Summary
De rol van het assortiment (ruimtelijke segregatie) in de evolutionaire scenario's kunnen worden onderzocht met behulp van eenvoudige microbiële systemen in het laboratorium die het mogelijk maken gecontroleerde aanpassing van de ruimtelijke verdeling. Door wijziging van de oprichter celdichtheid, kunnen diverse assortiment niveaus worden gevisualiseerd met behulp van fluorescent gelabelde bacteriestammen in de kolonie biofilms van Bacillus subtilis.
Introduction
In de afgelopen decennia zijn microben erkend als social communities in verband met diverse ecosystemen op aarde 1,2. In tegenstelling tot planktonische culturen die in het algemeen laboratorium praktijk microben in het milieu tonen een breed scala van ruimtelijke community structuren, afhankelijk van de natuurlijke omgeving. Eenvoudige microbiële systemen kunnen worden gebruikt om de gevolgen van ruimtelijke structuren op de evolutie van sociale interacties 3,4 begrijpen. Publicaties in de laatste 2-3 jaar gebruikt zowel eukaryotische als prokaryotische modelsystemen benadrukt het effect van ruimtelijke structuren op de stabiliteit van de samenwerking binnen microbiële populaties 5-8. Bovendien obligate interacties tussen microben, zoals metabolische cross-feeding, zou ook de ruimtelijke verdeling van interagerende partners 9-11 veranderen. De invloed van de ruimtelijke structuur in deze studies wordt meestal onderzocht met behulp van het oppervlak bevestigd sessiele cellen bevolken de zogenaamde-called biofilms of kolonies groeien op het oppervlak van een agarmedium. Genetische drift leidt tot hoge ruimtelijke assortiment waarneembaar in microbiële kolonies wanneer tekort aan nutriënten aan de rand van een celdeling gemedieerde expansie leidt reeks genetische knelpunten hoge plaatselijke fixatie waarschijnlijkheid bepaalde klonale linages 12 veroorzaakt. Genetische drift kan derhalve worden toegepast om de rol van ruimtelijke segregatie in microbiële kolonies onderzocht.
In het milieu, biofilms zijn multispecies gemeenschappen omringd door zelf geproduceerde polymeer matrix 13. Biofilm structuur, functie en de stabiliteit afhankelijk van een complex netwerk van sociale interacties, waar bacteriën wisselen signalen, matrix componenten en middelen, of concurreren voor ruimte en voedingsstoffen met behulp van giftige stoffen en antibiotica. Bacillus subtilis is een bodem levende en wortel koloniserende bacterie die sterk ontwikkelt georganiseerd biofilm gemeenschappen 14. Analoog aan socialeinsecten, B. subtilis cellen maken gebruik van een verdeling van arbeid strategie, de ontwikkeling van subpopulaties van extracellulaire matrix producenten en kannibalen, beweeglijke cellen, slapende sporen en andere celtypen 15,16. Het differentiatieproces is dynamisch en kan worden veranderd door omgevingsomstandigheden 17,18.
Strategieën oppervlaktekolonisatie door bacteriën kunnen gemakkelijk worden gemanipuleerd onder laboratoriumomstandigheden door aanpassing van de agar concentratie in het kweekmedium. Bij lage niveaus agar (0,2-0,3%), bacteriën herbergen actieve flagella in staat zijn om te zwemmen, terwijl de semi-vaste agar (0,7-1% agar) faciliteert flagellum gedreven gemeenschap verspreiden, genaamd zwermen 19-21. Aangezien flagellum bepaalde bacteriestammen kunnen via halfvast medium te bewegen via schuiven, ofwel groei afhankelijk populatie expansie vergemakkelijkt door exopolysaccharide matrix en andere uitgescheiden hydrofobine verbindingen 22-24. Tenslotte worden de bacteriën die zijn capable van de biofilm ontwikkeling vorm architectonisch complex kolonies op harde agar medium (1,2-2%) 14,17,25. Hoewel deze eigenschappen in het laboratorium onderzocht door nauwkeurig aanpassen van de omstandigheden in deze natuurlijke habitats oppervlak verspreiden strategieën kunnen transit geleidelijk van het ene naar het andere afhankelijk van de omgevingsomstandigheden 26. Hoewel enkele cel gebaseerde motiliteit kritisch bij aanvang van de biofilm ontwikkeling op het lucht-vloeistof-grensvlak in zowel Gram-positieve en -negatieve bacteriën 27, complex kolonie biofilms van B. subtilis worden niet beïnvloed door deletie van flagellaire beweeglijkheid 28. Echter, ruimtelijke organisatie gedurende de ontwikkeling van B. kolonie subtilis biofilms afhankelijk van de dichtheid van het bacteriële inoculum gebruikt om de biofilm 8 initiëren.
