Abstract
Identifikationen af funktionelle driver begivenheder i kræft er centralt for at fremme vores forståelse af kræft biologi og uundværlig for opdagelsen af den næste generation af nye lægemiddelkandidater. Det bliver tydeligt, at mere komplekse modeller for kræft er forpligtet til fuldt ud at værdsætte de medvirkende faktorer, som driver tumorigenese in vivo og øge effekten af nye behandlingsformer, der gør overgangen fra prækliniske modeller til kliniske forsøg.
Her præsenterer vi en metode til frembringelse af ensartede og reproducerbare tumor sfæroider, der kan underkastes siRNA funktionel screening. Disse sfæroider vise mange karakteristika, der findes i solide tumorer, der ikke er til stede i traditionel to-dimension kultur. Vi viser, at flere almindeligt anvendte brystkræft cellelinier er modtagelige for denne protokol. Desuden giver vi proof-of-principle data udnytter brystkræft cellelinje BT474, bekræfter deresafhængighed af amplifikation af den epidermale vækstfaktor receptor HER2 og mutation af phosphatidylinositol-4,5-biphosphat 3-kinase (PIK3CA), når de dyrkes som tumor sfæroider. Endelig er vi i stand til at undersøge og bekræfte den rumlige virkning af disse afhængigheder hjælp immunhistokemi.
Introduction
Solide tumorer vise betydelig histologiske, genetiske og mikro-miljø intra-tumor heterogenitet, som præsenterer klinikere med en betydelig udfordring i at kunne behandle patienter med succes. De fleste modeller, der anvendes til at identificere nye målrettede behandlinger ikke indregnet mange af disse funktioner. Faktisk har de nuværende målrettede behandlinger anvendes i klinikken er udviklet i de sidste ti år beskæftiger screening tilgange, der er afhængige af kræft cellelinjer dyrket under todimensionale (2D) dyrkningsbetingelser. Selv om dette har medført forskellige succeser, såsom receptor tyrosinkinaseinhibitorer, bliver det klart, at mere komplekse modeller for kræft er forpligtet til fuldt ud at værdsætte de medvirkende faktorer, som driver tumorigenese in vivo og øge antallet af nye behandlingsformer, der gør overgangen fra prækliniske modeller til kliniske forsøg. Desuden er det nu godt forstås, at 2D kultursystemer ikke afspejler ivivo adfærd 1,2. For eksempel i dårligt vaskulariserede tumorer, da efterspørgslen efter ilt og næringsstoffer i mikromiljø overstige udbuddet, regioner høje og lave leverancer udvikler. Tilstedeværelsen af lave oxygen (hypoxia) i tumorer, som påvist ved den immunhistokemiske farvning af tumorsektioner for etablerede hypoxiske markører, såsom carbonanhydrase IX (Caïx), korrelerer med en dårligere klinisk resultat ved brystcancer 3,4 Således inkorporerer funktioner såsom hypoxi i screening-modeller kan forbedre vores evne til at opdage nye lægemiddelkandidater, der vil være mere effektive in vivo. Faktisk lykkedes rettet mod aggressive tumorer, der indeholder hypoxi er en klinisk prioritet 5.
Den forandring af traditionelle 2D siRNA screening, i et forsøg på at mere nøjagtigt rekapitulere elementer af de betingelser, der forekommer ved cancerceller i tumormikromiljøet, har ført til identificeringen af adskillige gener thpå har vist sig at være vigtigt for tumorvækst in vivo. Disse omfatter funktionelle genomiske skærme udført under lav serum forhold 6, hypoxiske forhold 7 og i kombination 8. For eksempel inaktivering af 6-Phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), et protein, der er ansvarlig for regulering af kulstof, der tilføres glycolyse, kun induceret apoptose i prostatakræft linjer afledt metastase ved dyrkning i lavt serum. Silencing af PFKFB4 i normale prostata-cellelinjer under de samme betingelser ikke havde nogen effekt, hvorimod, udtømning af PFKFB4 helt ablaterede væksten af prostatakræft cellelinje xenografter 6.
