Summary
継承された不整脈は、しばしば、一つ以上のイオンチャネルの表面の配信を変更する突然変異によって引き起こされます。ここでは、TSA-201細胞で発現された組換えイオンチャネルの相対的な合計および細胞表面タンパク質発現の定量化を提供するために、フローサイトメトリーアッセイを適合させます。
Introduction
この論文は、既存のフローサイトメトリー技術を使用して組換え細胞中で発現するイオンチャネルなどの膜タンパク質の相対的な細胞表面発現を報告するために信頼性のあるアッセイを提供します。イオンチャネルは、細胞膜を横切るイオンの流れをゲート制御することによって電気信号を制御する責任があるポア形成膜タンパク質です。これらは、活性化メカニズム、自然、そしてそれらがローカライズされている細孔を通って通過するイオン種の選択によって分類されています。細胞および組織レベルでは、イオンチャネルを介して、巨視的なイオンフラックスは、生物物理学的（ゲーティングと浸透）、生化学的（リン酸化）、および生合成（合成、グリコシル化、輸送、及び分解）の特性1の産物です。これらのプロセスの各々は、イオンチャネルの種類ごとに固有であり、イオンチャネルの生理学的役割を果たすように最適化されます。その結果、貫通これらの微調整プロセスのいずれかの変化遺伝性またはしばしば「チャネロパチー」という遺伝的改変は、細胞ホメオスタシスに有害であることができます。細胞表面でのイオンチャネルの「右」量を送達することは、細胞恒常性に重要であることを強調することが重要です。小さくても増加する（機能獲得型）とイオンチャネル活性のわずかな減少は、（機能喪失）生涯にわたって深刻な病状を引き起こす可能性があります。成熟したイオンチャネルの細胞表面の配信の欠陥は、嚢胞性線維症（CFTRイオンチャネル）2、QT延長症候群形態（心臓カリウムチャネル）3の不整脈として、多数のchannelopathiesにおける重要な決定因子です。
Channelopathiesは、心臓突然死4に関連しています。すべての心臓channelopathiesの現在の世界的な有病率は、少なくとも1であると考えられている：2,000-1：個々の5あたり3000と突然不整脈心臓死CAの約半分を担当していますSES 6。心臓の電位依存性ナトリウム - 、カリウムで機能不全、およびカルシウム選択性イオンチャネルは、このプロセスにおいて重要な役割を果たすことが知られています。 L型Ca V 1.2電圧依存性カルシウムチャネルは、同期心筋収縮を開始するために必要とされます。心臓のL型Ca V 1.2チャネルは、主孔形成のCa Vの α1サブユニットとのCa V SSとのCa Vα2δ1補助サブユニット7-12で構成されるマルチサブユニットタンパク質複合体です。これらのサブユニットは、心臓13の正常な電気的機能をサポートするために不可欠であるとの間の補助サブユニットの完全な補完は、原形質膜での機能のCa V 1.2チャネルおよび動的な相互作用を生成するのに必要とされることに注意してください。カルシウムV SSは、非共有結合ナノモル疎水性相互作用14を介してのCa V 1.2チャネルの細胞表面発現を促進します。 Ca Vα2δ1サブユニットのwiの共発現カルシウムのV th の SS結合のCa Vα1がピーク電流の式（5から10倍）を刺激し、より負の電圧でチャネルの活性化を促進します。孔形成サブユニットのCa V 1.2の機能獲得型変異はL型Ca V 1.2チャネルを形成する3つの主要なサブユニットにおける点突然変異のホストに対し、QT延長症候群15と呼ばれる心室性不整脈の形と関連しています短いQT延長症候群のフォーム16,17の不整脈を患っている被験者において同定されています。イオンチャネルは、生化学的観点（タンパク質化学）から調査またはこれらの相補的なアプローチを使用して、しばしば電気ツール（電流生成機）を用いてすることができる膜タンパク質です。電気生理学は、特定の全細胞パッチクランプで、イオンチャネル15の機能を解明するための適切なアプローチであるが、それらの生物物理学的変化からタンパク質輸送における改変を解決することはできませんプロパティ。タンパク質化学は、しかし、多くの場合、小さい可溶性タンパク質に比べて大きな膜タンパク質の比較的低い発現に使用が制限されています。蛍光読み取りを使用して堅牢なハイスループット法は、具体的には、イオンチャネルの細胞表面発現の変化を引き起こすタンパク質生合成の欠陥に対処するために開発される必要があります。
フローサイトメトリー細胞計数、ソート、バイオマーカー検出、およびタンパク質工学18に用いられる生物物理学的技術です。生細胞または粒子の試料溶液をフローサイトメータに注入されると、細胞は、マシンの検出システム（ 図1）でプローブすることができる単一のストリームに順序付けされます。 1956年19で生産楽器サイトメーター最初の流れはパラメータを1つだけ検出されたが、近代的なフローサイトメーターは、30以上の蛍光パラメータ20,21の検出を可能にする複数のレーザと蛍光検出器を持っています。フィルタやミラー（発光系）は、その強度に比例して光を変換する電子ネットワーク（フォトダイオードおよび検出器）への細胞の光散乱や蛍光光を向けます。デジタルデータは、専用のソフトウェアを用いて分析され、一次出力はドットプロット21として表示されます。
図1：ソーティングフローサイトメトリーの生物物理学的原理単セルは、1つまたは複数のレーザインタロゲーションポイント間にそれらを移動させるシース流体の流れ内の高圧下でノズルを介して押し出されます。光ビームが通過する細胞によって偏向され、順方向（前方散乱、FCS）に集められた光は、セルの大きさに比例した信号に光を変換するフォトダイオードに送信されます。光もレーザー経路に対して90°の角度で収集され、検出器（とも呼ばれる光電子増倍管（PMT））に送信されます。励起された蛍光色素が細胞内に存在する場合、この光は、細胞内の粒度を反映した側方散乱信号（SSC）の検出を可能にダイクロイックミラー、および蛍光発光を介してルーティングされます。 3つの検出器（緑、黄、赤）は、異なる蛍光色素の同時検出を可能にする、異なる波長帯域フィルタで表現されています。異なる信号が外部のコンピュータによってデジタル化し、細胞の特性を定量化するために分析されるデータに変換されている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フローサイトメーターの高スループット能力は、組換え野生型およびトラフィッキング欠損電位依存性L型Ca V 1.2チャネルおよび生細胞内の関連するサブユニットの相対的な膜発現を定量するために利用されました。 cDNAを共同構築しますタンパク質のための鼎は、二重に同時に不透過性の蛍光標識抗体および構成的に蛍光性である細胞内の蛍光団によって検出することができる細胞外非蛍光エピトープを運ぶためにタグ付けされました。 C末端の後に挿入されたタンパク質の細胞外ループに挿入され、細胞外エピトープ、および細胞内の蛍光団、両方は、タンパク質と翻訳されます。