Hier gebruiken we B. subtilis aantonen dat ruimtelijke segregatie tijdens oppervlaktekolonisatie afhankelijk van het mechanisme van populatieniveau motility (dwz zwermen of schuifdeuren) en kolonie biofilm ontwikkeling hangt af van de oprichter celdichtheid. We presenteren een fluorescentiemicroscopie instrument dat kan worden toegepast om continu monitoren microbiële biofilmgroei, oppervlaktekolonisatie en assortiment Op macroschaal. Verder wordt een kwantitatieve methode voorgesteld om de relatieve abundantie rek in de populatie te bepalen.
Protocol
1. Voorbereiding van Cultuur Media, Semi-massief Agar en biofilm platen, Pre-culturen
- Medium Voorbereiding voor Zwermen en Sliding
- Los 2 g Lenox Broth (LB) en 0,7 g agar-agar in 100 ml gedeïoniseerd water en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C. Met kleine hoeveelheden (50-200 ml) de reproduceerbaarheid tussen experimenten te verbeteren.
- Direct na sterilisatie, sluit de dop van de fles om verdamping medium en plaats verminderen in een 55 ° C incubator gedurende ten minste 2 uur.
- Nadat het medium temperatuur getemperd tot 55 ° C, giet 20 ml agar LB-medium in een 90 mm polystyreen petrischaal onder een laboratorium steriele kap. Voor time-lapse experimenten, giet 5 ml agar LB-medium per 35 mm diameter van polystyreen petrischaal.
- Sluit de petrischaal na het gieten, stapel maximaal 4 platen op elkaar en laat het agarmedium stollen gedurende tenminste 1 uur.
- 2xSG Medium Peerherstel voor Colony Biofilms
- Los op 1,6 g Nutrient Broth, 0,2 g KCl, 0,05 g MgSO 4 7H 2 O en 1,5 g agar-agar in 100 ml gedeïoniseerd water en autoclaaf gedurende 20 minuten bij 120 ° C. Met kleine hoeveelheden (50-200 ml) de reproduceerbaarheid tussen experimenten te verbeteren.
- Direct na sterilisatie, sluit de dop van de fles medium verdamping te verminderen en zet de fles in een 55 ° C incubator gedurende ten minste 2 uur.
- Na de mediumtemperatuur heeft zelf ingesteld op 55 ° C, voeg 0,1 ml filter gesteriliseerd 1 M Ca (NO3) 2-oplossing, 0,1 ml filter gesteriliseerd 100 mM MnCl2 oplossing, 0,1 ml filter gesteriliseerd 1 mM FeSO 4 oplossing en 0,5 ml 20% steriele glucoseoplossing.
- In een laboratorium steriele kap, giet 20 ml agar 2x SG medium per diameter van 90 mm polystyreen petrischaal. Voor time-lapse experimenten, giet 5 ml agar LB-medium per 35 mm diameter van polystyreen petrischaal.
- Close de petrischaal na het gieten, stapel de plaat boven op elkaar, maar niet meer dan 4 platen, en laat het agarmedium stollen gedurende tenminste 1 uur.
