En Opdrift-baserede metode til bestemmelse kolesterolniveauet i Published: November 1, 2016 doi: 10.3791/54744

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Kelsey E. Hazegh¹, Tânia Reis¹

¹Department of Medicine, Division of Endocrinology, Metabolism, and Diabetes, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

Her præsenterer vi en metode til at måle organismal kolesterolniveauet i tredje stadie (L3) larvestadiet af Drosophila melanogaster. Denne metode udnytter den forholdsvis lave tæthed af fedtvæv at skelne mellem larver med ændrede fedtdepoter. Opdrift-baseret analyse er et værdifuldt redskab til hurtig, reproducerbar, og økonomisk screening.

Introduction

Drosophila melanogaster er blevet anvendt i over et århundrede i studiet af genetik og andre basale biologiske spørgsmål. I de seneste årtier, er det blevet klart, at Drosophila er et kraftfuldt værktøj i studiet af mange humane sygdomme. Som 70 - 80% af gener associeret med humane sygdomme har en identificeret flue ortolog ^{1 - 4,} Drosophila tilvejebringer en forenklet endnu translaterbar system, hvor at studere komplekse sygdomme. Metabolisme især har nydt godt af en sådan undersøgelse. Ikke alene er genetik metabolisme godt konserveret mellem fluer og mennesker, men de relevante organer og celletyper er også meget lignende ^2,5. For eksempel fedt kroppen af flyve butikker både triacylglycerider (TAG) og glykogen, funktioner svarende til dem, der udføres i pattedyr lever og hvid fedtvæv ^6. Ved hjælp af Drosophila som model for menneskelig fedme er stærkt forbedret vores forståelse af lipidstofskifte og genetik fedme ^7. Larvestadiet af udvikling er især nyttig til at studere adskillelse af næringsstoffer til opbevaring eller udnyttelse, da det er dedikeret til fodring og lagring af energi, der skal bruges under pupariation.

I øjeblikket er der mange forskellige kvantitative metoder til bestemmelse fedt oplagring niveauer i Drosophila. Den mest anvendte metode er koblet kolorimetrisk assay (CCA) ^8,9. CCA blev udviklet til bestemmelse TAG niveauer i humant serum og opererer på den forudsætning, at glycerol frigjort fra rygraden af ​​triglycerider vil undergå adskillige reaktioner, i sidste ende resulterer i en redox-koblet reaktion genererer et farvet produkt. Absorbansen af ​​specifikke lysbølgelængder derefter målt for at bestemme den oprindelige mængde af glycerol til stede. Dog kan glycerol også befriet fra mono- og diacylglycerider foruden TAG og kan derfor ikke være en nøjagtig måling af svåges kropsfedt ^9. Endvidere kan øjet pigment af knuste voksne fluer forstyrre nogle absorbanslæsninger og komplicere resultater ^9,10. Derfor skal CCA ledsages og valideret af tyndtlagskromatografi (TLC), som giver mulighed for adskillelse af de fleste lipid familier, der kan kvantificeres ved densitometri ^10,11. Dog kan visse lipid klasser som steroler ikke analyseres og skal kvantificeres en anden måde ^12. Massespektrometri (MS) er en nøjagtig måde at kvantificere alle klasser af store cellulære lipider ^12,13. Men lipid ekstraktion nødvendige procedurer til at analysere ved MS er både tidskrævende (de fleste tage næsten en hel dag) og dyrt. Her præsenterer vi en alternativ metode til hurtigt og billigt bestemme organismal fedtindhold i L3 larver af Drosophila melanogaster.

Fremgangsmåden præsenteres nedenfor udnytter forskellen i densitet mellem fedtvæv og magert væv. pattedyr fat væv har en massefylde på ca. 0,9 g / ml ¹⁴ mens skeletmuskel som en densitet på 1,06 g / ml ^15. Denne forskel betyder, at dyr med højere lagre af fedt vil have lavere massefylde end dyr med lavere lagre af fedt, som vil give dem mulighed for at flyde bedre i en opløsning af fast tæthed. Denne egenskab giver mulighed for ekstremt hurtig screening af et stort antal dyr og samtidig være både billig og ikke-invasiv. Opdrift-baseret analyse er blevet brugt både til at bekræfte de fænotyper af ændre kendte regulatorer af fedt niveauer samt at identificere nye genetiske og neurologiske regulatorer af fedme ^16,17.

