Introduction
DNA הסביבה (עדנה) בסביבות מימיות מתייחס לחומר גנטי המצוי בעמודת המים. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגימו את התועלת של עדנה לאיתור דגים מסביבות מימיים שונים, כולל בריכות 1-3, נהרות 4-8, נחלים 9, ומי ים 10-14. רוב המחקרים האלה התמקדו גילוי של יחיד או כמה פולשני 1,4-6,8,14 ונדירים או מאוימים מינים 3,9, בעוד מחקרים שנעשו לאחרונה כמה ניסו זיהוי סימולטני של מינים רבים בקהילות הדגים המקומי 7,9, 12,13,15 ו mesocosms 11,12.
הגישה האחרונה נקראת "metabarcoding" ועדנה metabarcoding משתמש וקבוצה אחת או מספר של פריימרים PCR כדי coamplify אזור הגן על פני דגימות מגוונות טקסונומית. זה ואחריו כנת ספרייה עם אינדוקס בנוסף מתאם, ואת הספריות באינדקס מנותחות על ידי רצף מקביל תפוקה גבוההפּלַטפוֹרמָה. לאחרונה מייה et al. 12 פיתח פריימרים PCR אוניברסלי עבור metabarcoding עדנה מן הדגים (המכונה "MiFish"). פריימרים MiFish ולמקד לאזור hypervariable של הגן המיטוכונדריה 12S rRNA (163-185 נ"ב), אשר מכיל מידע מספיק כדי לזהות דגים למשפחה, הסוג ומינים טקסונומיות למעט במבניהם כמה קשורים זה לזה. עם השימוש של פריימרים אלו metabarcoding עדנה, מייה et al. 12 זוהה יותר מ -230 מינים ימיים סובטרופי מטנקים אקווריום עם שוניות אלמוגים והרכב מינים ליד האקווריום.
תוך אופטימיזציה של פרוטוקול metabarcoding כדי להתאים מי ים טבעי עם רמות משתנות של ריכוז עדנה מן הדגים, יש לנו לב כי פריימרים MiFish נכשלו מדי פעם כדי להגביר את אזור היעד להכנת ספרייה שלאחר מכן. אחת הסיבות סבירות יותר עבור הגברת PCR מוצלחת זה הוא חוסר הכמות מספקת של template DNA הכלול בנפחים קטנים של מים מסוננים (כלומר 1-2 L). למרות ריכוז עדנה מקבוצת טקסונומיות ספציפית הוא לידיעה לפני ההגברה, סינון של כרכי מים גדולים (> 1-2 L) תהיה דרך פשוטה ויעילה כדי לאסוף יותר עדנה מן הסביבות המימיות עם שפע דגים נדיר ביומסה, כגון מערכות אקולוגיות תחת כיפת האוקיינוס במעמקי הים.
ביחס מסננים סיבים דיסק כמקובל בשימוש במספר של מחקר עדנה דגי 16, מחסניות מסננות יש את היתרון של אדיב כרכי מים גדולים לפני סתימת 17. למעשה, מחקר שנערך לאחרונה הראה נפח גדול (> 20 L) סינון של דגימות מי ים החוף באמצעות מחסניות מסננות 18. בנוסף, הם בנפרד ארוזים וסטרילי, וכמה מדרגות העבודה הניסיונית יכולות להתבצע בית המסנן, ובכך להקטין את ההסתברות של זיהום מהמעבדה 19. האחרוןתכונה חיונית עדנה metabarcoding, שבו את הסיכון לזיהום נותר בין הניסוי הגדול אתגרים 20,21. למרות היתרונות הטכניים האלה של מחסניות מסננות, זה לא נעשה שימוש במחקרי עדנה של דגים עם שני חריגים 8,15.
