Abstract
Идентификация функциональных событий водителя при раке имеет решающее значение для углубления нашего понимания биологии рака и необходимым условием для открытия следующего поколения новых мишеней для лекарственных средств. Становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и повышает эффективность новых видов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний.
Здесь мы представляем методологию для формирования однородных и воспроизводимых опухолевые сфероиды, которые могут быть подвергнуты миРНК функционального скрининга. Эти сфероиды отображать много характеристик, которые найдены в солидных опухолях, которые не присутствуют в традиционной двухмерной культуры. Покажем, что несколько часто используемых клеток рака молочной железы линии поддаются этому протоколу. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных, использующих рака молочной железы клеточной линии ВТ474, подтверждающие ихзависимость от усиления рецептора эпидермального фактора роста HER2 и мутации фосфатидилинозитол-4,5-бифосфата-3-киназы (PIK3CA) при выращивании в качестве опухолевых сфероидов. И, наконец, мы можем дополнительно исследовать и подтвердить пространственное воздействие этих зависимостей с использованием иммуногистохимии.
Introduction
Солидные опухоли отображать значительное гистологическое, генетические и микро-экологическая гетерогенность внутри опухоли, которая представляет клиницистам серьезную проблему в возможность успешно лечить пациентов. Большинство моделей, используемых для идентификации новых целевых терапии не учитывают многие из этих функций. Действительно, в настоящее время целевой терапии, используемые в клинике, были разработаны в последнее десятилетие с использованием скрининговых подходы, которые основываются на линиях раковых клеток, выращенных в двумерных условиях (2D) культуры. Хотя это привело к различным успехам, такие как ингибиторы рецептора тирозинкиназы, становится очевидным , что более сложные модели рака необходимо в полной мере оценить все способствующие факторы , которые управляют туморогенез в естественных условиях и увеличению числа новых методов лечения , которые делают переход от доклинических моделей для клинических испытаний. Кроме того, теперь хорошо понятно , что системы культуры 2D не отражают вVivo поведение 1,2. Например, в плохо васкуляризируется опухолей, так как спрос на кислород и питательные вещества в микросреде опережать предложение, регионы высоких и низких поставок развиваться. Наличие низкого уровня содержания кислорода (гипоксия) в опухолях, которая была определена иммуногистохимического окрашивания опухолевых участков для установленных маркеров гипоксических , таких как карбоангидразы IX (CAIX), коррелирует с худшим клиническим исходом при раке молочной железы 3,4 Таким образом , содержащего признаки , такие как гипоксия в модели скрининга может улучшить нашу способность обнаружить новые цели наркотиков , которые будут более эффективными в естественных условиях. Действительно, успешно таргетингом агрессивные опухоли , которые содержат гипоксию является клиническим приоритетом 5.
Изменяющий традиционного скрининга 2D миРНК, в попытке более точно резюмировать элементы условий, с которыми сталкиваются раковых клеток в опухоли микроокружения, привело к идентификации некоторых генов-гопри было установлено, что важное значение для роста опухоли в естественных условиях. Они включают в себя функциональные геномные экраны , выполненные в условиях низких сывороточных 6, 7 условиях гипоксии и в комбинации 8. Например, глушение 6-фосфофрукто-2-киназа / фруктоза-2,6-Biphosphatase 4 (PFKFB4), белка, ответственного за регулирование углерода ввод гликолиза, только индуцируется апоптоз в линиях рака предстательной железы, полученных из метастаза при выращивании в условиях низкой сыворотке. Сайленсинг PFKFB4 в нормальных клеточных линиях простаты при тех же самых условиях , не имели никакого эффекта, в то время как, истощение PFKFB4 полностью абляции рост линии клеток рака простаты ксенотрансплантатов 6.
В расширенной панели линий клеток рака молочной железы, замалчивании моно-карбоксилазы транспортером 4 (MCT4) преимущественно приводило к уменьшению роста клеточной линии в условиях пониженного содержания кислорода. Эта уязвимость была подтверждена в естественных условиях при раке молочной железы клеточной линии ортотропного xenograFTS. Пожалуй, наиболее ярко, глушителей из Ацетил-КоА синтетазы 2 (ACSS2), фермент, ответственный за преобразование ацетата в ацетил-КоА, снижается рак количество клеток при питательных условиях стресса (с низким содержанием кислорода и сыворотки), но не имели практически никакого эффекта при нормальных условиях культивирования 8. Абляция ACSS2 повлияло на рост рака молочной железы и рака простаты ксенотрансплантатов , предполагающих , что градиенты питательных веществ не существует в изоляции в пределах микросреды опухоли и клетки , которые находятся в этих областях имеют важное значение для развития опухоли 8. Кроме того, ACSS2 было также установлено, что важную роль в глиобластомы и гепатоцеллюлярной карциномой 9,10, предполагая , что повышение активности ACSS2 в опухолях может быть фундаментальным механизмом , который поддерживает рост при неблагоприятных условиях.