Protocol

1. Indsamle æg fra Fluer med genotyper Interessante

BEMÆRK: Ideelle kors består af 150 jomfruelige fluer og mindst 75 hanner. Stock samlinger bør bestå af mindst 200 fluer.

1. Forbered drue plader.
   1. Tilføj 37,5 g agar til 1,5 I destilleret vand i en 4 liters kolbe.
   2. Autoklave vand / agar mix for 50 min ved 121 ° C (250 ºF).
   3. Mens vand / agar mix er autoklavering, tilsættes 50 g sucrose til 500 ml druesaft og rør med en omrører på en opvarmet opsigt plade indtil saccharose er opløst.
   4. Sluk for varmen og fortsæt omrøring til afkøling af / saccharose blanding druesaft til under 70 ºC. Test indre temperatur med en alkohol termometer.
   5. Tilsæt 3 g Drosophila anti-svampe middel (f.eks Tegosept) at varme druesaft / saccharose blandingen og rør til opløsning.
   6. Når vand / agar blanding er taget ud af autoklaven, kolben afkøles ved berøring ved omrystning lejlighedsvis.
   7. Brug en serologisk pipette for at tilføje 8 - 10 ml af drue blanding til låget af en lille petriskål (35 x 10 mm stil). Lad blandingen krone højere end højden af ​​låget vægge for at danne en konveks form.
   8. Tillad drue plader til afkøling i 2 timer ved stuetemperatur og derefter opbevares i en lufttæt beholder ved 4 * C.
2. Forbered gær pasta.
   1. Tilsæt 6 ml phosphatpufferopløsning (PBS) til 4 g levende aktive tørgær i et 50 ml konisk rør og blandes med en spatel indtil glat.
   2. Store gær indsæt ved 4 ºC.
3. Tilsættes en lille klat (ca. 1/8 tsk) af gær pasta til midten af ​​en drue plade. Glat ned nogen skarpe kanter med en spatel.
4. Placer drue plader i en inkubator indtil de har nået stuetemperatur.
5. Overfør fluer af interesse i en ægudtagning kammer og sted drue plade wi'te gær pasta vender indad på toppen. Tape drue plade til ægget opsamlingskammeret at undgå at lade pladen falde ud. Sørg for at skrive vigtige genotype og opdaterede oplysninger om bunden af ​​drue plade.
6. Upend ægget opsamlingskammeret at lade fluerne at lægge æg på drue plade.
7. Placer en kasse eller dække over ægudtagning kamre og placere dem i en inkubator ved 25 ºC.
8. Tillad fluer at lægge æg for 4 - 6 timer.
9. Afslut samling ved at tage drue plade ud af ægget opsamlingskammeret og overførsel fluerne tilbage til deres flaske fødevarer. Brug en spatel til at tørre al overskydende gær pasta fra drue plade. Store drue plade i et større petriskål i en fugtig inkubator ved 25 ºC i ~ 24 timer.

2. Overfør Larverne til Experimental Food

1. Forbered eksperimentelle fødevarer.
   BEMÆRK: Denne mad opskrift er baseret på Bloomington lager center opskrift ^18. Vigtige ændringeromfatter øget mængde af gær for at optimere den ernæringsmæssige værdi af fødevarer som vurderet ved timingen af ​​vandre etape (mellem 112-120 timer efter ægudtagning ved 25 ºC). Mens vi har fundet denne opskrift ideel til sundhed og udvikling af vores eksperimentelle larver, noget mad opskrift acceptabelt givet kalibrering med positive og negative kontroller, eksempler herpå er anført i trin 3.10.
   1. Mål 1.600 ml destilleret vand.
   2. Bland 134 g majsmel, 10,6 g Drosophila Agar type II, og en del af vandet (~ 500 ml) i en 1 liters bægerglas. Blend i 2 min med en motoriseret håndmikser.
   3. Bland 70 g levende tørgær, 18,4 g sojamel, 84,8 g maltekstrakt, og en del af vandet (~ 500 ml) i en anden 1 L bægerglas. Blend i 2 min med en motoriseret håndmikser.
   4. Swirl hvert bæger, og hældes i en 4 liters kolbe. Brug resterende vand til at skylle ud bægerglassene og tilsæt i kolben.
   5. Mål 140 ml lys majssirup og tilføje til kolben, bland ved omrystning. </ Li>
   6. Autoklav i 50 minutter ved 121 ° C (250 ° F) i den flydende omgivelser.
   7. Efter autoklavering, hæld mad i en 4 L bægerglas, og lad det køle af. Hjælp køleprocessen ved at blande med en motoriseret håndmikser.
   8. Når kolben er afkølet nok til at røre, tilsættes 8,8 ml propionsyre og 16,8 ml Drosophila anti-svampe middel / ethanol-opløsning. Bland godt. (Make Drosophila anti-svampe middel ved tilsætning af 380 g Drosophila anti-svampe middel til en L 200 proof ethanol og omrøring på en varm plade, indtil opløst, og sørg løsningen ikke overstiger 70 ºC.)
   9. Hæld mad ind hætteglas indtil maden er ca 1 tomme dyb og lad den køle ved stuetemperatur til 2 - 3 timer. Plug hætteglas og opbevares i en inkubator ved 25 ºC. Brug inden for en uge.
2. Kaste en spatel flere gange i det øverste lag af hætteglasset med fødevarer at score det. Dette vil hjælpe larverne at grave sig ned og foder.
3. 22-24 timer efter ægudtagningen harended, bruge en lille pensel til at indsamle 50 første stadie (L1) larver af den samme omtrentlige størrelse. Placer larver i den eksperimentelle mad. Rengør pensel på et laboratorium Udvisk og sikre, at der ikke er nogen resterende larver på malerpenslen, før du fortsætter til en anden genotype.
4. Placér hætteglas med larver i en inkubator ved 25 ºC og tillade at udvikle sig.

