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Genetics

भूतल बस्तियां माइक्रोबियल आबादी में निगरानी स्थानिक पृथक्करण

Published: October 29, 2016 doi: 10.3791/54752
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Terrestrial Biofilms Group, Institute of Microbiology, Friedrich Schiller University, Jena

Summary

विकासवादी परिदृश्यों में वर्गीकरण (स्थानिक अलगाव) की भूमिका प्रयोगशाला है कि स्थानिक वितरण के समायोजन नियंत्रित अनुमति देने में सरल माइक्रोबियल सिस्टम का उपयोग कर जांच की जा सकती है। संस्थापक सेल घनत्व को संशोधित करके, विभिन्न स्तरों वर्गीकरण बेसिलस subtilis की कॉलोनी biofilms में fluorescently लेबल जीवाणु उपभेदों का उपयोग करते हुए देखे जा सकते हैं।

Introduction

पिछले दशकों में, रोगाणुओं पृथ्वी 1,2 पर विभिन्न पारिस्थितिक तंत्र के साथ जुड़े सामाजिक समुदायों के रूप में मान्यता दी गई है। planktonic सामान्य प्रयोगशाला अभ्यास में इस्तेमाल संस्कृतियों के विपरीत, वातावरण में रोगाणुओं पारिस्थितिक सेटिंग के आधार पर स्थानिक संरचनाओं समुदाय की एक विविध रेंज दिखा। सरल माइक्रोबियल प्रणालियों सामाजिक संबंधों 3,4 के विकास पर स्थानिक संरचनाओं का परिणाम समझने के लिए उपयोग किया जा सकता है। दोनों यूकेरियोटिक और प्रोकार्योटिक मॉडल प्रणाली का उपयोग करते हुए पिछले 2-3 वर्षों में प्रकाशन माइक्रोबियल आबादी 5-8 के भीतर सहयोग की स्थिरता पर स्थानिक संरचनाओं के प्रभाव पर प्रकाश डाला। इसके अतिरिक्त, चयापचय पार खिला रोगाणुओं के बीच बातचीत लाचार, जैसे, भी बातचीत भागीदारों 9-11 के स्थानिक वितरण बदल सकता है। इन अध्ययनों में स्थानिक संरचना के प्रभाव ज्यादातर सतह संलग्न बिना डंठल इसलिए inhabiting कोशिकाओं का उपयोग कर जांच कर रहा हैतथाकथित biofilms या कालोनियों में अगर मध्यम की सतह पर बढ़ रहा है। जेनेटिक बहाव उच्च स्थानिक वर्गीकरण में जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोबियल कालोनियों में देखा जा सकता है जहां आनुवंशिक बाधाओं की श्रृंखला में एक कोशिका विभाजन की मध्यस्थता विस्तार परिणामों की बढ़त है कि कुछ प्रतिरूप linages 12 के लिए उच्च स्थानीय निर्धारण संभावना का कारण बनता है पर पोषक तत्वों की कमी। जेनेटिक बहाव इसलिए माइक्रोबियल कालोनियों में स्थानिक अलगाव की भूमिका की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है।

वातावरण में, biofilms स्वयं उत्पादित बहुलक मैट्रिक्स 13 से घिरा हुआ multispecies समुदाय हैं। Biofilm संरचना, समारोह और स्थिरता सामाजिक संबंधों का एक जटिल नेटवर्क जहां बैक्टीरिया विनिमय का संकेत है, मैट्रिक्स घटकों और संसाधनों, या स्थान के लिए प्रतिस्पर्धा और विषाक्त पदार्थों और एंटीबायोटिक दवाओं का उपयोग कर पोषक तत्वों। बेसिलस subtilis एक मिट्टी रहने वाली और जड़-बस्तियां जीवाणु कि उच्च का आयोजन विकसित करता है पर निर्भर biofilm समुदायों 14। सामाजिक करने के सादृश्य मेंकीड़े, बी subtilis कोशिकाओं श्रम रणनीति का एक प्रभाग को रोजगार, बाह्य मैट्रिक्स उत्पादकों और नरभक्षी, गतिशील कोशिकाओं, निष्क्रिय बीजाणुओं और अन्य प्रकार की कोशिकाओं 15,16 के उप-जनसंख्या का विकास। भेदभाव की प्रक्रिया गतिशील है और पर्यावरण की स्थिति 17,18 से बदला जा सकता है।

बैक्टीरिया से सतह उपनिवेशवाद की रणनीतियाँ आसानी से विकास मीडिया में अगर एकाग्रता को संशोधित करके प्रयोगशाला परिस्थितियों में चालाकी से किया जा सकता है। कम अगर स्तर (0.2-0.3%) में सक्रिय flagella शरण बैक्टीरिया, तैरने में सक्षम हैं, जबकि अर्द्ध ठोस अगर (0.7-1% अगर) की सुविधा कशाभिका संचालित समुदाय के प्रसार, 19-21 रेंगनेवाले बुलाया। कशाभिका के अभाव में, कुछ जीवाणु उपभेदों रपट, यानी विकास निर्भर आबादी विस्तार exopolysaccharide मैट्रिक्स और अन्य स्रावित hydrophobin यौगिकों 22-24 द्वारा सुविधा के माध्यम से अर्द्ध ठोस मध्यम पर स्थानांतरित करने में सक्षम हैं। अंत में, जीवाणु जो capabl हैंbiofilm विकास प्रपत्र मुश्किल अगर मध्यम (1.2-2%) 14,17,25 पर वास्तुकला जटिल कालोनियों के ई। ये लक्षण ठीक प्राकृतिक निवास में, की स्थिति का समायोजन करके प्रयोगशाला में जांच कर रहे हैं जबकि इन सतह फैल रणनीतियों पारगमन एक से धीरे-धीरे एक और पर्यावरण की स्थिति 26 के आधार पर हो सकता है। जबकि एकल कोशिका आधारित गतिशीलता दोनों ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और -नकारात्मक 27, बी के जटिल कॉलोनी biofilms में हवा तरल इंटरफेस में biofilm विकास की दीक्षा के दौरान महत्वपूर्ण है subtilis कशाभ गतिशीलता 28 का विलोपन से प्रभावित नहीं हैं। बी के विकास के दौरान हालांकि, स्थानिक संगठन subtilis कॉलोनी biofilms जीवाणु biofilm 8 आरंभ करने के लिए इस्तेमाल किया inoculum के घनत्व पर निर्भर करता है।