В совокупности эти исследования доказывают , что перепросмотр условия , встречающиеся в естественных условиях и выполнения экранов миРНК позволяет для идентификации гены, необходимые для выживания рака. А также влияет 2D рост раковых клеток при питательных условиях стресса, истощения генов - мишеней в этих исследованиях ингибирует рост рака сфероид клеточной линии, отражая то , что наблюдалось в ксенотрансплантатов 6,8. Таким образом, линии раковых клеток сфероиды содержат некоторые из условий, встречающихся в микросреды опухоли, которые придают чувствительность к ACSS2 глушителей. Действительно, сфероиды отображать градиенты питательных веществ (сыворотка и кислорода), изменения рН, трехмерные (3D) межклеточных контактов, но и изменения в пролиферативной быстроты с клетками, проходящих остановку клеточного цикла и апоптоза. Примером этого может служить наличие в раковых сфероидов некротических областей, функция не найдена в традиционном 2D культуре.
раковая клетка сфероиды уже использовались в качестве более биологически соответствующих моделей для скрининга ингибиторов молекулы небольших, но это позволяет только для проверки соединения эффективности или перепрофилирования из компоunds изначально дизайн для других заболеваний 11. Современные методы скрининга сфероид не позволяют для анализа конкретного гена истощения в высокой пропускной способности высокого содержания способом. Здесь мы описываем впервые, функциональная геномика трубопровод для раскрытия конкретных зависимостей генов с использованием технологии малых интерферирующих РНК (киРНК) в раковых сфероидов клеточной линии. Мы разработали сделанную на заказ библиотеку с миРНК, направленных на 200 наиболее часто мутантных генов в раковых опухолей молочной железы человека и оценили влияние истощения гена на сфероида размера и метаболической активности в ВТ474 рака молочной железы сфероидов. Мы были в состоянии решительно и воспроизводимо обнаруживать влияние ERBB2 и PIK3CA глушителей в 3D культурах. Кроме того, мы могли бы оценить влияние истощения гена на пространственной архитектуры ВТ474 сфероидов с использованием иммуногистохимии.
Protocol
1. Получение 96-миРНК Плиты
Примечание: Внешние края 96-луночного планшета для более склонны к испарению по сравнению с другими скважинами, таким образом, ограничить количество киРНК до 60 на 96-луночный планшет. Заполните внешних скважин с обычной средней или PBS, чтобы ограничить это. Кроме того, экран проверки обращений рекомендуется уменьшить уклоны плиты.
- Развести миРНК до 250 - 500 нг / мкл в сниженной сыворотки среде (в соответствии с рекомендациями производителя) и аликвоты по 10 мкл в соответствующие лунки планшета со сверхнизким крепления. Выполните все экраны в трех экземплярах.
Примечание: Включить соответствующие ненацеливании (отрицательный) и убийства (положительный, такие как UBB и PLK1) управления миРНК в конструкции плиты, чтобы обеспечить эффективность трансфекции может быть оценена. Использование низкого крепежных пластин для миРНК работы имеет решающее значение, так как клетки будут добавлены к трансфекции смеси. Мы не можем исключать, что некоторые производители сверхнизким вложенияпластины могут иметь тонкие эффекты на сфероида роста. Таким образом, мы рекомендуем, чтобы эти испытания конечным пользователем. - Накладки с клейкими уплотнениями и хранить при температуре -20 ° C.
2. Обратный Трансфекция клеточной линии
- В день экрана, размораживать пластин при комнатной температуре и спина в течение 5 мин при 1000 х г, использу настольный центрифуге. Добавьте 10 мкл восстановленного сыворотки среды, содержащей оптимизированный трансфекция реагента в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки. Оставьте пластины в течение 15 мин для трансфекции комплексов, содержащих миРНК с образованием.
