Summary
Rollen sortiment (romlig atskillelse) i evolusjonære scenarier kan bli undersøkt ved hjelp av enkle mikrobielle systemer i laboratoriet som tillater kontrollert justering av romlig fordeling. Ved å endre grunnlegger celletetthet, kan ulike sortiment nivåer visualiseres ved hjelp av fluorescensmerkede bakteriestammer i koloni biofilm av Bacillus subtilis.
Introduction
I de siste tiårene har mikrober blitt anerkjent som sosiale fellesskap forbundet med ulike økosystemer på jorden 1,2. I motsetning til planktoniske kulturer brukes generelt laboratoriepraksis, mikrober i miljøet viser et variert utvalg av romlige samfunnsstrukturer avhengig av den økologiske innstilling. Enkle mikrobielle systemer kan anvendes for å forstå konsekvensen av romlige strukturer på utviklingen av sosial interaksjon 3,4. Publikasjoner i de siste 2-3 årene med både eukaryote og prokaryote modellsystemer fremhevet betydningen av romlige strukturer på stabiliteten av samarbeidet i mikrobielle populasjoner 5-8. I tillegg er obligate interaksjoner mellom mikrober, f.eks metabolsk kryssforing, kan også endre den romlige fordelingen av samvirkende partnere 9-11. Påvirkningen av romlige strukturen i disse studiene er stort sett undersøkt ved hjelp av overflate festet fastsittende celler som befolker såalarmert biofilm eller i kolonier som vokser på overflaten av et agarmedium. Genetisk drift resulterer i høy romlig utvalg kan observeres i mikrobielle kolonier hvor næringsutarming i kanten av en celledeling mediert utvidelse av resultatene i serie med genetiske flaskehalser som fører til høy lokal fiksering sannsynlighet for visse klonale linages 12. Genetisk drift kan derfor brukes til å undersøke hvilken rolle romlig segregering i mikrobielle kolonier.
I miljøet, biofilmer er flerbestands samfunn omgitt av egenprodusert polymermatriks 13. Biofilm struktur, funksjon og stabilitet er avhengig av et komplekst nettverk av sosiale interaksjoner hvor bakterier utveksle signaler, matrisekomponenter og ressurser, eller konkurrere om plass og næringsstoffer som bruker giftstoffer og antibiotika. Bacillus subtilis er en jord bolig og rot-koloniser bakterie som utvikler svært organisert biofilmsamfunn 14. I analogi til sosialinsekter, B. subtilis celler ansette en arbeidsdeling strategi, utvikle subpopulasjoner av ekstracellulære matrix produsenter og kannibaler, bevegelige celler, sovende sporer og andre celletyper 15,16. Differensieringsprosessen er dynamisk og kan endres av miljøforhold 17,18.
Strategier for overflate kolonisering av bakterier kan lett manipuleres under laboratorieforhold ved å endre agar konsentrasjonen i vekstmediet. Ved lave agar nivåer (0,2-0,3%), bakterier huser aktiv flag er i stand til å svømme, mens halvfast agar (0,7-1% agar) letter flagellen drevet samfunnet sprer seg, heter svermende 19-21. I fravær av flagellen, visse bakteriestammer er i stand til å bevege seg over halvfast medium via skyve, dvs. vekst avhengige befolkning utvidelse lettes ved exopolysaccharide matrise og andre utskilte hydrophobin forbindelser 22-24. Endelig bakterier som er capable av biofilm utvikling skjema arkitektonisk komplekse kolonier på hardt agar medium (1,2-2%) 14,17,25. Mens disse trekkene er undersøkt i laboratoriet ved nettopp å justere betingelsene, i naturlige habitater disse overflatespredning strategier kanskje transitt gradvis fra ett til et annet, avhengig av miljøforholdene 26. Mens enkelt celle basert motilitet er kritisk under initiering av biofilm utvikling ved luft-væske-grensesnittet i både Gram-positive og -negative bakterier 27, komplekse koloni biofilm av B. subtilis blir ikke påvirket av sletting av flagellar motilitet 28. Men romlige organiseringen under utviklingen av B. subtilis koloni biofilmer avhenger av tettheten av bakteriepodestoff anvendes for å initiere biofilmen 8.