この一連の実験では、カルシウムのVα2δ1タンパク質は、内因性の細胞内の蛍光団として抗HAおよびmCherryをを抱合外ヘマグルチニン（HA）エピトープ不透過性のFITC（フルオレセインイソチオシアネート）によって検出された（YPYDVPDYA）を発現するように操作されました。 mCherryを、カルシウムのVα2δ1HAタグ化タンパク質の相対的な細胞表面発現のレベルを決定するために、融合タンパク質を発現する組換え細胞は、トランスフェクション後に回収し、そしてFITC結合マウスモノクローナル抗HAエピトープタグ不格好なやつで染色しましたY（ 図2）。 FITCは、したがって、生物学的機能を妨害する可能性が低い酵素レポーターよりもかなり小さく、有機蛍光化合物です。 TSA-201cellsで過剰発現mCherry-のCa Vα2δ1-HAは、2次元プロット22上のFITC蛍光とmCherryを蛍光における有意な3-ログ増加をもたらします。 HAエピトープは、タンパク質の細胞外部分に位置していることを考えると、無傷細胞の存在下で得られたFITC用の蛍光強度は、HAタグ化タンパク質の細胞表面発現の相対的な指標を反映します。構築物中のHAエピトープのアクセシビリティが体系的細胞透過後のFITCシグナルを測定することによって検証されます。 FITCの相対蛍光強度は、透過性細胞で推定するので、この測定値はまた、正規化された全タンパク質の発現を確証するのに役立つFO相対蛍光値と定性的に同等ですR mCherryを透過処理し、非透過性の条件22,23の下で測定しました。固有の蛍光スペクトルを透過処理した後、より高い値にシフトしていることが、対照構築物と比較して報告されている唯一の値は、蛍光強度の変化があることに注意することが重要です。テスト構築物について蛍光強度の相対的変化は、各蛍光団（mCherryをまたはFITC）のためΔMean蛍光強度（ΔMFI）の値を用いて推定しています。実験は、フルオロフォア結合抗体の固有の蛍光の実験変動を制限するために、同一条件下で発現コントロール構築物の蛍光強度を試験構築物の相対的な蛍光強度を測定するように設計されています。二つの膜タンパク質は、正常にこのアッセイを用いて検討した：L型電位依存性カルシウムチャネルのCa V 1.2 14,22との異なるシリーズでの孔形成サブユニット実験では、α2δ1サブユニット22,23外補助のCa V。以下のプロトコルは、制御条件下でイオンチャネルの翻訳後修飾に影響を与える変異後の心臓L型Ca V 1.2チャネルのカルシウムのVα2δ1サブユニットの細胞表面発現を測定しました。標準化された実験条件下で、FITCの細胞表面蛍光はmCherryを、カルシウムVα2δ1-HAタンパク質（参考文献22の図5）をコードするcDNAの発現に準線形的に増加します。
図2：実験プロトコルフローサイトメトリーでの合計と、膜の標識の概略図スキームがFLにより、組換えイオンチャネルの相対的な合計と細胞表面発現を定量化するために必要な主な手順のいくつかを概説します。OWサイトメトリー。細胞を、（2）TSA-201細胞（1）で二重タグ付き構築mCherryを、カルシウムのVα2δ1-HAでトランスフェクトし、透過処理の前または後に染色されます。マルチパラメータデータを多変量解析するためのフローサイトメーター（3）で取得している（4）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Protocol
1.二重タグ付きDNA構築
- 部位特異的突然変異誘発（ 図3B）20によってD676とR677の間のCa Vの α2δ1の細胞外リンカー中のHAエピトープ（YPYDVPDYA）を挿入します。フォワードプライマーgccggattatgcgGGAAAACTCCAAACAACCを使用し、プライマーacatcatacggataTCAATAAATTCATTGAAATTTAAAAGAAATTCを逆にします。
- SacI及びSalI部位の間にmCherryを（ 図3B）20のN末端に融合タンパク質を発現するように設計された哺乳動物pmCherry-N1発現ベクターにタグ付けされたHAのCa Vの α2δ1のcDNA配列をサブクローニング。
注：適切なチャネルの機能は、標準的な電気生理学的方法24を用いて、対照構築物で試験する必要があります。
2.リポソーム媒介一過性トランスフェクション（30分、すべての手順は、層流フードの下で実行されています）
- 1日目：TSA-201細胞（またはHEKT）の半分の百万をプレートに10％ウシ胎児血清（FBS）および1％ペニシリン - ストレプトマイシン（PS）培養培地を補充したダルベッコ高グルコース最小必須培地（DMEM-HG）2mLで35mm培養皿。標準的な血球計を用いて細胞を数えます。トリパンブルーを用いて細胞試料の画分から細胞生存率を評価します。プレートに十分な細胞は、トランスフェクションの時点で90％コンフルエンスに到達します。
- 2日目：PSのない新鮮予め温めた（37℃）培地の2ミリリットルでの変更の培地。
- 各トランスフェクションサンプルについて、2 1.5ミリリットルのチューブを準備します。管1では、低血清培地250μlのDNAの4μgのを希釈。チューブ2には、250μlの血清減少培地でのリポソーム媒介トランスフェクション試薬を10μlを混合します。使用前に穏やかにトランスフェクション試薬を混ぜます。
- 室温で5分間インキュベートします。
- チューブ1とチューブ2の内容を組み合わせて、穏やかに混合し、室温で少なくとも20分間インキュベートします。
- リポソームを追加/ DN静かに培養した細胞との複合体が混在する培養皿を揺すります。
- 24時間、5％CO 2雰囲気下、37℃でインキュベートします。
フローサイトメトリーのための細胞の3染色（3時間）
- 細胞サンプルを準備します
- 3日目：慎重に培養皿から培地を除去し、予め温めておいた（37℃）0.05％トリプシン1xのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）を400μlで細胞を洗浄。
- トリプシンEDTAの400μlを添加して、細胞がディッシュから剥離することを可能にするために5分間、5％CO 2雰囲気下、37℃で皿をインキュベートします。
- PSなしで冷たい培地の1ミリリットルを追加することにより、酵素消化を停止し、静かに4-5回ピペッティングすることにより、表面からのすべてのセルを洗い流します。細胞死を減らすために消化および過ピペッティングは避けてください。
- 1.5ミリリットルチューブに細胞を収集し、直ちに氷上に置きます。氷冷溶液を使用して、内在化を防止するために、4℃で細胞を維持します表面抗原。蛍光シグナルの光退色を制限するために照明を減らします。
- 4℃で5分間、400×gで遠心分離管。慎重に吸引し、上清を捨てます。
- 再懸濁単一細胞懸濁液を調製し、リン酸緩衝生理食塩水1×1mlの（PBS）中でペレット。