Примечание: В данном исследовании использовали линию клеток рака молочной железы ВТ474 для функционального геномного скрининга (культивированные в среде DMEM высокого глюкозы (среда Игла в модификации Дульбекко), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотиками). - Trypsinize клетки должны быть экранированы (0,05% трипсина и 0,53 мМ ЭДТА), пока они не отрываются от колбы, нейтрализуют с помощью соответствующего объема клеточной линии specifIC среднего и спина в течение 5 мин при 1000 XG на настольном центрифуге, чтобы удалить трипсина. Ресуспендируют клетки с соответствующим объемом среды и определить точное количество клеток с помощью счетчика клеток.
Примечание: Обычно 5000 клеток на лунку достаточны для формирования сфероида через большинство клеточных линий тестируемых. Важно, чтобы точно подсчитать клетки, как суспензии отдельных клеток для получения точных сравнений размеров. - Развести клеток 5000 клеток на 180 мкл в холодной среде (4 ° С).
Примечание: Добавление восстановленных компонентов базальной мембраны матрица будет отрицательно воздействовать на эффективность трансфекции, и рекомендуется, чтобы он не используется. Оптимизация Клеточная линия для подтверждения сфероид формирования потенциала и эффективности нокдаун должны быть выполнены до экрана. - Передачи клеточной суспензии в резервуар, пипетка перемешать и добавить 180 мкл в каждую лунку 96-луночного сверхнизким крепежной пластиной, содержащей киРНК приготовленный ранее (2,1).
- Centrifugе планшет при 1000 мкг в предварительно охлажденный 4 ° C центрифуге в течение 10 мин, а затем вернуться к культуре инкубаторе 37 ° C ткани.
- Примечание: Ячейки будут появляться в виде мозаики в нижней части лунки. В течение следующих 12 - 24 ч клетки будут агрегировать вместе, чтобы сформировать единую сферу.
- Через 24 ч наблюдения клетки образуют единый сфероида в центре скважины. Добавьте 100 мкл полной среды в каждую лунку, чтобы стимулировать рост.
- Пополнять среду после трех дней. Аккуратно удалите 100 мкл среды из каждой лунки и добавляют 100 мкл свежей среды.
- На 7-й день, количественно автоматизированный размер сфероида на планшет-ридере, который может количественно контролировать сфероид рост с течением времени (см раздел 3).
- После определения жизнеспособности клеток с использованием люминесцентного жизнеспособности клеток краситель (см раздел 4).
3. Автоматизированная Image Acquisition
- Сканирование пластин на настольном, микро-и визуализации пластины цитометр на 7-й день.
- <li> Откройте программу, выберите: '96 -Ну пластины ', выберите соответствующий тип плиты и введите название эксперимента. Примечание: Любая дополнительная информация может быть добавлена в программное обеспечение.
- Выберите приложение 'Tumorsphere'. Alter фокус так, что сфероид находится в фокусе и имеет оптимальный контраст.
Примечание: Мы рекомендуем "изображения фокус на основе 'как существенные изменения в шаровидных размеров, как ожидается. - Выберите колодцы, которые требуют сканирования и «Начать сканирование».
- С помощью программного обеспечения сканера пластины, убедитесь, что маска объекта точно представляет размер сфероида. Сделайте это путем регулирования диаметра колонии, границы дилатации, минимальная толщина и точность настройки, специфичные для каждой клеточной линии проходят 11,12.
Примечание: сфероида площадь будет рассчитываться с использованием программного алгоритма. Например, чтобы точно рассчитать площадь ВТ474 сфероидов, выращенных в течение семи дней отрегулировать точность до "высокого"d установить минимальный диаметр колонии до 200 мкм. Это должно произвести соответствующий сфероид маски представителя сфероида области.
Примечание: Эти данные затем могут быть экспортированы из машины, с помощью функции экспорта, в в виде аннотированный файла данных. Дата является пластина медианный нормализуется, соединяли и анализировали либо с помощью Z-счет или строго стандартизированной средней разности (SSMD) для идентификации миРНК, которые имели статистически значимое влияние на сфероида области.
4. Определение Жизнеспособность клеток
- После того, как сфероид площадь была рассчитана, определяют жизнеспособность, используя люминесцентный краситель жизнеспособности клеток. Подготовьте реагент в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Тщательно удалите 100 мкл среды из каждой лунки и добавляют 100 мкл жизнеспособности красителя. Инкубируйте пластины в течение 15 мин, затем сканирование с помощью люминесцентного считывания планшетов.
Примечание: Эти данные затем могут быть экспортированы из машины, с помощью функции экспорта, в вформа аннотированный файла данных. Дата является пластина медианный нормализуется, соединяли и анализировали либо с помощью Z-счет или строго стандартизированной средней разности (SSMD) для идентификации миРНК, которые имели статистически значимое влияние на жизнеспособность сфероида.