כאן אנו מספקים פרוטוקול עבור סינון של דגימות מים עם מחסנית מסנן וסחיטת עדנה ממסנן שלה מבלי לחתוך את הדיור. כמו כן אנו מספקים שתי מערכות סינון מים חלופיות תלוי כרכי מים (L ≤4 או> 4 L). כדי להשוות את הביצועים של הפרוטוקול החדש שפותח ובפרוטוקול בעבר בשימוש באמצעות מסנן מזכוכית בקבוצת המחקר שלנו 12,14,22,23, אנו מבצעים עדנה metabarcoding ניתוח של מי ים מטנק אקווריום ענק (7,500 מ '3 ) עם הרכב מינים, ולהראות את מספר המינים שזוהו נגזרים משני הפרוטוקולים כתוצאות נציג. h פרוטוקול זהכפי שפותחו עבור metabarcoding עדנה מן הדגים, אך גם לגבי עדנה מאורגניזמים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: פרוטוקול זה אינו עוסק מי דגימה ושיטות metabarcoding. מים אפשר יהיה לטעום באופנים שונים בהתאם למטרות המחקר 16 ותראו מייה et al. 12 לפירוט אודות שיטות metabarcoding באמצעות פריימרים MiFish. ראוי לציין, כי המים שנדגמו צריכים להישמר מאוד קרים מסוננים בתוך כמה שעות, כדי למנוע שפלה של עדנה. כמו כן שימו לב כי פרוטוקול זה כרוך בשימוש של שייקר רוטרי באינקובטור, והאחרון חייב להיות גדול מספיק כדי להכיל את לשעבר. בנוסף, בצנטריפוגה שיכולה להכיל שני 15 מיליליטר ו 50 מ"ל צינורות חרוטים הם הכרחיים כדי להסיר את הנוזל הנותר מן מסנן סינון דואר לאסוף DNA שחולץ בתוך המחסנית, בהתאמה.
1. עיבוד ראש מתברג ושקית פלסטיק L 1
הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L.
- לקדוח חור דרך המרכז של ג בורגap (מצורף בשקית ניילון 1 L הפנויה) עם אותו קוטר (4.8 מ"מ) כמו הצינור מקרין מתוך מחבר luer נעילת זכר. באמצעות צבת אלכסונית, לקצר את הצינור של מחבר luer נעילת הזכר לגובה בלתי הולם (ca. 3 מ"מ) כדי למנוע סתימת כמות קטנה של מים בתוך הכובע לאחר סינון.
- החלת הדבקה מיוחדת עבור פוליאתילן (PE) ו פוליפרופילן (PP) הוא בתחתית המשטח של מחבר luer נעילת זכר בורג כובע, בהתאמה. יש להמתין מספר דקות עבור מליטת דבק טובה (עיין בהוראות היצרן).
- הכנס את מחבר luer נעילת זכר לתוך החור של מתברג. חכה עד מליטת דבק המלאה של שני חלקים (בדרך כלל> 24 שעות). לעקר את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר עם 10% אקונומיקה מסחרי (ca. תת-כלורי נתרן 0.6%) לפני השימוש.
- פאנץ שני חורים בשתי הפינות בתחתית שקית ניילון 1 L כדי לתלות אותו ממקור שאינו mesלוח h (שלב 3). ודאו בקוטר של החורים הוא גדול יותר מזה של השיניים בלוח הרשת.
2. אסיפה של מערכת הסינון
- צרף צינורות ואקום גבוה למחבר הקלט של משאבת aspirator ולצרף את הקצה השני של צינורות אל סעפת. הקפד כי T-שסתום אדום שלוש הסעפת נמצא "במצב הכבוי" (כלומר, אופקי).
- לבישת סט של כפפות נקיות, הכנס luer הנשי הולם ומחבר ואקום בקצות העליון והתחתון של צינורות גומי ואקום לסינון, בהתאמה.
- בזהירות לצרף את luer הנקבה ההולמת ליציאת לשקע של מחסנית המסנן ולצרף למחבר ואקום פקק סיליקון.
סינון 3. דגימות מים (≤4 L) באמצעות מסנן Cartridge
הערה: דלג על שלב זה אם נפח הסינון הוא> 4 L. זה מערכת סינון דורשת f לוח עומד עצמיאו לתלות את שקית פלסטיק ובה 1 ליטר של מים. פנל רשת, חודים מרובים, עמדו על הלוח, כולם הזמין מחנויות מקוונות, יהיו שימושיים להרכבת יחידה זו. חיטוי הכניסה ויציאה כמוס luer עבור המחסנית המסננת לפני השימוש.
- יוצקים את המים 1 L שנדגמו לתוך שקית ניילון ולסגור את מכסה בורג עם מחבר luer נעילת זכר.
- בזהירות לחבר יציאת כניסה של מחסנית המסנן התאספה עם מחבר luer נעילת הזכר של שקית הניילון. אל מעל להדק את מחבר luer נעילה; אחרת היחידה תדלוף פעם השאיבה מתחילה. ודא שכל החיבורים מחוברים היטב לפני שאני תולה את שקית הפלסטיק פאנל רשת.