- Voorbereiding van de Starter Cultures
LET OP: De B. subtilis 168, NCIB 3610 afgeleide stammen die constitutief onderstaand beschreven werkwijzen produceren groen- en rood-fluorescentie eiwitten en beschreven voor 8,27. Stammen routinematig opgeslagen in de -80 ° C vriezer.- Enten starterkweken van -80 ° C bestanden in 3 ml LB medium en incubeer overnacht (16-18 uur) bij 37 ° C met horizontale schudden (225 rpm). Niet broeden de cultuur langer dan 18 uur als wild isolaten van B. subtilis zijn vooral gevoelig voor aggregeren en vormen een biofilm in de reageerbuis.
2. Co-enting van fluorescent gelabelde bacteriële stammen voor Surface Spreading
- Drogen van semi-vaste agarplaten voor Swarming enGlijden van B. subtilis.
- Droge agarplaten voor zwermen en glijden gedurende 20 min vóór de inoculatie. Droge platen ontdekt in een laminaire stroming kap (zie figuur 1).
OPMERKING: Bacteriële zwermen en glijden afhankelijk van de droogheid van de halfvast agar medium. Onvoldoende droging maakt het mogelijk water accumulatie op het agar medium resulteert in-flagellum gemedieerde zwemmen. Langdurige droogtijd resulteert in een gebrek aan zwermen.
- Droge agarplaten voor zwermen en glijden gedurende 20 min vóór de inoculatie. Droge platen ontdekt in een laminaire stroming kap (zie figuur 1).
Figuur 1:.. Experimentele workflow De uniforme procedure die is afgebeeld in de figuur, met inbegrip van de voorbereiding van het kweken medium, het drogen van de plaat, inenting en fluorescentie microscopie detectie (van links naar rechts) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Co-inoculatievan bacterieculturen voor Zwermen en Sliding
- Bepaal de optische dichtheden van de nachtelijke starter cultures bij 600 nm en meng dichtheid genormaliseerd groen- en rood-fluorescerend eiwit producerende stammen van B. subtilis NCIB 3610 of haar Δ hag derivaat in een 1,5 ml reactie buis. Bijvoorbeeld, mix 100 ul stam 1 met (100 * [OD 600 van 's nachts cultuur van stam 1] / [OD 600 van' s nachts cultuur van de stam 2]) pl stam 2. Licht vortex (3 sec bij maximale snelheid) voor homogene verdeling.
LET OP: B. subtilis NCIB 3610 stammen worden geënt in zwermen observeren, terwijl hun Δ hag derivaten worden gebruikt voor schuiven. - Spot 2 pl mengcultuur op het midden van een voorgedroogde plaat (zie figuur 1) en de plaat verder drogen gedurende 10 minuten na de inoculatie.
- Incubeer de platen bij 37 ° C rechtop om overtollig vocht condenseert op het deksel en niet op het agar oppervlak. <br /> NB: De incubatie tijd voor B. subtilis zwermen is meestal tussen de 8-16 uur. In het algemeen, de rand van de zwerm bereikt de zijkant van de 90 mm petrischaal in 8 uur. Sliding is een trager proces vereist ten minste 16-42 uur incubatie. Na 36 uur werd de schuivende voorzijde bereikt de kant van de 90 mm petrischaal.
- Voor time-lapse experimenten, plaatst u de 35 mm diameter petrischalen in een voorverwarmde fase incubatiekamer ingesteld op 37 ° C. Zorg ervoor dat het deksel van de petrischaal blijft verwijderd tijdens de gehele duur van het experiment. Stel het deksel van het podium incubator tot 40 ° C om wasemvorming omzeilen bovenop de incubator.
- Bepaal de optische dichtheden van de nachtelijke starter cultures bij 600 nm en meng dichtheid genormaliseerd groen- en rood-fluorescerend eiwit producerende stammen van B. subtilis NCIB 3610 of haar Δ hag derivaat in een 1,5 ml reactie buis. Bijvoorbeeld, mix 100 ul stam 1 met (100 * [OD 600 van 's nachts cultuur van stam 1] / [OD 600 van' s nachts cultuur van de stam 2]) pl stam 2. Licht vortex (3 sec bij maximale snelheid) voor homogene verdeling.