3. Bestem Fat Niveauer i Larver

1. Forbered løsninger.
   1. Forbered en L 10x PBS lager.
      1. Der tilsættes 80 g NaCl, 2 g KCI, 14,4 g Na ₂ HPO _4, og 2,4 g KH ₂ PO ₄ til 800 ml vand i en 2 liters bægerglas indeholdende en omrører. Omrør uden varme, indtil alle salte er inkorporeret. Bringe pH til 7,4. Øge volumen til 1 liter med vand.
   2. Forbered 2 L 1x PBS. Tilsæt 200 ml 10x PBS stamopløsning til 1800 ml vand.
   3. Brug denne bestand af 1x PBS til at gøre 20% vægt / volumen sucrose.
2. Fjern hætteglasset af larver frainkubator når der 20 - 40 larver vandrer op i siderne af hætteglasset (generelt på femtedagen efter Ægsamlingerne). Registrere datoen og tidspunktet for assayet samt antallet af vandrer larver.
3. Forbered eksperimentel opløsning ved tilsætning 11,5 ml PBS og 9 ml 20% sucrose til en 50 ml konisk rør.
4. Tilsæt 20% saccharose til hætteglasset, indtil den er 0,5 - 1 inch fra toppen af ​​hætteglasset.
5. Brug en spatel til forsigtigt røre op det øverste lag af fødevarer til fri larver, der stadig gravende i maden. Alle larver vil stige til overfladen af ​​saccharoseopløsning.
6. Brug pincet til forsigtigt overføre larverne i den oprindelige saccharose koncentration fra trin 3.3.
7. Brug en spatel til forsigtigt omrøre larverne i denne opløsning.
8. Cap konisk rør og upend flere gange for grundig blanding af opløsningen.
9. Tag hætten af ​​konisk rør og slyng at skabe en blid vortex.
10. Lad larver at bosætte enten flyder til toppen af ​​opløsningen eller sinking til bunden. Vent 2 - 5, min for larver at bosætte.
    BEMÆRK: Hvis der stadig er larver, der ikke er afgjort enten flydende eller synkende, vælge en linje til at bruge som en cutoff punkt at mærke larverne som enten en floater eller en loddet. Anvende denne samme kriterium for alle genotyper. Vi bruger vinklen ved bunden af den koniske rør som vores grænse. ADP eller SIR2 ¹⁷ mutant larver kan anvendes som en positiv kontrol og lsd2 ¹⁹ mutanter kan anvendes som en negativ kontrol for kalibrering af assayet.
11. Notér antal flydende larver og den testede specifikke koncentration.
12. Tilsæt 1 ml 20% sucrose til den eksperimentelle opløsning for at forøge dens densitet.
13. Gentag trin 3,7-3,10. Registrere antallet af flydende larver og denne nye koncentration.
14. Fortsæt trin 3.12 og 3.13 indtil mindst 95% af larverne er flydende.
15. Brug pincet til at indsamle alle larver i en dissektion fad fyldt med PBS.
16. observe larver under mikroskop og note, hvis der er nogen små larver, pre-pupper, pupper, eller andre forskelle mellem genotyper.
    BEMÆRK: Ideelt set bør alle larver synes homogen og på samme udviklingstrin. Vi har kun observeret konsistente fedtmålinger under disse betingelser.
17. Registrere den samlede antal larver.
18. Med pincet, overføre 10 larver til et laboratorium tørre for at tørre. Mærke et mikrocentrifugerør og anbring 10 larver i røret.
19. Flash fryse larverne i flydende nitrogen. Opbevar røret ved -20 * C.