- 簡単に言えば、非常に穏やかにチューブをボルテックスし、完全培地を除去するための手順3.1.5と3.1.6を繰り返します。
- 1×PBS600μlの中にペレットを再懸濁し、3×10 6細胞/ mlの最小値に細胞濃度を調整します。
- 細胞外および細胞内染色のための2つの新しい1.5 mlチューブに細胞を分割します。非特異的な染色からの特異的染色を区別するために適切なコントロールを含めます。
注：アイソタイプコントロール抗体は、バックグラウンド染色のレベルを評価するのに役立ちますし、理想的には、各一次抗体の宿主種、アイソタイプおよびフルオロフォアと一致する必要があります。同じでアイソタイプコントロールとコンジュゲート抗体を使用してくださいタンパク質濃度。
表1： 非透過処理し、透過処理した細胞のためのフローサイトメトリー実験の対照試料各実験は、以下の陰性対照含める必要があります：。（1）非トランスフェクト細胞（抗体なし、アイソタイプを持つ又は共役抗体とを）。 （2）構成的蛍光細胞内蛍光色素なしのプラスミドにサブクローニング目的のタンパク質をトランスフェクトした細胞（pCMV-のCa Vα2δ1-HA）または二重にタグ付けされた建設（pmCherry-のCa Vの α2δ1とおよびアイソタイプまたはで、抗体なしでインキュベートしました結合抗体）。単色コントロールは蛍光色素、発光重なりを補償するために使用されます。同じコントロールは、非透過性のために実行し、実験の各シリーズに条件を透過処理しています。
- 無傷の細胞表面染色生細胞
- アリコート1.5ミリリットルチューブで1×10 6細胞/100μlの。
- ミリリットルを5μg/でFITC結合モノクローナル抗HA抗体を追加し、45分間、4℃の暗所でロッカープラットフォーム（200回転）上で細胞をインキュベートする前に渦。
注：抗体の最適な濃度は、予備滴定実験で決定した（ 図4）。 - 暗いから細胞を除去し、1×PBS /チューブの900μlを添加します。 4℃で5分間、400×gで遠心分離します。
- 上清を吸引し、4℃で5分間、400×gで1×PBS、ボルテックスと遠心機の1ミリリットル中にペレットを再懸濁。
- 未結合抗体を除去するために二回の洗浄（ステップ3.2.4）を繰り返します。非共役一次抗体が使用される場合、適切な二次抗体とインキュベートします。
- 最終洗浄後、1×PBS500μlの細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーチューブを流れるmlの5中の単一細胞懸濁液を移します。セルをキープサンプルを実行するまで4℃で暗所での。
- フローサイトメーターでサンプルを実行します。最良の結果を得るために、できるだけ早くと遅くとも24時間後より、フローサイトメーターで細胞を分析します。
- 細胞内染色：固定、透過処理、および染色
- 4℃で5分間、400×gで小分けし、1×10 6細胞/ 1.5 mlチューブと遠心分離機で100μlの。
- 在庫から直接固定-透過処理溶液100μlに上清および再懸濁細胞を捨てます。
- 20分間4℃で暗所でインキュベートします。
- （蒸留H 2 Oで10倍の透過性、洗浄緩衝液を希釈）新たに調製した1×透過性洗浄緩衝液100μlを追加します。 4℃で5分間、400×gでテーブル遠心機を用いて渦土砂細胞。
- 吸引し、上清を捨てます。
- 繰り返しは、3.3.4と3.3.5を繰り返します。
- 5でFITC結合モノクローナル抗HA抗体を追加/ mlの100 1X透過性洗浄バッファーμLと、4℃で30分間、暗所で細胞をインキュベートする前に、ボルテックスしました。
注：細胞内染色は、細胞表面染色のために使用されるものと同様の手順に従って行われます。サポニン媒介細胞透過は、したがって、細胞内染色中のサポニン一定の存在下で細胞を維持するために1×パーマ/洗浄緩衝液で1×PBSを交換することが重要である、しかしすぐに可逆過程です。 - 暗いから細胞を除去し、100μlの透過性、洗浄バッファーを追加します。 4℃で5分間、400×gで遠心分離します。
- 吸引し、慎重に上清を、4℃で5分間400×gで100μlの透過性、洗浄緩衝液、ボルテックスと遠心機でペレットを再懸濁。
- 未結合抗体を除去するために洗浄（ステップ3.3.9）1より多くの時間を繰り返します。
- 最終洗浄後、1×PBS500μlの細胞を再懸濁し、罪を転送管サイトメトリー5mLの流れにGLE細胞懸濁液。フローサイトメーター内に試料を注入するまで4℃で暗所で細胞を保管してください。
- フローサイトメーターでサンプルを実行します。できるだけ早くしかし、遅くとも1週間よりも染色後のフローサイトメーター上で固定したサンプルを実行します。同じ日に非透過処理し、透過処理した細胞を実行します。
4.フローサイトメトリー
- セルソーターデイリーセットアップフローサイトメーター
- フローサイトメトリーソフトウェアをオンにします。機器設定のビーズを使用することによって（ すなわちレーザーと光学系は仕様に実行され、レーザーおよびフローセルが正しく整列されている）、最適な機器性能を保証するために、セルソーターフローサイトメーターを、実験キャリブレーションとセットアップの前に。
- 20 psiのシース圧で100μmのノズルを使用してください。
注：ノズルがベンチフローサイトメーター上で変更する必要はありません。 - 機械製造に応じてサイトメーターの流量を設定しますER仕様。極めて高い流量は、蛍光の変化の検出感度を低下させます。
- 黄緑色レーザー（mCherryをを励起する561 nm）を（フルオレセインIsothiocayanateまたはFITCを励起するために488 nm）の青を選択します。 530/30 nmを用いてそれぞれ20分の610 nmのバンドパスフィルターを用いてFITCとmCherryを蛍光レベルを収集します。
- リニアスケールを用いて、非染色細胞のための側方散乱（SSC）ドットプロット対前方散乱（FCS）を取得。ドットプロットの左下の象限に細胞を可視化するために、各検出器の増幅を調整します。
- 無傷の非透過性細胞のサンプル・レディング
- このように無傷の細胞に蛍光シグナルを制限し、細胞破片および細胞凝集体を除く、分析される細胞の周りに自由形式の輪郭を描くことで、ライブ非透過性細胞のためのP1gateを設定します。
注：ライブ/デッド排除色素は生細胞にゲートの配置を容易にするために使用することができます。レコードに10,000事象を設定します。停止ゲートP1インチ必要であれば、イベントの大きな数値に設定してください。 - 非染色細胞のベースライン自家蛍光を検出するために、FITC 2パラメータ等高線図対mCherryをを取得します。負の値を示し、集団25の間の解像度を向上させるために、双対数スケールを使用してください。ログ蛍光強度プロットの最初の10台の下部内に未染色陰性細胞を設定するには、各検出器の電圧を調整します。