यहाँ, हम बी का उपयोग subtilis दिखाने के लिए कि सतह उपनिवेशवाद के दौरान स्थानिक अलगाव जनसंख्या के स्तर motili के तंत्र पर निर्भर करता हैTy (यानी रेंगनेवाले या फिसलने), और कॉलोनी biofilm विकास संस्थापक सेल घनत्व पर निर्भर करता है। हम एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी उपकरण है कि लगातार माइक्रोबियल biofilm विकास, सतह उपनिवेशवाद और मैक्रो पैमाने पर वर्गीकरण की निगरानी के लिए लागू किया जा सकता उपस्थित थे। इसके अलावा, एक मात्रा का ठहराव विधि आबादी में रिश्तेदार तनाव बहुतायत निर्धारित करने के लिए प्रस्तुत किया है।

Protocol

1. संस्कृति, मीडिया, अर्ध ठोस अगर और biofilm प्लेटें, प्री-संस्कृति की तैयारी

  1. रेंगनेवाले और फिसलने के लिए मध्यम तैयारी
    1. Lenox शोरबा (पौंड) के 2 जी और 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर आयन-विमर्श पानी में अगर-अगर और आटोक्लेव की 0.7 ग्राम भंग। प्रयोगों के बीच reproducibility में सुधार करने के लिए छोटी मात्रा (50-200 एमएल) का प्रयोग करें।
    2. इसके तत्काल बाद नसबंदी के बाद, मध्यम बोतल की टोपी बंद कम से कम 2 घंटे के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वाष्पीकरण और जगह कम करने के लिए।
    3. बाद मध्यम तापमान 55 डिग्री सेल्सियस के लिए स्वभाव है, डालना एक प्रयोगशाला बाँझ हुड के नीचे एक 90 मिमी व्यास polystyrene पेट्री डिश में 20 मिलीलीटर अगर लेग माध्यम। समय चूक प्रयोगों के लिए, डालना प्रति 35 मिमी व्यास polystyrene पेट्री डिश 5 मिलीलीटर अगर लेग माध्यम।
    4. तुरंत गिरने के बाद पेट्री डिश बंद करें, एक दूसरे के शीर्ष पर कोई अधिक से अधिक 4 प्लेटों ढेर और अगर मध्यम कम से कम 1 घंटे के लिए जमना।
  2. 2xSG माध्यम पीकालोनी Biofilms के लिए मरम्मत
    1. पोषक तत्व शोरबा का 1.6 जी, KCl की 0.2 ग्राम, MgSO 4 की 0.05 ग्राम 7H 2 हे, और 120 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 100 मिलीलीटर आयन-विमर्श पानी में अगर-अगर और आटोक्लेव के 1.5 ग्राम भंग। प्रयोगों के बीच reproducibility में सुधार करने के लिए छोटी मात्रा (50-200 एमएल) का प्रयोग करें।
    2. इसके तत्काल बाद नसबंदी के बाद, कम से कम 2 घंटे के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वाष्पीकरण को कम करने और बोतल जगह के लिए मध्यम बोतल की टोपी को बंद करें।
    3. मध्यम तापमान आत्म समायोजित 55 डिग्री सेल्सियस के लिए जाने के बाद, 0.1 मिलीग्राम फिल्टर निष्फल 1M सीए जोड़ें (कोई 3) 2 समाधान, 0.1 मिलीग्राम फिल्टर निष्फल 100 मिमी MnCl 2 समाधान, 0.1 मिलीग्राम फिल्टर निष्फल 1 मिमी FeSO 4 समाधान है, और 0.5 मिलीलीटर बाँझ 20% ग्लूकोज समाधान।
    4. एक प्रयोगशाला बाँझ हुड में, प्रति 90 मिमी व्यास polystyrene पेट्री डिश 20 मिलीलीटर अगर 2x एसजी मध्यम डालना। समय चूक प्रयोगों के लिए, डालना प्रति 35 मिमी व्यास polystyrene पेट्री डिश 5 मिलीलीटर अगर लेग माध्यम।
    5. क्लोसपेट्री डिश ई तुरंत गिरने के बाद, एक दूसरे के शीर्ष पर थाली ढेर, लेकिन अधिक से अधिक 4 प्लेटें, और कम से कम 1 घंटे के लिए जमना अगर मध्यम करते हैं।
  3. स्टार्टर संस्कृति की तैयारी
    नोट: बी subtilis 168, NCIB 3610 व्युत्पन्न अनिवार्यता से नीचे वर्णित तरीकों में इस्तेमाल उपभेदों ग्रीन या लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन का उत्पादन और 8,27 से पहले वर्णित किया गया। खींच -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में नियमित रूप से जमा हो जाती है।
    1. 3 मिलीलीटर लेग मध्यम में -80 डिग्री सेल्सियस शेयरों से स्टार्टर संस्कृतियों टीका लगाना और क्षैतिज मिलाते (225 आरपीएम) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते (16-18 घंटा)। 18 घंटा से अधिक समय संस्कृति सेते न जंगली बी के रूप में अलग कर subtilis ज्यादातर समग्र और टेस्ट ट्यूब में एक biofilm फार्म से ग्रस्त हैं।