Representative Results
Сфероида анализы в сверхмалых крепления 96-луночные планшеты обеспечивают оценку фенотипической высокой пропускной способностью для потенциального онкогенности в контексте , который с большей готовностью резюмирует физиологические условия , найденные в опухолях в естественных условиях. Действительно, клеточные линии рака MCF10DCIS.com и ВТ474 образуют плотные шаровидные структуры (рис 1А) и иммуногистохимического Исследование шаровидных участков показали различные пространственные изменения в клеточной и ядерной морфологии. Со временем некоторые сфероиды , такие как ВТ474 сфероидов развиваются некротические участки, общей чертой агрессивных солидных опухолей (рис 1В). Некоторые сфероиды не развиваются некротические сердечники, такие как клеточная линия MDA-MB-231, но сделать дисплей отмеченную вариацию в пролиферативного маркера Ki67, которое обратно пропорционально коррелирует с скола caspsase-3 экспрессии, маркер апоптоза (рис 1C). Для того, чтобы установить, что несколько клеточных линий действительно Реджепательной к киРНК-опосредованного молчанием генов ВТ474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 и клетки JIMT1 были трансфицированы обратной миРНК в течение семи дней. Присутствие трансфекции реагента (притворной) или трансфекции контроля миРНК не оказывает никакого влияния на сфероида жизнеспособность, в то время как глушение основного гена Ubiquitin B (ОББ) значительно пониженную жизнеспособность сфероида во всех клеточных линиях (рис 1D).
Мы разработали человеческую библиотеку миРНК, которая охватывала наиболее часто мутантных генов в невыделенная, ER +, HER2 + и тройной негатив рака молочной железы. Эта библиотека состоит из генов известной функции, такие как MYC, PIK3CA и TP53 и тех, чей вклад в канцерогенеза не установлено. На экране также содержит несколько ненацеливании миРНК управления (Control # 1, # 2 управления) и миРНК ориентации существенные гены, такие как PLK1 и UBB, которые действуют как убийство средства управления (таблица 1). Мы решили использовать груди Отмененаэр клеточные линии ВТ474, поскольку они легко образуют сфероидов без добавления водостойких базальной мембраны, установлены линии рабочей лошадкой клеточные и имеют известную геномную архитектуру. Например, ВТ474 клетки являются положительными для рецептора эстрогена (ER +), гиперэкспрессией человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2 +) и гавань мутации в TP53 (E285K) и PIK3CA (K111N) 13.
Используя протокол , описанной выше, мы провели мониторинг истощение гена влияние имел на сфероида размер и жизнеспособность после семи дней миРНК обратной трансфекции (рис 1E). Интересно отметить , что большинство генов не оказывает существенного влияния на сфероида области или жизнеспособности (фиг.2А). Сайленсинг FOXO3, PIK3CA, ERBB2 и SF3B1 привели к самым значительным воспроизводимым снижению сфероида размера. Это снижение также наблюдалось в сфероида жизнеспособности после ERBB2 и SF3B1 глушителей. Обнадеживает то, что мы Confirmed влияние PIK3CA, ERBB2 и SF3B1 глушителей от размера сфероида с использованием ярко-полевой микроскопии (рис 2B). Ранее мы определили SF3B1 в качестве основного гена в многочисленных моделях клеточных линий и , таким образом , siSF3B1 представляет собой хороший контроль убийство в дополнение к UBB 14. Интересно отметить , что из всех 200 генов только глушителей Е-кадгерина привело к значительному увеличению сфероида жизнеспособности (фиг.2А). Исследование сфероида морфологии показало , что Е-кадгерин глушителей привело к полному разрушению сфероида архитектуры, с жизнеспособными клетками лежит на нижней части низкого крепления скважины (Фигура 2В). Руководство повторное расследование данных экрана объема сфероида показал, что это было также отмечено, но были исключены из области количественной оценки из-за объекта выше ограничений, установленных размеров. Как было отмечено ранее, ВТ474 клетки сверхэкспрессии рецептора тирозинкиназы HER2 и укрывает онкогенного мутации в PIK3CA (K111N). Мы подтвердили , что глушение ERBB2 и PIK3CA привело к снижению жизнеспособности сфероида, в то время как трансфекция ненацеливании контроля не имели никакого эффекта (рис 2C).