- בזהירות לתלות את שקית הניילון עם המחסנית המסננת משתי שיניים בלוח הרשת וכנס פקק סיליקון לתוך יציאת כניסה של הסעפת.
- הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, tתרנגולת להפוך את t-שסתום אדום למצב כבוי.
- חזור על 3.1-3.4 צעדים עד כמות המים הרצויה מסוננת.
הערה: לקבלת 1 ליטר של מים שנלקחו שוניות אלמוגים סובטרופי, זה לוקח בערך שלוש דקות הסינון. - מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום.
- כיסוי או בשני הקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה.
- לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה.
- אחסן את מחסנית המסנן ב -20 C לפני מיצוי DNA.
סינון 4. מים (> 4 L) דוגמאות באמצעות מסנן Cartridge
ההערה: דלג על שלב זה אם נפח מי הסינון הוא ≤4 ל מערכת סינון זה דורש בקבוק ספר 10 L מצויד שסתום טיפ של 10 מיליליטר פיפטה חד פעמי. בקוטר פנימי של קצה פיפטה 10 מ"ל (15.0 מ"מ) להתחדד של קצהבסוף צריך להתאים כדי בקוטר חיצוני של השסתום (15.0 מ"מ) יציאת כניסת של מחסנית מסנן, בהתאמה. חיבורי שניהם נשמרים באופן מאובטח במהלך הסינון בהתקף חיכוך. לעקר את קצה פיפטה עם 10% אקונומיקה מסחרי (חומצת נתרן בקירוב 0.6%) לפני השימוש.
- הכן את כמות מתאימה של מים שנדגמו בבקבוק הספר. בחוזקה והכנס את קצה פיפטה 10 מ"ל לתוך השסתום של הבקבוק הספר 10 L.
- בחוזקה להכניס את פתח היציאה של מחסנית המסנן לתוך סוף קצה פיפטה והכנס את פקק סיליקון לתוך יציאת הכניסה של הסעפת. הפעל את aspirator. פתח את t-שסתום האדום לסינון. הפעל את הסעפת עד מחסנית המסנן היא יבשה, ולאחר מכן להפעיל את T-שסתום אדום למצב הכבוי.
הערה: לקבלת 10 ליטר של מי ים שנלקח שוניות אלמוגים סובטרופי חיצוניות, זה לוקח בערך 30-40 דקות עבור הסינון. - מוציאים בזהירות את מחסנית מסנן משקית הניילון ואת מחבר ואקום. שווי הואהקצוות של מחסנית עם כמוסות luer הכניסה והיציאה. לייבל luer מחסנית כניסת הכובע כראוי באמצעות עט ממס הוכחה לייבוש מהיר וסימון הלא מריחה. אחסן את מחסנית המסנן ב -20 ° C לפני מיצוי DNA.
הפקת 5. עדנה מהמסננת
הערה: שלבי 4 ו -5, אנו משתמשים ערכה מסחרית, בעקבות פרוטוקול במידה רב "דם בעלי הגרעין" שמספק ערכה. לשם פשטות, אנו מתארים את ההליך לעיבוד מחסנית פרט. בפועל, אנו ממליצים עיבוד 8 (או את המספר המרבי של צנטריפוגות) או מסננים פחות בכל פעם.
- מחממים באינקובטור ל -56 מעלות צלזיוס.
- להכין צינור 2.0 מ"ל על ידי חיתוך כובע צירים מהצינור. מחק את הכובע.
הערה: צינור זה משמש צינור איסוף עבור הנוזל הנותר במסנן. - הסר את הכניסה (לא מוצא) luer כובע ממחסנית המסנן והכנס את i יציאת כניסהn כדי צינור האיסוף. בחוזקה לאטום חיבור בין צינור המחסנית ואיסוף באמצעות סרט עצמי איטום.
- הכנס את יחידת בשילוב למתאם צנטריפוגות במשך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה מחסנית ב 5000 XG דקות 1 כדי להסיר את הנוזל הנותר במסנן.
- הסר את צינור איסוף ממחסנית מסנן וזורקים הצינור. Re-כובע נמל המפרצון של המחסנית.
- הכינו תערובת של 20 μl פתרון proteinase-K, 220 μl PBS (פוספט בופר; לא מסופק על ידי בערכה) ו -200 μl חיץ AL.