सतह के लिए fluorescently लेबल जीवाणु उपभेदों के 2. सह-टीका प्रसार

  1. रेंगनेवाले के लिए अर्द्ध ठोस अगर प्लेट्स के सूखने औरबी की रपट subtilis।
    1. रेंगनेवाले और टीका करने से पहले 20 मिनट के लिए फिसलने के लिए सूखी अगर प्लेटें। एक लामिना का प्रवाह हुड में खुला सूखी प्लेट (चित्रा 1 देखें)।
      नोट: बैक्टीरियल झुंड और फिसलने अर्द्ध ठोस अगर मध्यम का सूखापन पर निर्भर करता है। अपर्याप्त सुखाने अगर मध्यम कशाभिका की मध्यस्थता तैराकी में जिसके परिणामस्वरूप पर पानी संचय की अनुमति देता है। झुंड के अभाव में लंबे समय तक सुखाने समय का परिणाम है।

आकृति 1
चित्रा 1:।। प्रायोगिक कार्यप्रवाह सामान्य प्रक्रिया, आकृति में चित्रित किया गया, संवर्धन माध्यम की तैयारी भी शामिल है थाली, टीका और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का पता लगाने (बाएं से दाएं) सुखाने यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. सह-टीकारेंगनेवाले और फिसलने के लिए बैक्टीरियल संस्कृतियों की
    1. 600 एनएम पर रात भर स्टार्टर संस्कृतियों के ऑप्टिकल घनत्व का निर्धारण करते हैं और मिश्रण बी के घनत्व सामान्यीकृत ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन उपभेदों subtilis NCIB 3610 या एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में अपनी Δ डायन व्युत्पन्न। उदाहरण के लिए, के साथ के लिए तनाव 2. हल्का भंवर (अधिकतम गति से 3 सेकंड) की μl (100 * / [600 आयुध डिपो तनाव 2 की रात संस्कृति की] [तनाव 1 की रात संस्कृति के आयुध डिपो के 600]) तनाव 1 के 100 μl मिश्रण समरूप वितरण।
      नोट: बी subtilis NCIB 3610 में तनाव, झुंड निरीक्षण करने के लिए टीका कर रहे हैं, जबकि उनके Δ डायन डेरिवेटिव फिसलने के लिए उपयोग किया जाता है।
    2. स्पॉट एक पूर्व सूखे की थाली के बीच में मिश्रित संस्कृति के 2 μl (चित्रा 1 देखें) और आगे टीका के बाद 10 मिनट के लिए थाली सूखी।
    3. 37 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते अधिक नमी ढक्कन पर और अगर सतह पर नहीं गाढ़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए ईमानदार। <br /> नोट: बी के लिए ऊष्मायन समय subtilis झुंड 8-16 मानव संसाधन के बीच आम तौर पर है। आम तौर पर, झुंड के किनारे 8 घंटे में 90 मिमी पेट्री डिश के पक्ष में पहुंचता है। फिसलने एक धीमी प्रक्रिया है और ऊष्मायन के कम से कम 16 करने के लिए 42 मानव संसाधन की आवश्यकता है। 36 घंटे के बाद, रपट सामने 90 मिमी पेट्री डिश के पक्ष में पहुंचता है।
    4. समय चूक प्रयोगों के लिए, एक preheated चरण ऊष्मायन कक्ष 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट में 35 मिमी व्यास पेट्री डिश जगह है। सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश के ढक्कन प्रयोग की अवधि के दौरान हटा दिया रहता है। इनक्यूबेटर के शीर्ष पर नमी गठन नाकाम करने के लिए 40 डिग्री सेल्सियस के लिए मंच इनक्यूबेटर के कवर सेट करें।

विभिन्न प्रारंभिक सेल घनत्व के साथ Fluorescently लेबल जीवाणु उपभेदों के 3. सह-टीका

  1. बी की कालोनी biofilm गठन के लिए अगर प्लेट के सूखने subtilis।
    1. एक लामिना का प्रवाह में कवर के बिना कॉलोनी biofilm विकास के लिए प्लेटें सूखीटीका करने से पहले 15 मिनट के लिए हुड।
      नोट: वृद्धि की नमी और तैराकी या झुंड में अपर्याप्त सुखाने परिणाम संभव 29 हो सकती है। छोटे biofilm कालोनियों में भी लंबे समय से परिणाम सुखाने।
  2. कालोनी Biofilms के लिए 10 गुना पतला स्टार्टर संस्कृति की तैयारी
    1. बी की रात स्टार्टर संस्कृतियों का निर्माण ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन के 100 μl मिक्स समरूप वितरण के लिए एक 1.5 मिलीलीटर प्रतिक्रिया ट्यूब में subtilis 168 और हल्का भंवर। लेग माध्यम में 10 गुना कमजोर पड़ने श्रृंखला तैयार करें।
    2. गैर-पतला या 10 1, 10 2 की स्पॉट 2 μl, 10 3, 10 4 biofilm उत्प्रेरण मध्यम युक्त थाली पर पतला मिश्रित संस्कृतियों।
      नोट: 6 से 9 biofilm कालोनियों ध्यान में रखते हुए कि कालोनियों एक दूसरे से समान दूरी पर अलग हो रहे हैं एक भी 90 मिमी पेट्री डिश पर शुरू किया जा सकता है।
    3. 30 डिग्री सेल्सियस पर प्लेटें सेते अधिक नमी ढक्कन पर गाढ़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए ईमानदार औरनहीं अगर सतह पर।
      नोट: बी के लिए ऊष्मायन समय subtilis biofilm से 3 के बीच 1 दिन है। आम तौर पर, बी की कॉलोनी biofilm subtilis 2 दिनों में इसकी औसत आकार और जटिल संरचना तक पहुँचता है।
    4. समय चूक प्रयोगों के लिए, एक 35 मिमी व्यास पेट्री डिश के बीच में एक भी inoculum जगह और एक preheated चरण ऊष्मायन कक्ष 30 डिग्री सेल्सियस पर सेट में पकवान जगह है। सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश के शीर्ष प्रयोग की अवधि के दौरान हटा दिया रहता है। इनक्यूबेटर के शीर्ष पर नमी गठन नाकाम करने के लिए 35 डिग्री सेल्सियस के लिए मंच इनक्यूबेटर के कवर सेट करें।

4. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी लेबल खींच की जांच

  1. इमेजिंग के लिए उपकरण का विवरण।
    1. सतह उपनिवेशवाद और प्रतिदीप्ति संकेत का पता लगाने के लिए, एक मोटर चालित प्रतिदीप्ति स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप (सामग्री तालिका में विस्तृत सूची देखें) एक 0.5X PlanApo उद्देश्य से लैस उपयोग करते हैं, दो एलईडीठंड प्रकाश स्रोतों (प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए एक और दृश्य प्रकाश के लिए एक), फिल्टर सेट 629 से 572/25 एनएम और mRFP (उत्तेजना (525/50 एनएम पर 470/40 एनएम और उत्सर्जन में उत्तेजना) GFP और उत्सर्जन के लिए / 62 एनएम), और एक उच्च संकल्प मोनोक्रोम कैमरा।
    2. उचित मल्टीचैनल और समय चूक मॉड्यूल सहित स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप के लिए उपलब्ध सॉफ्टवेयर के साथ छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण प्रदर्शन करना। समय व्यतीत हो जाने के प्रयोग के लिए, एक मानक हीटिंग चरण इनक्यूबेटर एक एडाप्टर के साथ स्टीरियो ज़ूम माइक्रोस्कोप के लिए मुहिम शुरू का उपयोग करें।
  2. रेंगनेवाले और फिसलने विस्तार की इमेजिंग
    1. 90 मिमी प्लेट का सबसे बड़ा संभावित क्षेत्र पर कब्जा करने के लिए सबसे कम बढ़ाई प्रयोग करें। रेडियल बैक्टीरियल विस्तार और प्रतिदीप्ति की निगरानी के लिए दिखाई मैदान के कोने में टीका के मूल (90 मिमी पेट्री डिश के बीच) की स्थापना की।
    2. प्रतिदीप्ति सिग्नल की शक्ति पर निर्भर करता है इष्टतम जोखिम समय समायोजित करें।
      नोट: अनिवार्यता से Expre के लिएबी में ssed प्रतिदीप्ति जीन subtilis, ग्रीन और 1.5 और 3 सेकंड जोखिम समय के साथ लाल प्रतिदीप्ति क्रमश इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, 10 मिसे जोखिम समय दृश्य प्रकाश के लिए उपयुक्त है।
  3. बढ़ाई है कि पूरे biofilm कॉलोनी का पता लगाने के लिए अनुमति देता है का उपयोग करें और देखने के क्षेत्र के बीच में कॉलोनी को समायोजित।
    नोट: रेंगनेवाले और विस्तार फिसलने के लिए के रूप में, इष्टतम जोखिम बार biofilm कालोनियों में प्रतिदीप्ति संकेतों का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोडिंग जीनों की अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है। नीचे प्रतिनिधि परिणामों के लिए, ग्रीन और लाल प्रतिदीप्ति क्रमश: 1 और 3 सेकंड जोखिम अंतराल का उपयोग, का पता चला था।
  4. समय चूक इमेजिंग के लिए, निरंतर जोखिम बार का उपयोग कर कुछ अंतराल पर छवियों को प्राप्त।
  5. एक फ़ाइल स्वरूप में प्रतिदीप्ति stereomicroscope दर्ज की छवियों कि मात्रात्मक डेटा विश्लेषण के लिए ImageJ सॉफ्टवेयर द्वारा मान्यता प्राप्त है बचाओ।