Далее мы исследовали влияние истощения миРНК на сфероида гистологии. ВТ474 сфероиды обратный трансфицировали ненацеливании управления миРНК и миРНК ориентации PIK3CA, ErbB2 и UBB. Сайленсинг ERBB2 и UBB привело к уменьшению про-пролиферативного маркера Ki67 сравнению с контрольными миРНК (рис 2D). Активация проапоптотического маркера расщепляется каспазы-3 наблюдалась только после того, как UBB глушителей, предполагая, что истощение HER2 и PIK3CA не приводило к апоптозу, но были цитостатическое, а не цитотоксические. Действительно, глушение HER2 и PIK3CA действительно приводило к увеличению экспрессии белка из клеточного цикла белка p27 сравнению с контрольными трансфицированные сфероидов.
лор "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Взятые вместе, эти результаты показывают, что клетки ВТ474 управляются онкогенного HER2 и PIK3CA сигнализации при выращивании как 3D сфероидов Что еще более важно, эти результаты показывают, что можно. Разработка и внедрение на заказ миРНК скрининга библиотеки сотен генов в линии раковых клеток сфероидов робастно и воспроизводимо.
Рисунок 1: Клеточная линия оптимизации для 3-мерного роста. A. Линии клеток рака молочной железы, MCF10DCIS.com и ВТ474 культивировали в низких пластин крепления в течение 7 дней. Светлое представительные изображения были взяты с использованием инвертированного микроскопа. Масштабные полоски = 100 мкм. B. MCF10DCIS.com и ВТ474 сфероиды культивировали в течение 28 дней. 100 мкл свежей среды пополняется каждые 3 - 4 дня. Spheroids фиксировали в 3,8% формальдегида, еmbedded, профилированные и окрашивали гематоксилином и эозином (H & E). Типичные изображения показаны при низком и высоком увеличении. Масштабные столбики представляют 100 мкм и 33 мкм соответственно. C. MDA-MB-231 сфероидов культивировали в течение 21 дней. 100 мкл свежей среды пополняется каждые 3 - 4 дня. Сфероидов фиксировали в 3,8% формальдегида, заливали, делали срезы и окрашивали Ki67 и расщепляется каспазы-3. Типичные изображения показаны. Масштабные полоски = 100 мкм. Д. ВТ474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231, и JIMT1 клеточные линии обратной трансфицировали фиктивный (только трансфекция реагентом) и миРНК управления и UBB, сверхнизкие крепежные пластины были затем подвергли формованию с образованием сфероидов. Свежую среду (100 мкл) добавляли в дни 1 и 4. По истечении 7 дней жизнеспособность клеток количественно. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение двух независимых биологических повторностей, выполненных в трех экземплярах, нормированной для управления # 1. Статистическую значимость рассчитывали с использованием UNPAIRED Студенты т-тест (р <0,05). E. Блок - схема подведения итогов обратного протокола трансфекции , используемый для функционально опрашивать зависимость генов в раковых клеточных линий сфероидов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Функциональная геномная Исследование ВТ474 СФЕРОИДОВ обнажает онкогенными зависимостями. Клетки A. ВТ474 были обратной трансфицированных 200-гена человеческого siGENOME библиотеки миРНК в трех экземплярах. наблюдалась Сфероид размер и жизнеспособность. Сырые значения данных были пластинчатые медиана нормированные и г-баллы были рассчитаны для выявления существенных выбросов больше , чем 1.7x стандартное отклонение пластины срединного 15. Примечание окраинные гены ERBB2, SF3B1, PLK1 и UBBй E-хам. миРНК, что значительно увеличена или уменьшена площадь сфероида и жизнеспособность закрашены синим и красным, где красный изображает контроль миРНК-х. B. Клетки обратной трансфицировали контролем ненацеливании, Е-кадгерин (E-Cad), PIK3CA, ERBB2 