- 4.1.5および4.1.6に設立された設定を使用して、すべての無傷の非透過処理のサンプルを取得し、蛍光検出器でFSC、SSCおよび信号を収集します。
- エクスポートおよび*保存.fcsファイルを解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いた分析のために使用されます。
- このように無傷の細胞に蛍光シグナルを制限し、細胞破片および細胞凝集体を除く、分析される細胞の周りに自由形式の輪郭を描くことで、ライブ非透過性細胞のためのP1gateを設定します。
- 透過処理した細胞のサンプル・レディング
- 透過処理試料中の生細胞を選択し、4.1.5と4.1.6に示すように、FSCとSSCの電圧を調整するために、P1のゲートを移動します。
- すべての透過処理のサンプルを取得し、FSC、SSC aを集めます蛍光検出器でND信号。
- エクスポートおよび*保存.fcsファイルを解析ソフトウェアフローサイトメトリーを用いた分析のために使用されます。
- データ分析
- 4.2.4と4.3.3に保存された解析ソフトウェアと輸入* .fcsファイル、フローサイトメトリーを起動します。
- ワークスペースウィンドウにリストされた最初のサンプルをクリックします。チューブID番号にちなんで名付けられた新しいウィンドウが自動的に開きます。 FSC対SSCのプロットでゲーティングプロセスを開始します。生細胞の周りに楕円形のアイコンを使用してゲート（P1）を描画し、任意の残骸、死細胞、または生きている細胞とは異なる前方散乱および側方散乱を持つ凝集体を排除
- FITC（X軸）生細胞の蛍光強度対mCherryを（y軸）の2つのパラメータの等高線図を描画するために、x軸上に第一のクリック及びFITCチャネルを選択し、Yをクリック - 軸とPE-mCherryをチャンネルを選択します。のエッジで象限マーカーを配置する「クワッド」アイコンをクリックしてください各蛍光チャネルにおけるutofluorescent細胞。
注：FITCとmCherryを陽性細胞の周りに設定されゲートがP2ゲートです。蛍光陰性細胞集団は、P3のゲートと呼ばれます。この記事で使用する代表的なゲーティング方法については、 図5を参照してください。 - P2とP3のゲートを選択して、元のワークスペースウィンドウで、「追加の統計」アイコンをクリックしてください。 「カウント」（陽性細胞の数）をクリックして、オプションのリストの中で（各蛍光色素の平均蛍光強度）を「平均」または「中央値」（各蛍光色素の蛍光強度中央値）の統計情報をクリックしてください。再び「追加の統計」アイコンをクリックします。すべてのこれらの値は自動的に元のワークスペースウィンドウに転送されます。
注：「平均」蛍光強度が正規分布に従う場合にのみ使用されます。他のすべてのケースでは、「中央値」タブをクリックします。 MFIは、このように蛍光Intensitを意味するために参照することができますYまたは蛍光強度中央値。
注：次のステップは、サイトメーターによってプローブすべてのサンプルにゲート」パラメータと統計を適用することです。 - ワークスペース]ウィンドウで、すべてのサンプルをマークされた行の上にゲートと統計パラメータをドラッグアンドドロップするには、マウスを使用しています。
- 2次元の等高線プロット（FITC対mCherryを）と非透過処理し、透過処理した細胞のヒストグラム（セルは蛍光強度カウント対）（ - B 図6A）のバッチレポートを生成します。
- ステップ4.4.4において生成された統計から、染色された細胞についての各蛍光色素の平均蛍光強度（MFI）を計算します。この値から、表面と目的のタンパク質の総発現を定量化するために染色されていない細胞から得られたMFI値を減算します。
- 各蛍光団（mCherryをとFITC）（ - D 図6C）のためΔMFI値を報告します。 CAの測定ΔMFIを正規化
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Representative Results
この記事では、サイトメトリーアッセイ2色フローによってTSA-201cellsに発現された組換えイオンチャネルの合計と細胞表面を定量化するための信頼性の高いプロトコルを記述します。一例として、相対的な細胞表面および総タンパク質の発現は、CA のVα2δ1subunitために定量化しました。サイトメトリーアッセイ2色のフローを実行するためには、カルシウムのVα2δ1は、二重に抗HA FITC結合抗体および構成の蛍光細胞内mCherryを蛍光団によって検出することができる細胞外非蛍光エピトープHAを表現するためにタグ付けされました。 FITCおよびmCherryをするための励起および発光スペクトルは、FITCが488nmレーザーで88％の効率で励起されるが、効率は561 nmのレーザーで0％まで減少することを示します。 561 nmレーザーが、488nmレーザーを持つ唯一の7.6％（ 図3）で励起されたときmCherryを、その最大蛍光の63.9パーセントを示しています。励起および発光SPECTRAは両方のフルオロフォアのために選択された異なるレーザーおよびフィルタを最適な集光と最小限の重複を示します。所与の蛍光色素のためのMFI限り、アッセイは、大きな細胞集団からの膜タンパク質の相対的発現に関する定量的情報を提供することができるフローサイトメトリーでは、各セルでのCa Vの α2δ1のタンパク質の発現はなく、蛍光細胞の数に正比例します。これは、飽和を超えた蛍光標識抗体の濃度を使用することを含みます。カルシウムのVα2δ1に結合する抗HA FITC結合抗体（ 図4）のための滴定曲線は、3つの段階を示しています。全く蛍光が第1段階で検出されなかったが、蛍光強度は、第2段階での抗体濃度の増加に伴って指数関数的に増加しました。彩度（第三相）のポイントの後、抗体の濃度を増加させると、相対蛍光INTENには影響を与えませんFITCのsity（RFI）。抗HA FITCコンジュゲート抗体の飽和点は、このようにコンジュゲート抗体の濃度は、実験中にMFIを限定するものではないことを確認して、5μg/ mlのに確立されました。
タグ付けされたカルシウムのVは、TSA-201cellsで発現α2δ1wasサイトメトリーアッセイは、非透過性細胞（ 図5）にFITC結合抗HAの存在下で実施したフロー。適切な対照（ 表1）は 、レーザビームを通過する各セルに、XY値属性フローサイトメーター上で分析しました。細胞分布は、ドットプロット（ 図5A）上で可視化されます。 FCS / SSCドットプロットは、細胞サンプルの調製は高い生存性（ 図5BA）で単一細胞懸濁液を提供することを確認します。生細胞（P1）のための選択されたゲートは、分析した細胞の総数の75％を表します。総タンパク質発現OTSA-201細胞中のFのCa Vの α2δ1は、mCherryを蛍光に比例すると考えられました。 FITC輪郭プロット及びヒストグラム（ 図5BB - BC） 対 mCherryをに見られるように、pmCherry -カルシウムのVα2δ1-HAでトランスフェクションし47 2％TSA-201細胞は、有意に起因する有意なFITC蛍光を示すだけでなく、mCherryを蛍光を発現することが見出されました非透過性細胞中のCa Vの α2δ1の外部HAタグに結合します。抗体なしまたはアイソタイプで行う陰性対照実験は、FITCのみまたは主に積極的にトランスフェクトされた細胞に結合することを示しています。