הערה: המחסנית המסננת להכיל עד פי ארבעה כרכים של התערובת (. Ca 1.8 מיליליטר). - הסר את הפקק ולהוסיף את התערובת (440 μl) לתוך המחסנית מסנן באמצעות קצה פיפטה. הכנס פיפטה לחלוטין ליציאת הכניסה כך קצה פיפטה גלוי בתוך המחסנית בדיוק מעל הממברנה.
- Re-כובע יציאת הכניסה ולמקם את המכונית המסננתtridge על שייקר רוטרי.
- מניחים את שייקר רוטרי בחממה שחומם מראש ב 56 C ולהדליק את שייקר במהירות של 20 סל"ד במשך 20 דקות.
- במהלך הדגירה, להכין צינור 2.0 מ"ל חדש, תווית הצינור כראוי באמצעות עט ממס הוכחה ולמקם אותו צינור חרוטי 50 מ"ל.
הערה: לשעבר (2.0 מ"ל) וצינורות האחרון (50 מ"ל) משמשים לאיסוף DNA המחולץ ועבור החזקת הצינור 2.0 מ"ל, בהתאמה. - לאחר הדגירה, להסיר את הפקק והכנס את הכניסה (לא לשקע) יציאה של המחסנית לתוך צינור 2.0 מיליליטר בתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. סגור את צינור חרוטי 50 מ"ל עם ראש מתברג.
- צנטריפוגה צינור חרוטי 50 מ"ל ב 5000 XG במשך 1 דקות כדי לאסוף את ה- DNA חילוץ מהמחסנית. הוצא את המחסנית המסננת ואת צינור 2.0 מיליליטר באמצעות מלקחיים מעוקרים מכסה את הצינור. מחק את מחסנית המסנן.
טיהור 6. של ה- DNA החילוץ
הערה: אנו elute עדנה עם 100 μl חיץ AE במקום 200 μl שצוין במדריך של הערכה המסחרית.
- הוסף 200 μl אתנול (96-100%) ל- DNA חילוץ בצינור 2.0 מ"ל מהשלב לעיל (בערך 440 μl), ומערבבים היטב על ידי vortexing.
- Pipet את התערובת לתוך עמוד ספין להציב צינור איסוף 2 מ"ל. צנטריפוגה ב 5000 XG דקות 1. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
- מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, ולהוסיף 500 μl חיץ AW1, צנטריפוגות דקות 1 ב 5000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
- מניח את טור ספין צינור איסוף חדש 2 מיליליטר, להוסיף AW2 חיץ 500 μl, ו צנטריפוגות במשך 3 דקות ב 20,000 x ז. מחק את הזרימה דרך צינור האיסוף.
- הכין צינור 1.5 מיליליטר חדש (בתנאי שלא על ידי בערכה) ואת התווית הצינור כראוי באמצעות עט עמיד למים עבור ייבוש מהיר ולא מורח תיוג. מעבירים את t טור ספיןo הצינור 1.5 מ"ל.
- Elute את ה- DNA על ידי הוספת 100 חיץ μl AE למרכז הממברנה טור ספין. דגירה של 1 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן צנטריפוגות ב 6000 XG דקות 1.
- מחק את טור הספין מכסה את הצינור. אחסן את ה- DNA מטוהרים ב -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
מבחינה טכנית, קשה לבודד ולכמת עדנה דגים רק מן עדנה בתפזורת חילוץ, משום פריימרים MiFish coamplify באזור היעד מכמה חוליות שאינם דגים, כגון עופות ויונקים, עם מוצרי ה- PCR של באותו גודל (ca. 170 נ"ב 12). במקום לכימות דגי עדנה, אנו מבצעים MiFish metabarcoding ניתוח של עדנה מטנק האקווריום עם הרכב מינים באמצעות שתי שיטות שונות של סינון מיצוי DNA, ולהשוות את המספרים של מינים שזוהו במהלך ספרייה משני הפרוטוקולים. ניסוי פשוט זה נועד להראות היתכנות של הפרוטוקול הנוכחי כמו "תוצאות נציג" ולא להפגין את עליונותו בקפדנות על גילדות אחרות.