I en udstrakt panel af brystcancer cellelinjer, fortrinsvis undertrykkelse af mono-carboxylase transportør 4 (MCT4) førte til en reduktion af cellelinjen vækst under betingelser med lavt oxygenindhold. Denne sårbarhed blev valideret in vivo i brystcancercellelinie orthotrop xenograFTS. Måske mest slående, silencing af acetyl-CoA syntetase 2 (ACSS2), et enzym der er ansvarlig for omdannelse af acetat til acetyl-CoA, reduceret cancer celleantal under næringsstoffer stressbetingelser (lav oxygen og serum), men havde ringe eller ingen virkning på normale dyrkningsbetingelser 8. Ablation af ACSS2 påvirket væksten af brystkræft og prostatakræft implanteret tyder på, at næringsstoffer gradienter ikke eksisterer i isolation i tumor mikromiljø, og at celler, der bor i disse områder er afgørende for tumor progression 8. Endvidere ACSS2 viste sig også at være vigtige i glioblastom og hepatocellulære carcinomer 9,10, hvilket tyder på, at øget ACSS2 aktivitet i tumorer kan være en fundamental mekanisme, som understøtter vækst under ugunstige forhold.
Kollektivt, disse undersøgelser viser, at den gentog de betingelser, der forekommer in vivo og udførelse siRNA skærme giver mulighed for identifikation af genes essentielle for kræft overlevelse. Såvel som påvirker 2D cancervækst celle under næringsstoffer stressbetingelser, udtømning af målgener i disse undersøgelser inhiberede cancercellelinie kugleformet vækst, spejling, hvad der blev observeret i tumorxenotransplantater 6,8. Således cancercellelinie sfæroider indeholder flere af de forhold, hvorunder der tumormikromiljøet der forlener følsomhed over for ACSS2 silencing. Faktisk sfæroider vise farveforløb næringsstoffer (Serum og ilt), ændringer i pH, tre-dimensionelle (3D) celle-celle kontakt, men også, ændringer i proliferativ hurtighed med celler undergår cellecyklusstop og apoptose. Dette er eksemplificeret ved tilstedeværelsen i kræft sfæroider af nekrotiske områder, en funktion ikke findes i traditionelle 2D kultur.
Kræft celle sfæroider er allerede blevet anvendt som mere biologisk relevante modeller til at screene småmolekyleinhibitorer men dette kun giver mulighed for validering af forbindelsen effekt eller nyorientering af kompounds oprindeligt design for andre sygdomme 11. Aktuelle sfæroid screeningsmetoder ikke mulighed for analysen af specifikt gen udtømning i en high-throughput af højinformativ måde. Her beskriver vi for første gang, en funktionel genomforskning rørledning til at afdække specifikke gen afhængigheder anvender lille interfererende RNA (siRNA) teknologi i cancercellelinie sfæroider. Vi har designet en skræddersyet bibliotek med siRNA'er rettet mod de 200 hyppigst muterede gener i humane brystcancer og vurderet konsekvenserne af gen udtømning på klumpformet størrelse og metabolisk aktivitet i BT474 brystkræft sfæroider. Vi var i stand til robust og reproducerbart afsløre virkningen af ERBB2 og PIK3CA tavshed i 3D kulturer. Desuden kunne vi vurdere virkningen af gen udtynding på den rumlige arkitektur BT474 sfæroider hjælp immunhistokemi.
Protocol
1. Fremstilling af 96-brønds siRNA Plader
BEMÆRK: De ydre kanter af en plade med 96 brønde er mere udsat for fordampning i forhold til andre brønde, således begrænse mængden af siRNA'er til 60 96-brønds plade. Udfyld ydre brønde med almindelig medium eller PBS til at begrænse dette. Desuden er en validering skærm hits anbefales at lindre plade bias.
- Fortynd de siRNA'er til 250 - 500 ng / uL i reduceret serum medium (som pr fabrikantens anvisninger) og alikvot 10 uL til de relevante brønde i ultralav vedhæftet fil plade. Udfør alle skærmbilleder i tre eksemplarer.