このプロトコルは、TSA-201cells 23中のCa Vの α2δ1の合計と細胞表面発現のN-グリコシル化の役割を特徴づけるために使用されました。実験は、細胞表面発現を評価するために、非透過性細胞中で実施しました。そして透過性細胞においてHAエピトープの接近性を確認するだけでなく、全タンパク質の発現を評価しました。カルシウムのVα2δ1の相対的発現を、MFIは、各フルオロフォア（mCherryをまたはFITC）のための推定に基づいて計算しました。変異体についてΔMFI値は、同じ条件下で発現mCherryを、カルシウムVα2δ1-HA WTため同日測定された最大値に対して標準化しました。これは、抗HA FITCコンジュゲート抗体の絶対的な蛍光強度の経時変化を考慮することが重要です。 図6Aに見られるように、WT及び4xNQ構築物が、16xNQ構築のためのバックグラウンド蛍光レベルに近いが、タンパク質が原形質膜からほぼ不在であることを示すために、非透過性細胞におけるFITCのためのΔMFIは強かったです。アッセイは、細胞透過の後に行わ、16xNQ構築物の総タンパク質発現も有意にそれかどうか減少したことを示し（ - D 図6C）透過性細胞または非透過処理で測定された構成mCherryを蛍光から、膜透過した細胞にFITC蛍光から推定されました。 図6Bに見られるように、細胞の自己蛍光レベルが、無傷の非透過性と透過性細胞との間の絶対蛍光値の比較を防ぐ細胞透過の後に増加しました。 mCherryをするための測定ΔMFI蛍光は透過性ソリューションは、mCherryをの相対的な蛍光シグナルを変更しないことを意味する非透過処理し、透過処理した細胞の両方のために類似していました。 N-グリコシル化部位の変異は、タンパク質の生合成/安定性が23に減少した公開された観察支援mCherryをするための蛍光強度の減少と関連していました。この一連の実験では、透過性細胞で測定されたFITCのための相対的な蛍光シグナルがbに判明しましたタンパク質のN型糖鎖付加の状態は、細胞外ドメイン内のFITCコンジュゲート抗HA抗体により検出された蛍光の強度に影響を及ぼし得ることを示唆しているmCherryをするための相対的な信号よりも小さいE。要するに、細胞透過前後FITCの相対的な蛍光の変化は、タンパク質の発現を定量化するための信頼性のメトリックを提供します。
図3：FITCとmCherryを2色のフローサイトメトリーアッセイのための蛍光色素の適切なペアを形成する励起（空の曲線）と561 nmの黄色で励起488nmの青色レーザー（AA）で励起し、mCherryをFITC用の発光スペクトル（満たされたカーブを）。緑色レーザー（Ab）が 。FITCおよびmCherryを蛍光は530/30 nmおよびA 20分の610 nmのbandpasで収集しましたsがそれぞれフィルタリングします。異なるレーザー（着色縦線）及びフィルタ（有色の長方形）の波長は、最適な光収集および最小限の重複のために選択されます。 （B）mCherryを-のCa Vα2δ1-HAタンパク質の模式図。 Ca Vの α2δ1は、二重に抗HA FITC結合抗体および構成の蛍光細胞内mCherryを蛍光色素により検出することができる細胞外非蛍光エピトープHAを表現するためにタグ付けされた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：カルシウムのVα2δ1に結合する抗HA FITC結合モノクローナル抗体の滴定 TSA-201細胞を一過pmCherry-のCa V＆をトランスフェクトしました ＃945;2δ1-HAおよび抗HA FITC結合またはアイソタイプの抗体の範囲とインキュベートしました。唯一のFITCシグナルは、このパネルで分析されています。 （A）単一のパラメータのヒストグラムは、y軸上の細胞の相対数及び濃度の抗HA FITCコンジュゲート抗体の範囲（/ mlの0.01~20μgの）のX軸上のFITCの蛍光強度を示します。 （B）FITCのMFIの関数としての抗HA FITCコンジュゲート抗体に対する片対数グラフ。滴定曲線はトレンドライン値R 2 = 0.99561で方程式を1つの結合部位を使用して取り付けました。予想通りアイソタイプ抗体について行わ滴定には蛍光を示しませんでした。 0.001〜0.01μgの/ mlに濃度がバックグラウンドノイズと区別がつかない。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5：pmCherry-のCa Vの α2δ1-HAをトランスフェクトした非透過処理TSA-201cellsの分析代表的なフローサイトメトリー （A）分析試料をフローサイトメトリーで使用されるゲーティング戦略の模式図。データは、適切なソフトウェアを使用して取得した後に分析しました。第1のゲート戦略は、前方散乱（FSC）および側方散乱（SSC）生細胞の周りにゲート（P1）を表示し、生きている細胞とは異なる前方散乱および側方散乱を持っている任意の残骸、死細胞、または凝集体を排除するドットプロットを活用します。 FITC（X軸）蛍光強度対 mCherryを（y軸）の2つのパラメータの等高線プロットは、P1の集団のために表示されていました。長方形ゲートは陽性集団のP2（FITCとmCherryを）と負の人口P3を選択するために、細胞の自己蛍光の端に配置しました。トンのための蛍光レベル領域P2とP3内の彼の細胞をFITCまたはmCherryを蛍光強度単一パラメータヒストグラムカウント対その後の細胞を用いて可視化しました。 y軸とx軸上の蛍光強度のシフトは、それぞれのCa Vの α2δ1の合計と膜式の信頼性の指標を提供します。蛍光シグナルの強度は、蛍光色素分子の数の関数として増大します。述べたように各条件について（BA）代表FCS / SSCドットプロット。万イベントの合計は、分析のために取得しました。楕円ゲート（P1）は、低FSC（死細胞）または高SSC（集合体）のイベントを除く生きた細胞の周りの目が描かれています。 FITC（X軸）蛍光強度対 （BB）mCherryを（y軸）の代表的な2つのパラメータの等高線プロット。ゲートはFITC-mCherryを陽性細胞の集団を分離するために、細胞の自己蛍光の端に配置した（P2ゲート）と負の蛍光細胞（P3）。 （BC）シングル-PA相対数（または最大の％）のラメータヒストグラム蛍光強度（FITCまたはmCherryを） 対細胞。 