или UBB миРНК , а затем центрифугировали в пластине сверхнизкой крепления с образованием сфероидов. Через 7 дней Светлое представительные сфероида снимки были сделаны с использованием инвертированного микроскопа. Масштабные полоски = 100 мкм. C. Клетки обратной трансфицировали ненацеливании управления, PIK3CA, ERBB2 или UBB миРНК , а затем развернулся в пластине сверхнизким крепления с образованием сфероидов. Через 7 дней жизнеспособность клеток количественно. Данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение двух независимых биологических повторностей, выполненных в трех экземплярах, нормированной для управления # 1. Статистическая значимость была рассчитана с использованием непарных Студенты т-тест (р <0,05). D. Через 7 дней сфероиды фиксировали, заливали, делали срезы и окрашивалидля H & E, Ki67 расщепляется каспазы-3 и р27. Типичные изображения показаны. Масштабные полоски = 100 мкм. Обратите внимание, что H & E сфероидов siControl кажутся меньше из-за артефакта обработки и индивидуальных неповрежденными сфероидов выбранных для окрашивания. Однако это не умаляет изменений, наблюдаемых с отсканированными изображениями и результатами жизнеспособности клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ненацеливании 1 | TP53 | DST | KMT2C | Необработанные 1 | FCGBP | ARID1B | FBXM7 | TTC40 | Ненацеливании 2 | ||
| GATA3 | ТТН | MUC12 | MUC4 | AHNAK | HUWEI1 | DNAH11 | ITPR2 | abca13 | CREBBP | ||
| MAP2K4 | PIK3CA | F5 | APOB | ANKRD30A | MUC17 | DNAH17 | LAMA2 | ACE | CSMD2 | ||
| STARD9 | ush2a | FAT3 | LPR2 | CSMD3 | MYO18B | DNAH5 | MDN1 | ARHGAP5 | DNAH9 | ||
| CXCR3 | MUC16 | RB1 | PKHD1L1 | DNAH2 | SYNE2 | DYNC1H1 | PCLO | CACNA1B | ERBB2 | ||
| PLK1 | SYNE1 | лизатора | PTEN | SPTA1 | Неочищенные 2 | ВХЛ | RYR1 | COL6A3 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ненацеливании 1 | ENAM | RyR2 | BRCA2 | Необработанные 1 | FMN2 | HECW1 | LAMB4 | С.И. | Ненацеливании 2 | ||
| FHOD3 | MACF1 | RYR3 | C2ORF16 | DMD | FRG1 | HERC2 | MYH11 | STAB1 | ZDBF2 | ||
| GOLGA6L2 | NEB | SMG1 | CACNA1E | DNA14 | gcc2 | HIVEP2 | NIPBL | TANC1 | ZNF536 | ||
| HMCN1 | NF1 | UBR5 | CACNA1F | DYNC2H1 | GON4L | HYDIN | PKD1L1 | TF | ank3 | ||
| HRNR | OBSCN | USP34 | CYMA5 | FAM208B | GPR112 | ITSN2 | RNF213 | TPR | ASPM | ||
| PLK1 | Pcdh15 | XIRP2 | COL7A1 | FLG2 | Неочищенные 2 | ВХЛ | SAGE1 | UNC80 | UBB | ||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ненацеливании 1 | DCHS2 | MUC5B | ZFHX4 | Необработанные 1 | MYO9A | SPHKAP | CXORF22 | NCOR1 | VPS13D | ||
| DMXL2 | MXRA5 | ank2 | KIAA1210 | PRUNE2 | TCHH | DANH6 | Notch2 | ANKRD12 | |||
| BIRC6 | DNAH10 | TENM1 | Банкомат | LRP1 | SCN10A | VPS13C | DNAH7 | SPEN | C5ORF42 | ||
| CDH1 | DNAH3 | PEG3 | DIDO1 | MAP1A | SCN2A | IPTR3 | ErbB3 | SRRM2 | CCDC88A | ||
| CUBN | NOCK11 | RELN | DNAH8 | MED12 | SHROOM2 | CEP350 | FAT4 | SZT2 | chd4 | ||
| PLK1 | EYS | SACS | KIAA1109 | MED13 | Неочищенные 2 | KMT2A | VPS13A | UBB | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 |
| Ненацеливании | QSER1 | ARID1A | WDFY3 | Необработанные 1 | SDK1 | TEX15 | LAMA1 | Ненацеливании 2 | |||
| COL14A1 | SHROOM3 | ATRX | EFCAB5 | SF3B1 | CBFB | AHNAK2 | |||||
| CSMD1 | Tbx3 | KIAA0947 | FOXA1 | ITPR1 | DDX3X | KIF4A | |||||
| MEFV | UBR4 | MYCBP2 | INPPL1 | FLG | HECTD4 | FAT2 | |||||
| мгАмн | VCAN | NBEAL1 | MAP3K1 | AKAP9 | GPR98 | FOXO3 | |||||
| PLK1 | ZNF462 | Setx | NRP1 | HERC1 | Неочищенные 2 | ВХЛ | UBB | ||||
Таблица 1: Пластина Layout и человеческая миРНК библиотека Де-свертка. Таблица содержит содержание каждого из бассейнов миРНК и макет для низких пластин крепления, используемых на экране.