BEMÆRK: Indarbejd relevante ikke-målretning (negativ) og dræber (positiv, såsom UBB og PLK1) siRNA kontrol i pladen design for at sikre transfektion effektivitet kan vurderes. Brug af lav-fastgørelsesplader for siRNA arbejde er kritisk, da celler vil blive tilføjet til transfektionsblandingen. Vi kan ikke udelukke, at nogle producenter ultralav vedhæftet filPladerne kan have subtile virkninger på klumpformet vækst. Som sådan anbefaler vi at disse er testet af slutbrugeren. - Dækplader med selvklæbende sæler og opbevares ved -20 ° C.
2. Reverse Transfektion af cellelinie
- På dagen for skærmen, afrimning pladerne ved stuetemperatur og spin i 5 min ved 1.000 xg ved anvendelse af en bordcentrifuge. Der tilsættes 10 pi med reduceret serum medium indeholdende den optimerede-transfektion reagens til hver brønd med en multikanalpipette. Pladerne henstår i 15 minutter for transfektionskomplekser indeholdende siRNA at danne.
BEMÆRK: Denne undersøgelse udnyttet brystcancercellelinie BT474 til funktionel genomisk screening (dyrket i høj glucose DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika). - Trypsinisér cellerne, der skal screenes (0,05% trypsin og 0,53 mM EDTA), indtil de løsnes fra kolben, neutraliseres ved hjælp af passende volumen af cellelinie specific medium og centrifugering i 5 minutter ved 1.000 xg på en bordcentrifuge til fjernelse trypsin. Resuspender celler med en passende mængde af medium og bestemme præcis celle nummer ved hjælp af en celle tæller.
BEMÆRK: Typisk 5.000 celler per brønd er tilstrækkelige til klumpformet dannelse tværs af de fleste testede cellelinjer. Det er vigtigt nøjagtigt at tælle celler som en enkelt cellesuspension for nøjagtige størrelse sammenligninger. - Fortynd celler til 5.000 celler pr 180 pi i koldt medium (4 ° C).
BEMÆRK: Tilsætning af rekonstitueret basalmembranmatrix komponenter vil have en negativ indvirkning transfektionseffektiviteten, og det anbefales, at det ikke bruges. Cell line optimering for at bekræfte klumpformet danner kapacitet og knockdown effekt skal udføres før skærmen. - Overfør cellesuspensionen til et reservoir, til pipette blandes og tilsættes 180 pi til hver brønd i 96-brønds ultralav fastgørelsesplade indeholdende siRNA tidligere fremstillede (2,1).
- Centrifuge pladen ved 1.000 xg i en forafkølet 4 ° C centrifuge i 10 minutter og derefter vende tilbage til et 37 ° C vævsdyrkningsinkubator.
- BEMÆRK: Cellerne vises som en mosaik i bunden af brøndene. Over de næste 12 - 24 t vil cellerne aggregere sammen til en enkelt kugle.
- Efter 24 timer observere cellerne danner en enkelt sfæroid i centrum af brønden. Tilsæt 100 pi af komplet medium til hver brønd for at fremme væksten.
- Påfyld medium efter tre dage. Fjern forsigtigt 100 pi medium fra hver brønd og tilsæt 100 pi frisk medium.
- På dag 7, kvantificere automatiserede klumpformet størrelse på en plade læser, der kvantitativt kan overvåge klumpformet vækst over tid (se afsnit 3).
- Bagefter bestemme cellernes levedygtighed ved hjælp af en selvlysende cellernes levedygtighed farvestof (se afsnit 4).
3. Automatiseret Image Acquisition
- Scan pladerne på en bænk-top, mikro-brønde imaging cytometer på dag 7.
- <li> Åbn softwaren, skal du vælge følgende: '96 brønds plade ', vælge den relevante plade og indtast et eksperiment navn. BEMÆRK: Alle yderligere oplysninger kan også tilføjes i softwaren.
- Vælg "Tumorsphere 'ansøgning. Ret fokus, således at klumpformet er i fokus og har optimal kontrast.
BEMÆRK: Vi anbefaler 'billede baseret fokus' som betydelige variationer i kugleformede størrelser forventes. - Vælg de brønde, der kræver scanning og 'Start scan ".
- Brug af pladen scanner software, sikre, at objektet masken nøjagtigt repræsenterer klumpformet størrelse. Gør dette ved at justere indstillingerne for koloni diameter, grænsekontrol dilatation, minimum tykkelse og præcision, der er specifikke for hver cellelinie testet 11,12.