Her bruker vi B. subtilis for å vise at romlig segregering under overflaten koloniseringen er avhengig av mekanismen for populasjonsnivå motility (dvs. krydde eller skyve), og kolonien biofilm utvikling avhenger av grunnleggeren celletetthet. Vi presenterer et fluorescerende mikroskopi verktøy som kan brukes til kontinuerlig å overvåke mikrobiell biofilm vekst, overflate kolonisering og sortiment på makroskala. Videre er en kvantifisering fremgangsmåte presentert for å bestemme den relative belastning overflod i befolkningen.
Protocol
1. Utarbeidelse av Culture Media, halvfaste Agar og Biofilm plater, pre-kulturer
- Medium Forberedelse til Swarming og Sliding
- Oppløs 2 g av Lenox-buljong (LB) og 0,7 g Agar-agar i 100 ml ionebyttet vann og autoklav i 20 minutter ved 120 ° C. Bruk små volumer (50-200 ml) for å bedre reproduserbarhet mellom eksperimenter.
- Umiddelbart etter sterilisering, lukker lokket av mediet flasken for å redusere fordampning og plasser i en 55 ° C inkubator i minst 2 timer.
- Etter at mediet temperaturen er temperert til 55 ° C, helles 20 ml agar-LB-medium inn i en 90 mm diameter polystyren petriskål i henhold til et laboratorium steril hette. For time-lapse eksperimenter, hell 5 ml agar LB medium per 35 mm diameter polystyren petriskål.
- Lukke petriskål umiddelbart etter støping, stable ikke mer enn 4 plater oppå hverandre og la den stivne agar medium i minst en time.
- 2xSG Medium Poppreisning for Colony Biofilm
- Oppløs 1,6 g Nutrient Broth, 0,2 g KCl, 0,05 g MgSO4 7H 2 O, og 1,5 g Agar-agar i 100 ml ionebyttet vann og autoklav i 20 minutter ved 120 ° C. Bruk små volumer (50-200 ml) for å bedre reproduserbarhet mellom eksperimenter.
- Umiddelbart etter sterilisering, lukker lokket av mediet flasken for å redusere fordampning og plassere flasken i en 55 ° C inkubator i minst 2 timer.
- Etter at mediet temperatur har selv-regulert til 55 ° C, tilsett 0,1 ml filtersterilisert 1M Ca (NO3) 2-løsning, 0,1 ml filtersterilisert 100 mM MnCl2-oppløsning, 0,1 ml filtersterilisert 1 mM FeSO 4-løsning, og 0,5 ml steril 20% glukoseløsning.
- I et laboratorium steril hette, hell 20 ml agar 2x SG medium per 90 mm diameter polystyren petriskål. For time-lapse eksperimenter, hell 5 ml agar LB medium per 35 mm diameter polystyren petriskål.
- Close Petri-skålen umiddelbart etter støping, stable platen på toppen av hverandre, men ikke mer enn 4 plater, og la det agarmedium for å stivne i minst 1 time.
- Utarbeidelse av startkulturer
MERK: B. subtilis 168, NCIB 3610 avledede stammer som ble anvendt i fremgangsmåtene som er beskrevet nedenfor konstitutivt produsere klima- eller rød fluorescens-proteiner og ble beskrevet tidligere 8,27. Stammer er lagret rutinemessig på -80 ° C fryser.- Inokulere startkulturer fra -80 ° C lagre i 3 ml LB-medium og inkuberes over natten (16-18 timer) ved 37 ° C med horisontal risting (225 rpm). Ikke inkuber kulturen lenger enn 18 timer så vill isolater av B. subtilis er mest tilbøyelige til å aggregere og danne en biofilm i reagensglasset.