Representative Results

Figur 1 viser et eksempel på hvordan opdriften assay kan detektere både højere og lavere fedtdepoter i genmanipuleret larver. Figur 1A viser, at excitation eller dæmpning af en bestemt delmængde af neuroner (E347) i larvernes hjernen fremkalder lavere og højere fedtindhold butikker henholdsvis. Det samme genetiske kontrol baggrund blev brugt i begge tilfælde. Figur 1B er et eksempel på, hvordan denne fænotype opnået ved tætheden analysen bekræftes af neutralt lipid ekstraktion og kvantificering ved GCMS.

Figur 1. Neuronal Funktion i specifikke regioner i Larver Brain er nødvendige og tilstrækkelige for kropsfedt forordning. Neuronal aktivitet i den angivne E347-GAL4 linje blev bragt til tavshed af overekspression af Shi ^DNEller aktiveret ved overekspression af NB, som angivet i panelerne, og virkninger på kropsfedt blev vurderet. (A) Procent af flydende larver ved ligevægt i forskellige tæthed løsninger. Halvtreds larver blev undersøgt pr biologisk gentagelse, n = 7 - 9 biologiske replikater pr genotype (B) Procent kropsfedt (total neutrale lipider, herunder triacylglycerider og phospholipider divideret med kropsvægt) som målt ved GCMS ^17,20 (n = 8).. Blå linjer eller søjler repræsenterer GAL4-only (ingen UAS) dyr krydsede til w ¹¹¹⁸ at kontrollere for effekten af genetisk baggrund. P-værdier repræsenterer resultater for tohalede t-tests. **** P <0,0001, *** P = 0,0001 til 0,001 ** P = 0,001 til 0,01, * P = 0.01 med 0,05. Fejlbjælker viser SEM. Dette tal er blevet ændret ^16. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er en mangfoldighed af teknikker, der er udviklet til at måle lipidniveauer ^8-10. Men hver af disse metoder kommer med nogle store ulemper, der henhører under den opdrift assay beskrevet ovenfor. Først, dette assay er ekstremt hurtig. Test en fuld koncentrationsgradient tager ikke mere end 30-60 min. Dette er en enorm forbedring på de fleste af de teknikker i brug i øjeblikket. For eksempel, lipid kvantificering af MS tager 7-9 timer at isolere lipider og en anden flere timer til at analysere dem. Dette er en stærk afskrækkende, når du udfører en skærm på et stort antal dyr. Ved at måle en hurtig opdrift fænotype, kan man hurtigt fokusere på de genotyper, der har fænotypen af ​​interesse. For det andet, tætheden analysen kræver kun fælles reagenser, såsom salte (for PBS) og saccharose. Dette gør det meget lettere og billigere at screene et stort antal larver eller hurtigt teste en interessant genotype. Endelig er denne protokol is non-invasive og larverne er stadig i live i slutningen. Dette giver yderligere eksperimenter, der skal udføres på dyr som specifikke lipid kvantificering eller afskrift eller protein analyse. Derudover kan genvindes larver kunne fortsætte væksten til voksenalderen.

En yderligere fordel ved denne teknik frem for andre er forøget følsomhed over for små ændringer i kolesterolniveauet i en population. Ved at udføre en hel koncentrationsgradient på en befolkning på 50 larver, vil små forskydninger i befolkningens fedt niveauer identificeres ved en ændring i de mellemliggende koncentrationer, selvom den koncentration, hvor larverne begynder flydende og er totalt flød kan ikke være anderledes end kontrol . Denne lille forskydning i populationen ikke altid kan identificeres af andre fedt kvantificeringsfremgangsmåder da de kræver en stor gruppe af larver at analysere. Densiteten assay derimod aflæser individer i populationen og kan følgelig identificere these små ændringer eller forskydninger i den samlede befolkning fordeling.