BEMÆRK: klumpformet område beregnes herefter ved hjælp af softwaren algoritmen. For eksempel præcist at beregne arealet af BT474 sfæroider dyrket i syv dage justere præcision til "høj" end indstille minimum koloni diameter til 200 uM. Dette bør frembringe en passende kugleformet maske repræsenterer sfæroiden område.
BEMÆRK: Disse data kan derefter eksporteres fra maskinen ved hjælp af eksport-funktionen, i i form af en kommenteret datafil. Dato er plade median normaliseret, kombineret og analyseret enten ved z-score eller strengt standardiseret gennemsnitlige forskel (SSMD) for at identificere siRNAs, der havde en statistisk signifikant effekt på klumpformet område.
4. Bestemmelse cellelevedygtighed
- Efter sfæroid område er blevet beregnet, bestemme levedygtigheden anvendelse af et luminescens cellernes levedygtighed farvestof. Forbered reagenset i henhold til fabrikantens anvisninger.
- Fjern forsigtigt 100 pi medium fra hver brønd og tilsæt 100 pi viabilitetsfarvestoffet. Pladerne inkuberes i 15 minutter og derefter scanne med en luminescerende pladelæser.
BEMÆRK: Disse data kan derefter eksporteres fra maskinen ved hjælp af eksport-funktionen, i iform af en kommenteret datafil. Dato er plade median normaliseret, kombineret og analyseret enten ved z-score eller strengt standardiseret gennemsnitlige forskel (SSMD) for at identificere siRNAs, der havde en statistisk signifikant effekt på klumpformet levedygtighed.
Representative Results
Sfæroide assays i ultralave vedhæftede plader med 96 brønde giver en høj kapacitet fænotypisk vurdering af potentiel onkogenicitetsstudie i en sammenhæng, lettere rekapitulerer de fysiologiske forhold i tumorer in vivo. Faktisk er de cancer cellelinjer MCF10DCIS.com og BT474 danner stramme sfæroide strukturer (figur 1A) og immunhistologiske undersøgelse af kugleformede sektioner viste tydelige rumlige ændringer i cellulær og nuklear morfologi. Over tid, nogle sfæroider såsom BT474 sfæroider udvikler nekrotiske regioner, et fælles træk ved aggressive solide tumorer (figur 1b). Nogle sfæroider udvikler ikke nekrotiske kerner, såsom MDA-MB-231-cellelinie, men gøre display markeret variation i den proliferative Ki67, hvilket omvendt korrelerer med spaltede caspsase-3-ekspression, en markør af apoptose (fig 1C). At fastslå, at flere cellelinjer er faktisk recepnativ til siRNA-medieret gen-nedregulering BT474, blev MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 celler revers transficeret med siRNA i syv dage. Tilstedeværelsen af transfektionsreagens (mock) eller transfektion af kontrol- siRNA'er havde ingen effekt på kugleformet levedygtighed, mens silencing af det essentielle gen Ubiquitin B (UBB) signifikant reduceret sfæroid levedygtighed i alle de testede cellelinier (figur 1D).
Vi har designet en menneskelig siRNA bibliotek, der omfattede de hyppigst muterede gener i fravalgt, ER +, HER2 + og tredobbelt negative brystkræft. Dette bibliotek består af gener med kendt funktion, såsom MYC, PIK3CA og TP53 og dem, hvis bidrag til carcinogenese ikke er etableret. Skærmen indeholder også flere ikke-målrettet kontrol siRNA'er (Kontrol # 1, Kontrol # 2) og siRNA'er målretning essentielle gener, såsom PLK1 og UBB, der fungerer som dræbe kontroller (tabel 1). Vi valgte at bruge brystet CancER cellelinier BT474 da de let danner sfæroider uden tilsætning af rekonstitueret basalmembran, er etableret arbejdshest cellelinier og har en kendt genomisk arkitektur. For eksempel, BT474-celler er positive for østrogenreceptoren (ER +), overudtrykker human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2 +) og harbor mutationer i TP53 (E285K) og PIK3CA (K111N) 13.