P2のゲート（蛍光陽性細胞）内のセルのための測定された蛍光強度の分布は、 灰色で表示され、及びP3のゲート（蛍光陰性細胞）中に存在する細胞についての蛍光強度の分布におけるオーバーレイとして表示されています透明な灰色のプロット 。見られるように、蛍光強度は。のCa Vの α2δ1が十分に発現し、明らかに細胞膜に存在していることを示すmCherryをとFITCの両方のために強かった。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：Nの -glycosylationサイトの同時変異は、細胞表面の元を破壊しカルシウムのVα2δ1のPRESSION。安定したTSA-201のCa Vの β3細胞は一過性のpCMV-のCa V 1.2 WTとpmCherry-のCa Vα2δ1-HA WTまたは変異体と同時にトランスフェクトしました。上記のように、非透過性（A）および透過性細胞（B）は抗HA FITC結合抗体で染色しました。 mCherryを対 FITC蛍光（左パネル）の代表的な2つのパラメータの等高線プロットし、抗HA FITCコンジュゲート抗体染色（右のパネル）についての蛍光強度の分布のヒストグラムプロットは、後に、N個の -glycosylation変異体（NQ）について示されています4つのサイト（4xNQ：N92Q / N184Q / N468Q / N876Q）の破壊および16のサイト（16xNQ：N92Q / N136Q / N184Q / N324Q / N348Q / N468Q / N475Q / N585Q / N594Q / N663Q / N769Q / N812Q / N876Q / N883Q / N973Q無傷の非透過処理またはNP細胞（A）及び透過性やP細胞（B）中/ N986Q）。 DISTRIBP2のゲート内の細胞（蛍光陽性細胞）について測定した蛍光強度のutionは灰色で示し、P3のゲート（蛍光陰性細胞）中に存在する細胞についての蛍光強度の分布は、透明なオーバーレイとして表示され灰色のプロット 。 （B）に示すように、自己蛍光レベルが細胞透過の後に増加しました。すべてのトランスフェクトされたHAタグ付きのCa Vの α2δ1タンパク質は、抗HA FITC抗体で染色し、検出されたことを示す（x軸の右シフトとして見られる）の増加すべてのトランスフェクトされた透過性細胞に対して測定FITC用の蛍光強度。 （C）バーグラフは、無傷の非透過処理（表面発現）または透過性細胞（合計式）におけるFITCの存在下で測定正規化されたMFIを示しています。相対蛍光密度は、各条件（30,000細胞）のために、細胞の三つの異なるバッチで三重に測定したtransfec1ヶ月の期間にわたってテッドは、したがってデータは、各条件のために90,000細胞についての平均±SEMとして示されています。ピーク蛍光強度は、トランスフェクション後24および36時間の間に到達しました。無傷の非透過性細胞中で測定されたFITC用ΔMFI値は、CA Vα2δ1-HAの細胞表面発現の指標として使用し、透過性細胞で測定FITC用ΔMFI値は、総タンパク質発現（細胞表面および細胞内タンパク質の発現を反映して）。 FITC用ΔMFIはFITC陽性細胞（P2）の蛍光強度からFITC陰性細胞（P3）のFITC蛍光強度を差し引くことによって計算しました。同様の方法は、mCherryを用ΔMFIを計算するために使用しました。 MFI値は、mCherryを-のCa Vα2δ1-HA WTのための同じ日に測定された最大値に正規化しました。 （D）はバーグラフは、非透過処理または透過性細胞（TOTで測定された正規化ΔMFImCherryを示していますアル式）。結果は平均±SEMとして表されている。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このフローサイトメトリーベースのアッセイを首尾よく蛍光標識された孔形成および電位依存性カルシウムチャネル14,22,26の、関連するサブユニットの相対的な合計と細胞表面レベルの測定に適用しました。これは、遺伝子変異の影響を調べる際に最良に使用され、このように標識された蛍光タグ付けされた野生型構築物の固有の蛍光強度は、蛍光標識されたタグなし構築物の蛍光強度よりも大きく100倍、少なくとも10であることが必要とされています。この特定の例では、本明細書に記載のmCherryを、カルシウムのVα2δ1-HA構築物は、対雑音比より大きい信号と以前に公開のCa V 1.2-HAおよびCa V 2.3-HA構築物を測定したものよりも大きなダイナミックレンジが得られました。このため、多くの考えられる理由があります。これは、Ca V＆の細胞外ドメイン中のHAエピトープのローカル環境と推測することができます＃945;2δ1タンパク質は、FITC結合抗HA抗体の信号対雑音比を最大にします。
また、この方法は、細胞表面でのタンパク質の数の絶対値を提供しないことを心に留めておくことは重要です。機能性チャンネルの発現を得るために必要なタグ付けされた構築物の相対的発現は、側方パッチ・クランプによって側を行い、参照22の図7に示すように、同じ条件で実験をフローサイトメトリーによってそれにもかかわらず得ることができます。これらのデータから、ピーク電流密度、イオンチャネル活性のグローバルな尺度は、一般的にタグ付けされたカルシウムのVα2δ1サブユニットの表面発現の関数として増加すると推定することができます。この現在の細胞表面発現アッセイの主要な制限は、内因性イオンチャネルの研究にこの時点で適用することができないままです。これは、いくつかの市販の抗体に起因します具体的には、イオンチャネルの予想外ドメインに結合することが知られています。したがって、例えば、TSA-201細胞などの未分化組換え細胞系で発現研究されるタンパク質の一次配列の遺伝子操作を必要とします。
アッセイの最適化における重要なステップ：エピトープの挿入はを妨害してはならないため、蛍光体の適切なペアの同定は、外部エピトープの選択、および挿入部位の局在化は、この方法の成功に不可欠ですタンパク質機能。異なる蛍光体の組み合わせを試験しました。 2つの外部エピトープ： - 、R-フィコエリトリン-赤血球凝集素（HA）エピトープ（YPYDVPDYA）とブンガロトキシン結合部位エピトープ（WRYYESSLEPYPD）27と3不透過性の蛍光標識抗体は、すなわちFITC（フルオレセインイソチオシアネート）を評価し、 PE-Cy7-抱合抗体。また、10以上の異なる挿入外部HAエピトープのためのサイトでは、カルシウムのVα2δ1内で試験しました。部位特異的突然変異誘発法および組換えDNA技術を必要とするエピトープの挿入に関しては、同じ領域内のプライマー3セットの最小値を設計することが推奨されます。 9残基と、HAエピトープは、市販の蛍光標識抗体が、27ヌクレオチドの挿入の成功率は、点突然変異よりも低い場合に存在する小さなエピトープの一つです。テトラシステインモチーフ（残基のCys-Cysを、プロのGly-のCys-Cysが）2残基HAエピトープよりも小さいが、フルオレセインヒ素ヘアピンバインダーは、膜透過性および膜結合タンパク質28の分析には適していないです。