Da denne teknik er afhængig af densiteten af ​​opløsningen til frembringelse af pålidelige resultater, er det yderst vigtigt, at PBS og saccharose løsninger bliver konsekvent. Vi har fundet, at forskellige PBS opskrifter producere forskelle i opløsning tæthed, hvilket fører til forskellige resultater. Vi bruger opskriften skitseret ovenfor for ensartede resultater. Endvidere gør den 20% saccharose fra samme batch af 1x PBS er vigtig, da det resulterer i den samme baggrund opløsning densitet. Hvis de to opløsninger blev foretaget separat, kan små variationer i PBS tæthed bringe i ekstra tæthed variabel ud tilsætning af saccharose til den eksperimentelle koniske hætteglas. Endelig kan fordampningen være et problem, fordi over tid løsningerne vil blive mere koncentreret med fordampning af vand. Det er derfor vigtigt at lægge loft flaskerne stramt og omdannede løsningen hver uge, så den eksperimentelleløsninger være konsekvent.

Blandt de skridt der er skitseret ovenfor, er der flere kritiske trin, hvis ændret, kunne resultere i unøjagtige resultater ved opdrift analysen. For det første er det vigtigt, at larverne overført til det eksperimentelle hætteglas fødevarer være den samme alder. Overførsel larver, varierer i størrelse, vil resultere i larver på forskellige udviklingsstadier på tidspunktet opdriften analysen udføres. Denne protokol er blevet udviklet til at bestemme ændringer i fedtindhold i vandre L3 larver og vil ikke fungere præcist for tidlig L3 eller pre-pupper eller senere. Tidlig tredje stadie larver har en tendens til at flyde uafhængigt af fedtindhold mens præ-pupper og pupper vask selv ved de højeste koncentrationer anvendes. Derfor alder L1 larver overført er kritisk. Tilsvarende det punkt, hvor hætteglasset er taget for at udføre den opdrift assayet er vigtig. Af de samme udviklingsmæssige timing ovenfor nævnte grunde, bør kun træffes hætteglassene, når 20 -40 larver vandrer at sikre målinger nøjagtige tæthed. Derudover er antallet af L1 overføres, kan påvirke resultaterne samt. De brede hætteglas anvendes i denne protokol tillader 50 larver at spise uden konkurrence under udvikling. Et langt større antal larver overført end dette vil resultere i konkurrencen om fødevarer og kan påvirke mængden af ​​fedt lagret uafhængigt af genotype.

Der kan være genotyper med sådanne ekstremt høje fedtindhold, at de fleste eller alle larverne vil flyde ved den første koncentration. I dette tilfælde kan den protokol modificeres ved at reducere koncentrationen af ​​udgangsmaterialet opløsning for at opnå et fuldt spektrum af fordelingen befolkningstæthed. På den anden side kan en bestemt genotype være så magert at ingen larve flyder i den indledende saccharose. I dette tilfælde kan de indledende trin udelades, og en højere koncentration udgangspunkt anvendes. Dette assay er meget fleksibel og kan modificeres for bedre at passe til en lang række fedt niveauer.Vi anbefaler brug af kontroller såsom passende vildtype dyr (kontrolleret for genetisk baggrund), positive kontroller (etablerede fedt mutanter, såsom ADP eller SIR2 ¹⁷⁾ og negative kontroller (offentliggjorte lean mutanter såsom lsd2 ^19). Korrekt brug af denne protokol vil tillade fremtidige screening af samlinger for at bestemme nye regulatorer af metabolisme og fedme disposition. Desuden er denne protokol giver en nem måde for forskere i ethvert område for at teste, om deres genetiske manipulation af interesse medfører en ændring i fedtindhold, uden behov for komplekse protokoller eller dyrt udstyr. Denne protokol vil bidrage til at belyse det komplekse forhold mellem genetik og fedme.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	VWR	214030
Welch's Original 100% Grape Juice
Sucrose	Fisher	S512
Tegosept	Genesee Scientific	20-259
Ethanol			200 proof
Baker's yeast	Fleichmann's
Yellow Corn Meal	Quaker		Enriched degerminated
Drosophila Agar Type II	Apex	66-104
Soy Flour	ADM Specialty Ingredients	062-100
Malt Extract	Breiss	5748
Light Corn Syrup	Karo
Propionic Acid	VWR	U330-09
Sodium chloride	Fisher	50147491
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5655-100G
Sodium phosphate anhydrous	Fisher	S3933
Potassium chloride	Fisher	P330-500
35 x 10 mm petri plate	Fisher	08-757-100A
50 ml Conical	Fisher	50-869-569