5. Datएक विश्लेषण

  1. क्षेत्र प्रत्येक अलग लेबल फ्लोरोसेंट तनाव के कब्जे में विश्लेषण करने के लिए, ImageJ सॉफ्टवेयर में रुचि एक BioVoxxel प्लगइन के साथ विस्तारित की फाइल को खोलने के।
    1. एक खिड़की "जैव प्रारूप आयात विकल्प" कहा जाता है प्रकट होता है जहां केवल विकल्प और "लपेटकर" चुने गए हैं "सभी श्रृंखला खुला", क्लिक करें "ठीक" से फ़ाइल खोलें।
      नोट: फ़ाइलों तीन छवियों, माइक्रोस्कोप (ग्रीन, लाल प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र छवियों) में एक छवि को रिकॉर्ड करने के लिए प्रयोग किया जाता प्रत्येक चैनल के लिए एक के एक ढेर के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं।
    2. "ढेर" - - "छवि" का चयन करके अलग व्यक्ति चैनल छवियों में ढेर ImageJ नियंत्रण कक्ष में "छवियों को ढेर"।
      नोट: छवियाँ दिखाई देते हैं और 1/3 (ग्रीन चैनल) के रूप में गिने जा रहे हैं, 2/3 (लाल चैनल) और 3/3 (उज्ज्वल क्षेत्र)। इधर, उज्ज्वल क्षेत्र छवि विश्लेषण से बाहर रखा गया है।
  2. छवियों का विश्लेषण करने के लिए, का चयन करके एक 8 बिट छवि में प्रत्येक को बदलने"छवि" - "प्रकार" - "8 बिट"।
  3. "पैमाने पर सेट" - पिक्सेल 2 में कब्जा क्षेत्र का निर्धारण करने के लिए, "विश्लेषण" का उपयोग कर छवियों के पैमाने को रीसेट। एक खिड़की अलग पैमाने विकल्पों के साथ चबूतरे जब "स्केल हटाने के लिए क्लिक करें" का चयन करके पैमाने रीसेट। विकल्प "ग्लोबल" सभी खुले छवियों के लिए पैमाने दूर करने के लिए जाँच करें।
  4. पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए, ImageJ नियंत्रण कक्ष में "ओवल" उपकरण का उपयोग कर एक अंडाकार क्षेत्र (हित के क्षेत्र, आरओआई) फ्लोरोसेंट क्षेत्र के बाहर खींचना।
    1. यह सुनिश्चित करें कि पृष्ठभूमि अंडाकार आकार के सभी विश्लेषण किया छवियों के लिए ही है, कीबोर्ड की [टी] चरित्र के माध्यम से आरओआई प्रबंधक में जोड़ें। एक रॉय प्रबंधक विंडो ऊपर आता है, जहां पृष्ठभूमि अंडाकार रॉय "अधिक" के माध्यम से बचाया जा सकता है - "सहेजें" विकल्प।
    2. "उपाय" - तो पृष्ठभूमि अंडाकार रॉय छवि पर दिखाई दे रहा है, "विश्लेषण" का चयन करके क्षेत्र की तीव्रता को मापने।
      नोट: एक परिणामविंडो प्रकट होता है, जहां दूसरों के बीच मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता स्तंभ लेबल "मतलब है" में दिखाया गया है।
    3. "गणित" - - "घटाएँ" और मापा मूल्य डालने पृष्ठभूमि अंडाकार रॉय को अचयनित, "प्रक्रिया" पर क्लिक करके छवि से मतलब पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता का मूल्य घटाना।
  5. "समायोजित" - - "सीमा" विकल्प "छवि" के माध्यम से छवि के लिए एक सीमा लागू करें। विधि Otsu और ब्लैक एंड व्हाइट (बी एंड डब्ल्यू) का चयन करें। "डार्क पृष्ठभूमि" विकल्प चेक करें और "लागू करें" पर क्लिक करके सीमा को रोजगार।
    नोट: जहां सीमा से ऊपर क्षेत्र में सफेद और दिखाया गया है कि नीचे दहलीज काले रंग में दिखाया गया है एक द्विआधारी छवि के लिए छवि बदल जाता है।
  6. "विश्लेषण कण" विकल्प - "विश्लेषण" के माध्यम से सीमा से ऊपर सब कुछ का चयन करें। सेटिंग्स के साथ विंडो में, डिफ़ॉल्ट विकल्प रखने के लिए और "प्रदर्शन परिणाम" रखने के लिए और "एसummarize कुल क्षेत्र "" और परिणाम विंडो में सारांश प्रदर्शन स्तंभ लेबल में क्षेत्र पर कब्जा कर प्रदर्शित करने के लिए "" विकल्प की जाँच की। क्लिक करें "ठीक है।

Representative Results

बैक्टीरियल आबादी की प्रयोगशाला प्रणाली पारिस्थितिक या विकासवादी सवालों का पता लगाने के लिए एक आकर्षक दृष्टिकोण प्रदान करते हैं। इधर, तीन बी की सतह बसाना मोड subtilis, जनसंख्या के वर्गीकरण की उपस्थिति की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया आनुवंशिक रूप से समान के अलगाव यानी, लेकिन fluorescently अलग लेबल उपभेदों। रेंगनेवाले, जो बी के एक कशाभिका निर्भर सामूहिक सतह आंदोलन है subtilis, एक अत्यधिक मिश्रित आबादी में परिणाम है। इन रेंगनेवाले कालोनियों में, ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया उपनिवेश क्षेत्रों ओवरलैपिंग कर रहे थे (2A चित्रा देखें)। तेजी से सतह बसाना समय (वीडियो चित्रा 1) में किया जा सकता है। बी subtilis के झुंड के दौरान कोशिकाओं की एक पतली परत ऊष्मायन के कुछ ही घंटों के बाद टीका केंद्र से फैलता है (देखें चित्र 2 बी)।

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चित्रा 2: बी के विस्तार के रेंगनेवाले । 1 टीका से पहले: subtilis रेंगनेवाले कॉलोनी ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट उपभेदों 1 मिलाया गया है कि होता है। (ए) 15 घंटा, ग्रीन और लाल प्रतिदीप्ति (GFP और आरएफपी, क्रमशः) के बाद उचित प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ पाया गया। (बी) के झुंड बी की पतली परत की छवियाँ subtilis चयनित समय से वीडियो चित्रा 1. स्केल बार = 5 मिमी निकाले बिंदुओं पर दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

हालांकि, जब बी subtilis तनाव, कि कार्यात्मक flagella कमी कर रहे हैं, लेकिन उत्पादन exopolysaccharide, hydrophobin और surfactin की मदद से प्रसार करने में सक्षम हैं, अर्द्ध ठोस अगर मध्यम पर देखा गया था, अलग लेबल उपभेदों कुछ def में अलग हो गए थेined क्षेत्रों (चित्रा 3A देखें)। रपट कॉलोनी के विकास के समय में दर्ज किया जा सकता है (देखें चित्रा 3 बी या वीडियो चित्रा 2)।

