Abstract
De identificatie van functionele gebeurtenissen bestuurder bij kanker staat centraal in een beter inzicht in de biologie van kanker en onmisbaar voor de ontdekking van de volgende generatie van nieuwe drug targets. Wordt duidelijk dat meer complexe modellen van kanker moeten de factoren die in vivo tumorigenese rijden en verhoging van de effectiviteit van nieuwe therapieën dat de overgang van pre-klinische modellen klinische proeven te waarderen.
Hier presenteren we een methode voor het genereren van uniforme en reproduceerbare bolvormige tumoren die kunnen worden onderworpen aan functionele siRNA screening. Deze sferoïden vertonen veel kenmerken die worden gevonden in vaste tumoren die niet in traditionele tweedimensionale cultuur. We laten zien dat diverse veelgebruikte borstkankercellijnen vatbaar zijn voor dit protocol. Verder bieden we proof-of-principle data met behulp van de borstkanker cellijn BT474 bevestigt hunafhankelijkheid amplificatie van de epidermale groeifactor receptor HER2 en mutatie van fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat 3-kinase (PIK3CA) wanneer gekweekt als bolvormige tumoren. Tot slot, we zijn in staat om verder te onderzoeken en te bevestigen de ruimtelijke impact van deze afhankelijkheden met behulp van immunohistochemie.
Introduction
Vaste tumoren tonen significante histologische, genetische en micro-milieu intra-tumor heterogeniteit, die clinici presenteert een aanzienlijke uitdaging voor het succesvol kunnen behandelen patiënten. De meerderheid van de modellen die worden gebruikt om nieuwe te identificeren gerichte therapieën niet veel van deze functies op te nemen. Inderdaad hebben de huidige gerichte therapieën gebruikt in de kliniek ontwikkeld in de afgelopen tien jaar dienst screeningsmethoden die afhankelijk kankercellijnen gekweekt onder tweedimensionale (2D) kweekomstandigheden. Hoewel dit over verschillende successen, zoals receptor tyrosinekinaseremmers is gebracht, wordt steeds duidelijker dat complexere modellen van kanker moeten de factoren die tumorigenese rijden in vivo en het aantal van nieuwe therapieën die de overgang van maken volle waarderen preklinische modellen klinische proeven. Bovendien is het nu goed begrepen dat 2D kweeksystemen niet om na te denken invivo gedrag 1,2. Bijvoorbeeld in slecht gevasculariseerde tumoren, omdat de vraag naar zuurstof en voedingsstoffen in de micro overtreffen levering, gebieden van hoge en lage leveringen ontwikkelen. De aanwezigheid van weinig zuurstof (hypoxie) in tumoren, zoals gedetecteerd door de immunohistochemische kleuring van tumorsecties voor gevestigde hypoxische merkers zoals koolzuur anhydrase IX (CAIX), correleert met een slechtere klinische uitkomst bij borstkanker 3,4 Aldus kenmerkende eigenschappen zoals hypoxie in screening modellen kunnen onze capaciteit te vergroten om nieuwe drug targets die meer werkzaam in vivo zal ontdekken. Inderdaad, met succes op agressieve tumoren die hypoxie bevatten een klinische prioriteit 5.
Het veranderen van traditionele 2D siRNA screening, in een poging om nauwkeuriger recapituleren elementen van het waarmee kankercellen in de tumor micro omstandigheden, heeft geleid tot de identificatie van verschillende genen thbij gevonden belangrijk tumorgroei in vivo. Deze omvatten functionele genomische screens uitgevoerd onder lage serum condities 6, hypoxische omstandigheden 7 en in combinatie 8. Bijvoorbeeld, onderdrukking van 6-Phosphofructo-2-kinase / fructose-2,6-bisfosfatase 4 (PFKFB4), een eiwit dat verantwoordelijk is voor het reguleren van koolstof die glycolyse, alleen geïnduceerde apoptose in prostaatkankerlijnen afgeleid van metastase wanneer gekweekt in laag serum. Silencing van PFKFB4 in normale prostaat cellijnen die onder dezelfde omstandigheden had geen effect, terwijl, uitputting van PFKFB4 volledig weggenomen de groei van prostaatkanker cellijn xenotransplantaten 6.