3. Co-enting van fluorescent gelabelde bacteriële stammen met verschillende Initial celdichtheden
- Drogen van Agar Platen voor Colony biofilmvorming B. subtilis.
- Droog de platen voor kolonie biofilm ontwikkeling zonder deksel in een laminaire stromingkap voor 15 minuten vóór de inoculatie.
LET OP: Onvoldoende drogen resulteert in een verhoogde luchtvochtigheid en zwemmen of zwermen is mogelijk 29 zijn. Drogen te lang leidt tot kleine kolonies biofilm.
- Droog de platen voor kolonie biofilm ontwikkeling zonder deksel in een laminaire stromingkap voor 15 minuten vóór de inoculatie.
- Voorbereiding van de 10-voudig Verwaterd Starter Cultures for Colony Biofilms
- Meng 100 ul van groen- en rood-fluorescerend eiwit producerende nachts starter culturen van B. subtilis 168 in een 1,5 ml reageerbuis en mild vortex voor een homogene verdeling. Bereid 10-voudige verdunningsreeks in LB medium.
- Spot 2 pl niet-verdund of 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 verdunde gemengde culturen op de plaat met biofilm-inducerende medium.
OPMERKING: 6-9 biofilm kolonies kunnen worden ingeleid op een 90 mm petrischaal met dien verstande dat de kolonies worden gescheiden op gelijke afstand van elkaar. - Incubeer de platen bij 30 ° C rechtop om overtollig vocht condenseert op het deksel enniet op het agar oppervlak.
LET OP: De incubatietijd voor B. subtilis biofilm tussen 1-3 dagen. In het algemeen, de kolonie biofilm van B. subtilis bereikt zijn gemiddelde grootte en de complexe structuur in 2 dagen. - Voor time-lapse experimenten plaats een enkel inoculum in het midden van een 35 mm petrischaal en plaats de schaal in een voorverwarmde fase incubatie, ingesteld op 30 ° C. Zorgen dat de bovenzijde van de petrischaal verwijderd blijft gedurende de duur van het experiment. Stel het deksel van het podium incubator 35 ° C tot wasemvorming omzeilen bovenop de incubator.
4. fluorescentiemicroscopie detectie van gelabelde stammen
- Beschrijving uitrusting for Imaging.
- Om oppervlak kolonisatie en fluorescentie-signaal te detecteren, gebruiken een gemotoriseerde fluorescentie stereo zoom microscoop (zie gedetailleerde lijst in Materials Table) uitgerust met een 0.5X PlanApo Objective, twee LEDKoudlichtbronnen (een voor fluorescentiedetectie en een voor zichtbaar licht), filtersets voor GFP (excitatie bij 470/40 nm en emissie bij 525/50 nm) en mRFP (excitatie bij 572/25 nm en emissie bij 629 / 62 nm), en een hoge resolutie monochrome camera.
- Voer het capturen en verwerken met de juiste software beschikbaar voor de stereo zoom microscoop waaronder multikanaals en time-lapse-modules. Voor time lapse experiment, gebruik dan een standaard verwarming podium incubator gemonteerd op de stereo zoom microscoop met een adapter.
- Beeldvorming van Zwermen en Sliding Expansion
- Gebruik de laagst mogelijke vergroting van de grootst mogelijke oppervlakte van de 90 mm plaat vast te leggen. Stel de oorsprong van inoculatie (midden van de 90 mm petrischaal) om de hoek van het zichtbare gebied toezicht bacteriële radiale expansie en fluorescentie.
- Pas optimale belichtingstijd afhankelijk van de sterkte van het fluorescentiesignaal.
LET OP: Voor constitutief Expressed fluorescentie genen in B. subtilis, groen- en rood-fluorescentie met 1,5 en 3 sec blootstellingstijden kunnen worden gebruikt, respectievelijk. Bovendien, 10 msec belichtingstijd is geschikt voor zichtbaar licht.