予備実験は、2つの細胞内の蛍光団mCherryをし、緑色蛍光タンパク質（GFP）を用いて行きました。三つの条件は、イオンチャネルを有する蛍光体の成功したペアを識別するために使用した：フルオロフォアのニーズ1）発光スペクトル重ならない（詳細は参考文献20,21参照 ）。 2）タグ付けされた構築物の発現は、標準的な電気生理学的方法によって検証として組換え細胞において機能的イオンチャネルを生成します。 3）対照構築物の発現は、強力な蛍光読み出しを生成します。これらの基準のいずれかが満たされない場合は、タグや蛍光体の挿入は、チャネル機能に干渉する場合、例えば、1は振り出しに戻って行くと、外部のエピトープの挿入部位および/または挿入部位のいずれかを変更する必要がありますフルオロフォアの。タンパク質のC末端とフルオロフォアとの間の5グルタミン残基のリンカーは、タンパク質機能を改善するのに役立つ可能性があります。また、タンパク質の機能および/またはタンパク質グリコシル化に重要な役割を果たしていることが知られていない大きなループ外部エピトープを挿入するために役立つかもしれません。 1つはまたマイナーな技術的側面を意識する必要があります。
リポソーム媒介TRANSFの成功率TSA-201細胞中のectionは、CaのVの α2δ1内の2つのエピトープの挿入後に低下させることができました。したがって、新規DNA構築物でトランスフェクション効率を再較正することが提案されています。 30kDaのタンパク質の挿入はDNAの分子量を変化させるためです。必要に応じて3または長い期間（24〜72時間）、37℃で細胞をインキュベート：1 2：一つは、1リポソーム比にDNAを変更することができます。細胞を透過性のための右の処方を選択することが重要です。このプロジェクトのために鑑定ほとんどの自家製ソリューションは、細胞が凝集し、フローサイトメーターを詰まらせる原因となることが判明しました。
フルオロフォアコンジュゲートした抗体を用いて細胞を染色しながら露光を抑制することは光退色や信号の損失を制限することが不可欠です。蛍光バックグラウンドを最小限に抑えるためには、使用前にコンジュゲート抗体の過剰量を遠心分離することが重要です。最後に、Tを分析するために極度のに重要です彼できるだけ早くとしてフローサイトメーター上のセルと遅くとも24時間よりも後。 4℃で一晩染色した細胞を維持する可能性が高い信号を減少させ、細胞の生存を損なうであろう。バッチからバッチへのフルオロフォア結合抗体の固有の蛍光の変化は、試験構築物の蛍光強度は、同一の実験条件下で発現コントロール構築物の蛍光強度の関数として報告される必要があることを指示します。
雑音比に全体的に良好な信号を得るためには、細胞死を減少させるために、穏やかに3×10 6細胞/ mlをフローサイトメータに注入されるように細胞を再懸濁し、細胞をピペッティングを最小化することが推奨されます。高い細胞濃度が細胞の流れを減少させ、フローサイトメーターを詰まらせることに注意してください。一方、低い細胞濃度は、より長い処理時間を必要とします。一つは、このようにTYに応じて濃度を調整する必要があるかもしれ分析される細胞のPE。
代替アッセイ：フォー大きなカテゴリに細胞表面形質膜秋におけるイオンチャネルの存在を記録するために展開追加方法：1）フルオロフォア標識抗体と標的タンパク質との間の高親和性相互作用を利用する共焦点イメージング方法。 2）ビオチン化試薬による標的タンパク質の共有結合修飾に載っタンパク質化学技術。 3）非定常ノイズ解析の電気生理学的測定。放射性プローブと標的タンパク質の4）光親和性標識。電位依存性カルシウムチャネル、（±）トリチウム化と光親和性標識の場合- [3 H] PN 200-100、ジヒドロピリジンファミリーの高親和性リガンドは、1980年代31で広く使用されました。これは、高感度のアッセイのままであるが、出現次のファッションの外に落ちた放射性物質31の操作を伴います特に若い研究者との高感度蛍光、発光プローブ。また、表面発現と機能の間の相関は、このアプローチの範囲を超えているように、アンタゴニストの存在下でのイオンチャネル活性を測定することは不可能です。実験的な連続体のもう一方の端では、イオンチャネルの非定常ノイズ解析は、分、長時間録音のための安定したベースラインで高品質のギガシールパッチクランプ記録を必要とします。このアプローチの1つの任意の所与の電位32-34で測定された平均電流の関数としての雑音分散をプロットするグラフの傾きから単細胞オープンイオンチャネルの数を抽出することができます。これは、標準的な電気生理学的アプローチの同じ虚飾を表示します。これは、労働集約し、加えて、スペクトル解析32-34、ない細胞生物学者のステープルとの良好な知識が必要と低スループット法です。 analysiのさらに、このタイプsが膜での全タンパク質の数と異なる場合があります（オープン状態）アクティブイオンチャネルの番号を識別します。ビオチン化試薬を有する細胞表面タンパク質の標識は、細胞膜に存在するタンパク質を同定するための比較的効率的なツールです。この方法は、ビオチン、さらに高親和性及び膜非透過性ストレプトアビジンまたはアビジン分子とビオチンの高い特異性非共有結合によって膜タンパク質の共有結合修飾を利用します。このアプローチは、質的に信頼性があるが、定期的にウエスタンブロット法を用いてタンパク質を明らかに関連付けられた定量化の問題によって妨げられたり制限されています。共焦点イメージングおよびその誘導体は、広く細胞表面35を有する膜タンパク質の共局在を文書化するために使用されます。質的形質膜分離は、ショ糖勾配36を含むまたは含まない分画遠心法を用いて可能のままです。上記のフローサイトメトリーASSAのようYは、標的タンパク質およびフルオロフォア結合抗体との間の高度に特異的な相互作用に依存します。特に、全反射蛍光画像化は、膜表面37,38に単一のイオンチャネルの分布及び分子の挙動を報告できた強力なアプローチです。読み出しは間違いなく目を引くですが、低スループット小容量のアプローチのまま。これらのアッセイのすべては、彼らの科学的メリットを持っています。ハイスループットフローサイトメトリーベースのアッセイは、読み出し再現性と定量化可能な測定基準の面で優れているが、大規模な金融機関の中核施設の一部であるセルソーターサイトメトリーマルチレーザーフローに簡単にアクセスする必要があります。蛍光ベースのプレートリーダーは、より安く、よりアクセス可能ですが、同じ実験条件下で同じ構築物で測定して得られた信号対雑音比が高い蛍光背景に、大部分で有意に低かったことによるものです。フォアコンジュゲートANのコストtibodiesは、テスト構築物で処理されなければならない適切な対照実験の数に特に起因に因数分解することができます。同じテーマのバリエーションは、費用対効果のために酵素活性ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼ酵素レポーター抗体は、化学発光29,30によってアッセイすることができる蛍光色素標識抗体を変更することが含まれます。