In een uitgebreid panel van borstkankercellijnen, de onderdrukking van mono-carboxylase transporter 4 (MCT4) bij voorkeur geleid tot een vermindering van de cellijn groei onder omstandigheden van lage zuurstof. Dit beveiligingslek is gevalideerd in vivo bij borstkanker cellijn orthotroop xenografts. Misschien het meest opvallend, zwijgen Acetyl-CoA synthetase 2 (ACSS2), een enzym dat verantwoordelijk is voor het omzetten acetaat in acetyl-CoA, verminderde kankercel toegekend nutriënten stresscondities (laag zuurstof en serum), maar had weinig of geen effect bij normale kweekomstandigheden 8. Ablatie van ACSS2 invloed op de groei van borst- en prostaatkanker xenotransplantaten suggereren dat voedingsstoffen hellingen bestaan niet afzonderlijk in de tumor micro-omgeving en die cellen die in deze gebieden bevinden essentieel zijn voor tumorprogressie 8. Verder werd ook gevonden ACSS2 belang glioblastoma en hepatocellulaire carcinomen 9,10 te zijn, wat suggereert dat verhoogde ACSS2 activiteit in tumoren een fundamenteel mechanisme dat de groei ondersteunt onder ongunstige omstandigheden zijn.
Tezamen zijn deze studies tonen aan dat de indient aangetroffen in vivo omstandigheden en het uitvoeren van siRNA schermen maakt de identificatie van genes van essentieel belang voor de overleving van kanker. Naast invloed 2D kankercelgroei onder stressomstandigheden voedingsstoffen, uitputting van doelwitgenen in deze studie remde kankercellijn sferoïde groei weerspiegelen wat werd waargenomen bij 6,8 tumorxenotransplantaten. Aldus kanker cellijn sferoïden bevatten verschillende van de aangetroffen in de tumor micro voorwaarden die gevoeligheid voor ACSS2 silencing geven. Inderdaad, sferoïden tonen voedingsstoffen gradiënten (Serum en zuurstof), veranderingen in pH, driedimensionale (3D) cel-cel contact, maar ook veranderingen in proliferatieve celerity met cellen ondergaan celcyclus en apoptose. Dit wordt geïllustreerd door de aanwezigheid van kanker sferoïden van necrotisch gebieden, een eigenschap die niet in traditionele 2D cultuur.
cel kanker sferoïden zijn al gebruikt als biologisch relevante modellen kleinmoleculige remmers te screenen maar staat alleen voor de validatie van verbinding werkzaamheid of herbestemming van compounds oorspronkelijk ontwerpen voor andere ziekten 11. Sferoïde huidige screeningsmethoden niet toelaten de analyse van specifieke genen depletie in een high-throughput of high content wijze. Hier beschrijven we voor de eerste keer, een functionele genomics pijpleiding voor het blootleggen specifiek gen afhankelijkheden gebruikmaking klein interfererend RNA (siRNA) techniek bij kanker cellijn sferoïden. We ontwierpen een op maat gemaakte bibliotheek met siRNA gericht op de 200 meest frequent gemuteerde genen in humane borstkanker en onderzocht de impact van gen uitputting op spheroïde grootte en de metabolische activiteit in BT474 borstkanker sferoïden. We waren in staat om de impact van ErbB2 en PIK3CA zwijgen in 3D culturen robuust en reproduceerbaar te sporen. Bovendien kunnen we de impact van gen uitputting op de ruimtelijke architectuur van BT474 bolletjes met behulp van immunohistochemie beoordelen.