Under anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, monitorerede vi virkningen gen udtømning havde på sfæroide størrelse og levedygtighed efter syv dages siRNA revers transfektion (fig 1E). Interessant, har de fleste gener ikke har en væsentlig indvirkning på klumpformet område eller levedygtighed (figur 2A). Silencing af FOXO3, PIK3CA, ERBB2 og SF3B1 resulterede i den mest betydningsfulde reproducerbare reduktion i klumpformet størrelse. Denne reduktion blev også observeret i klumpformet levedygtighed efter ERBB2 og SF3B1 lyddæmpning. Opmuntrende, vi confirmed virkningen af PIK3CA, ERBB2 og SF3B1 tavshed på klumpformet størrelse ved hjælp af lys-field mikroskopi (figur 2B). Vi har tidligere identificeret SF3B1 som et essentielt gen i talrige cellelinje modeller og dermed siSF3B1 repræsenterer en god aflivning kontrol foruden UBB 14. Interessant, af alle 200 gener kun undertrykkelse af E-cadherin resulterede i en signifikant stigning i klumpformet levedygtighed (figur 2A). Undersøgelse af sfæroid morfologi viste, at E-cadherin silencing resulterede i et fuldstændigt sammenbrud af sfæroide arkitektur, med levedygtige celler hvilende på bunden af den lave fastgørelse godt (figur 2B). Manuel fornyet undersøgelse af skærmen data klumpformet volumen viste, at dette også var blevet observeret, men var blevet slået ud af området kvantificering grund til objektet er over de begrænsninger, sæt størrelse. Som tidligere fremhævet, BT474-celler overudtrykker receptortyrosinkinase HER2 og harbor et onkogent mutation i PIK3CA (K111N). Vi bekræftede, at lyddæmpning i ErbB2 og PIK3CA resulterede i reduceret kugleformet levedygtighed, mens transfektion med ikke-målretning af kontrollen havde nogen virkning (figur 2C).
Næste undersøgte vi virkningen af siRNA udtømning på klumpformet histologi. BT474 sfæroider blev omvendt transficeret med ikke-targeting kontrol siRNA og siRNA'er rettet mod PIK3CA, ERBB2 og UBB. Nedregulering i ErbB2 og UBB resulterede i en reduktion af den pro-proliferative Ki67 sammenlignet med kontrol siRNA (figur 2D). Aktiveringen af den pro-apoptotiske markør spaltet caspase-3 blev kun observeret efter UBB lyddæmpning, hvilket antyder, at udtømning af HER2 og PIK3CA resulterede ikke i apoptose, men var cytostatisk snarere end cytotoksiske. Faktisk nedregulering af HER2 og PIK3CA førte til en stigning i protein ekspression af cellecyklusstandsningen protein p27 sammenlignet med kontrol transficerede sfæroider.
ent "FO: keep-together.within-side =" 1 "> Taget sammen viser disse resultater, at BT474-celler er drevet af onkogene HER2 og PIK3CA signalering, når de dyrkes som 3D sfæroider Vigtigere viser disse resultater, at det er muligt at. designe og implementere et skræddersyet siRNA screening bibliotek af hundredvis af gener i cancer cellelinje sfæroider robust og reproducerbart.