דגמנו סך של 30 ליטר של מי ים מטנק Kuroshio באקווריום Churaumi אוקינווה, אוקינאווה, יפן (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). טנק Kuroshio מיועד מפגין megafauna הימי, עם ממדים (ע x אורך x הרוחב) של 35 mx 27 mx 10 מ 'ואת נפח מים כולל של 7,500 מ' 3. זה הבתים כ -60 גדולים קטן בגודל דגי ים מינים האופייניים לאזורים סביב Kuroshio, אחד הזרמים הגבול המערבי זורם צפון מזרח לאורך כל אורכו של יפן. במחקר metabarcoding MiFish הקודם, מייה et al. 12 זוהה 61 63 מינים (97%) הכילו במיכל מחמש דגימות מי ים 2 L.
לסינון של מי הים, השתמשנו מחסניות מסננות (גודל נקבובי = 0.45 מיקרומטר) ומסנן דיסק מהזכוכית (גודל נקבובי = 0.70 מיקרומטר). אנחנו במקביל מסוננים מי הים על אותו סעפת באמצעות שני פרוטוקולים עבור בארבעה כרכים מים (1, 2, 3, ו -4 L; בסך הכל, שמונה מסננים). לאחר הסינון של מי ים, גם אנחנו מסונן 1 ליטר של מי PCR כיתה עם שני המסננים (fמחסנית ilter ולסנן מזכוכית) כמו הפקדים השליליים (שני חסר מסנן). מאלה סוגים של מסננים, שחלצנו עדנה באמצעות הפרוטוקולים החדשים בעבר בשימוש 12, אשר שניהם להעסיק אותה הערכה המסחרית. סך של 10 דגימות עדנה (כולל השנייה השולטת השלילית) היו נתוני MiFish ניתוח metabarcoding כמתואר מייה et al. 12
בקצרה, בצענו סיבוב 1 PCR כדי להגביר את אזור היעד (12S המיטוכונדריה גני rRNA;. Ca 170 נ"ב) וכדי לצרף מתאמים עבור סידור לזווג הסוף. במשך שמונה דגימות עדנה (למעט שתי השולטת השלילית), ערכנו 10 PCR משכפלים לראות וריאציות מספר המינים זוהו בתוך כל דגימה (סה"כ 80 PCRs). הוספנו גם את המסנן ואת חסר PCR עד שמונה כל דגימות עדנה (סה"כ 16 PCRs). בסך הכל, השגנו 96 מוצרים PCR מסבב-1 PCR והם שימשו כתבניות 2nd ימות PCR לאינדקס כפול צירוף מתאמים נוספים להכנת הספרייה הבאה מייה et al. 12
והרצף לזווג הסוף (2 x 150 נ"ב) של 96 ספריות ניב 4,127,546 קורא, עם ממוצע של 42,995 קורא לכל ספרייה (40,539 קורא במחסנית לסנן 43,121 קורא במסנן מהזכוכית). לאחר demultiplexing מראש העיבוד הבא של הנתונים הגולמיים, 1,068,266 כניסות נשמרו עבור החיפושים יפציצו למשימת טקסונומיות. מתוכם קורא, 830,788 כניסות זוהו המינים הללו הכלול הטנק Kuroshio (טבלה 1). זיהינו 60 מינים מיכל מ 830,788 קורא את המספרים הממוצע של מינים שזוהו עבור 10 PCR משכפל משמונה דגימות עדנה נע בין 29 ל 1 L (מסנן מזכוכית) 55 עבור 4 L (מחסנית מסנן) (טבלה 1) . מספרים קראו משני חסרות משמונה דגימות העדנה היו מינוריים, בטווח שבין 0עד 12 עבור מין הטנק.
מצאנו כי מספר המינים שזוהו על-ידי מחסנית מסנן היה גבוה משמעותית מאלה של מסנני-סיבי זכוכית (ANCOVA, F = 381.8, p <0.001; איור 1) על פני 1-4 כרכים מי ים L. מספר מינים שזוהו על-ידי מחסנית מסנן היו כ גבוה פי 1.5 מאלה באמצעות מסנני-סיבי זכוכית, בשתי השיטות, מספר המינים שזוהו גדל עם נפח של מים מסוננים (ANCOVA, F = 164.2, p <0.001).