Protocol
1. Voorbereiding van de 96-well siRNA Plates
OPMERKING: De buitenranden van een 96-putjesplaat zijn meer vatbaar voor verdamping in vergelijking met andere putten, dus de hoeveelheid siRNAs beperken tot 60 per 96-well plaat. Vul in de buitenste wells met gewone medium of PBS om deze te beperken. Daarnaast wordt een validatie scherm hits aan te raden om plaat vooroordelen te verlichten.
- Verdun de siRNAs tot 250-500 ng / ul in gereduceerde serum medium (volgens aanbevelingen van de fabrikant) en aliquot 10 pi aan de juiste putjes van de ultra-lage bevestigingsplaat. Voer alle schermen in drievoud.
LET OP: Nemen passende niet-targeting (negatief) en het doden van (positief, zoals UBB en Plk1) siRNA controles in de plaat ontwerp om ervoor te zorgen transfectie-efficiëntie kan worden beoordeeld. Het gebruik van lage-bevestigingsplaten voor de siRNA werk is kritisch, aangezien cellen worden toegevoegd aan het transfectie mengsel. We kunnen niet uitsluiten dat sommige fabrikanten ultra-low attachmentplaten kunnen subtiele effecten op sferoïde groei. Daarom raadzaam deze worden getest door de eindgebruiker. - Afdekplaten met zelfklevende zegels en bewaar bij -20 ° C.
2. Reverse Transfectie van Cell Line
- Op de dag van het scherm Ontdooi de platen bij kamertemperatuur en spin gedurende 5 min bij 1000 xg met een tafelmodel centrifuge. Voeg 10 ul van gereduceerd serum medium dat het optimale transfectie-reagens aan elk putje met een multichannel pipet. Laat de plaatjes gedurende 15 minuten voor transfectie met siRNA complexen te vormen.
Opmerking: Dit onderzoek maakte gebruik van de borstkankercellijn BT474 functionele genomische screening (gekweekt in hoog glucose DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica). - Trypsinize de cellen worden gescreend (0,05% trypsine en 0,53 mM EDTA) totdat ze los te maken van de kolf, neutraliseren met behulp van de juiste omvang van de cellijn SPECIFic medium en centrifugeren gedurende 5 min bij 1000 xg op een tafelmodel centrifuge trypsine te verwijderen. Resuspendeer cellen met een geschikt volume van de middelgrote en bepalen accurate aantal cellen met behulp van een cel teller.
OPMERKING: Typisch 5.000 cellen per well zijn voldoende voor bolvormige formatie in de meeste geteste cellijnen. Het is belangrijk om nauwkeurig te tellen van de cellen als een enkele celsuspensie voor nauwkeurige maat vergelijkingen. - Verdun cellen 5000 cellen per 180 ul medium in koude (4 ° C).
OPMERKING: De toevoeging van gereconstitueerde basaalmembraan matrix componenten negatief effect transfectie-efficiëntie en het wordt aanbevolen dat het niet wordt gebruikt. Cellijn optimalisatie sferoïde vormen capaciteit te bevestigen en knock-down werkzaamheid moeten voorafgaand aan het scherm worden uitgevoerd. - Breng de celsuspensie een reservoir, pipet te mengen en voeg 180 ul aan elk putje van de 96-well plaat ultralage hechting met de eerder bereide siRNA (2,1).
- Centrifuge de plaat bij 1000 xg in een voorgekoelde 4 ° C centrifugeer gedurende 10 min en dan terug naar een 37 ° C weefselkweek incubator.
- OPMERKING: De cellen worden weergegeven als een mozaïek in de bodem van de putjes. In de komende 12-24 uur zullen de cellen met elkaar samen te voegen tot één bol te vormen.
- Na 24 h, moeten de cellen vormen een sferoïde in het midden van de put. Voeg 100 ul compleet medium aan elk putje om de groei te stimuleren.
- Vul medium na drie dagen. Verwijder voorzichtig 100 ul van medium uit elk putje en voeg 100 ul vers medium.