Figur 1: cellelinie Optimization for 3-dimensionel vækst. A. brystkræft cellelinier, MCF10DCIS.com og BT474 blev dyrket i lave vedhæftede plader i 7 dage. Lysfelt repræsentative billeder blev taget med et inverteret mikroskop. Scale barer = 100 um. B. MCF10DCIS.com og BT474 sfæroider blev dyrket i 28 dage. 100 pi frisk medium blev genopfyldes hver 3 - 4 dage. Sfæroider blev fikseret i 3,8% formaldehyd, embedded, snittet og farvet med hematoxylin og eosin (H & E). Repræsentative billeder vises ved lav og høj forstørrelse. Scale søjler repræsenterer 100 um og 33 um, hhv. C. MDA-MB-231 sfæroider blev dyrket i 21 dage. 100 pi frisk medium blev genopfyldes hver 3 - 4 dage. Sfæroider blev fikseret i 3,8% formaldehyd, indlejret, sektioneret og farvet med Ki67 og spaltes caspase-3. Repræsentative billeder vises. Scale barer = 100 um. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, og JIMT1 cellelinjer blev revers transficeret med mock (kun transfektionsreagens) og styre- siRNA'er og UBB blev ultralav fastgørelsesplader derefter spundet til dannelse sfæroider. Frisk medium (100 pi) blev tilsat på dag 1 og 4. Efter 7 dage blev cellelevedygtighed kvantificeret. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af to uafhængige biologiske replikater udført tredobbelt normaliseret til kontrol # 1. Statistisk signifikans blev beregnet med en UNPAIRED Students t-test (p <0,05). E. En rutediagram opsummerer den omvendte transfektion protokol, der bruges til funktionelt afhøre gen afhængighed i cancercellelinie sfæroider. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Funktionel Genomisk Undersøgelse af BT474 Spheroids afdækker oncogen afhængigheder. A. BT474-celler blev revers transficeret med 200-genet humant siGENOME siRNA bibliotek i tre eksemplarer. blev observeret sfæroid størrelse og levedygtighed. Rå dataværdier var plade median normaliserede og z-scores blev beregnet til at identificere væsentlige outliers større end 1,7x standardafvigelsen af pladen median 15. Bemærk afsidesliggende gener ERBB2, SF3B1, PLK1 og UBB ennd E-cad. siRNAs der væsentligt forhøjede eller reducerede sfæroid område og levedygtighed er skygge i blå og rød, hvor rød skildrer kontrol siRNA-s. B. Celler blev revers transficeret med ikke-targeting kontrol, E-cadherin (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 eller UBB siRNA og derefter centrifugeret i en ultralav fastgørelsesplade til dannelse sfæroider. Efter 7 dage lysfelt repræsentative sfæroide billeder blev taget under anvendelse af et omvendt mikroskop. Scale barer = 100 um. C. Celler blev revers transficeret med ikke-targeting kontrol, PIK3CA, ERBB2 eller UBB siRNA og derefter centrifugeret i en ultralav fastgørelsesplade til dannelse sfæroider. Efter 7 dage blev cellelevedygtighed kvantificeret. Dataene repræsenterer gennemsnittet ± SD af to uafhængige biologiske replikater udført tredobbelt normaliseret til kontrol # 1. Statistisk signifikans blev beregnet ved anvendelse af en uparret Students t-test (p <0,05). D. Efter 7 dage blev sfæroider fikseret, indlejret, sektioneret og farvetfor H & E, Ki67, kløvet caspase-3, og p27. Repræsentative billeder vises. Scale barer = 100 um. Bemærk H & E i de siControl sfæroiderne synes mindre på grund af en artefakt af forarbejdning og individuelle intakt sfæroider valgt til farvning. Dette betyder imidlertid ikke aflede opmærksomheden fra de observerede med de scannede billeder og levedygtighed celle resultater ændringer. Klik her for at se en større version af dette tal.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ikke-targeting 1 | TP53 | DST | KMT2C | Ubehandlet 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | Ikke-targeting 2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | apoB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | ES | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2A | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | LYST | PTEN | SPTA1 | Ubehandlet 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ikke-targeting 1 | enam | RYR2 | BRCA2 | Ubehandlet 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | SI | Ikke-targeting 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | Ubehandlet 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ikke-targeting 1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | Ubehandlet 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | Pengeautomat | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | ScN2a | IPTR3 | ErbB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| PLK1 | eys | SACS | KIAA1109 | MED13 | Ubehandlet 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ikke-targeting | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | Ubehandlet 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | Ikke-targeting 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| mg Am | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | -anlæg | NRP1 | HERC1 | Ubehandlet 2 | VHL | UBB | ||||
Tabel 1: Plate Layout og menneskelige siRNA Bibliotek De-foldning. Tabellen indeholder indholdet af hver af siRNA pools og layout for de lave fastgørelsesplader anvendes i skærmen.
Discussion
Tredimensionelle modeller af kræft i stigende grad anvendes til at evaluere effekten af kendte og hidtil ukendte forbindelser, der er designet til selektivt at dræbe cancerceller. Kræft celle sfæroider er strukturer, der viser forhold mere ligner dem, der findes i tumorer in vivo, således forbindelser, der har øget effektivitet i 3D er mere tilbøjelige til at have en effekt in vivo. Men disse modaliteter ikke mulighed for at identificere potentielt nye mål, som ikke har været genstand for narkotika design, der kunne have en betydelig effekt i behandling af kræft.
