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पानी के नमूने निस्पंदन और पर्यावरण डीएनए की निकासी के लिए एक फिल्टर कारतूस का प्रयोग करें

Published: November 25, 2016 doi: 10.3791/54741
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 4, 2, 1, 5
1Department of Ecology and Environmental Sciences, Natural History Museum and Institute, Chiba, 2Graduate School of Human Development and Environment, Kobe University, 3Faculty of Science and Technology, Ryukoku University, 4Okinawa Churashima Research Center, 5Graduate School of Simulation Studies, University of Hyogo

Introduction

पर्यावरण डीएनए (एडना) जलीय वातावरण में पानी स्तंभ में पाया आनुवंशिक सामग्री को दर्शाता है। हाल के अध्ययनों से, तालाबों 1-3, 4-8 नदियों सहित विभिन्न जलीय वातावरण, से मछलियों का पता लगाने के लिए एडना की उपयोगिता का प्रदर्शन किया धाराओं 9, और समुद्री जल 10-14। इन अध्ययनों में से अधिकांश, एक या कुछ आक्रामक 1,4-6,8,14 और दुर्लभ या संकटग्रस्त प्रजाति 3,9 का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित है, जबकि कुछ हाल के अध्ययनों से स्थानीय मछली समुदायों 7.9 में कई प्रजातियों के एक साथ पता लगाने का प्रयास 12,13,15 और mesocosms 11,12।

बाद दृष्टिकोण "metabarcoding" कहा जाता है और एडना metabarcoding पीसीआर प्राइमरों के एक या एकाधिक सेट का उपयोग करता है taxonomically विविध नमूने भर में एक जीन क्षेत्र coamplify करने के लिए। इस अनुक्रमण और एडाप्टर अलावा के साथ पुस्तकालय तैयारी द्वारा पीछा किया जाता है, और इंडेक्स पुस्तकालयों एक उच्च throughput समानांतर अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण कर रहे हैंमंच। हाल ही में मिया एट अल। 12 मछलियों ( "MiFish" कहा जाता है) से एडना metabarcoding के लिए सार्वभौमिक पीसीआर प्राइमरों विकसित की है। MiFish प्राइमरों mitochondrial 12S rRNA जीन (163-185 बीपी) है, जो वर्गीकरण परिवार, वंश और कुछ निकट से संबंधित congeners के लिए छोड़कर प्रजातियों के लिए मछलियों की पहचान करने के लिए पर्याप्त जानकारी शामिल की एक hypervariable क्षेत्र को लक्षित। एडना metabarcoding में उन प्राइमरों के उपयोग के साथ, मिया एट अल। 12 मछलीघर के पास ज्ञात प्रजातियों की संरचना और प्रवाल भित्तियों के साथ मछलीघर टैंक से 230 से अधिक उपोष्णकटिबंधीय समुद्री प्रजातियों का पता चला।

metabarcoding प्रोटोकॉल के अनुकूलन मछलियों से एडना एकाग्रता के स्तर पर अलग से प्राकृतिक समुद्री जल को समायोजित करने के लिए करते हैं, हमने देखा है कि MiFish प्राइमरों कभी कभी बाद में पुस्तकालय तैयारी के लिए लक्ष्य क्षेत्र बढ़ाना करने में विफल रहा। इस असफल पीसीआर प्रवर्धन के लिए और अधिक होने की संभावना कारणों में से एक ते की पर्याप्त मात्रा की कमी हैmplate डीएनए पानी की छोटी मात्रा में छान में निहित है (यानी 1-2 एल)। हालांकि एक विशिष्ट वर्गीकरण समूह से एडना एकाग्रता, बड़ी पानी की मात्रा (> 1-2 एल) के निस्पंदन प्रवर्धन से पहले अज्ञात है दुर्लभ मछली बहुतायत और बायोमास, जैसे के साथ जलीय वातावरण से अधिक एडना इकट्ठा करने के लिए एक सरल और प्रभावी का मतलब होगा खुले समुद्र और गहरे समुद्र में पारिस्थितिक तंत्र।

डिस्क फाइबर फिल्टर के सापेक्ष पारंपरिक मछली एडना अनुसंधान 16 की संख्या में इस्तेमाल किया, फिल्टर कारतूस 17 clogging से पहले बड़ा जल की मात्रा को समायोजित करने में फायदा है। वास्तव में, एक ताजा अध्ययन में बड़ी मात्रा में (> 20 एल) फिल्टर कारतूस 18 का उपयोग करते हुए तटीय समुद्री जल के नमूनों की छानने का पता चला है। इसके अलावा, वे व्यक्तिगत रूप से पैक कर रहे हैं और बाँझ, और प्रयोगात्मक कार्यप्रवाह के लिए कई कदम फिल्टर आवास में किया जा सकता है, इस प्रकार प्रयोगशाला 19 से संक्रमण की संभावना को कम करने। बाद वालासुविधा एडना metabarcoding के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें प्रदूषण का खतरा बना रहता है के बीच सबसे बड़ा प्रयोगात्मक को चुनौती दी 20,21। फिल्टर कारतूस के इन तकनीकी फायदे के बावजूद, यह दो अपवाद 8,15 साथ मछलियों की एडना अध्ययन में इस्तेमाल नहीं किया गया है।

यहाँ हम आवास खोलने में कटौती करने के लिए बिना अपने फिल्टर से फिल्टर कारतूस और एडना की निकासी के साथ पानी के नमूनों की छानने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। हम यह भी दो वैकल्पिक पानी छानने का काम पानी की मात्रा (≤4 एल या> 4 एल) के आधार पर सिस्टम प्रदान करते हैं। नव विकसित प्रोटोकॉल का प्रदर्शन और एक पहले से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल हमारे शोध समूह 12,14,22,23 में एक ग्लास फाइबर फिल्टर का उपयोग करने की तुलना करने के लिए, हम एडना एक बड़ा मछलीघर टैंक से समुद्री जल का विश्लेषण metabarcoding प्रदर्शन (7,500 मीटर 3 ) ज्ञात प्रजातियों में रचना के साथ, और प्रतिनिधि परिणाम के रूप में दो प्रोटोकॉल से निकाली गई पता चला प्रजातियों की संख्या दिखा। इस प्रोटोकॉल जके रूप में मछलियों से एडना metabarcoding के लिए विकसित किया गया है, लेकिन यह भी अन्य जीवों से एडना के लिए लागू है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल के पानी के नमूने और metabarcoding तरीकों के साथ सौदा नहीं करता है। जल अध्ययन प्रयोजनों के 16 के आधार पर अलग शिष्टाचार में जांचा और MiFish प्राइमरों का उपयोग metabarcoding तरीकों की जानकारी के लिए देखते हैं Miya एट अल। 12 हो सकती है। ध्यान दें कि जांचा पानी बहुत ठंडा रखा जाना चाहिए और कुछ ही घंटों के भीतर फ़िल्टर एडना की गिरावट से बचने के लिए। यह भी ध्यान रखें कि इस प्रोटोकॉल एक रोटरी प्रकार के बरतन और एक मशीन का इस्तेमाल शामिल है, और बाद काफी बड़े पूर्व समायोजित करने के लिए किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एक सेंट्रीफ्यूज है कि दोनों 15 मिलीग्राम और 50 मिलीग्राम समायोजित कर सकते हैं शंक्वाकार ट्यूबों के बाद निस्पंदन फिल्टर से शेष तरल दूर करने के लिए और क्रमश: कारतूस के भीतर निकाले डीएनए एकत्र करने के लिए अपरिहार्य है।

1. एक पेंच टोपी और एक 1 एल प्लास्टिक की थैली प्रसंस्करण

नोट: इस चरण को छोड़ें यदि निस्पंदन मात्रा> 4 एल है

  1. एक पेंच सी के केंद्र के माध्यम से एक छेद ड्रिलए.पी. (एक डिस्पोजेबल 1 एल प्लास्टिक की थैली से जुड़ी) एक ही व्यास (4.8 मिमी) ट्यूब एक पुरुष luer ताला कनेक्टर से पेश रूप के साथ। विकर्ण सरौता का उपयोग करना, एक उचित लंबाई (सीए। 3 मिमी) के लिए पुरुष luer ताला कनेक्टर की ट्यूब को छोटा छानने के बाद टोपी के अंदर पानी की एक छोटी राशि के clogging से बचने के लिए।
  2. दोनों नीचे और पुरुष luer ताला कनेक्टर की सतह के लिए चिपकने वाला एक पॉलीथीन (पीई) और polypropylene (पीपी) के लिए विशेष गोंद लागू करें और पेंच टोपी, क्रमशः। अच्छा चिपकने वाला संबंध के लिए कुछ मिनट (निर्माता के निर्देशों को देखें) रुको।
  3. पेंच टोपी के छेद में पुरुष luer ताला कनेक्टर डालें। दो भागों (आमतौर> 24 घंटा) की पूरी चिपकने वाला संबंध जब तक प्रतीक्षा करें। 10% वाणिज्यिक ब्लीच (सीए। 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट) उपयोग करने से पहले साथ पुरुष luer ताला कनेक्टर के साथ पेंच टोपी जीवाणुरहित।
  4. आदेश में 1 एल प्लास्टिक की थैली में से दो नीचे कोनों पर दो छेद पंच एक एमईएस से लटकाज पैनल (चरण 3)। सुनिश्चित करें कि छेद का व्यास जाल पैनल पर prongs की तुलना में बड़ा है।

2. निस्पंदन सिस्टम के विधानसभा

  1. एक Aspirator पंप के इनपुट कनेक्टर के लिए उच्च वैक्यूम ट्यूबिंग देते हैं और एक कई गुना करने के लिए ट्यूबिंग के दूसरे छोर देते हैं। सुनिश्चित करें कि कई गुना के तीन लाल टी-वाल्व "बंद की स्थिति" (यानी, क्षैतिज) में हैं।
  2. दस्ताने की एक स्वच्छ सेट पहने हुए क्रमश: फिटिंग एक महिला Luer डालने और छानने के लिए वैक्यूम रबर टयूबिंग के ऊपर और नीचे के सिरों पर एक वैक्यूम कनेक्टर,।
  3. ध्यान से फिल्टर कारतूस की एक दुकान के बंदरगाह के लिए महिला Luer फिटिंग देते हैं और एक सिलिकॉन डाट करने के लिए वैक्यूम कनेक्टर देते हैं।

