Denne proces sker uden behov for fiksering med paraformaldehyd, en proces, der inducerer lokal plasma membranpermeabilisering, selv under milde betingelser 42. Assayet er hurtigt, specifikt og praktisk med analysen af ​​op til flere hundrede prøver pr arbejdsdag. Foruden analyse kan cellerne med tiden blive sorteret ved flowcytometri til at vurdere den funktionelle potentiale celler, der udtrykker højere eller lavere niveauer af den samme membran-protein.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523).
Tubes 1.5 ml Sarstedt 72-690-001
Tubes 15 ml  Sarstedt  62-554-002
Disposable graduated Tranfer Pipets  VWR 160001-192 
100 mm culture dish Corning 430167 For standard culture of HEKT cells.
35 mm culture dish Falcon 353001 For standard culture of HEKT cells.
Serological pipette 1 ml Sarstedt 86.1251.001
Serological pipette 5 ml Sarstedt 86.1253.001
Serological pipette 10 ml Sarstedt 86.1254.001
Serological pipette 25 ml Sarstedt 86.1285.001
Dulbecco's high-glucose medium Life Technologies 12100-046 Warm in 37 °C water bath before use.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin Life Technologies 16140-071
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Life Technologies 15140-122
Lipofectamine 2000  Life Technologies 11668-019 For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Life Technologies 31985-070 Warm in 37 °C water bath before use.
Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red Life Technologies 25300-062
1.5 ml microtubes Sarstedt 72.690.001
 Phosphate Buffered Saline 1x Fisher BP661-10 Can be "home-made".
Anti-HA FITC conjugated antibody Sigma H7411
IgG1−FITC Isotype Control antibody Sigma F6397
BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit BD Biosciences 554714 Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C.
Hemacytometer Fisher 49105161
Trypan Blue Fisher 15250061 To access cell viability.
Refrigerated Microcentrifuge, 5430R Eppendorf  A14H172200
Forma Steri-Cycle CO2 Incubator Fisher 370
Laboratory Platform Rocker Fisher 545034
Water Bath VWR 89032-216
BD FACSARIA III  BD Biosciences 648282 Flow cytometer.
FlowJo Software v10 FlowJo FlowJo v10 Dongle For data analysis.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Delisle, B. P., Anson, B. D., Rajamani, S., January, C. T. Biology of Cardiac Arrhythmias: Ion Channel Protein Trafficking. Circ. Res. 94, 1418-1428 (2004).
  2. Birault, V., Solari, R., Hanrahan, J., Thomas, D. Y. Correctors of the basic trafficking defect of the mutant F508del-CFTR that causes cystic fibrosis. Curr Opin Chem Biol. 17, 353-360 (2013).
  3. Balijepalli, S. Y., Anderson, C. L., Lin, E. C., January, C. T. Rescue of Mutated Cardiac Ion Channels in Inherited Arrhythmia Syndromes. J. Cardiovas Pharm. 56, 113-122 (2010).
  4. Gargus, J. J. Unraveling Monogenic Channelopathies and Their Implications for Complex Polygenic Disease. Am. J. Hum. Genet. 72, 785-803 (2003).
  5. Abriel, H., Zaklyazminskaya, E. V. Cardiac channelopathies: Genetic and molecular mechanisms. Gene. 517, 1-11 (2013).
  6. Behr, E. R., et al. Sudden arrhythmic death syndrome: familial evaluation identifies inheritable heart disease in the majority of families. Eur Heart J. 29, 1670-1680 (2008).
  7. Catterall, W. A. Structure and regulation of voltage-gated Ca2+ channels. Annu. Rev. Cell Dev.Biol. 16, 521-555 (2000).
  8. Peterson, B. Z., DeMaria, C. D., Adelman, J. P., Yue, D. T. Calmodulin is the Ca2+ sensor for Ca2+ -dependent inactivation of L- type calcium channels. Neuron. 22, 549-558 (1999).
  9. Dolphin, A. C. Calcium channel diversity: multiple roles of calcium channel subunits. Curr.Opin.Neurobiol. 19, 237-244 (2009).
  10. Dai, S., Hall, D. D., Hell, J. W. Supramolecular assemblies and localized regulation of voltage-gated ion channels. Physiol Rev. 89, 411-452 (2009).
  11. Gao, T., et al. Identification and subcellular localization of the subunits of L-type calcium channels and adenylyl cyclase in cardiac myocytes. J. Biol. Chem. 272, 19401-19407 (1997).
  12. Carl, S. L., et al. Immunolocalization of sarcolemmal dihydropyridine receptor and sarcoplasmic reticular triadin and ryanodine receptor in rabbit ventricle and atrium. J. Cell Biol. 129, 673-682 (1995).
  13. Abriel, H., Rougier, J. S., Jalife, J. Ion Channel Macromolecular Complexes in Cardiomyocytes: Roles in Sudden Cardiac Death. Circ. Res. 116, 1971-1988 (2015).
  14. Bourdin, B., et al. Molecular Determinants of the Cavb-induced Plasma Membrane Targeting of the Cav1.2 Channel. J. Biol. Chem. 285, 22853-22863 (2010).
  15. Raybaud, A., et al. The Role of the GX9GX3G Motif in the Gating of High Voltage-activated Calcium Channels. J. Biol. Chem. 281, 39424-39436 (2006).