- Op dag 7, kwantificeren van de geautomatiseerde spheroïde grootte op een plaat lezer die kwantitatief bolvormige groei na verloop van tijd kunt controleren (zie hoofdstuk 3).
- Daarna bepalen levensvatbaarheid van de cellen met behulp van een lichtgevende levensvatbaarheid van de cellen kleurstof (zie hoofdstuk 4).
3. geautomatiseerde Image Acquisition
- Scan de platen op een bench-top, micro-well plaat imaging cytometer op dag 7.
- <li> Open de software, selecteert u de volgende: '96 -goed plaat ', selecteert u de juiste typeplaatje en voert een experiment naam. OPMERKING: Eventuele aanvullende informatie kan ook worden toegevoegd aan de software.
- Selecteer de applicatie 'Tumorsphere'. Verander de focus zodat de bolvormige is scherpgesteld en heeft een optimaal contrast.
OPMERKING: Wij raden 'image-based focus' zoals aanzienlijke verschillen in bolvormige maten worden verwacht. - Selecteer de putten die scannen en 'Start scan' vereisen.
- Met behulp van de plaat scanner software, ervoor te zorgen dat het object masker nauwkeurig de bolvormige grootte vertegenwoordigt. Doe dit door aanpassing van de kolonie diameter grens dilatatie, minimale dikte en precisie instellingen, specifiek voor elke cellijn getest 11,12.
OPMERKING: De sferoïde gebied wordt dan berekend met het software-algoritme. Bijvoorbeeld, om nauwkeurig te berekenen het gebied van BT474 sferoïden gekweekt voor zeven dagen aan te passen precisie om 'high' eend de minimale kolonie diameter tot 200 urn. Dit moet een passende sferoïde masker vertegenwoordiger van de sferoïde gebied produceren.
LET OP: Deze gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd uit de machine, met behulp van de export-functie, in de vorm van een geannoteerde gegevensbestand. Date is plaat mediaan genormaliseerd, gecombineerd en door de z-score of strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil (SSMD) geanalyseerd ofwel siRNA dat een statistisch significant effect op spheroïde gebied had te identificeren.
4. Het bepalen van levensvatbaarheid van de cellen
- Nadat sferoïde gebied is berekend, bepaalt de levensvatbaarheid middels een luminescerend cellevensvatbaarheid kleurstof. Bereid het reagens volgens de instructies van de fabrikant.
- Verwijder voorzichtig 100 ul van medium uit elk putje en voeg 100 ul van de levensvatbaarheid kleurstof. Incubeer de platen gedurende 15 min vervolgens scannen met een lichtgevende plaat reader.
LET OP: Deze gegevens kunnen vervolgens worden geëxporteerd uit de machine, met behulp van de export-functie, in inde vorm van een geannoteerde gegevensbestand. Date is plaat mediaan genormaliseerd, gecombineerd en door de z-score of strikt gestandaardiseerde gemiddelde verschil (SSMD) geanalyseerd ofwel siRNA dat een statistisch significant effect op spheroïde levensvatbaarheid hadden te identificeren.
Representative Results
Sferoïde assays ultra-low attachment 96 putjes zorgen voor een hoge-doorvoer fenotypische beoordeling van mogelijke oncogeniteitsstudie in een context die gemakkelijker recapituleert de fysiologische omstandigheden in tumoren in vivo. Inderdaad, de kanker cellijnen MCF10DCIS.com en BT474 vorm strakke bolvormige structuren (Figuur 1A) en immunohistologische onderzoek bolvormige secties toonde duidelijke ruimtelijke veranderingen in de cellulaire en nucleaire morfologie. In tijd sommige Steroiden zoals BT474 sferoïden ontwikkelen necrotische gebieden, een gemeenschappelijk kenmerk van agressieve vaste tumoren (Figuur 1B). Sommige sferoïden ontwikkelen geen necrotische kern, zoals MDA-MB-231 cellijn, maar doen weergave aangegeven variatie in de proliferatie merker Ki67, die omgekeerd correleert met gesplitst caspsase-3 expressie, een marker van apoptose (figuur 1C). Om vast te stellen dat meerdere cellijnen zijn inderdaad recepnatief voor siRNA gene silencing BT474 werden MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 cellen en JIMT1 reverse getransfecteerd met siRNA zeven dagen. De aanwezigheid van transfectiereagens (mock) of transfectie controle siRNA geen effect had op de levensvatbaarheid sferoïde, terwijl zwijgen van het essentiële gen ubiquitine B (UBB) aanzienlijk verminderd sferoïde levensvatbaarheid in alle geteste cellijnen (Figuur 1D).