चित्र तीन
चित्रा 3: ख की कॉलोनी फिसलने । 1 टीका से पहले: subtilis कॉलोनी ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट उपभेदों 1 मिलाया गया है कि होता है। (ए) 24 घंटा, ग्रीन और लाल प्रतिदीप्ति (GFP और आरएफपी, क्रमशः) के बाद उचित प्रतिदीप्ति फिल्टर के साथ पाया गया। (बी) बी की छवियाँ डिस्क रपट subtilis चयनित समय से वीडियो चित्रा 2. स्केल बार = 5 मिमी निकाले बिंदुओं पर दिखाए जाते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

जबकि झुंड और SLI के वर्गीकरण का स्तरडिंग के विस्तार कालोनियों संशोधित नहीं किया जा सकता है, कॉलोनी biofilm में अलग लेबल फ्लोरोसेंट उपभेदों के स्थानिक अलगाव शुरू सेल घनत्व से प्रभावित किया जा सकता है। जब बी की एक कॉलोनी biofilm subtilis मिश्रित आबादी के उच्च घनत्व सेल के साथ शुरू किया गया था, ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट उपभेदों नाबालिग से पता चला है या नहीं स्थानिक वर्गीकरण (चित्रा 4 देखें)। इसके विपरीत, जब biolfilm आरंभ करने के लिए सेल घनत्व कम था पर, खाली ग्रीन और लाल प्रतिदीप्ति क्षेत्रों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी से पता लगाया जा सकता है। वर्गीकरण स्तर स्पष्ट रूप से biofilm की शुरुआत की आबादी के कमजोर पड़ने के स्तर पर निर्भर था। वीडियो चित्रा 3 और 4 टीका उपभेदों के निम्नतम और उच्चतम कमजोर पड़ने के लिए कॉलोनी विस्तार प्रस्तुत करते हैं।

चित्रा 4
चित्रा 4: ख की कॉलोनी biofilms में वर्गीकरण स्तर पर subtilis। (: क्रमश: 10 5 बार संस्कृतियों की शुरुआत पतला करने के लिए गैर-पतला नीचे करने के लिए ऊपर से) विभिन्न प्रारंभिक सेल घनत्व ग्रीन और लाल प्रतिदीप्ति उपभेदों की कॉलोनी biofilms 2 दिन है कि विभिन्न प्रारंभिक सेल घनत्व के साथ inoculated थे के बाद दिखाए जाते हैं। स्केल बार = 5 मिमी। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट उपभेदों के अनुपात से आगे ImageJ सॉफ्टवेयर है कि जनसंख्या संरचना और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल उपभेदों के competiveness के मात्रात्मक लक्षण वर्णन अनुमति देता का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

वीडियो 1
वीडियो चित्रा 1: समय व्यतीत हो जाने के imagझुंड बी के es subtilis 1 के साथ शुरू की। ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट स्ट्रेन के 1 मिश्रण (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।) वीडियो 10 घंटा के एक समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है। स्केल बार = 7 मिमी।

वीडियो 2
वीडियो चित्रा 2: बी फिसलने के समय चूक छवियों subtilis 1 के साथ शुरू की। ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट स्ट्रेन के 1 मिश्रण (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।) वीडियो 24 घंटा के एक समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है। स्केल बार = 5 मिमी।

वीडियो 3
वीडियो चित्रा 3: ख के समय चूक छवियों हरे रंग की 1 मिक्स: subtilis कॉलोनी biofilms 1 के साथ शुरू की-। और उच्च सेल घनत्व में लाल फ्लोरोसेंट उपभेदों (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।) वीडियो 48 घंटा के एक समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है। स्केल बार = 5 मिमी।

वीडियो 4
वीडियो चित्रा 4: ख के समय चूक छवियों कम सेल घनत्व में ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट स्ट्रेन के 1 मिक्स: subtilis कॉलोनी biofilms 1 के साथ शुरू की। (राइट डाउनलोड करने के लिए क्लिक करें।) वीडियो 48 घंटा के एक समय के पाठ्यक्रम से पता चलता है। स्केल बार = 5 मिमी।

Discussion

बैक्टीरिया के लिए एक फ्लोरोसेंट उपकरण बॉक्स की उपलब्धता न केवल विषम जीन अभिव्यक्ति 30,31 और प्रोटीन स्थानीयकरण 32 के अध्ययन के लिए, लेकिन यह भी एक जनसंख्या 8 भीतर उपभेदों के स्थानिक वितरण के विश्लेषण की सुविधा। पर्याप्त अलग उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ फ्लोरोसेंट मार्करों साफ़ तौर पर दो उपभेदों कि अन्यथा जब मिश्रित एक दूसरे से पृथक कर रहे हैं स्थानीयकरण करने के लिए अनुमति देते हैं। वर्णित प्रोटोकॉल उपभेदों या प्रजातियों के बीच मिश्रित संस्कृतियों में जनसंख्या गतिशीलता, जैसे प्रतियोगिता प्रयोगों या सहकारिता के अवलोकन के लिए नियोजित किया जा सकता है। रिश्तेदार प्रचुरता के fluorescently एक मिश्रित आबादी में लेबल उपभेदों निर्धारित करने की क्षमता जुड़ी रेंगनेवाले, रपट, या biofilm कालोनियों सतह तक ही सीमित नहीं है, लेकिन जलमग्न सहित अन्य बहुकोशिकीय biofilm सिस्टम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, प्रवाह सेल या हवा-मध्यम इंटरफ़ेस 27,33-35 biofilms।