結論：二色蛍光アッセイ、フローサイトメーターを用いて、培養細胞中で発現される組換えタンパク質の相対的な細胞表面発現を推定するために開発されました。 2つだけの蛍光パラメータは、この現在のアッセイに使用したが、このアプローチの高い柔軟性を実証し、単一のセルに30以上の蛍光プローブの同時検出に適しているフローサイトメトリー。このハイスループット超アッセイは、遺伝的変異22,26または翻訳後modificatiの影響を調査するために適合させることができます23アドオンと同様に、膜タンパク質技術39の表面人身売買のためのシャペロンの薬理学的プロファイルを研究。このプロトコルの背後にある原動力は、分離して、組換え細胞内のイオンチャネルの膜発現に対する遺伝子変異の影響を評価する必要性から生まれました。異なる対立遺伝子における変異の組み合わせは、心臓突然死40をトリガする必要がある場合がありますので、モデル細胞株における変異体チャネル機能障害の重症度は、常に部分的に突然変異キャリア5における臨床症状の重症度と相関しないことに留意することが重要です、41。この文脈において、このアッセイは、機能喪失型変異22に関連付けられた単一の遺伝子における単一または複数の突然変異を研究の急速な最初の段階の近似を提供するものとして見ることができます。 cardiomyocyの分化した細胞では、将来的に同じコンストラクトのウイルス媒介発現を想像することがもっともらしいですTE系統。ソーターは、均一な細胞集団のサスペンションと報告蛍光強度の生細胞を扱うサイトメーター全体的に、他の画像または発光技術と比較して、流れます。このプロセスは、さらに穏やかな条件42の下、パラホルムアルデヒド、ローカル形質膜透過化を誘導する工程と、固定を必要とせずに行われます。アッセイは、迅速な特定、および営業日あたり数百のサンプルまでの分析と便利です。分析に加えて、細胞は、最終的に同一の膜タンパク質のより高いまたはより低いレベルで発現している細胞の機能的能力を評価するためにフローサイトメトリーによってソートすることができます。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | Can be substitute with QuickChange site-directed mutagenesis Kit (Agilent, #200523). |
| Tubes 1.5 ml | Sarstedt | 72-690-001 | |
| Tubes 15 ml | Sarstedt | 62-554-002 | |
| Disposable graduated Tranfer Pipets | VWR | 160001-192 | |
| 100 mm culture dish | Corning | 430167 | For standard culture of HEKT cells. |
| 35 mm culture dish | Falcon | 353001 | For standard culture of HEKT cells. |
| Serological pipette 1 ml | Sarstedt | 86.1251.001 | |
| Serological pipette 5 ml | Sarstedt | 86.1253.001 | |
| Serological pipette 10 ml | Sarstedt | 86.1254.001 | |
| Serological pipette 25 ml | Sarstedt | 86.1285.001 | |
| Dulbecco's high-glucose medium | Life Technologies | 12100-046 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, US origin | Life Technologies | 16140-071 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | For liposomal transfection. Can be substituted with calcium phosphate transfection. |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-070 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Trypsin-EDTA (1x) 0.05%, phenol red | Life Technologies | 25300-062 | |
| 1.5 ml microtubes | Sarstedt | 72.690.001 | |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher | BP661-10 | Can be "home-made". |
| Anti-HA FITC conjugated antibody | Sigma | H7411 | |
| IgG1−FITC Isotype Control antibody | Sigma | F6397 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD Biosciences | 554714 | Fixation/Permeabilization. Permeabilization/Wash solution, store at 4 °C. |
| Hemacytometer | Fisher | 49105161 | |
| Trypan Blue | Fisher | 15250061 | To access cell viability. |
| Refrigerated Microcentrifuge, 5430R | Eppendorf | A14H172200 | |
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Fisher | 370 | |
| Laboratory Platform Rocker | Fisher | 545034 | |
| Water Bath | VWR | 89032-216 | |
| BD FACSARIA III | BD Biosciences | 648282 | Flow cytometer. |
| FlowJo Software v10 | FlowJo | FlowJo v10 Dongle | For data analysis. |
References
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