  16. Burashnikov, E., et al. Mutations in the cardiac L-type calcium channel associated with inherited J-wave syndromes and sudden cardiac death. Heart Rhythm. 7, 1872-1882 (2010).
  17. Hennessey, J. A., et al. A CACNA1C Variant Associated with Reduced Voltage-Dependent Inactivation, Increased Cav1.2 Channel Window Current, and Arrhythmogenesis. PLoS ONE. 9, e106982 (2014).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Graham, M. D. The Coulter Principle: Foundation of an Industry. J. Lab. Autom. 8, 72-81 (2003).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243, 77-97 (2000).
  21. Rothe, G. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Sack, U., Tarnok, A., Rothe, G. , Karger. Basel. 53-88 (2009).
  22. Bourdin, B., et al. Functional Characterization of Cavalpha2delta Mutations Associated with Sudden Cardiac Death. J. Biol. Chem. 290, 2854-2869 (2015).
  23. Tetreault, M. P., et al. Identification of glycosylation sites essential for surface expression of the Cavalpha2delta1 subunit and modulation of the cardiac Cav1.2 channel activity. J. Biol. Chem. 291, 4826-4843 (2016).
  24. Senatore, A., Boone, A. N., Spafford, J. D. Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells. J Vis Exp. (47), (2011).
  25. Herzenberg, L. A., Tung, J., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Parks, D. R. Interpreting flow cytometry data: a guide for the perplexed. Nat.Immunol. 7, 681-685 (2006).
  26. Shakeri, B., Bourdin, B., Demers-Giroux, P. O., Sauve, R., Parent, L. A quartet of Leucine residues in the Guanylate Kinase domain of Cavbeta determines the plasma membrane density of the Cav2.3 channel. J Biol Chem. 287, 32835-32847 (2012).
  27. Morton, R. A., Baptista-Hon, D. T., Hales, T. G., Lovinger, D. M. Agonist- and antagonist-induced up-regulation of surface 5-HT3A receptors. Br. J. Pharmacol. 172, 4066-4077 (2015).
  28. Hoffmann, C., et al. Fluorescent labeling of tetracysteine-tagged proteins in intact cells. Nat. Protocols. 5, 1666-1677 (2010).
  29. Cockcroft, C. J. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. Totowa, NJ. 233-241 (2013).
  30. Gonzalez-Gutierrez, G., Miranda-Laferte, E., Neely, A., Hidalgo, P. The Src Homology 3 Domain of the beta-Subunit of Voltage-gated Calcium Channels Promotes Endocytosis via Dynamin Interaction. J. Biol.Chem. 282, 2156-2162 (2007).
  31. Galizzi, J. P., Borsotto, M., Barhanin, J., Fosset, M., Lazdunski, M. Characterization and photoaffinity labeling of receptor sites for the Calcium channel inhibitors d-cis-diltiazem, (+/-)-bepridil, desmethoxyverapamil, and (+)-PN 200-110 in skeletal muscle transverse tubule membranes. J. Biol.Chem. 261, 1393-1397 (1986).
  32. Bezanilla, F. The voltage sensor in voltage-dependent ion channels. Physiol.Rev. 80, 555-592 (2000).
  33. Sigworth, F. J. The variance of sodium current fluctuations at the node of Ranvier. J Physiol. 307, 97-129 (1980).
  34. Bailey, M. A., Grabe, M., Devor, D. C. Characterization of the PCMBS-dependent modification of KCa3.1 channel gating. J. Gen. Physiol. 136, 367-387 (2010).
  35. Fletcher, P. A., Scriven, D. R., Schulson, M. N., Moore, E. D. Multi-Image Colocalization and Its Statistical Significance. Biophys. J. 99, 1996-2005 (2010).
  36. Lizotte, E., Tremblay, A., Allen, B. G., Fiset, C. Isolation and characterization of subcellular protein fractions from mouse heart. Anal. Biochem. 345, 47-54 (2005).
  37. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J. Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  38. Yamamura, H., Suzuki, Y., Imaizumi, Y. New light on ion channel imaging by total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. J. Pharmacol. Sci. 128, 1-7 (2015).
  39. Wible, B. A., et al. HERG-Lite-R: A novel comprehensive high-throughput screen for drug-induced hERG risk. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 52, 136-145 (2005).
  40. Wilde, A. A. M., Brugada, R. Phenotypical Manifestations of Mutations in the Genes Encoding Subunits of the Cardiac Sodium Channel. Circ. Res. 108, 884-887 (2011).
  41. Milano, A., et al. Sudden Cardiac Arrest and Rare Genetic Variants in the Community. Circ Cardiovasc Genet. , (2016).
  42. Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat. Meth. 9, 152-158 (2012).

Tags

Cellular Biology Calciumkanaler celleoverfladeprotein ekspression intracellulær proteinekspression rekombinant ekspression flowcytometri
Bestemmelse af den relative celleoverfladen og Total ekspression af rekombinante Ion Channels anvendelse af flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bourdin, B., Segura, E.,… More

Bourdin, B., Segura, E., Tétreault, M. P., Lesage, S., Parent, L. Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (115), e54732, doi:10.3791/54732 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter