Introduction
Miljö DNA (eDNA) i vattenmiljöer avser genetiska material som finns i vattnet. Nya studier har visat användbarheten av eDNA för detektering av fiskar från olika vattenmiljöer, inklusive dammar 1-3, floder 4-8, strömmar 9, och havsvatten 10-14. De flesta av dessa studier fokuserade på detektion av en enda eller ett fåtal invasiv 1,4-6,8,14 och sällsynta eller hotade arter 3,9, medan några nya studier försökt samtidig detektion av flera arter i lokala fisksamhällen 7,9, 12,13,15 och mesokosmosstudier 11,12.
Den senare metoden kallas "metabarcoding" och Edna metabarcoding använder en eller flera uppsättningar av PCR-primers för att coamplify en genregion över taxonomiskt skilda prover. Detta följs av biblioteket förberedelse med indexering och adapter dessutom och indexerade bibliotek analyseras av en hög genomströmning parallell sekvenseplattform. Nyligen Miya et al. 12 utvecklade universella PCR-primers för metabarcoding eDNA från fiskar (kallas "MiFish"). De MiFish primers rikta en hypervariabel region av den mitokondriella 12S rRNA-genen (163-185 bp), som innehåller tillräcklig information för att identifiera fiskar till taxonomiska familj, släkte och art, utom för vissa närbesläktade kongener. Med hjälp av dessa primers i Edna metabarcoding, Miya et al. 12 upptäckt mer än 230 subtropiska marina arter från akvarier med kända artsammansättning och korallrev i närheten akvariet.
Medan optimera metabarcoding protokollet att rymma naturliga havsvatten med olika nivåer av eDNA koncentration från fiskar, har vi märkt att MiFish primers ibland misslyckades att förstärka målområdet för efterföljande bibliotek beredning. En av de mer troliga orsakerna till detta misslyckade PCR-förstärkning är brist på tillräckliga mängder av template DNA som finns i små mängder vatten filtrerade (dvs 1-2 L). Även eDNA koncentration från en viss taxonomisk grupp är omöjlig innan förstärkning, filtrering av stora vattenvolymer (> 1-2 L) skulle vara ett enkelt och effektivt sätt att samla in mer eDNA från vattenmiljöer med knappa fisk förekomst och biomassa, såsom öppen havet och djuphavsekosystem.
I förhållande till skivfiberfilter som konventionellt används i ett antal fiskar eDNA forskning 16, filterpatroner har fördelen att ta emot större vattenvolymer innan igensättning 17. Egentligen en nyligen genomförd studie visade stor volym (> 20 L) filtrering av kusthavsvattenprover som använder filterpatroner 18. Dessutom, de är individuellt förpackade och steril, och flera steg av den experimentella arbetsflödet kan utföras i filterhuset, vilket minskar sannolikheten för kontaminering från laboratoriet 19. Den senareFunktionen är avgörande för eDNA metabarcoding, där risken för kontaminering är fortfarande bland de största experimentella utmaningar 20,21. Trots dessa tekniska fördelar av filterpatroner, har det inte använts i Edna studier av fiskar med två undantag 8,15.
Här ger vi ett protokoll för filtrering av vattenprover med filterpatronen och utvinning av eDNA från sin filter utan att behöva skära upp höljet. Vi tillhandahåller också två alternativa vattenfiltreringssystem beroende på volymer vatten (≤4 L eller> 4 L). För att jämföra prestanda nyutvecklade protokoll och en tidigare protokoll som används med hjälp av en glasfiberfilter i vår forskargrupp 12,14,22,23, vi utför eDNA metabarcoding analys av havsvatten från en enorm akvarium (7500 m 3 ) med känd artsammansättning och visar antalet upptäckta arter som härrör från de två protokoll som representativa resultat. Detta protokoll hsom utvecklats för metabarcoding eDNA från fiskar, men är också tillämpbar på eDNA från andra organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Detta protokoll behandlar inte vatten provtagning och metabarcoding metoder. Vatten kan provtas på olika sätt beroende på studiesyfte 16 och se Miya et al. 12 för detaljer om metabarcoding metoder med användning MiFish primers. Observera att den samplade vattnet bör hållas mycket kallt och filtreras inom några timmar för att undvika nedbrytning av eDNA. Notera också att detta protokoll innefattar användning av en roterande skakanordning och en inkubator, och den senare måste vara tillräckligt stor för att rymma den förra. Dessutom har en centrifug som kan rymma både 15 ml och 50 ml koniska rör är nödvändig för att avlägsna den återstående vätskan från efterfiltreringsfilter och att samla in extraherat DNA inuti patronen, respektive.
1. Behandling skruvkork och en 1 L plastpåse
OBS: Hoppa över detta steg om filtreringsvolymen är> 4 L.
- Borra ett hål genom centrum av en skruv cap (fastsatt på engångs en L plastpåse) med samma diameter (4,8 mm) i form av röret som skjuter ut från en manlig luer-lock-kontakt. Med användning Avbitartång, förkorta röret av den manliga luer-låsanslutning till en lämplig längd (ca. 3 mm) för att undvika igensättning av en liten mängd vatten inuti locket efter filtrering.
- Applicera en adhesiv lim specialiserade för polyeten (PE) och polypropen (PP) till både botten och ytan av det manliga luer-lock-kontakt och skruvlock, respektive. Vänta några minuter för god limning (se tillverkarens instruktioner).
- Infoga den manliga luer-lock-kontakt i hålet av skruvkorken. Vänta tills fullständig limning av de två delarna (vanligtvis> 24 h). Sterilisera skruvlocket med hanluer-låsanslutning med 10% kommersiellt blekmedel (ca. 0,6% natriumhypoklorit) före användning.
- Punch två hål vid de två nedre hörnen på en L plastpåse för att hänga den från en mesh panelen (steg 3). Se till att diametern på hålen är större än den hos stiften på maskor.
2. Montering av filtreringssystem
- Fäst högvakuum slangen till ingången på en aspirator pump och fäst den andra änden av slangen till ett grenrör. Se till att de tre röda t-ventiler i grenröret är i "från-läge" (dvs. horisontellt).
- Iklädd en ren uppsättning av handskar, infoga en kvinnlig luerkoppling och en vakuumkontakt på de övre och nedre ändarna av vakuumgummislangen för filtrering, respektive.
- Kläm fast den kvinnliga luerkoppling till ett utlopp av filterpatronen och fästa vakuum kontakt till en silikonpropp.
3. Filtrering av vattenprover (≤4 L) med filterpatron
OBS: Hoppa över detta steg om filtreringsvolymen är> 4 L. filtreringssystem kräver en fristående panel feller hängande plastpåsen fylld med en liter vatten. En maskor, flera stift, och ett stativ för panelen, alla tillgängliga från nätbutiker, skulle vara användbart för montering denna enhet. Autoklavera inlopp och utlopp Luer lock för filterpatronen före användning.
- Häll 1 L samplade vatten i plastpåsen och stänga skruvlocket med den manliga luer-lock-kontakt.
- Anslut försiktigt en inloppsöppning av den sammansatta filterpatronen med den manliga luer-lock-kontakten på plastpåsen. Do inte åt Luer-lock-kontakt; annars enheten kommer att läcka när pumpningen startar. Vara säker på att alla anslutningar är säkra innan hängande plastpåsen från en maskor.
- hänga noga plastpåsen med filterpatronen från två stift på maskor och infoga en silikonpropp till en inloppsöppning av grenröret.
- Slå på sug. Öppna röda t-ventiler för filtrering. Köra fördelaren tills filterpatronen är torr, thöna vänder den röda t-ventilen till läget.
- Upprepa 3,1-3,4 steg tills den önskade mängden vatten filtreras.
OBS: För en liter vatten tas från subtropiska korallrev, det tar ungefär tre minuter för filtrering. - Försiktigt bort filterinsatsen från plastpåsen och vakuumkontakt.
- Cap båda ändarna av patronen med inlopps- och utlopps luer lock.
- Märka patronen och inloppet luerlocket lämpligt sätt med användning av en lösningsmedelresistenta penna för snabbtorkande och icke-smetar märkning.
- Lagra filterpatronen vid -20 C före DNA-extraktion.
4. Filtrering av vatten (> 4 L) Prover som använder filterpatronen
Obs! Hoppa över detta steg om vattenfiltreringsvolymen är ≤4 L. filtreringssystem kräver en 10 L bok flaska utrustad med en ventil och en disponibel 10 ml pipettspetsen. En innerdiameter av 10 ml pipettspetsen (15,0 mm) och en avsmalning av spetsenänden bör passa till en yttre diameter av ventilen (15,0 mm) och inloppsporten hos filterkassetten, respektive. Båda anslutningar bibehålls säkert under filtreringen i en friktionspassning. Sterilisera pipettspetsen med 10% kommersiellt blekmedel (ca 0,6% natriumhypoklorit) före användning.
- Förbereda en lämplig mängd samplad vatten i boken flaskan. Tätt infoga 10 ml pipettspetsen i ventilen 10 L bok flaska.
- Tätt sätt i utloppsöppningen hos filterpatronen i pipettspetsen ände och för in silikonpropp in i inloppsporten hos grenröret. Slå på sug. Öppna röda t-ventiler för filtrering. Kör fördelaren tills filterpatronen är torr, vrid sedan den röda t-ventilen till läget.
OBS: För 10 liter havsvatten tas från subtropiska yttre korallrev, det tar ca 30-40 minuter för filtrering. - Försiktigt bort filterinsatsen från plastpåsen och vakuumkontakt. Cap bådeändar av patronen med inlopps- och utlopps luer lock. Märka patronen och inloppet luerlocket lämpligt sätt med användning av en lösningsmedelresistenta penna för snabbtorkande och icke-smetar märkning. Lagra filterpatronen vid -20 ° C innan DNA-extraktion.
5. Utvinning omEdna från filtret
OBS: I steg 4 och 5, använder vi ett kommersiellt kit, till stor del till följd av ett protokoll för "kärn blod" från satsen. För enkelhets skull beskriver vi proceduren för behandling av en enskild patron. I praktiken rekommenderar vi bearbetning 8 (eller det maximala antalet centrifugen) eller färre filter åt gången.
- Värm en inkubator till 56 ° C.
- Bered en 2,0 ml rör genom att skära den gångjärnsförsedda locket från röret. Släng locket.
OBS: Detta rör används som ett uppsamlingsrör för den kvarvarande vätskan i filtret. - Ta inloppet (INTE utlopp) luerlocket från filterpatronen och sätt i inloppsöppningen into uppsamlingsröret. Tätt täta en förbindelse mellan patronen och provrör med hjälp av en självtätande film.
- Sätt den kombinerade enheten i en centrifug adapter för en 15-ml koniska rör. Centrifugera patronen vid 5000 xg under 1 min för att avlägsna den återstående vätskan i filtret.
- Avlägsna provröret från filterpatronen och släng röret. Re-cap inloppsporten av patronen.
- Förbered en blandning av 20 pl proteinas-K-lösning, 220 pl PBS (fosfatbuffrad saltlösning, som inte tillhandahålls av satsen) och 200 pl buffert AL.
OBS: Filterpatronen rymmer upp till fyra gånger volymer av blandningen (. Ca 1,8 ml). - Avlägsna inloppslocket och tillsätt blandningen (440 | j, l) in i filterpatronen med hjälp av en pipettspets. För in pipetten helt i inloppsöppningen så att pipettspetsen är synlig inuti kassetten precis ovanför membranet.
- Re-cap inloppet och placera filter bilkassetten på en roterande skakanordning.
- Placera den roterande skakapparaten i förvärmd inkubator vid 56 C och slå på skakanordning vid en hastighet av 20 rpm under 20 min.
- Under inkubation, förbereda en ny 2,0 ml rör, märka röret lämpligt att använda en lösningsmedelresistenta penna och placera den i en 50-ml koniska rör.
OBS: De tidigare (2,0 ml) och senare rör (50 ml) används för uppsamling av det extraherade DNA och för att hålla 2,0 ml rör, respektive. - Efter inkubation, ta bort inloppslocket och sätt i inloppet (EJ utlopp) porten på kassetten i 2,0 ml rör i 50 ml koniska rör. Stänger 50 ml koniska rör med skruvkork.
- Centrifugera 50-ml koniskt rör vid 5000 xg under 1 min för att samla in den extraherade DNA från patronen. Ta ut filterpatronen och 2,0 ml rör användning av steriliserade pincett och locket röret. Kasta filterpatronen.
6. Rening av extraherat DNA
OBS: Vi eluera eDNA med 100 pl buffert AE i stället för 200 ul som anges i handboken för kommersiellt kit.
- Tillsätt 200 l etanol (96-100%) till den extraherade DNA i 2,0 ml rör från ovanstående steg (ca 440 l), och blanda väl genom att vortexa.
- Pipettera blandningen i en spinnkolonn placerades i en 2 ml uppsamlingsrör. Centrifugera vid 5000 xg under 1 min. Kassera genomströmning och uppsamlingsröret.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör, tillsätt 500 | il buffert AW1, och centrifugera i 1 min vid 5000 x g. Kassera genomströmning och uppsamlingsröret.
- Placera spinnkolonn i ett nytt 2 ml uppsamlingsrör, tillsätt 500 | al buffert AW2, och centrifugera under 3 min vid 20000 x g. Kassera genomströmning och uppsamlingsröret.
- Förbered en ny 1,5 ml rör (inte tillhandahålls av satsen) och märka röret lämpligt att använda en vattentät penna för snabbtorkande och icke-smetar märkning. Överför spinnkolonn to 1,5 ml rör.
- Eluera DNA genom att tillsätta 100 | il buffert AE till centrum av den centrifugeringskolonn membranet. Inkubera under 1 min vid rumstemperatur, och sedan centrifugera vid 6000 xg under 1 min.
- Kassera spinnkolonn och locket röret. Lagra den renade DNA vid -20 ° C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det är tekniskt svårt att isolera och kvantifiera bara fisk eDNA från den extraherade bulk eDNA eftersom MiFish primers coamplify målområdet från vissa icke-fisk ryggradsdjur, såsom fåglar och däggdjur, med PCR-produkter av samma storlek (ca. 170 bp ) 12. I stället för att kvantifiera fisk eDNA utför vi MiFish metabarcoding analys omEdna från ett akvarium tank med känd artsammansättning med hjälp av två olika metoder för filtrering och DNA-extraktion, och jämföra antalet upptäckta arter per bibliotek från de två protokollen. Denna enkla experiment utformades för att visa genomförbarheten av det nuvarande protokollet som "representativa resultat" och inte strikt visa sin överlägsenhet över andra.
Vi urvalet totalt 30 liter havsvatten från en Kuroshio tank i Okinawa Churaumi Aquarium, Okinawa, Japan (26˚41'39 "N,127˚52'41 "E). Den Kuroshio tanken är konstruerad för att uppvisa marin megafauna, med måtten (L x B x D) av 35 mx 27 mx 10 m och en total vattenvolym av 7500 m 3. Här finns cirka 60 stora tänkas hamna marina fiskarter karaktäristiska områden runt Kuroshio, en av den västra gränsen strömmar northeast längs hela längden av Japan. i en tidigare MiFish metabarcoding studie, et al. Miya 12 detekteras 61 av de 63 arter (97%) innehöll i tanken från fem 2 L havsvattenprover.
För filtrering av havsvatten, använde vi filterpatroner (porstorlek = 0,45 um) och glasfiberskivfilter (porstorlek = 0,70 um). Vi filtreras samtidigt havsvattnet på samma grenröret med hjälp av de två protokollen för fyra vattenvolymer (1, 2, 3, och 4 L, totalt, åtta filter). Efter filtrering av havsvatten, filtrerades vi också ett L av PCR-kvalitet vatten med de två filtren (fIlter patron och glasfiberfilter) som de negativa kontrollerna (två filterblanksteg). Från dessa typer av filter, extraherade vi eDNA med de nya och tidigare använda protokollen 12, som båda använder samma kommersiella kit. Totalt 10 eDNA prover (inklusive de två negativa kontroller) utsattes för MiFish metabarcoding-analys såsom beskrivits i Miya et al. 12
Kortfattat, utförde vi 1. Ligt PCR för att amplifiera målregionen (mitokondriella 12S rRNA-genen;. Ca 170 bp) och att lägga till adaptrar för parade-end sekvensering. För åtta EDNA prov (exklusive de två negativa kontroller), genomförde vi 10 PCR replikerar att se variationer i antalet upptäckta arter inom varje prov (totalt 80 PCR). Vi har också lagt filtret och PCR-ämnen till varje åtta EDNA prover (totalt 16 PCR). Totalt erhöll vi 96 PCR-produkter från den 1: a-round PCR och de användes som mallar för 2: a-round PCR för dubbel indexering och lägga ytterligare adaptrar för biblioteks beredning efter Miya et al. 12
Den parade-end sekvensering (2 x 150 bp) av de 96 biblioteken gav 4127546 läser, med ett genomsnitt på 42.995 läsningar per bibliotek (40539 läser i filterpatronen och 43.121 läser in den glasfiberfilter). Efter demultiplexering och efterföljande förbearbetning av rådata, läser 1.068.266 behölls för BLAST-sökningar för taxonomisk uppdrag. Av dessa läser, 830788 läser identifierades som de arter som finns i Kuroshio tanken (Tabell 1). Vi upptäckt 60 tank arter från 830.788 läser och det genomsnittliga antalet upptäckta arter för 10 PCR replikerar från de åtta EDNA proverna varierade från 29 till 1 L (glasfiberfilter) till 55 för fyra L (filter) (tabell 1) . Läs nummer för de två ämnena från de åtta EDNA proverna var mindre, som sträcker sig från 0till 12 för tank arter.
Vi fann att antalet upptäckta arter av filterpatronen var betydligt högre än för de glasfiberfilter (ANCOVA, F = 381,8, p <0,001; figur 1) över 1-4 L havsvatten volymer. Antalet upptäckta arter av filterpatronen var cirka 1,5 gånger högre än dem som använder glasfiberfilter och i båda metoderna, antalet upptäckta arter ökade med vattenvolymen filtrerad (ANCOVA, F = 164,2, p <0,001).
Högre antal upptäckta arter av filterpatronen kan bli följden av en eller flera av följande steg i de experimentella arbetsflöden: filtrering av den samplade vatten genom (1) olika material (hydrofila PVDF [polyvinyliden difluorid] kontra glasmikrofiber) och / eller (2) olika nominella porstorlekar (0,4581; m vs. 0,70 um) i filterpatroner och glasfiberfilter kan behålla mer eDNA från fiskar på tidigare filter; (3) användning av en rotationsskakare i förvärmd inkubator producerar mer DNA utbyte från filterpatronerna än från de vikta glasfiberfilter i en spinnkolonn placerades på en orörlig värmeblock; (4) inkassering av extraherade DNA genom centrifugering från filterpatronen är mer effektivt än från glasfiberfilter på grund av olika filtermaterial och / eller olika centrifugeringsmetoder. Uppenbarligen är en mer strikt utformade studie som krävs för att sätta fingret på de faktorer som är ansvariga för den genomgående högre antalet upptäckta arter av filterpatronen i den aktuella studien.
Figur 1: antalet upptäckta arter avsatt mot filtrerat vatten Volymerna i MiFish Metabarcoding Ana lys omEdna från Kuroshio Tank, Okinawa Churaumi Aquarium. Antalet upptäckta arter är begränsad till de arter som finns i tanken. Från 30 liter havsvatten, filtrerades vi en, två, tre, och fyra L sampel med hjälp av filterpatroner och glasfiberfilter och extraheras eDNA från dessa filter nuvarande och tidigare beskrivna protokoll 12, respektive. Vi utförde MiFish metabarcoding analys (samtidig detektion av flera arter) för 10 PCR replikerar från de fyra vattenvolymer med hjälp av två protokoll. Den horisontella bar i rutan representerar medianen; de övre och nedre kanterna av rutan motsvarar inter-kvartil, de vertikala staplarna motsvarar 1,5 x kvartiler och prickarna representerar extremvärden. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
/files/ftp_upload/54741/54741tbl1.jpg "/>
Tabell 1:.. Artsammansättning och Läs Antal 60 Arter som upptäcks i MiSeq Analyser omEdna Prover från Kuroshio Tank endast de arter som ingår i tanken med referenssekvenser i egen databas visas Klicka här för att se en större version av denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I många metabarcoding studier med miljöprov såsom vatten och mark, är i allmänhet efterfiltreringsbehandling av filterpatronen enligt följande 24,25: 1) skära upp eller sprickbildning huset med handverktyg (slang cutter eller tång); 2) avlägsnande av filtret från patronen; och 3) att skära filtret i små bitar med ett rakblad för DNA-extraktion. För att undvika sådana besvärliga och tidskrävande förfaranden som är benägna att kontaminering i laboratoriet, har vi försökt flera DNA extraktionsmetoder i huset av filterpatronen med hjälp av en allmänt använd, billig kommersiellt kit och framgångsrikt utvecklat det nuvarande protokollet med gynnsam resultat från edna metabarcoding analys (Figur 1).
En av de mer kritiska steg i det nuvarande protokollet är användningen av en rotationsskakare i en förvärmd inkubator, som har förmåga att ge god DNA avkastning för efterföljande bibliotek FÖRBEREDELSEation i eDNA metabarcoding analys. Konstant omröring av proteinas-K-lösning inuti huset vid optimal temperatur underlättar förmodligen DNA-extraktion från partiklar fångade på filtret. Observera dock att detta protokoll innefattar användning av både en roterande skakanordning och en inkubator, och den senare måste kunna rymma den förra. Dessutom har en centrifug som kan rymma både 15 ml och 50 ml koniska rör är nödvändig för att avlägsna den återstående vätskan från efterfiltreringsfilter och uttag av extraherat DNA inuti patronen, respektive.
Det finns ett annat alternativ för att uppnå en sådan DNA-extraktion utan att behöva skära upp kassetten (se tabell Material / reagenser). Satsen använder inte några enzymer för DNA-extraktion; I stället används en speciell lysbuffert i kombination med ytterligare mekanisk lys med pärla stryk. I preliminära experiment baserade på natur havsvatten från tempererade kust Stilla havet, vi attempTed DNA-extraktioner som använder detta kit tillsammans med en prototyp av det nuvarande protokollet med hjälp av kommersiella kit. Med hjälp av den senare prototyp protokollet, vi konsekvent erkänt distinkta amplifieringsprodukter i gelelektrofores för 1: a-round PCR. Däremot misslyckades vi få tillgång till PCR-produkter genom att använda en annan sats (se Material / reagenser tabell) trots följande två alternativa protokoll som tillhandahålls av tillverkaren. Med tanke på att PCR avlägsnande hämmare steg ingår i de två protokollen i den andra satsen (se Material / reagenser tabell), antyder denna iakttagelse brist på tillräckliga mängder DNA i mallen. Sådana relativt låga DNA-utbyten från miljöprover med hjälp av andra satsen redovisas i senare studier 26,27.
I det nuvarande protokollet, har vi valt filterpatronen med stor nominell porstorlek (0,45 um), medan vattenmikrobiella studier conventionally använda den mindre en (0,22 | im) efter förfiltrering genom större por-storleksfilter (1 till 3 | j, m) 28. Skälen för vårt val är enkelt och okomplicerat, och bygger inte på teoretiska argument: 1) porstorleken är mycket närmare den hos glasfiberfilter (0,70 mikrometer) vi har konventionellt använts i tidigare eDNA studerar 12,14, 22,23; 2) den förväntas att tillåta en större mängd vatten som skall filtreras än den mindre. Den sistnämnda funktionen är särskilt betydelsefull för våra pågående forskningsprojekt som genomgår i öppna havet och djuphavsekosystem med knappa fisk överflöd och biomassa. I själva verket, bekräftade vi framgångsrika filtrering av en självständigt samplad 10-L av havsvatten från Kuroshio tanken utan någon märkbar tilltäppning (resultat ej visade). Nyligen har dock al. Turner et 29 visade att 0,2 pm filtrering maximerad karp eDNA capture (85% ± 6%) och samtidigt minimera totalt (dvs. icke-mål) eDNAcapture (48% ± 3%), men filter tilltäppning begränsat denna porstorlek till en provvolym på mindre än 250 ml. Det behövs ytterligare studier för att bestämma den optimala filter porstorlek och vattenfiltreringsvolym av filterpatronen för eDNA metabarcoding i olika typer av vattenmiljöer med olika nivåer av fisk förekomst och biomassa.
En av begränsningarna i detta protokoll är att vattnet filtrering bör utföras i laboratoriet där en strömkälla är tillgänglig. På grund av begränsad kemisk stabilitet av DNA, börjar eDNA att brytas ned så snart som den är en byggnad från en organism och kan detekteras endast under en kort tidsperiod i vattenmiljöer (timmar till dagar) 30. Därför är det idealiskt att filtrera vattenprovet omedelbart efter insamling för att undvika betydande försämring om Edna. I detta sammanhang skulle utvecklingen av på plats filtreringsmetoder som använder filterpatronen vara en lovande nästa steg. Portabilitet och sterility av filterpatronen möjliggör utvecklingen av på plats filtreringsmetoder, som kommer att ge mer intakt eDNA som kan reflektera artsammansättning av fisksamhället mer exakt i Edna metabarcoding. Den uppsamlade eDNA på filterpatronerna kan stabiliseras genom injektion av en kommersiell reagens 31 (se Material / reagenser tabell) eller Longmire buffert 32 i patronen innan föra den tillbaka till laboratoriet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mesh panel | Iris Ohyama | MPP-3060-BE | |
| Metal prong | Iris Ohyama | MR12F | |
| Stand for the mesh panel | No brand | 4184-9507 | available from Amazon Japan |
| 1 L plastic bag with screw cap | Yanagi | DP16-TN1000 | |
| Male luer-lock connector | ISIS | 11620 | |
| 10 ml pipette tip | Eppendorf | 0030 000.765 | |
| 10 L book bottle with valve | As One | 1-2169-01 | |
| Sterivex-HV filter | Millipore | SVHVL10RC | denoted as "filter cartridge" throughout the ms and used in the protocol |
| Male luer fitting | As One | 1-7379-04 | |
| Female luer fitting | As One | 5-1043-14 | |
| Inlet luer cap | ISIS | VRMP6 | |
| Outlet luer cap | ISIS | VRFP6 | |
| High vacuum tubing | As One | 6-590-01 | |
| Vacuum connector | As One | 6-663-02 | |
| Silicone stopper | As One | 1-7650-07 | |
| Manifold | As One | 2-258-01 | |
| Aspirator-GAS-1 | As One | 1-7483-21 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | Qiagen | 69506 | |
| PowerWater Sterivex DNA Isolation Kit | MO BIO | 14600-50-NF | denoted as "optional kit" in the ms |
| Tabletop Centrifuge | Kubota | Model 4000 | Maximum speed 6,000 rpm |
| Fixed-angle rotor | Kubota | AT-508C | |
| Adaptor for a 15 ml conical tube | Kubota | 055-1280 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Thermo Fisher Scientific | AM7020 | |
| Parafilm | PM992 | denoted as "self-sealing film" |
References
- Takahara, T., Minamoto, T., Doi, H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE. 8, e56584 (2013).
- Takahara, T., Minamoto, T., Yamanaka, H., Doi, H., Kawabata, Z. Estimation of fish biomass using environmental DNA. PLoS ONE. 7, e35868 (2012).
- Sigsgaard, E. E., Carl, H., Møller, P. R., Thomsen, P. F. Monitoring the near-extinct European weather loach in Denmark based on environmental DNA from water samples. Biol. Conserv. 183, 48-52 (2015).
- Jerde, C. L., et al. Detection of Asian carp DNA as part of a Great Lakes basin-wide surveillance program. Can. J. Fish. Aquat. Sci. 70, 522-526 (2013).
- Jerde, C. L., Mahon, A. R., Chadderton, W. L., Lodge, D. M. "Sight-unseen" detection of rare aquatic species using environmental DNA. Conserv. Lett. 4, 150-157 (2011).
- Mahon, A. R., et al. Validation of eDNA surveillance sensitivity for detection of Asian carps in controlled and field experiments. PLoS ONE. 8, e58316 (2013).
- Minamoto, T., Yamanaka, H., Takahara, T., Honjo, M. N., Kawabata, Z. Surveillance of fish species composition using environmental DNA. Limnology. 13, 193-197 (2012).
- Keskin, E. Detection of invasive freshwater fish species using environmental DNA survey. Biochem. Syst. Ecol. 56, 68-74 (2014).
- Wilcox, T. M., et al. Robust detection of rare species using environmental DNA: the importance of primer specificity. PLoS ONE. 8, e59520 (2013).
- Thomsen, P. F., et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples. PLoS ONE. 7, e41732 (2012).
- Kelly, R. P., et al. Harnessing DNA to improve environmental management. Science. 344, 1455-1456 (2014).
- Miya, M., et al. Mifish, a set of universal PCR primers for metabarcoding environmental DNA from fishes: detection of more than 230 subtropical marine species. Roy. Soc. Open Sci. 2, 150088 (2015).
- Port, J. A., et al. Assessing vertebrate biodiversity in a kelp forest ecosystem using environmental DNA. Mol. Ecol. 25, 527-541 (2015).
- Yamamoto, S., et al. Environmental DNA provides a 'snapshot' of fish distribution: a case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE. 11, e0149786 (2016).
- Valentini, A., et al. Next generation monitoring of aquatic biodiversity using environmental DNA metabarcoding. Mol. Ecol. 25, 929-942 (2016).
- Rees, H. C., Maddison, B. C., Middleditch, D. J., Patmore, J. R., Gough, K. C. Review: The detection of aquatic animal species using environmental DNA - a review of eDNA as a survey tool in ecology. J. Appl. Ecol. 51, 1450-1459 (2014).
- Stewart, F. J. Microbial metagenomics, Metatranscriptomics, and metaprotenomics Vol. 531 Methods in Enzymology. DeLong, E. E. 10, Elsevier. Ch. 10 187-218 (2013).
- Walsh, D. A., Zaikova, E., Hallam, S. J. Large volume (20L+) filtration of coastal seawater samples. J Vis Exp. (28), e1161 (2009).
- Smalla, K. Molecular Microbial Ecology Manual. Akkermans, D. L., Elsas, J. D., Bruijn, F. J. , Springer. 13-22 (1995).
- Thomsen, P. F., Willerslev, E. Environmental DNA - An emerging tool in conservation for monitoring past and present biodiversity. Biol. Conserv. 183, 4-18 (2014).
- Pedersen, M. W., et al. Ancient and modern environmental DNA. Phil. Trans. R. Soc. B. 370, 20130383 (2015).
- Fukumoto, S., Ushimaru, A., Minamoto, T. A basin scale application of environmental DNA assessment for rare endemic species and closely related exotic species in rivers: a case study of giant salamanders in Japan. J. Appl. Ecol. 52, 358-365 (2015).
- Yamanaka, H., Minamoto, T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity. Ecol. Indicators. 62, 147-153 (2016).
- Moss, J. A., et al. Ciliated protists from the nepheloid layer and water column of sites affected by the Deepwater Horizon oil spill in the Northeastern Gulf of Mexico. Deep Sea Res. Pt I. 106, 85-96 (2015).
- Hilton, J. A., Satinsky, B. M., Doherty, M., Zielinski, B., Zehr, J. P. Metatranscriptomics of N2-fixing cyanobacteria in the Amazon River plume. The ISME journal. 9, 1557-1569 (2015).
- Deiner, K., Walser, J. -C., Mächler, E., Altermatt, F. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA. Biol. Conserv. 183, 53-63 (2015).
- Eichmiller, J. J., Miller, L. M., Sorensen, P. W. Optimizing techniques to capture and extract environmental DNA for detection and quantification of fish. Mol. Ecol. Res. 16, 56-68 (2016).
- Lemarchand, K., Pollet, T., Lessard, V., Badri, M. A. Sample Preparation Techniques for Soil, Plant, and Animal Samples'Springer Protocols Handbooks. Micic, M. , Springer. 325-339 (2016).
- Turner, C. R., et al. Particle size distribution and optimal capture of aqueous macrobial eDNA. Methods Ecol. Evol. 5, 676-684 (2014).
- Barnes, M. A., Turner, C. R. The ecology of environmental DNA and implications for conservation genetics. Conserv. Genet. 17, 1-17 (2016).
- Sorokulova, I., Olsen, E., Vodyanoy, V. Biopolymers for sample collection, protection, and preservation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 99, 5397-5406 (2015).
- Renshaw, M. A., Olds, B. P., Jerde, C. L., McVeigh, M. M., Lodge, D. M. The room temperature preservation of filtered environmental DNA samples and assimilation into a Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol DNA extraction. Mol. Ecol. Res. 2014, (2014).