- Met de vergroting dat de detectie van de gehele kolonie biofilm maakt en pas de kolonie in het midden van het gezichtsveld.
Opmerking: Voor zwermen en glijden uitbreidingen, de optimale belichtingstijden de fluorescentiesignalen in de biofilm kolonies gedetecteerd afhankelijk van het expressieniveau van het fluorescerende eiwit coderende genen. Voor de representatieve resultaten hieronder werd groen- en rood-fluorescentie gedetecteerd met 1 en 3 blootstelling sec intervallen, respectievelijk. - Voor time-lapse imaging, beelden op bepaalde tijdstippen met behulp van constante blootstelling keer te verkrijgen.
- Sla de fluorescentie stereomicroscoop opgenomen beelden in een bestandsformaat dat door ImageJ software voor kwantitatieve data-analyse wordt herkend.
5. Dateen analyse
- Om het gebied bezet door elk verschillend gelabelde fluorescerende stam te analyseren, opent u het bestand van de interesse in ImageJ software uitgebreid met een BioVoxxel plugin.
- Als er een venster met de naam "Bio-Formats Import Options" verschijnt waar alleen de opties 'Open alle series "en" Autoscale "zijn geselecteerd, opent u het bestand door te klikken op" OK ".
OPMERKING: De bestanden worden weergegeven als een stapel van drie beelden, één voor elk gebruikt om een beeld in de microscoop (groen-rood-fluorescentie en bright-field images) opnamekanaal. - Scheid de stapel in afzonderlijke kanaal beelden door te kiezen voor "Image" - "Stacks" - "stapel Images" in de ImageJ bedieningspaneel.
OPMERKING: Afbeeldingen verschijnen en zijn genummerd als 03/01 (groene kanaal), 03/02 (rood kanaal) en 3/3 (bright-field). Hier wordt het beeld helder-veld van de analyse uitgesloten.
- Als er een venster met de naam "Bio-Formats Import Options" verschijnt waar alleen de opties 'Open alle series "en" Autoscale "zijn geselecteerd, opent u het bestand door te klikken op" OK ".
- Om de beelden te analyseren, te transformeren elk beeld een 8-bits in door het selecteren"Beeld" - "Type" - "8-bit".
- Om het bezette gebied pixel 2 te bepalen, stelt de omvang van de beelden met behulp van "Analyze" - "Set Scale". Als er een venster verschijnt met verschillende schaal opties, reset de weegschaal door het selecteren van "Click to Scale verwijderen". Vink de optie "Global" om de schaal te verwijderen voor alle geopende afbeeldingen.
- Om de achtergrond te verwijderen, trek een ovaal gebied (regio van belang, ROI) buiten het fluorescerende gebied met behulp van de "Oval" tool in de ImageJ bedieningspaneel.
- Opdat de grootte van de achtergrond ovaal is hetzelfde voor alle geanalyseerde afbeeldingen toevoegen aan de ROI beheerder via het [t] karakter van het toetsenbord. Een venster ROI Manager komt waar de achtergrond ovale ROI via "More" kunnen worden opgeslagen - opties "Opslaan".
- Als de achtergrond ovale ROI is zichtbaar op het beeld, het meten van de intensiteit van het gebied door te kiezen voor "Analyseren" - "Maatregel".
LET OP: de resultaten Eenvenster waarin onder andere de gemiddelde fluorescentie-intensiteit wordt weergegeven in de kolom "Mean". - Trek de waarde van de gemiddelde achtergrond fluorescentie-intensiteit van het beeld door de selectie van de achtergrond ovale ROI, te klikken op "Process" - "Math" - "Trek" en het plaatsen van de gemeten waarde.
- Breng een drempel om het beeld via de "Image" - "Adjust" - optie 'Threshold'. Selecteer de methode Otsu en zwart-wit (B & W). Vink de optie "Donkere achtergrond" en maken gebruik van de drempel door te klikken op "Apply".