Vi udviklede et siRNA funktionel genomforskning tilgang, der er tilladt for varig gendæmpning i op til syv dage i kræft celle linje sfæroider. Der er flere kritiske trin til den protokol, der kræver optimering, før en siRNA skærm kan udføres. Evnen til at danne reproducerbare levedygtige sfæroider i stor skala er afgørende. Endvidere er enppropriate transfektionsbetingelser skal nøje optimeres. Vi foreslår trialing flere forskellige transfektionsreagenser med relevante ikke-målretning og drab kontroller inden du forsøger skærmen. Vi var i stand til at vise, at flere almindeligt anvendte brystkræft cellelinier, nemlig BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 og JIMT1 var modtagelig for siRNA transfektion. Desuden tilbyder vi proof-of-principle data screening de 200 hyppigst muterede gener i brystkræft i BT474 sfæroider, bekræftede deres afhængighed af opformering af HER2 og onkogen mutation af PIK3CA. Interessant silencing af transkriptionsfaktoren FOXO3 resulterede i en reduktion i sfæroid størrelse, men ingen signifikant virkning på levedygtighed. FOXO3 er kendt for at regulere respons på hypoxi, ændre den metaboliske kapacitet af kræftceller giver dem mulighed for at tilpasse sig lettere til deres omgivelser 16. Denne rolle kan potentielt forstyrre cellelevedygtigheden læsning som den opdager ATP overflod, En af de vigtigste produkter i cellens stofskifte.
Til støtte for observation af en reduktion i klumpformet størrelse, har det vist sig, at lyddæmpning af FOXO3 i HeLa-xenotransplantater forringet tumorvækst og induceret apoptose 17. Det er vigtigt at bemærke, at nogle gener kan påvirke kapaciteten af cancerceller for at bevare deres 3D arkitektur, hvilket kan resultere i falske positive. F.eks knockdown af E-cadherin resulterede i opløsning af BT474 klumpformet struktur. Dette var tidligere blevet rapporteret ved brug E-Cadherin målrettede antistoffer 18. Som med enhver screening platform, bør potentielle mål blive screenet igen for at vurdere reproducerbarheden af observerede virkning. Der er begrænsninger for den teknik, nemlig forbigående karakter af siRNA-medieret gen knockdown. Vedvarende tavshed længere end syv dage var ikke opnås med siRNA.
Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at den kan kobles med forskellige andre biometriske farvestoffer ikke kun dem, der vurderer klumpformet levedygtighed, for eksempel, giver geografisk information af klumpformet hypoxi eller overvågning celler undergår apoptose. Desuden fordi plade læseren scanninger er relativt hurtig og ikke-invasiv, virkningen af siRNA'er på klumpformet størrelse kan vurderes over tid i stedet for blot på forsøgsstadiet slutpunktet. Faktisk er vi undersøger i øjeblikket flere af disse muligheder inden for vores screening pipeline. En alternativ fremgangsmåde, der udnytter 3D-kulturer til at identificere hidtil ukendte afhængigheder er anvendelsen af kemiske biblioteker, som inhiberer enten en bred vifte af mål eller bestemte familier af proteiner. Faktisk Bitler et al. udnyttet denne målrettede tilgang til at identificere den syntetiske dødelighed samspillet mellem ARID1A status og EZH2 inhibitorer i æggestokkene klare celle carcinomer 19. Opdagelsen af CRISPR-Cas9 gen redigering teknologi har også tilladt for udviklingen af genetiske skærme i organoide kulturer og in vivo. Men thans tilgang er afhængig af at have passende dyrefaciliteter og kan koste uoverkommelige 20.
Afslutningsvis mener vi, at vi har skitseret en protokol, som mere præcist modeller ilt- og næringsstoffer forløb, som er funktioner i tumor mikromiljø in vivo, der giver mulighed for identifikation af nye cancer mål eller robust validering af de fastsatte mål. Endvidere kan vores protokol anvendes på enhver type cellelinie, som danner sfæroider og dermed kan rutinemæssigt anvendes i kræftforskning community for high-throughput siRNA skærme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