We ontwierpen een mens siRNA bibliotheek die de meest frequent gemuteerde genen in niet-geselecteerde, ER +, HER2 + en triple negatieve borstkanker omvatte. Deze bibliotheek bestaat uit genen van bekende functie, zoals MYC, PIK3CA en TP53 en die waarvan de bijdrage tot carcinogenese is niet vastgesteld. Het scherm bevat ook een aantal niet-targeting control siRNAs (Control # 1, # 2 Controle) en siRNA targeting essentiële genen, zoals Plk1 en UBB, die als doden controles (tabel 1). We kozen ervoor om de borst canc gebruikener cellijnen BT474 zij gemakkelijk vormen sferoïden zonder toevoeging gereconstitueerde basaalmembraan, gevestigd werkpaard cellijnen en een bekende genomische architectuur. Bijvoorbeeld BT474 cellen positief voor de oestrogeenreceptor (ER +), overexpressie van het humane epidermale groeifactor receptor 2 (HER2) en de haven mutaties in TP53 (E285K) en PIK3CA (K111N) 13.
Gebruikmakend van het protocol hierboven beschreven, we bewaakt de impact gen uitputting had op spheroïde grootte en de levensvatbaarheid na zeven dagen van siRNA reverse transfectie (figuur 1E). Interessant was de meerderheid van genen geen significant effect op sferoïde area of levensvatbaarheid (Figuur 2A) hebben. Silencing van FOXO3, PIK3CA, ERBB2 en SF3B1 resulteerde in de significante reproduceerbare vermindering bolvormige formaat. Deze daling werd ook waargenomen in bolvormige levensvatbaarheid na ERBB2 en SF3B1 silencing. Bemoedigend, we confirmed de impact van PIK3CA, ERBB2 en SF3B1 zwijgen op spheroïde formaat met behulp van bright-field microscopie (Figuur 2B). We eerder geïdentificeerd SF3B1 als een essentieel gen in talrijke cellijn modellen en dus siSF3B1 vormt een goede moord controle in aanvulling op UBB 14. Interessant van 200 genen alleen de onderdrukking van E-cadherine resulteerde in een significante toename van bolvormige levensvatbaarheid (Figuur 2A). Onderzoek bolvormige morfologie aangetoond dat E-cadherine silencing resulteerde in een volledige afbraak van sferoïde architectuur met levensvatbare cellen rust op de bodem van de lage hechting vormt (figuur 2B). Handmatig nieuwe onderzoek van het bolvormige volume scherm gegevens bleek dat deze was ook waargenomen, maar had geëlimineerd uit het gebied kwantificering te wijten aan het object zich boven de ingestelde grootte beperkingen. Zoals eerder vermeld, BT474 cellen overexpressie van de receptor tyrosine kinase HER2 en de haven een oncogene mutatie in PIK3CA (K111N). We bevestigd dat silencing van ErbB2 en PIK3CA resulteerde in verminderde levensvatbaarheid bolvormige, terwijl transfectie met niet-targeting controles geen effect (Figuur 2C) was.
Vervolgens onderzochten we de impact van siRNA uitputting op spheroïde histologie. BT474 sferoïden werden omgekeerde getransfecteerd met niet-targeting controle siRNA en siRNA gericht PIK3CA, ERBB2 en UBB. Silencing van ErbB2 en UBB resulteerde in een vermindering van de pro-proliferatieve marker Ki67 opzichte van siRNA (figuur 2D) te controleren. De activering van het pro-apoptotische marker gesplitst caspase-3 werd alleen waargenomen na UBB silencing, wat suggereert dat uitputting van HER2 en PIK3CA niet tot apoptose maar waren cytostatisch dan cytotoxisch. Inderdaad, onderdrukking van HER2 en PIK3CA resulteerde in een toename van de eiwitexpressie van de celcyclus arrest eiwit p27 vergeleken met getransfecteerde sferoïden controleren.
ent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Samengenomen tonen deze resultaten dat BT474-cellen worden gedreven door oncogeen HER2 en PIK3CA signalering wanneer gekweekt als 3D sferoïden nog belangrijker, deze resultaten dat het mogelijk is. ontwerpen en implementeren van een op maat gemaakte siRNA screening bibliotheek van honderden genen in kanker cellijn sferoïden robuust en reproduceerbaar.
Figuur 1: Optimalisatie voor Cellijn 3-dimensionale groei. A. De borstkankercellijnen, MCF10DCIS.com en BT474 werden gekweekt in laag platen bevestiging voor 7 dagen. Helderveld representatieve beelden werden genomen met behulp van een omgekeerde microscoop. Schaal bar = 100 urn. B. MCF10DCIS.com en BT474 sferoïden werden gekweekt gedurende 28 dagen. 4 dagen - 100 ul vers medium werd elke 3 bijgevuld. Sferoïden werden gefixeerd in 3,8% formaldehyde, embedded, doorgesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E). Representatieve beelden worden getoond bij lage en hoge vergroting. Schaalbalken vertegenwoordigen 100 urn en 33 urn respectievelijk. C. MDA-MB-231 sferoïden werden gedurende 21 dagen. 4 dagen - 100 ul vers medium werd elke 3 bijgevuld. Sferoïden werden gefixeerd in 3,8% formaldehyde, ingebed, coupes en gekleurd met Ki67 en gesplitst caspase-3. Representatieve beelden worden getoond. Schaal bar = 100 urn. D. BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 en JIMT1 cellijnen werden getransfecteerd met omgekeerde mock (alleen transfectiereagens) en de controle siRNA en UBB werden ultralage platen attachment vervolgens gecentrifugeerd om sferoïden te vormen. Vers medium (100 pl) werd toegevoegd op dagen 1 en 4 na 7 dagen werd de cellevensvatbaarheid gekwantificeerd. Gegevens stellen het gemiddelde ± SD van twee onafhankelijke biologische repliceert in drievoud uitgevoerd genormaliseerd bedienen # 1. Statistische significantie werd berekend met een unpaIRED Studenten t-test (p <0,05). E. Een stroomdiagram een samenvatting van de reverse transfectie protocol dat wordt gebruikt om functioneel te ondervragen gen afhankelijkheid bij kanker cellijn sferoïden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Functionele Genomic Onderzoek van BT474 sferoïden onthult Oncogene afhankelijkheden. A. BT474-cellen werden getransfecteerd met de omgekeerde 200-gen menselijk siGENOME siRNA bibliotheek in drievoud. Sferoïde grootte en de levensvatbaarheid werd waargenomen. Ruwe gegevenswaarden plaat waren mediane genormaliseerd en z-scores berekend aanzienlijke uitschieters groter dan 1,7 x de standaarddeviatie van de plaat mediaan 15 identificeren. Opmerking afgelegen genen ERBB2, SF3B1, Plk1 en UBB eennd E-cad. siRNA's die aanzienlijk verhoogd of verlaagd bolvormige gebied en de levensvatbaarheid zijn gearceerd in blauw en rood, waarbij rood toont de controle siRNA's. B. De cellen werden omgekeerde getransfecteerd met niet-targeting controle, E-cadherine (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 of UBB siRNA en vervolgens gesponnen in een ultra-low bevestigingsplaat