LET OP: Het beeld verandert in een binair beeld, waar het gebied boven de drempel wordt weergegeven in wit en dat onder de drempel wordt weergegeven in zwart. - Selecteer alles boven de drempel via de "Analyze" - "Analyseer Deeltjes" optie. In het venster met de instellingen, houdt u de standaard opties en bewaar de "Toon resultaten" en "Summarize "opties aangevinkt. Klik op" OK Total Area "" om de samenvatting in het venster resultaten en de display van de bezette gebied in de kolom weer te geven ".
Representative Results
Laboratorium systemen van bacteriële populaties bieden een aantrekkelijke benadering van ecologische of evolutionaire vragen te verkennen. Hier, drie oppervlak kolonisatie takken van B. subtilis werden gebruikt om het uiterlijk van het assortiment populatie onderzocht, namelijk de scheiding van genetisch identieke, maar verschillend fluorescent gemerkte stammen. Zwermen, dat is een flagellum afhankelijk collectieve grondbewegingen van B. subtilis, resulteert in een zeer gemengde populatie. In deze zwermen kolonies, de groen- en rood-fluorescerende bacteriën gekoloniseerde gebieden werden overlappen (zie figuur 2A). De snelle oppervlaktekolonisatie kan in tijd (Video figuur 1) gevolgd. Tijdens zwermen van B subtilis, een dunne laag cellen wordt geopend via het centrum inoculatie na enkele uren incubatie (zie figuur 2B).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
Figuur 2: zwermen uitbreiding van B. . subtilis De zwermen kolonie bevat groen- en rood-fluorescerende stammen die werden gemengd 1: 1 voor enting. (A) Na 15 uur, de groen- en rode fluorescentie (GFP en RFP, respectievelijk) werden gedetecteerd met de juiste fluorescentie filters. (B) Beelden van dunne laag uitzwermen B. subtilis worden getoond op geselecteerde tijdstippen onttrokken Video Figuur 1. Schaal bar = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Wanneer echter B. subtilis stammen die ontbreken functionele flagellen maar kunnen verspreiden met behulp van geproduceerde exopolysacharide, hydrofobine en surfactine, werden gespot op halfvast agar medium, werden de verschillend gemerkte stammen gescheiden bepaalde defined sectoren (zie figuur 3A). De ontwikkeling van de glijdende kolonie kan worden opgenomen in de tijd (zie figuur 3B of Video figuur 2).
Figuur 3: Sliding kolonie van B. . subtilis De kolonie bevat groen- en rood-fluorescerende stammen die werden gemengd 1: 1 voor enting. (A) na 24 uur, de groen- en rood-fluorescentie (GFP en RFP, respectievelijk) werden gedetecteerd met fluorescentie geschikte filters. (B) Foto's van de B. subtilis sliding disk worden weergegeven op geselecteerde tijdstippen onttrokken Video Figuur 2. Schaal bar = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Hoewel het assortiment niveaus van zwermen en sliding groeiende kolonies kon niet worden gewijzigd, kan de ruimtelijke scheiding van verschillend gemerkte fluorescerende stammen in de kolonie biofilm worden beïnvloed door het starten celdichtheden. Wanneer een kolonie biofilm van B. subtilis werd ingeleid met een hoge celdichtheid van de gemengde populatie, de groen- en rood-fluorescerende stammen vertoonden geen of weinig ruimtelijke assortiment (zie figuur 4). Integendeel, wanneer de celdichtheid het biolfilm inleiding laag was, konden duidelijk groen- en rood-fluorescentie sectoren worden gedetecteerd door fluorescentie microscopie. Het assortiment niveau was duidelijk afhankelijk van de verdunning niveau van de biofilm initiëren bevolking. Video Figuur 3 en 4 presenteren de kolonie uitbreiding voor de laagste en hoogste verdunning van de geënte stammen.