_content "> प्रस्तुत तकनीक तनाव और डिजाइन प्रतियोगिता प्रयोगों के स्थानिक वितरण का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, यह भी विस्तार कालोनियों में जीन की अभिव्यक्ति विविधता निम्नलिखित अनुमति देता है। संवर्धन यहाँ वर्णित शर्तों बी subtilis और पर विस्तार के लिए सटीक मापदंडों के लिए आवेदन जबकि इमेजिंग प्रयोगकर्ता परमिट समय में जनसंख्या गतिशीलता का पालन करने के लिए अगर मीडिया अन्य प्रजातियों या उपभेदों 20 के लिए अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। एक ऊष्मायन चैम्बर में नमूने रखकर, हालांकि ध्यान ऊष्मायन के दौरान कक्ष के भीतर नमी का स्तर को दी जानी चाहिए।

इतना है कि उपभेदों फ्लोरोसेंट मार्करों जो एक दूसरे से प्रतिष्ठित किया जा सकता अभिव्यक्त तकनीक यहाँ वर्णित भी जांच जीवाणु उपभेदों की आनुवंशिक संशोधन की आवश्यकता है। इसके अलावा, अलग उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा होने के अलावा, यह सिफारिश की है कि चुने गए दो फ्लोरोसेंट मार्करों समान क्वांट हैउम पैदावार और एक तुलनीय स्तर में व्यक्त कर रहे हैं (अवशोषित फोटॉनों कि उत्सर्जित कर रहे हैं यानी अनुपात)। इसके अलावा, समय में रिश्तेदार तीव्रता परिवर्तन मापा जाता है और एक प्रयोग के लिए एक प्रारंभिक समय बिंदु के लिए सामान्यीकृत किया जा सकता है। रिश्तेदार वृद्धि या कमी तो अलग क्वांटम क्षमता के साथ विभिन्न fluorophores के बीच तुलना की जा सकती। प्रस्तुत प्रायोगिक प्रणाली के लिए, विभिन्न ग्रीन और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन पहले सबसे इष्टतम फ्लोरोसेंट जोड़े कि बी में पता लगाया जा सकता है के लिए चयन करने के लिए 36,37 परीक्षण किया गया subtilis। इष्टतम जोखिम समय प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन और नमूने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। निश्चित सेल घनत्व या कोशिकाओं के कई परतों आबादी के भीतर कुशलतापूर्वक संकेत का पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है। कुछ फ्लोरोसेंट प्रोटीन अक्षम अभिव्यक्ति और / या प्रोटीन का अनुवाद है और इस तरह कम क्वांटम उपज के कारण बैक्टीरियल कोशिकाओं में कम तीव्रता हो सकता है। इस तरह अक्षम फ्लोरोसेंट मार्करों सकता है rप्रणाली की संवेदनशीलता निष्कर्ष निकालना और समय जीवाणु उपभेदों संभवतः उत्तेजना प्रकाश द्वारा cytotoxicity में जिसके परिणामस्वरूप पता लगाने के लिए की जरूरत का विस्तार। फ्लोरोसेंट तीव्रता तदनुसार फ्लोरोसेंट रिपोर्टर कोडिंग जीन व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रमोटर बदलकर संशोधित किया जा सकता है। एक अभिव्यक्ति स्तर बहुत अधिक है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन जीवाणु के लिए हानिकारक फिटनेस लागत के लिए अग्रणी के अनावश्यक overproduction में परिणाम सकता है। जब प्रतियोगिता प्रयोगों प्रदर्शन, एक की कोशिकाओं में विशेष फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उत्पादन की लागत पर विचार करना चाहिए। नियंत्रण प्रयोगों, जहां फ्लोरोसेंट मार्करों प्रतिस्पर्धा उपभेदों या जहां दो isogenic उनकी फ्लोरोसेंट मार्करों में ही अलग-अलग उपभेदों एक दूसरे के खिलाफ प्रतिस्पर्धा कर रहे हैं के बीच बदली हैं, हमेशा एक मार्कर की ओर किसी भी पूर्वाग्रह निर्धारित करने के लिए आवश्यक हैं। कोशिकाओं के भीतर फ्लोरोसेंट प्रोटीन का जीवन काल भी मापा तीव्रता प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, कुछ जीवाणु नकदी के autofluorescenceअलग फ्लोरोसेंट यहाँ वर्णित के अलावा अन्य मार्कर के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है।

ठीक स्थानिक वितरण और विशिष्ट जीवाणु उपभेदों की प्रचुरता का निर्धारण करने के लिए, पृष्ठभूमि संकेत पहले फ्लोरोसेंट प्रोटीन से होने वाले है, जबकि दूसरा फ्लोरोसेंट मार्कर और इसके विपरीत के लिए प्रतिदीप्ति फिल्टर का उपयोग व्यक्तिगत रूप से (मोनोकल्चर नमूनों पर परीक्षण किया जाना चाहिए केवल एक मार्कर के उत्पादन बैक्टीरिया युक्त )। इस फ्लोरोसेंट संकेत तीव्रता ओवरलैपिंग के घटाव की अनुमति देता है। महत्वपूर्ण बात है, stereomicroscope के विस्तार कॉलोनी के ऊपर से प्रतिदीप्ति संकेत रिकॉर्ड के रूप में, प्रस्तुत प्रोटोकॉल सुविधाजनक दो आयामों में स्थानिक व्यवस्था निर्धारित करने के लिए है। विस्तार हो बैक्टीरियल आबादी की वास्तुकला बदलती प्रतिदीप्ति के स्तर में परिणाम सकता है (यानी शिकन संरचनाओं की तरह अधिक से अधिक स्थानीय प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रदर्शित कोशिकाओं हो सकते हैं)। इसलिए, छवियों का वर्णन किया गया विश्लेषण घस्थानिक वितरण नहीं, बल्कि एक निश्चित स्थान के भीतर उपभेदों की बहुतायत etermines। पिछले प्रोटोकॉल बैक्टीरियल कालोनियों 38 में जनसंख्या गतिशीलता के 20 या प्रतिदीप्ति इमेजिंग झुंड के लिए नमूना तैयार करने में वर्णित है, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल इन तकनीकों को जोड़ती है। अन्य माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि जनसंख्या संरचना के तीन आयामी संकल्प (जैसे लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग 39,40 या संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 41) के अवलोकन की अनुमति वृद्धि हुई संरचनात्मक जटिलताओं के साथ नमूने के लिए लागू किया जा सकता है। इन अतिरिक्त तकनीक भी उपभेदों 31 कि stereomicroscopes का उपयोग कर उपलब्ध नहीं है की एकल कोशिका आधार पर पता लगाने समर्थन करते हैं।

Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

Acknowledgments

यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft (DFG) से अनुदान KO4741 / 3-1 से वित्त पोषित किया गया। इसके अलावा, Á.TK की प्रयोगशाला एक मैरी क्यूरी Skłodowska कैरियर एकीकरण अनुदान (PheHetBacBiofilm) द्वारा समर्थित और DFG से KO4741 / 2-1 अनुदान दिया गया था। वें, ई, आरजी एम।, और ईएम अंतर्राष्ट्रीय मैक्स प्लैंक रिसर्च स्कूल, अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन, Consejo नैशनल डे Ciencia y Tecnologia-जर्मन शैक्षणिक विनिमय सेवा (CONACYT-डीएएडी), और JSMC फैलोशिप, क्रमशः द्वारा समर्थित थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lennox Broth (LB) Carl Roth GmbH X964
Agar-agar, Kobe I Carl Roth GmbH 5210
Petri dish (90 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Petri dish (35 mm diameter) any NA Use Petri dishes without ventillation cams
Difco Nutrient Broth BD Europe 234000
KCl any NA
MgSO,4 7H2O any NA
Ca(NO3)2 4H2O any NA
MnCl24H2O any NA
FeSO4 any NA
D-Glucose any NA
Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope Carl Zeiss Microscopy GmbH see bellow detailed description
AxioZoom V16 Microscope body Carl Zeiss Microscopy GmbH 435080 9030 000
Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9020 000 without eyepieces
Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9060 000
Controller EMS 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435610 9010 000
System Control Panel SYCOP 3 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435611 9010 000
Reflector module Z Carl Zeiss Microscopy GmbH 435180 9160 000 For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3
Filter set 38 HE eGFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489038 9901 000 EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50
Filter set 63 HE mRFP shift free (E) Carl Zeiss Microscopy GmbH 489063 0000 000 EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62
Mount S Carl Zeiss Microscopy GmbH 435402 0000 000
Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm Carl Zeiss Microscopy GmbH 435280 9050 000 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front
Coarse/fine drive with profile column Carl Zeiss Microscopy GmbH 435400 0000 000 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450
Stand base 450 Carl Zeiss Microscopy GmbH 435430 9902 000
Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN Carl Zeiss Microscopy GmbH 435700 9000 000
CAN-bus cable Carl Zeiss Microscopy GmbH 457411 9011 000 2.5 m length
Slit-ring illuminator Carl Zeiss Microscopy GmbH 417075 9010 000 d = 66 mm
Flexible light guide 1500 Carl Zeiss Microscopy GmbH 417063 9901 000 8/1,000 mm 
Illumination Adapter for light guide Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 1370 927
Lightguide HXP with liquid fill Carl Zeiss Microscopy GmbH 000000 0482 760 ø3 mm x 2,000 mm
Camera Adapter 60N-C  Carl Zeiss Microscopy GmbH 426113 0000 000 2/3" 0.63X
High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire Carl Zeiss Microscopy GmbH 426509 9901 000
AxioCam FireWire Trigger Cable Set Carl Zeiss Microscopy GmbH 426506 0002 000 for direct shutter synchronization
ZEN pro 2012 Carl Zeiss Microscopy GmbH 410135 1002 120 Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit
ZEN Module Time Lapse Carl Zeiss Microscopy GmbH 410136 1031 110
Standard Heating Stage Top Incubator Tokai Hit INUL-MS1-F1
Zeiss Stereo Microscope Base Adapter Tokai Hit MS-V12
Softwares
ImageJ National Institute of Health, Bethesda, MD, USA v 1.49m
BioVoxxel plugin BioVoxxel http://www.biovoxxel.de/development/

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References

  1. Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
  2. West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
  3. Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
  4. Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
  5. Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
  6. Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
  7. van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
  8. van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
  9. Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
  10. Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
  11. Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
  12. Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
  13. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  14. Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
  15. Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
  16. Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
  17. Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
  18. Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
  19. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  20. Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
  21. Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
  22. Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
  23. Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
  24. van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
  25. Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
  26. Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
  27. Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
  28. Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
  29. Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
  30. de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
  31. Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
  32. Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
  33. Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
  34. Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
  35. Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
  36. Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
  37. Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
  38. Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
  39. Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
  40. Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
  41. Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).

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आनुवंशिकी अंक 116, हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन लाल प्रतिदीप्ति प्रोटीन biofilm रेंगनेवाले रपट वर्गीकरण इमेजिंग सतह के प्रसार
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Hölscher, T., Dragoš, A., Gallegos-Monterrosa, R., Martin, M., Mhatre, E., Richter, A., Kovács, Á. T. Monitoring Spatial Segregation in Surface Colonizing Microbial Populations. J. Vis. Exp. (116), e54752, doi:10.3791/54752 (2016).

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