3. पानी के नमूने (≤4 एल) फिल्टर कारतूस का उपयोग करने का निस्पंदन

नोट: यह कदम यदि निस्पंदन मात्रा> 4 एल यह छानने का काम प्रणाली छोड़ें एक स्वयं खड़े पैनल च की आवश्यकता हैया प्लास्टिक की थैली पानी का 1 एल के साथ भरा फांसी। एक जाल पैनल, कई कोणों, और पैनल के लिए एक स्टैंड, ऑनलाइन स्टोर से सभी उपलब्ध, इस इकाई के संयोजन के लिए उपयोगी होगा। इनलेट आटोक्लेव और उपयोग करने से पहले फिल्टर कारतूस के लिए Luer टोपियां आउटलेट।

  1. प्लास्टिक की थैली में 1 एल जांचा पानी डालो और पुरुष luer ताला कनेक्टर के साथ पेंच टोपी बंद करें।
  2. ध्यान से प्लास्टिक बैग के पुरुष luer ताला कनेक्टर के साथ इकट्ठे फिल्टर कारतूस का एक इनलेट पोर्ट से कनेक्ट। luer ताला कनेक्टर के ऊपर से कस मत करो; एक बार पम्पिंग शुरू होता है अन्यथा इकाई रिसाव जाएगा। सुनिश्चित करें कि सभी कनेक्शन एक जाल पैनल से प्लास्टिक की थैली फांसी से पहले सुरक्षित हैं बनें।
  3. ध्यान से जाल पैनल पर दो कोणों से फिल्टर कारतूस के साथ प्लास्टिक बैग लटका और कई गुना की एक इनलेट पोर्ट में एक सिलिकॉन डाट डालें।
  4. Aspirator चालू करें। निस्पंदन के लिए लाल टी-वाल्व खुला। कई गुना चलाने के लिए जब तक फिल्टर कारतूस सूखा है, टीमुर्गी बंद की स्थिति के लिए लाल टी-वाल्व बारी है।
  5. 3.1-3.4 चरणों को दोहराएँ जब तक पानी के वांछित राशि फ़िल्टर किया जाता है।
    ध्यान दें: उपोष्णकटिबंधीय प्रवाल भित्तियों से लिया पानी का 1 एल के लिए, यह छानने का काम के लिए लगभग तीन मिनट लगते हैं।
  6. ध्यान से प्लास्टिक बैग और वैक्यूम कनेक्टर से फिल्टर कारतूस को हटा दें।
  7. इनलेट और आउटलेट Luer टोपी के साथ कारतूस के दोनों सिरों कैप।
  8. कारतूस और इनलेट Luer टोपी लेबल उचित रूप से तेजी से सूखने और गैर-smearing लेबलिंग के लिए एक विलायक प्रूफ कलम का उपयोग कर।
  9. डीएनए निष्कर्षण से पहले -20 सेल्सियस पर फिल्टर कारतूस की दुकान।

4. पानी की निस्पंदन (> 4 एल) फिल्टर कारतूस का उपयोग कर नमूने

नोट: इस चरण को छोड़ें अगर पानी छानने का काम मात्रा ≤4 है एल यह छानने का काम प्रणाली एक 10 एल किताब एक वाल्व और एक डिस्पोजेबल 10 मिलीलीटर विंदुक टिप के साथ सुसज्जित बोतल की आवश्यकता है। 10 मिलीलीटर विंदुक टिप (15.0 मिमी) की एक आंतरिक व्यास और टिप की एक घटनाअंत में क्रमश: वाल्व (15.0 मिमी) के एक बाहरी व्यास और फिल्टर कारतूस के प्रवेश बंदरगाह के लिए फिट होना चाहिए। दोनों कनेक्शन एक घर्षण फिट में छानने के दौरान सुरक्षित रूप से रखा जाता है। उपयोग करने से पहले 10% वाणिज्यिक ब्लीच (सीए 0.6% सोडियम हाइपोक्लोराइट) के साथ विंदुक टिप जीवाणुरहित।

  1. पुस्तक बोतल में नमूना पानी का एक उचित मात्रा में तैयार करें। कस कर 10 एल पुस्तक बोतल के वाल्व में 10 मिलीलीटर विंदुक टिप डालें।
  2. कसकर विंदुक टिप अंत में फिल्टर कारतूस के आउटलेट बंदरगाह डालने और कई गुना के इनलेट पोर्ट में सिलिकॉन डाट डालें। Aspirator चालू करें। निस्पंदन के लिए लाल टी-वाल्व खुला। कई गुना चलाने के लिए जब तक फिल्टर कारतूस सूखा है, तो बंद की स्थिति के लिए लाल टी-वाल्व बारी है।
    ध्यान दें: उपोष्णकटिबंधीय बाहरी प्रवाल भित्तियों से लिया समुद्री जल के 10 एल के लिए, यह निस्पंदन के लिए के बारे में 30-40 मिनट लगते हैं।
  3. ध्यान से प्लास्टिक बैग और वैक्यूम कनेक्टर से फिल्टर कारतूस को हटा दें। कैप दोनोंइनलेट और आउटलेट Luer टोपी के साथ कारतूस के समाप्त होता है। कारतूस और इनलेट Luer टोपी लेबल उचित रूप से तेजी से सूखने और गैर-smearing लेबलिंग के लिए एक विलायक प्रूफ कलम का उपयोग कर। -20 डिग्री सेल्सियस डीएनए निष्कर्षण से पहले कम से फिल्टर कारतूस की दुकान।

फ़िल्टर से एडना 5. निष्कर्षण

ध्यान दें: चरण 4 और 5 में, हम एक वाणिज्यिक किट का उपयोग, काफी हद तक "केन्द्रक रक्त" किट द्वारा प्रदान के लिए एक प्रोटोकॉल का पालन। सादगी के लिए, हम एक व्यक्ति कारतूस के प्रसंस्करण के लिए प्रक्रिया का वर्णन। अभ्यास में, हम एक समय में प्रसंस्करण 8 (या सेंट्रीफ्यूज की अधिकतम संख्या) या कम फिल्टर सलाह देते हैं।

  1. 56 डिग्री सेल्सियस के लिए एक मशीन पहले से गरम।
  2. ट्यूब से hinged टोपी काटने से एक 2.0 मिलीलीटर ट्यूब तैयार करें। टोपी त्यागें।
    ध्यान दें: इस ट्यूब फिल्टर में शेष तरल के लिए एक संग्रह ट्यूब के रूप में प्रयोग किया जाता है।
  3. इनलेट (नहीं आउटलेट) फिल्टर कारतूस से Luer टोपी निकालें और इनलेट बंदरगाह मैं डालनेNto संग्रह ट्यूब। कसकर एक स्वयं सील फिल्म का उपयोग कारतूस और संग्रह ट्यूब के बीच एक संबंध सील।
  4. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए एक सेंट्रीफ्यूज एडाप्टर में संयुक्त इकाई डालें। 1 मिनट के लिए 5000 XG पर कारतूस अपकेंद्रित्र फिल्टर में शेष तरल हटा दें।
  5. फिल्टर कारतूस से निकालें संग्रह ट्यूब और ट्यूब त्यागें। री-कैप कारतूस के प्रवेश बंदरगाह।
  6. और 200 μl अल बफर; 20 μl proteinase कश्मीर समाधान का एक मिश्रण, 220 μl पीबीएस (किट द्वारा नहीं दिया गया है फॉस्फेट बफर खारा) तैयार करें।
    नोट: फिल्टर कारतूस चार बार मिश्रण की मात्रा को accommodates (। CA 1.8 एमएल)।
  7. इनलेट टोपी निकालें और एक विंदुक टिप का उपयोग फिल्टर कारतूस में मिश्रण (440 μl) जोड़ें। पिपेट इनलेट पोर्ट में पूरी तरह से डालें तो यह है कि विंदुक टिप सिर्फ झिल्ली ऊपर कारतूस के अंदर दिख रहा है।
  8. री-कैप इनलेट पोर्ट और फिल्टर कार जगहएक रोटरी प्रकार के बरतन पर tridge।
  9. 56 सी में preheated इनक्यूबेटर में रोटरी प्रकार के बरतन की जगह और 20 मिनट के लिए 20 आरपीएम की गति प्रकार के बरतन पर बारी।
  10. ऊष्मायन के दौरान, एक नया 2.0 मिलीलीटर ट्यूब तैयार ट्यूब लेबल उचित रूप से एक विलायक प्रूफ कलम का उपयोग कर और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में जगह है।
    नोट: पूर्व (2.0 एमएल) और बाद ट्यूब (50 एमएल) निकाले डीएनए के संग्रह के लिए और 2.0 मिलीलीटर ट्यूब पकड़े, क्रमशः के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं।
  11. ऊष्मायन के बाद, इनलेट टोपी को हटा दें और (नहीं आउटलेट) 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के भीतर 2.0 मिलीलीटर ट्यूब में डालने इनलेट कारतूस के बंदरगाह। एक पेंच टोपी के साथ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब को बंद करें।
  12. 5000 XG पर 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब अपकेंद्रित्र 1 मिनट कारतूस से निकाले डीएनए एकत्र करने के लिए। फिल्टर कारतूस और निष्फल संदंश का उपयोग 2.0 मिलीलीटर ट्यूब निकालें और ट्यूब टोपी। फिल्टर कारतूस त्यागें।

6. निकाले डीएनए की शुद्धि

नोट: हम साथ 100 μl बफर एई के बजाय 200 μl वाणिज्यिक किट के मैनुअल में निर्दिष्ट एडना elute।

  1. ऊपर चरण (सीए 440 μl) से 2.0 मिलीलीटर ट्यूब में निकाले डीएनए के लिए 200 μl इथेनॉल (96-100%) जोड़ें, और vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से।
  2. Pipet एक स्पिन स्तंभ एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा में मिश्रण। 1 मिनट के लिए 5000 XG पर अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें।
  3. , एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ के स्थान पर 5000 x जी 1 मिनट के लिए 500 μl बफर AW1, और सेंट्रीफ्यूज जोड़ें। प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें।
  4. , एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ की जगह 20,000 पर एक्स 3 मिनट के लिए 500 μl बफर AW2, और सेंट्रीफ्यूज जोड़ने जी। प्रवाह के माध्यम से और संग्रह ट्यूब त्यागें।
  5. एक नया 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (किट द्वारा नहीं दिया गया है) तैयार करें और ट्यूब लेबल उचित रूप से तेजी से सूखने और गैर-smearing लेबलिंग के लिए एक निविड़ अंधकार कलम का उपयोग कर। स्पिन स्तंभ टी स्थानांतरणओ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब।
  6. 100 μl बफर एई जोड़ने स्पिन स्तंभ झिल्ली के केंद्र के द्वारा डीएनए Elute। कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते हैं, और उसके बाद 1 मिनट के लिए 6000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. स्पिन स्तंभ त्यागें और ट्यूब टोपी। -20 डिग्री सेल्सियस पर शुद्ध डीएनए स्टोर।

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Representative Results

यह अलग-थलग करने और निकाले थोक एडना से केवल मछली एडना यों, क्योंकि MiFish प्राइमरों इस तरह के पक्षियों और स्तनधारियों के रूप में कुछ गैर-मछली रीढ़ से लक्ष्य क्षेत्र coamplify, एक ही आकार के पीसीआर उत्पादों के साथ तकनीकी रूप से कठिन है (सीए। बीपी 170 ) 12। इसके बजाय मछली एडना बढ़ाता का, हम निस्पंदन और डीएनए निष्कर्षण के दो अलग अलग तरीकों का उपयोग ज्ञात प्रजातियों संरचना के साथ एक मछलीघर टैंक से एडना के विश्लेषण metabarcoding MiFish करते हैं, और दो प्रोटोकॉल से पुस्तकालय के अनुसार पता चला प्रजातियों की संख्या की तुलना करें। यह सरल प्रयोग "प्रतिनिधि परिणाम" और नहीं के रूप में उपस्थित प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता को दिखाने के लिए कड़ाई से दूसरों पर अपनी श्रेष्ठता प्रदर्शित करने के लिए डिजाइन किया गया था।

हम ओकिनावा Churaumi एक्वेरियम, ओकिनावा, जापान (26˚41'39 "एन में एक Kuroshio टैंक से समुद्री जल का 30 एल की कुल नमूना,127˚52'41 "ई)। Kuroshio टैंक 35 एमएक्स 27 एमएक्स 10 मीटर और 7500 मीटर 3 के एक कुल जल की मात्रा का (समुद्री megafauna प्रदर्शन, आयामों के साथ के लिए डिज़ाइन किया गया है एल एक्स डब्ल्यू एक्स डी)। यह लगभग 60 बड़े घरों आकार के समुद्री मछली Kuroshio, जापान की पूरी लंबाई के साथ उत्तर-पूरब बहने पश्चिमी सीमा धाराओं में से एक के आसपास के क्षेत्रों के लिए विशिष्ट प्रजातियों। पिछले एक MiFish metabarcoding अध्ययन में, मिया एट अल। 12 से 63 प्रजातियों में से 61 (97%) का पता चला निहित पांच 2 एल समुद्री जल के नमूनों से टैंक में।

समुद्री जल का निस्पंदन के लिए, हम फिल्टर कारतूस इस्तेमाल किया (ताकना आकार = 0.45 माइक्रोन) और ग्लास फाइबर डिस्क फिल्टर (ताकना आकार = 0.70 माइक्रोन)। हम समवर्ती चार पानी की मात्रा (; कुल आठ फिल्टर 1, 2, 3, 4 और एल) के लिए दो प्रोटोकॉल का उपयोग ही कई गुना पर समुद्री जल फ़िल्टर। समुद्री जल के छानने के बाद, हम भी दो फिल्टर के साथ पीसीआर ग्रेड पानी का 1 एल फ़िल्टर (fİlter कारतूस और ग्लास फाइबर फिल्टर) नकारात्मक नियंत्रण (दो फिल्टर कारतूस) के रूप में। फिल्टर के उन प्रकार से, हम नए और पहले से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल 12, जो दोनों के एक ही वाणिज्यिक किट का उपयोग कर रोजगार एडना निकाली गई। (दो नकारात्मक नियंत्रण सहित) 10 एडना नमूनों की कुल 12 मिया एट अल में वर्णित के रूप में metabarcoding विश्लेषण MiFish के अधीन थे।

और बनती अंत अनुक्रमण के लिए एडेप्टर संलग्न करने के लिए, संक्षेप में, हम लक्ष्य क्षेत्र (। CA 170 बीपी mitochondrial 12S rRNA जीन) बढ़ाना 1 से दौर पीसीआर प्रदर्शन किया। आठ एडना नमूने (दो नकारात्मक नियंत्रण को छोड़कर) के लिए, हम 10 पीसीआर प्रत्येक नमूना (कुल 80 PCRs) के भीतर का पता चला प्रजातियों की संख्या में बदलाव देखने के लिए प्रतिकृति का आयोजन किया। हम भी प्रत्येक आठ एडना नमूने (कुल 16 PCRs) के फिल्टर और पीसीआर कारतूस जोड़ा। कुल में, हम 1 के दौर पीसीआर से 96 पीसीआर उत्पादों प्राप्त की और वे 2 के दौर पी के लिए टेम्पलेट्स के रूप में इस्तेमाल किया गयादोहरे अनुक्रमण के लिए सीआर और निम्न मिया एट अल पुस्तकालय तैयारी के लिए अतिरिक्त एडेप्टर जोड़कर। 12

96 पुस्तकालयों की बनती अंत अनुक्रमण (2 x 150 बीपी) झुकेंगे 4127546 पढ़ता है, के साथ 42,995 के एक औसत (40539 फिल्टर कारतूस में पढ़ता है और 43,121 ग्लास फाइबर फिल्टर में पढ़ता है) पुस्तकालय प्रति पढ़ता है। demultiplexing और कच्चे डेटा के बाद पूर्व प्रसंस्करण के बाद, 1068266 वर्गीकरण काम के लिए बम विस्फोट खोजों के लिए बनाए रखा गया पढ़ता है। इनमें से पढ़ता है, 830,788 Kuroshio टैंक (1 टेबल) में निहित उन प्रजातियों के रूप में पहचान की गई पढ़ता है। हम 60 टैंक प्रजातियों का पता चला 830,788 पढ़ता है और 10 पीसीआर के लिए पता लगाया प्रजातियों की औसत संख्या 4 एल (फिल्टर कारतूस) (तालिका 1) के लिए 29 से लेकर आठ एडना नमूने 1 एल (ग्लास फाइबर फिल्टर) 55 से प्रतिकृति से । आठ एडना नमूनों से दो कारतूस के पढ़ें संख्या नाबालिग थे, 0 से लेकरटैंक प्रजातियों के लिए 12 को।

हमने पाया फिल्टर कारतूस द्वारा पता लगाया प्रजातियों की संख्या ग्लास फाइबर फिल्टर (ANCOVA, एफ = 381.8, पी <0.001, चित्रा 1) के उन लोगों की तुलना में काफी अधिक था कि 1-4 एल समुद्री जल की मात्रा के पार। फिल्टर कारतूस द्वारा पता लगाया प्रजातियों की संख्या ग्लास फाइबर फिल्टर का उपयोग उन लोगों की तुलना में और दोनों तरीकों में लगभग 1.5 गुना अधिक थे, फ़िल्टर (ANCOVA, एफ = 164.2, पी <0.001) पानी की मात्रा के साथ वृद्धि हुई पता चला प्रजातियों की संख्या।

(1) विभिन्न सामग्रियों के माध्यम से जांचा पानी की निस्पंदन (हाइड्रोफिलिक PVDF [polyvinylidine difluoride] बनाम कांच microfiber) और / या: फिल्टर कारतूस द्वारा पता लगाया प्रजातियों की उच्च संख्या एक या एक से अधिक प्रयोगात्मक workflows में निम्न चरणों में से हो सकता है (2) विभिन्न नाममात्र ताकना आकार (0.4581, एम बनाम 0.70 माइक्रोन) फ़िल्टर कारतूस और ग्लास फाइबर फिल्टर में पूर्व फ़िल्टर पर मछलियों से अधिक एडना बनाए रखने के लिए कर सकता है; (3) preheated इनक्यूबेटर में एक रोटरी प्रकार के बरतन का उपयोग एक स्पिन स्तंभ एक स्थिर गर्मी ब्लॉक पर रखा में मुड़ा हुआ ग्लास फाइबर फिल्टर से तुलना फिल्टर कारतूस से अधिक डीएनए उपज पैदा करता है; (4) फिल्टर कारतूस से centrifugation द्वारा निकाले डीएनए का संग्रह है कि ग्लास फाइबर फिल्टर अलग फिल्टर सामग्री और / या अलग centrifugation तरीकों के कारण से की तुलना में अधिक कुशल है। जाहिर है, एक और अधिक कड़ाई से डिज़ाइन अध्ययन कारकों वर्तमान अध्ययन में फिल्टर कारतूस द्वारा पता लगाया प्रजातियों के लगातार उच्च संख्या के लिए जिम्मेदार इंगित करने के लिए आवश्यक है।

आकृति 1
चित्रा 1: का पता चला प्रजाति साजिश रची की संख्या फ़िल्टर्ड पानी खंड के खिलाफ MiFish Metabarcoding एना में Kuroshio टैंक, ओकिनावा Churaumi एक्वेरियम। पता चला प्रजातियों की संख्या से एडना की सेल टैंक में निहित प्रजातियों के लिए प्रतिबंधित है। समुद्री जल का 30 एल से, हम फ़िल्टर 1, 2, 3, और 4 एल नमूने फिल्टर कारतूस का प्रयोग और ग्लास फाइबर फिल्टर और वर्तमान और पहले से वर्णित प्रोटोकॉल 12, क्रमशः का उपयोग उन लोगों फिल्टर से एडना निकाली गई। हम 10 पीसीआर चार पानी दो प्रोटोकॉल का उपयोग संस्करणों से प्रतिकृति MiFish metabarcoding विश्लेषण (कई प्रजातियों के एक साथ पता लगाने) का प्रदर्शन किया। बॉक्स में क्षैतिज पट्टी मंझला प्रतिनिधित्व करता है; बॉक्स के ऊपरी और निचले किनारों अंतर-चतुर्थकों के अनुरूप है, ऊर्ध्वाधर सलाखों 1.5 x चतुर्थकों के अनुरूप है, और डॉट्स outliers प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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तालिका 1:।। वर्गीकरण संरचना और 60 प्रजातियों Kuroshio टैंक से एडना नमूने की MiSeq विश्लेषण में पता चला पढ़ें नंबर केवल उन प्रजातियों कस्टम डेटाबेस में संदर्भ दृश्यों के साथ टैंक में निहित दिखाए जाते हैं, का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें यह तालिका।

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Discussion

कई metabarcoding जैसे पानी और मिट्टी के रूप में पर्यावरण के नमूनों का उपयोग अध्ययन में, फिल्टर कारतूस के बाद निस्पंदन उपचार आम तौर पर इस प्रकार है 24,25: 1) खुला काटने या हाथ उपकरण (ट्यूबिंग कटर या सरौता) के साथ आवास खुर; 2) कारतूस से फिल्टर को हटाने; और 3) डीएनए निष्कर्षण के लिए एक धार के साथ छोटे टुकड़ों में काटने फिल्टर। एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया, सस्ती वाणिज्यिक किट का उपयोग फिल्टर कारतूस के आवास के भीतर इस तरह के जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है कि प्रयोगशाला में संक्रमण होने का खतरा है, हम प्रयास किया है कई डीएनए निष्कर्षण तरीकों से बचने के लिए, और सफलतापूर्वक अनुकूल के साथ मौजूद प्रोटोकॉल विकसित एडना metabarcoding विश्लेषण से परिणाम (चित्रा 1)।

वर्तमान प्रोटोकॉल में और अधिक महत्वपूर्ण कदमों में से एक एक preheated इनक्यूबेटर में एक रोटरी प्रकार के बरतन का इस्तेमाल होता है, कि बाद पुस्तकालय prepar के लिए अच्छा डीएनए उपज उपलब्ध कराने में सक्षम हैएडना metabarcoding विश्लेषण में समझना। अधिकतम तापमान में आवास के भीतर proteinase कश्मीर समाधान के लगातार सरगर्मी शायद फिल्टर पर फंसे कणों से डीएनए निकासी की सुविधा। ध्यान दें, तथापि, कि इस प्रोटोकॉल दोनों एक रोटरी प्रकार के बरतन और एक मशीन का इस्तेमाल शामिल है, और बाद पूर्व समायोजित करने में सक्षम होना चाहिए। इसके अलावा, एक सेंट्रीफ्यूज है कि दोनों 15 मिलीग्राम और 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों क्रमशः के बाद निस्पंदन फिल्टर से शेष तरल को दूर करने और कारतूस के भीतर निकाले डीएनए का संग्रह है, के लिए अपरिहार्य है समायोजित कर सकते हैं।

वहाँ कारतूस खोलने में कटौती करने के लिए बिना इस तरह के डीएनए निष्कर्षण प्राप्त करने के लिए एक और विकल्प है (सामग्री / अभिकर्मकों की तालिका देखें)। किट डीएनए निष्कर्षण के लिए किसी भी एंजाइमों का उपयोग नहीं करता है; इसके बजाय, यह मनका पिटाई के साथ अतिरिक्त यांत्रिक सेल के साथ संयोजन में एक विशेष सेल बफर उपयोग करता है। शीतोष्ण तटीय प्रशांत से प्राकृतिक समुद्री जल के आधार पर प्रारंभिक प्रयोगों में, हम प्रयासवर्तमान प्रोटोकॉल वाणिज्यिक किट का उपयोग कर के एक प्रोटोटाइप के साथ साथ इस किट का उपयोग टेड डीएनए एक्सट्रेक्शन। बाद के प्रोटोटाइप प्रोटोकॉल के उपयोग के साथ, हम लगातार अलग प्रवर्धन उत्पादों जेल वैद्युतकणसंचलन में 1 के दौर पीसीआर के लिए मान्यता दी। इसके विपरीत, हम (देखें सामग्री / अभिकर्मकों तालिका) दो वैकल्पिक निर्माता द्वारा प्रदान प्रोटोकॉल का पालन के बावजूद एक अलग किट के उपयोग के माध्यम से किसी भी पीसीआर उत्पादों को प्राप्त करने में विफल रहा। यह देखते हुए कि पीसीआर अवरोध हटाने कदम दूसरी किट के दो प्रोटोकॉल में शामिल किए गए हैं (देखें सामग्री / अभिकर्मकों तालिका), इस अवलोकन टेम्पलेट में डीएनए की पर्याप्त मात्रा की कमी का सुझाव देते हैं। दूसरी किट का उपयोग कर पर्यावरण के नमूनों से इस तरह की अपेक्षाकृत कम डीएनए पैदावार हाल के अध्ययनों से 26,27 में रिपोर्ट कर रहे हैं।