מספרים גבוהים יותר של מינים שזוהו על-ידי מחסנית המסנן עלולים לגרום מאחד או יותר מהצעדים הבאים זרימות העבודה הניסוייות: סינון של המים שנדגמו דרך (1) חומרים שונים (PVDF הידרופילי [difluoride polyvinylidine] לעומת מיקרופייבר זכוכית) ו / או (2) גדלים נקבוביים נומינליים שונים (0.4581; מ 'לעומת 0.70 מיקרומטר) במחסניות המסננות ומסננים מהזכוכית יוכל להחזיק יותר מ עדנת דגים על המסנן לשעבר; (3) שימוש שייקר רוטרי בחממה שחוממה מראש מייצר תשואת DNA יותר ממחסניות המסנן מאשר מן המסננים מהזכוכית המקופלות טור ספין דגש על גוש חום ללא תנועה; אוסף (4) של ה- DNA שחולץ על ידי צנטריפוגה ממחסנית המסנן יעיל יותר מזה ממסנן מהזכוכית בשל חומרי סינון שונים ו / או שיטות צנטריפוגה שונות. ככל הנראה, שיעוצב יותר בקפדנות נדרש לאתר את הגורמים אחראים למספר בעקביות הגבוה של מינים שזוהו על-ידי מחסנית המסנן במחקר הנוכחי.
איור 1: מספר זמם מינים זוהו נגד כרכי מים מסוננים ב MiFish Metabarcoding אנה תמוגה של עדנה מטנק Kuroshio, אקווריום Churaumi אוקינאווה. מספר המינים שזוהו מוגבלת למין כלול הטנק. מ 30 ליטר של מי ים, סננו 1, 2, 3, ו -4 דגימות L משתמש במחסניות מסננות מסננים מזכוכית והוציא עדנה מן מסננים אלו באמצעות פרוטוקולים בהווה שתואר לעיל 12, בהתאמה. בצענו ניתוח metabarcoding MiFish (זיהוי סימולטני של מינים רבים) במשך 10 PCR משכפלים מארבעת כרכי המים באמצעות שני פרוטוקולים. הבר האופקי בתיבה מייצג את החציון; את הקצוות העליונים ותחתונים של התיבה מתאימות-אחוזונים יתר, הקווים האנכיים מתאימים 1.5 x אחוזונים, ואת הנקודות מייצגות חריגות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
טבלת 1:.. רכב טקסונומי ומספרי הספר המומלצים של 60 המינים זוהו ניתוח MiSeq של דוגמאות עדנה מטנק Kuroshio רק אלה המינים כלולים הטנק עם רצפי הפניה באתר המותאם אישית מוצגים אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של בטבלה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקרים רבים metabarcoding באמצעות דגימות סביבתיות כגון מים ואדמה, טיפול סינון לתפקיד מחסנית המסנן הוא בדרך כלל כדלקמן 24,25: 1) חיתוך פתוח או פיצוח דיור עם כלי יד (חותך צינורות או צבת); 2) הסרת המסנן מהמחסנית; ו -3) חיתוך המסנן לחתיכות קטנות עם סכין גילוח להפקת DNA. כדי להימנע מסורבל ונדרש זמן רב נהלים כאלה שמועדים זיהום במעבדה, ניסינו מספר שיטות DNA חילוץ בתוך הדיור של המחסנית המסננת באמצעות ערכה מסחרית בשימוש נרחב, לא יקרה, פתח בהצלחה בפרוטוקול הנוכחי עם נוחים מניתוח תוצאות metabarcoding עדנה (איור 1).
אחד השלבים הקריטיים יותר בפרוטוקול הנוכחי הוא השימוש שייקר רוטרי חממה שחוממה מראש, כי הוא מסוגל לספק תשואת DNA טובה prepar ספרייה עוקבation בניתוח metabarcoding עדנה. ערבוב מתמיד של הפתרון-K proteinase בתוך הדיור בטמפרטורה אופטימלית כנראה הופך לפשוט מיצוי דנ"א חלקיקים לכודים על המסנן. שים לב, עם זאת, כי פרוטוקול זה כרוך בשימוש הן שייקר רוטרי באינקובטור, וזו חייבת להיות מסוגלת להכיל את לשעבר. בנוסף, בצנטריפוגה שיכול להכיל שני 15 מ"ל צינורות חרוטי 50 מ"ל היא הכרחית עבור הסרת את הנוזל הנותר מן מסנן סינון פוסט ואיסוף DNA חילוץ בתוך המחסנית, בהתאמה.