om bolletjes te vormen. Na 7 dagen, helderveld sferoïde representatieve beelden werden genomen met behulp van een omgekeerde microscoop. Schaal bar = 100 urn. C. De cellen werden omgekeerde getransfecteerd met niet-targeting controle, PIK3CA, ERBB2 of UBB siRNA en vervolgens gesponnen in een ultra-low bevestigingsplaat om bolletjes te vormen. Na 7 dagen werd de cellevensvatbaarheid gekwantificeerd. Gegevens stellen het gemiddelde ± SD van twee onafhankelijke biologische repliceert in drievoud uitgevoerd genormaliseerd bedienen # 1. Statistische significantie werd berekend met behulp van een ongepaarde student t-test (p <0,05). D. Na 7 dagen werden sferoïden gefixeerd, ingebed, coupes en gekleurdH & E, Ki67, gesplitst caspase-3 en p27. Representatieve beelden worden getoond. Schaal bar = 100 urn. Noteer de H & E van de siControl sferoïden kleiner weergegeven door een artefact van de verwerking en individuele intact sferoïden gekozen kleuring. Maar dit doet niets af aan de veranderingen waargenomen met de gescande afbeeldingen en de levensvatbaarheid van de cellen resultaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting 1 | TP53 | DST | KMT2C | onbehandelde 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | Non-targeting 2 | ||
| GATA3 | TTN | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | ABCA13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | APOB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | AAS | CSMD2 | ||
| STARD9 | USH2a | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| Plk1 | SYNE1 | Lyst | PTEN | SPTA1 | onbehandelde 2 | VHL | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting 1 | ENAM | RYR2 | BRCA2 | onbehandelde 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | SI | Non-targeting 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | herc2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | GCC2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ANK3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| Plk1 | PCDH15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | onbehandelde 2 | VHL | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting 1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | onbehandelde 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ANK2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | NOTCH2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | Geldautomaat | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ErbB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | CHD4 | ||
| Plk1 | EYS | SACS | KIAA1109 | MED13 | onbehandelde 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Non-targeting | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | onbehandelde 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | Non-targeting 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | TBX3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| MGAM | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| Plk1 | ZNF462 | SETX | Nrp1 | HERC1 | onbehandelde 2 | VHL | UBB | ||||
Tabel 1: Plaat Layout and Human siRNA Bibliotheek De winding. De tabel bevat de inhoud van elk van de siRNA zwembaden en inrichting voor de bevestiging lage platen gebruikt in het scherm.
Discussion
Driedimensionale modellen van kanker worden steeds meer gebruikt om de werkzaamheid van bekende en nieuwe verbindingen die zijn ontworpen om selectief kankercellen doden evalueren. Cel kanker sferoïden zijn structuren die voorwaarden meer op die aangetroffen in tumoren in vivo geven, dus verbindingen die in 3D toegenomen werkzaamheid eerder effect in vivo heeft. Echter, deze wijze niet kunnen vaststellen van potentieel nieuwe targets geen onderwerp van geneesmiddelontwerp die aanzienlijke werkzaamheid bij de behandeling van kanker zou geweest zijn.