Figuur 4: Assortiment niveau kolonie biofilms van B. subtilis bij. verschillende initiële celdichtheden De kolonie biofilms van groen- en rood-fluorescentie stammen getoond na 2 dagen die werden geïnoculeerd met verschillende initiële celdichtheden (van boven naar beneden: onverdund tot 10 5 keer verdund initiëren culturen, respectievelijk). Schaal bar = 5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
De verhouding van groen- en rood-fluorescerende stammen kunnen verder worden gekwantificeerd met behulp ImageJ software die de kwantitatieve karakterisatie van populatiestructuur en concurrentievermogen van de stammen gebruikt voor de experimenten toestaat.
Video Figuur 1: Time lapse images van zwermen B. subtilis ingeleid. 1: 1 mix van groen- en rood-fluorescerende stammen (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) De video toont een tijdsverloop van 10 uur. Schaal bar = 7 mm.
Video Figuur 2: Time lapse beelden van glijdende B. subtilis ingeleid. 1: 1 mix van groen- en rood-fluorescerende stammen (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) De video toont een tijdsverloop van 24 uur. Schaal bar = 5 mm.
Video Figuur 3: Time lapse beelden van B. subtilis kolonie biofilms gestart met 1: 1 mix van groen-. En rood fluorescerende stammen bij hoge celdichtheden (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) De video toont een tijdsverloop van 48 uur. Schaal bar = 5 mm.
Video Figuur 4: Time lapse beelden van B. kolonie subtilis biofilms gestart met 1: 1 mix van groen- en rood-fluorescerende stammen bij lage celdichtheden. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.) De video toont een tijdsverloop van 48 uur. Schaal bar = 5 mm.
Discussion
De beschikbaarheid van een toolbox fluorescerende bacteriën bevordert niet alleen de studie van heterogene genexpressie 30,31 en eiwit lokalisatie 32, maar ook de analyse van de ruimtelijke verdeling van spanningen in een populatie 8. Fluorescente merkers met voldoende verschillende excitatie- en emissiegolflengte laten duidelijk lokaliseren twee stammen die anders niet te onderscheiden zijn van elkaar wanneer gemengd. De beschreven protocol kan worden gebruikt voor het observeren van de populatiedynamiek in gemengde culturen, bijvoorbeeld concurrentie experimenten of synergie tussen stammen of species. De mogelijkheid om de relatieve abundanties van fluorescent gemerkte stammen in een gemengde populatie te bepalen is niet beperkt bijgevoegde zwermen, glijden of biofilm kolonies oppervlak, maar kan ook worden gebruikt voor andere multicellulaire biofilm, waaronder ondergedompeld, stroomcel of lucht-medium-interface biofilms 27,33-35.
_content "> Hoewel de gepresenteerde techniek is een krachtig instrument om de ruimtelijke verdeling van de stammen en de concurrentie ontwerp experimenten op te sporen, het zorgt er ook volgende genexpressie heterogeniteit in de uitbreiding van kolonies. De hier beschreven kweekomstandigheden gelden voor B. subtilis en de exacte parameters voor uitbreiding op agar afdrukmateriaal optimalisatie van andere soorten of stammen 20 vereisen. het plaatsen van de monsters in een incubatiekamer terwijl imaging maakt de experimentator de populatiedynamiek volgen in de tijd, maar de aandacht moet worden geschonken aan de vochtigheidsgraad in de kamer tijdens de incubatie.De hier beschreven technieken vereisen ook de genetische modificatie van de onderzochte bacteriestammen zodat de stammen tot expressie fluorescente merkers die kunnen worden onderscheiden van elkaar. Bovendien, naast het hebben van verschillende excitatie- en emissiespectra, wordt aanbevolen dat de twee gekozen fluorescente merkers vergelijkbare quantum rendementen (dwz verhouding van de geabsorbeerde fotonen die worden uitgestoten) en worden uitgedrukt in een vergelijkbaar niveau. Bovendien kan relatieve intensiteit veranderingen in de tijd worden gemeten en genormaliseerd op een vroeg tijdpunt van een experiment. De relatieve toename of afname kan dan worden vergeleken tussen verschillende fluoroforen met verschillende kwantumefficiëntie. Voor