אין אפשרות אחרת להשיג מיצוי DNA כזה מבלי לחתוך את המחסנית (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים). ההערכה אינה משתמשת בשום אנזימים להפקת DNA; במקום זאת הוא משתמש חיץ תמוגה מיוחד בשילוב עם תמוגה מכני נוסף עם מכות חרוז. בניסויים ראשוניים המבוססים על מי ים טבעי מאוקיינוס שקט החוף הממוזג, אנחנו attempעקירות טד DNA באמצעות ערכה זו יחד עם אב טיפוס של הפרוטוקול הנוכחי באמצעות הערכה המסחרית. עם השימוש בפרוטוקול אבטיפוס האחרון, אנחנו בעקביות מוכר מוצרי הגברה ברורים ג'ל אלקטרופורזה עבור סיבוב 1 PCR. לעומת זאת, לא הצלחנו להשיג כל מוצרי ה- PCR באמצעות ערכה שונה (ראה חומרים / טבלת ריאגנטים) למרות בעקבות שני פרוטוקולים חלופיים שספקו יצרן. בהתחשב בכך צעדים מעכבים הסרת PCR כלולים ב- שני הפרוטוקולים של הערכה השנייה (ראה חומרים / ריאגנטים טבלה), תצפית זו מרמזת על חוסר הכמות מספקת של DNA בתבנית. תשואות DNA כזה יחסית נמוכות מ דגימות סביבתיות באמצעות ערכת השני מדווחות במחקרים האחרונים 26,27.
בפרוטוקול הנוכחי, בחרנו את מחסנית המסנן עם גודל נקבובי נומינלי גדול (0.45 מיקרומטר), בעוד conventiona מחקרים מיקרוביאליים מימיlly להשתמש אחד קטן (0.22 מיקרומטר) לאחר prefiltration דרך מסננים נקבוביות בגודל גדול יותר (1 עד 3 מיקרומטר) 28. הסיבות לפי בחירתנו הן פשוט וברורות, ואינן מבוססות על טיעונים תיאורטיים: 1) על הגודל הנקבובי הוא הרבה יותר קרוב לזה של המסננים-סיב זכוכית (0.70 מיקרומטר) השתמשנו מקובל באותו העדנה קודמת לומד 12,14, 22,23; 2) זה צפוי לאפשר כמויות גדולות יותר של מים כדי להיות מסוננות מזו הקטנה. התכונה האחרונה היא משמעותית במיוחד עבור הפרויקטים המחקריים הנוכחיים שלנו עוברים בתוך המערכות אקולוגיות תחת כיפת האוקיינוס במעמקי ים עם שפע דגים נדיר ביומסה. למעשה, אשרנו סינון המוצלח של מי ים 10-L של שנדגמו באופן עצמאי מטנק Kuroshio ללא סתימת מורגש (תוצאות לא מוצגות). לאחרונה, עם זאת, טרנר et al. 29 הראה כי 0.2 מיקרומטר סינון ללכוד עדנה קרפיון מוגדלת (85% ± 6%) תוך מזעור כולל (כלומר מי שאינו יעד) עדנהלכידה (48% ± 3%), אבל מסנן סתימת מוגבל גודל נקבובי זה נפח דגימה של פחות מ -250 מיליליטר. מחקרים נוספים נדרשים כדי לקבוע את עוצמת קול סינון גודל ומים נקבובי מסנן האופטימלי של מחסנית מסנן עדנה metabarcoding בסוגים שונים של סביבות מימיות עם רמות משתנות של שפע ביומסה דגים.
אחת המגבלות של פרוטוקול זה הוא כי סינון המים צריך להתבצע במעבדה שבה אספקת חשמל זמינה. בגלל יציבות כימית המוגבלת של ה- DNA, עדנה מתחילה להיפגע ברגע זה מזיל מאורגניזם והוא לזיהוי רק לתקופה קצרה של זמן בסביבות מימיות (שעות עד ימים) 30. לכן הוא אידיאלי כדי לסנן את דגימת המים מייד לאחר איסוף, כדי למנוע השפלה משמעותית של עדנה. בהקשר זה, ההתפתחויות של שיטות סינון באתר באמצעות מחסנית מסנן יהיה הצעד הבא מבטיח. טלטלות sterility של מחסנית המסנן לאפשר פיתוח של שיטות הסינון באתר, אשר תספקנה עדנה שלמה יותר שיכול לשקף רכב מינים של קהילת הדגים באופן מדויק יותר עדנה metabarcoding. העדנה שנאספה על המחסניות המסננות עשויה להיות מיוצב על ידי ההזרקה של מגיב מסחרי 31 (ראה חומרים / טבלת ריאגנטים) או Longmire חיץ 32 לתוך המחסנית לפני להביא אותו בחזרה למעבדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