We ontwikkelden een siRNA functionele genomica benadering die manier konden voor duurzame gene silencing voor maximaal zeven dagen bij kanker cellijn sferoïden. Er zijn een aantal kritische stappen om het protocol dat optimalisatie vereisen voordat een siRNA scherm kan worden uitgevoerd. De mogelijkheid om reproduceerbare levensvatbare sferoïden vormen op grote schaal is essentieel. Bovendien is eenppropriate transfectie voorwaarden moeten strikt worden geoptimaliseerd. We raden trialing verschillende transfectiereagentia met aangewezen niet-targeting en het doden van de controles voorafgaand aan het proberen het scherm. We konden aantonen dat verschillende veelgebruikte borstkankercellijnen, namelijk BT474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 en JIMT1 waren ontvankelijk voor siRNA transfectie. Verder bieden we proof-of-principle data screening van de 200 meest frequent gemuteerde genen bij borstkanker in BT474 sferoïden, bevestigden hun afhankelijkheid van de amplificatie van HER2 en oncogene mutatie van PIK3CA. Interessant is silencing van de transcriptiefactor FOXO3 resulteerde in een vermindering van bolvormige grootte, maar geen significant effect op de levensvatbaarheid. FOXO3 is bekend dat de reactie op hypoxie reguleren, veranderen de metabole capaciteit van kankercellen waardoor ze gemakkelijker aanpassen aan hun omgeving 16. Deze rol zou kunnen interfereren met de cellevensvatbaarheid lezen als het ATP overvloed detecteertEen van de belangrijkste producten van de celstofwisseling.
Ter ondersteuning van de waarneming van een vermindering in grootte bolvormige, werd aangetoond dat silencing van FOXO3 in HeLa xenotransplantaten verminderde tumorgroei en 17 geïnduceerde apoptose. Het is belangrijk op te merken dat sommige genen het vermogen van kankercellen om hun 3D architectuur, wat kan leiden tot vals positieven behouden kunnen beïnvloeden. Bijvoorbeeld, knockdown van E-cadherine geleid oplossen van BT474-bolvormige structuur. Dit was eerder gerapporteerd met behulp van E-cadherine antilichamen gericht 18. Zoals bij elke screeningsplatform moeten potentiële doelwitten opnieuw worden gescreend om de reproduceerbaarheid van het effect waargenomen beoordelen. Er zijn beperkingen aan de techniek, te weten de voorbijgaande aard van de siRNA-gemedieerde gen knockdown. Aanhoudende zwijgen langer dan zeven dagen was niet haalbaar met siRNA.
Het voordeel van deze aanpak is dat het kan worden gecombineerd met verschillende andere biomesche kleurstoffen niet alleen die bolvormige levensvatbaar zal zijn, bijvoorbeeld, waardoor ruimtelijke informatie van sferoïde hypoxie of controle cellen apoptose ondergaan. Omdat bovendien de plaatlezer scans relatief snelle en niet-invasieve, het effect van siRNA's op sferoïde grootte kan worden beoordeeld in de tijd in plaats van alleen aan de experimentele eindpunt. Sterker nog, zijn we momenteel het verkennen van een aantal van deze mogelijkheden binnen onze screening pijplijn. Een alternatieve benadering die 3D culturen gebruikt om nieuwe afhankelijkheden identificeren is het gebruik van chemische bibliotheken die ofwel een groot aantal targets of bepaalde families van eiwitten remmen. Inderdaad, Bitler et al. gebruikt deze gerichte aanpak van de synthetische dodelijkheid interactie tussen de status ARID1A en EZH2 inhibitors te identificeren in de eierstokken clear cell carcinoma 19. De ontdekking van CRISPR-Cas9 gen-editing technologie heeft ook de ontwikkeling mogelijk van genetische screens in organoïde culturen en in vivo. Echter, tZijn aanpak is afhankelijk van het hebben van de juiste dier faciliteiten en kunnen worden onbetaalbaar 20.
Tot slot zijn wij van mening dat we een protocol hebben geschetst dat nauwkeuriger modellen van de zuurstof en voedingsstoffen gradiënten, welke kenmerken van de tumor micro-omgeving in vivo, waardoor de identificatie van nieuwe targets kanker of uitgebreide validatie van de vastgestelde doelen zijn. Bovendien kan ons protocol worden toegepast op elk type cellijn die sferoïden vormen en derhalve kan routinematig worden gebruikt in het kankeronderzoek gemeenschap high-throughput siRNA schermen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