de gepresenteerde experimentele systeem werden verschillende groen- en rood-fluorescerende eiwitten eerder geteste 36,37 om te selecteren op de meest optimale fluorescerende paren die in B kan worden gedetecteerd subtilis. De optimale belichtingstijd moet worden bepaald voor elke fluorescerend eiwit en monster. Bepaalde celdichtheden of meervoudige lagen van cellen nodig zijn om het signaal efficiënt binnen de populatie te detecteren. Bepaalde fluorescente proteïnen kunnen lage intensiteiten in de bacteriële cellen door inefficiënte expressie en / of translatie van het eiwit en dus lage opbrengst quantum hebben. Dergelijke ondoelmatige fluorescente merkers kunnen reduce de gevoeligheid van het systeem en verlengen de tijd die nodig is om de bacteriële stammen met mogelijke cytotoxiciteit door het excitatielicht te detecteren. De fluorescentie intensiteiten kunnen dienovereenkomstig worden gemodificeerd door wijziging van de promoter gebruikt om de fluorescente reporter coderende gen expressie. Een expressieniveau te hoog zou kunnen leiden tot onnodige overproductie van het fluorescerende eiwit leidt tot nadelige fitheidkosten voor de bacterie. Bij het uitvoeren van competitie-experimenten, moet men de kosten van specifieke fluorescerend eiwit productie in de cellen onderzocht. Controle-experimenten, waarbij de fluorescerende markers worden uitgewisseld tussen streden stammen of waar twee isogene stammen alleen verschillen in hun fluorescerende markers worden tegen elkaar, zijn altijd verplicht om elke neiging naar een marker te bepalen. De levensduur van de fluorescerende eiwitten in de cellen kan ook invloed hebben op de gemeten intensiteit. Bovendien, de autofluorescentie van bepaalde bacteriële species zou het gebruik van verschillende anders dan hier beschreven fluorescente merkers vereist.
De ruimtelijke verdelingen en abundanties van de verschillende bacteriestammen nauwkeurig te kunnen bepalen, moet het achtergrondsignaal afkomstig van de eerste fluorescerende eiwit tijdens het gebruik van de fluorescentie-filter voor de tweede fluorescerende merker en vice versa afzonderlijk getest op monocultuur monsters (met bacteriën die slechts één merker ). Hierdoor kan de aftrekking van overlappende fluorescerende signaalintensiteiten. Belangrijk, omdat de stereomicroscoop neemt het fluorescentiesignaal van boven de groeiende kolonie, de gepresenteerde protocol is handig om de ruimtelijke rangschikking bepalen twee dimensies. De architectuur van de groeiende bacteriepopulatie kan resulteren in variërende fluorescentieniveaus (dwz rimpel structuren mogelijk meer cellen die hogere lokale fluorescentie intensiteiten bevatten). Daarom is de beschreven analyse van de beelden determines de ruimtelijke verdeling, maar niet de overvloed van de spanningen binnen een bepaalde locatie. Vorige protocollen beschreef het monster voorbereiding zwermen 20 of fluorescentie beeldvorming van de populatiedynamiek in bacteriekolonies 38, maar ons protocol combineert deze technieken. Andere microscopische technieken dat de waarneming van driedimensionale resolutie van de bevolking structuur (zoals confocale laser scanning microscopie 39,40 of gestructureerde verlichting microscopie 41) toe kan worden toegepast voor monsters met hogere structurele complexiteit. Deze aanvullende technieken ondersteunen ook enkele cel gebaseerde detectie van de stammen 31 die niet beschikbaar is met behulp van stereomicroscopen.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door subsidie KO4741 / 3-1 van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Verder, het laboratorium van Á.TK werd ondersteund door een Marie Curie-Skłodowska carrière integratie subsidie (PheHetBacBiofilm) en het verlenen van KO4741 / 2-1 van DFG. TH, AD, RG-M., En EM werden ondersteund door International Max Planck Research School, Alexander von Humboldt Stichting, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia-Duitse Academic Exchange Service (CONACyT-DAAD) en JSMC beurzen, respectievelijk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