वर्तमान प्रोटोकॉल में, हम, बड़े नाममात्र ताकना आकार (0.45 माइक्रोन) के साथ फिल्टर कारतूस को चुना है, जबकि जलीय माइक्रोबियल अध्ययनों conventionally बड़ा ताकना आकार फिल्टर (1 से 3 माइक्रोन के लिए), 28 के माध्यम से छोटे से एक (0.22 माइक्रोन) prefiltration के बाद का उपयोग करें। हमारी पसंद के कारणों सरल और सीधा कर रहे हैं, और सैद्धांतिक तर्क पर आधारित नहीं हैं: 1) में छेद के आकार में ज्यादा फाइबर ग्लास फिल्टर (0.70 माइक्रोन) हम पारंपरिक पिछले एडना में इस्तेमाल किया है 12,14 अध्ययन के करीब है, 22,23; 2) यह पानी की बड़ी मात्रा में छोटे से एक से फ़िल्टर करने के लिए अनुमति की उम्मीद है। उत्तरार्द्ध सुविधा हमारे वर्तमान शोध दुर्लभ मछली बहुतायत और बायोमास के साथ खुले समुद्र और गहरे समुद्र में पारिस्थितिक तंत्र में के दौर से गुजर परियोजनाओं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है। वास्तव में, हम कोई ध्यान clogging के साथ Kuroshio टैंक से समुद्री जल की एक स्वतंत्र रूप से जांचा 10-एल के सफल निस्पंदन की पुष्टि की (परिणाम) नहीं दिखाया। हाल ही में, तथापि, टर्नर एट अल। 29 दिखा दिया है कि 0.2 माइक्रोन निस्पंदन को बड़ा कार्प एडना कब्जा (85% ± 6%) कुल (यानी गैर लक्ष्य) को कम करते हुए एडनाकब्जा (48% ± 3%), लेकिन फिल्टर कम से कम 250 मिलीलीटर की एक नमूना मात्रा को यह ध्यान में लीन होना आकार सीमित clogging। अतिरिक्त अध्ययन इष्टतम फिल्टर ताकना एडना मछली बहुतायत और बायोमास के स्तर पर अलग से जलीय वातावरण के विभिन्न प्रकारों में metabarcoding के लिए फिल्टर कारतूस के आकार और पानी छानने की मात्रा निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं।

इस प्रोटोकॉल की सीमाओं में से एक यह है कि पानी छानने का काम प्रयोगशाला है जहां एक बिजली की आपूर्ति उपलब्ध है में किया जाना चाहिए है। डीएनए की सीमित रासायनिक स्थिरता की वजह से, एडना के रूप में जल्द ही नीचा करने के लिए शुरू होता है के रूप में यह एक जीव से बहाने के लिए और केवल (दिनों घंटे) जलीय वातावरण में समय की एक छोटी अवधि के लिए 30 detectable है। इसलिए यह संग्रह के तुरंत बाद पानी का नमूना फिल्टर करने के लिए एडना में महत्वपूर्ण गिरावट से बचने के लिए आदर्श है। इस संबंध में ऑन-साइट निस्पंदन फिल्टर कारतूस का उपयोग तरीकों की घटनाओं के एक होनहार अगले कदम होगा। पोर्टेबिलिटी और sterilitफिल्टर कारतूस के y साइट पर निस्पंदन तरीकों, जो अधिक बरकरार एडना कि मछली समुदाय की प्रजातियों संरचना एडना metabarcoding में अधिक सही प्रतिबिंबित कर सकते हैं प्रदान करेगा के विकास के लिए सक्षम है। फिल्टर कारतूस पर एकत्र एडना एक वाणिज्यिक अभिकर्मक 31 के इंजेक्शन से स्थिर किया जा सकता है (देखें सामग्री / अभिकर्मकों तालिका) या Longmire प्रयोगशाला के लिए इसे वापस लाने से पहले कारतूस में 32 बफर।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mesh panel Iris Ohyama MPP-3060-BE
Metal prong Iris Ohyama MR12F
Stand for the mesh panel No brand 4184-9507 available from Amazon Japan
1 L plastic bag with screw cap Yanagi DP16-TN1000
Male luer-lock connector ISIS 11620
10 ml pipette tip Eppendorf 0030 000.765
10 L book bottle with valve As One 1-2169-01
Sterivex-HV filter Millipore SVHVL10RC denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol
Male luer fitting As One 1-7379-04
Female luer fitting As One 5-1043-14  
Inlet luer cap ISIS VRMP6
Outlet luer cap ISIS VRFP6
High vacuum tubing As One 6-590-01
Vacuum connector As One 6-663-02
Silicone stopper As One 1-7650-07
Manifold As One 2-258-01
Aspirator-GAS-1 As One 1-7483-21
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) Qiagen 69506
PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit MO BIO 14600-50-NF denoted as "optional kit" in the ms
Tabletop Centrifuge Kubota Model 4000 Maximum speed 6,000 rpm
Fixed-angle rotor Kubota AT-508C
Adaptor for a 15 ml conical tube Kubota 055-1280
RNAlater Stabilization Solution Thermo Fisher Scientific AM7020
Parafilm PM992 denoted as "self-sealing film"

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References

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