Discussion
Трехмерные модели рака все чаще используются для оценки эффективности известных и новых соединений, которые были разработаны для селективного уничтожения раковых клеток. Раковая клетка сфероиды структуры , которые отображают условия более аналогичные тем , которые встречаются в опухолях в естественных условиях, таким образом , соединения , которые увеличили эффективность в 3D, более вероятно , чтобы иметь эффект в естественных условиях. Тем не менее, эти методы не позволяют для идентификации потенциально новых целей, которые не были предметом разработки лекарств, которые могут иметь значительную эффективность при лечении рака.
Мы разработали миРНК функциональному геному подход, который позволил к прочному молчанием генов на срок до семи дней в раковых клеточных линий сфероидов. Есть несколько важных шагов к протоколу, которые требуют оптимизации перед тем экран миРНК может быть выполнена. Способность формировать воспроизводимые жизнеспособные сфероидов в больших масштабах имеет важное значение. Кроме того,ppropriate условия трансфекции должны быть тщательно оптимизированы. Мы предлагаем несколько различных испытания той реагентов трансфекции с соответствующим ненацеливании и убивая контроля до попытки экрана. Нам удалось показать, что несколько часто используемых клеточных линий рака молочной железы, а именно ВТ474, MCF10DCIS.com, MDA-MB-231 и JIMT1 поддавались миРНК трансфекции. Кроме того, мы обеспечиваем проверка и подтверждение принципа действия данных скрининга 200 наиболее часто мутантных генов при раке молочной железы в ВТ474 сфероидов, подтвердили свою зависимость от амплификации HER2 и онкогенных мутаций PIK3CA. Интересно отметить, что глушение фактора транскрипции FOXO3 привело к уменьшению размеров сфероида, но не оказывает существенного влияния на жизнеспособность. FOXO3 , как известно, регулируют ответ на гипоксию, изменяя метаболическую способность раковых клеток , позволяя им адаптироваться с большей готовностью к их среде 16. Эта роль может потенциально мешать чтению жизнеспособности клеток, как он обнаруживает АТФ изобилие, Одним из основных продуктов клеточного метаболизма.
В поддержку наблюдения уменьшение сфероид размера, было показано , что глушение FOXO3 в HeLa ксенотрансплантатов ослабленный рост опухоли и индуцированный апоптоз 17. Важно отметить, что некоторые гены могут влиять на способность раковых клеток, чтобы сохранить их 3D архитектуру, которая может привести к ложных срабатываний. Например, нокдаун E-кадгерина привело к роспуску структуры сфероида ВТ474. Это уже сообщалось ранее , используя E-Cadherin целевых антител 18. Как и с любой скрининговой платформы, потенциальные цели должны быть снова просеивают с целью оценки воспроизводимости наблюдаемого эффекта. Существуют ограничения на технику, а именно переходного характера миРНК-опосредованной гена нокдаун. Устойчивые глушителей больше, чем за семь дней не было достижимо с миРНК.
Преимущество этого подхода состоит в том, что она может быть соединена с различными другими биомуческие красители не только те, которые оценивают жизнеспособность сфероид, например, давая пространственную информацию о сфероида гипоксии или мониторинга клеток, подвергающихся апоптозу. К тому же, так как сканирование планшет-ридер относительно быстрый и неинвазивный, влияние киРНК на сфероид размера может быть оценена в течение долгого времени, а не только на экспериментальной конечной точке. Действительно, мы в настоящее время изучают некоторые из этих проспектов в рамках нашего скрининга трубопровода. Альтернативный подход, который использует 3D культур для идентификации новых зависимостей является использование химических библиотек, ингибирующих либо широкий круг задач или конкретных семейств белков. В самом деле, Bitler и др. использовали этот целевой подход для идентификации синтетического взаимодействия летальности между статусом ARID1A и ингибиторов Ezh2 в яичниках четких карцином 19. Открытие технологии редактирования гена CRISPR-cas9 также позволило для развития генетических экранов в Органоид культурах , так и в естественных условиях. Тем не менее, тего подход зависит от наличия соответствующих технических средств животного происхождения и могут стоить непомерно 20.
В заключение, мы считаем , что мы наметили протокол , который более точно моделирует кислорода и питательных градиенты, которые являются особенности микросреды опухоли в естественных условиях, что позволяет для идентификации новых мишеней рака или надежной проверки установленных целевых показателей . Кроме того, наш протокол может быть применен к любому типу клеток линии, образующей сфероиды и, следовательно, может быть, которые обычно используются в научно-исследовательском сообществе рака высопроизводительный экранов киРНК.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lullaby | Oz Biosciences | LL70500 | lipid-based transfection reagent |
| Viromer | Lipocalyx | VB-01LB-01 | virus-like polymer transfection reagent |
| Ultra-low attachment plate | Corning | CLS7007 | 96 well plate |
| Foil plate seals | ThermoFisher | AB-0626 | |
| Luminescent cell viability dye | Promega | G7570 | CellTitre-Glo |
| Pipette tips (200 μL) | Starlab | S1111-0806 | |
| Pipette tips (10 μL) | Starlab | S1111-3800 | |
| Pipette tips (1, 000 μL) | Starlab | S1122-1830 | |
| Serological pipettes (5 mL) | Sarstedt | 86.1253.025 | |
| Serological pipettes (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.025 | |
| Serological pipettes (25 mL) | Sarstedt | 86.1685.020 | |
| RPMI Media | GIBCO | 11875-093 | |
| DMEM Media | GIBCO | 11965-084 | |
| Opti-MEM | GIBCO | 31985070 | |
| Feta bovine serum | GIBCO | 16140063 | |
| siRNA | Dharmacon | Cherry picked library | |
| Countess Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chamber slides | ThermoFisher Scientific | C10312 | |
| Celigo S | Nexcelom | contact company | |
| Victor X5 | Perkin Elmer | contact company | |
| Benchtop centrifuge | Various | ||
| Axiovert Inverted brightfield microscope | Zeiss | contact company | |
| Tissue culture CO2; Incubator | Various | ||
| Mulitichannel pipette | Various |
References
- Seton-Rogers, S. E., et al. Cooperation of the ErbB2 receptor and transforming growth factor beta in induction of migration and invasion in mammary epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (5), 1257-1262 (2004).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Chia, S. K., et al. Prognostic significance of a novel hypoxia-regulated marker, carbonic anhydrase IX, in invasive breast carcinoma. J Clin Oncol. 19 (16), 3660-3668 (2001).
- Trastour, C., et al. HIF-1alpha and CA IX staining in invasive breast carcinomas: prognosis and treatment outcome. Int J Cancer. 120 (7), 1451-1458 (2007).
- Wilson, W. R., Hay, M. P. Targeting hypoxia in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 11 (6), 393-410 (2011).
- Ros, S., et al. Functional metabolic screen identifies 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 4 as an important regulator of prostate cancer cell survival. Cancer Discov. 2 (4), 328-343 (2012).
- Baenke, F., et al. Functional screening identifies MCT4 as a key regulator of breast cancer cell metabolism and survival. J Pathol. 237 (2), 152-165 (2015).
- Schug, Z. T., et al. Acetyl-CoA synthetase 2 promotes acetate utilization and maintains cancer cell growth under metabolic stress. Cancer Cell. 27 (1), 57-71 (2015).
- Mashimo, T., et al. Acetate is a bioenergetic substrate for human glioblastoma and brain metastases. Cell. 159 (7), 1603-1614 (2014).
- Comerford, S. A., et al. Acetate dependence of tumors. Cell. 159 (7), 1591-1602 (2014).
- Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-dimensional (3D) tumor spheroid invasion assay. J Vis Exp. (99), e52686 (2015).
- Vinci, M., Box, C., Zimmermann, M., Eccles, S. A. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods Mol Biol. 986, 253-266 (2013).
- Barretina, J., et al. The Cancer Cell Line Encyclopedia enables predictive modelling of anticancer drug sensitivity. Nature. 483 (7391), 603-607 (2012).
- Maguire, S. L., et al. SF3B1 mutations constitute a novel therapeutic target in breast cancer. J Pathol. 235 (4), 571-580 (2015).
- Brough, R., et al. Functional viability profiles of breast cancer. Cancer Discov. 1 (3), 260-273 (2011).
- Ferber, E. C., et al. FOXO3a regulates reactive oxygen metabolism by inhibiting mitochondrial gene expression. Cell Death Differ. 19 (6), 968-979 (2012).
- Jensen, K. S., et al. FoxO3A promotes metabolic adaptation to hypoxia by antagonizing Myc function. EMBO J. 30 (22), 4554-4570 (2011).
- Ivascu, A., Kubbies, M. Diversity of cell-mediated adhesions in breast cancer spheroids. Int J Oncol. 31 (6), 1403-1413 (2007).
- Bitler, B. G., et al. Synthetic lethality by targeting EZH2 methyltransferase activity in ARID1A-mutated cancers. Nat Med. 21 (3), 231-238 (2015).
- Dow, L. E., et al. Inducible in vivo genome editing with CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 33 (4), 390-394 (2015).