2. Co-inokulering av fluorescerende merkede bakteriestammer for Surface Sprer
- Tørking av halvfaste agarskåler for svermende ogSliding av B. subtilis.
- Tørre agar plater for svermende og glidende i 20 minutter før inokulering. Tørre plater avdekket i en laminær hette (se figur 1).
MERK: Bakteriell svermende og glidende an på tørrhet i halvfast agarmedium. Utilstrekkelig tørking gir vannansamling på agar medium som resulterer i flagellen-mediert svømming. Forlengede Tørketiden fører til mangel på svermende.
- Tørre agar plater for svermende og glidende i 20 minutter før inokulering. Tørre plater avdekket i en laminær hette (se figur 1).
Figur 1:.. Experimental arbeidsflyt Den vanlige prosedyren er avbildet på figuren, herunder utarbeidelse av dyrking medium, tørking plate, vaksinasjon og fluorescens mikroskopi deteksjon (fra venstre til høyre) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
- Co-vaksinasjonav bakteriekulturer for Swarming og Sliding
- Bestem de optiske tettheten av natten startkulturer ved 600 nm og bland tetthet normaliserte klima og røde fluorescerende protein produserende stammer av B. subtilis NCIB 3610 eller dets Δ strekning derivat i et 1,5 ml reaksjonsrøret. For eksempel blande 100 ul stamme en med (100 * [OD 600 av natten kultur belastning 1] / [OD 600 av natten kultur belastning 2]) pl belastning 2. Mildt vortex (3 sek ved maks hastighet) for homogen fordeling.
MERK: B. subtilis NCIB 3610 stammer er vaksinert for å observere svermende, mens deres Δ HAG derivater benyttes for å skyve. - Spot 2 ul av blandet kultur på midten av en fortørket platen (se figur 1), og ytterligere tørke platen i 10 minutter etter inokulering.
- Inkuber platene ved 37 ° C oppreist stilling for å tillate at fuktighet kondenserer på lokket og ikke på agaroverflaten. <br /> MERK: Inkubasjonstid for B. subtilis sverm er typisk mellom 8-16 timer. Generelt, ved kanten av svermen når den siden av 90 mm petriskål i 8 timer. Skyve er en langsommere prosess og krever minst 16-42 timer med inkubasjon. Etter 36 timer, når den glidende fronten på siden av 90 mm petriskål.
- For time-lapse eksperimenter, legg 35 mm diameter petriskåler i en forvarmet scenen inkubasjon kammer innstilt på 37 ° C. Pass på at lokket på petriskålen forblir fjernet under hele forsøket. Still dekselet av scenen inkubator til 40 ° C for å omgå fuktighet dannelse på toppen av inkubatoren.
- Bestem de optiske tettheten av natten startkulturer ved 600 nm og bland tetthet normaliserte klima og røde fluorescerende protein produserende stammer av B. subtilis NCIB 3610 eller dets Δ strekning derivat i et 1,5 ml reaksjonsrøret. For eksempel blande 100 ul stamme en med (100 * [OD 600 av natten kultur belastning 1] / [OD 600 av natten kultur belastning 2]) pl belastning 2. Mildt vortex (3 sek ved maks hastighet) for homogen fordeling.
3. Co-inokulering av fluorescerende merkede bakteriestammer med forskjellige Innledende celletettheter
- Tørking av Agar Plater for Colony biofilmdannelse av B. subtilis.
- Tørk de plater for koloni biofilm utvikling uten deksel i en laminær strømninghette i 15 min før vaksinasjonen.
MERK: Utilstrekkelige tørke fører til økt fuktighet og svømming eller sverm kan være mulig 29. Tørking altfor lange resultater i små biofilm kolonier.
- Tørk de plater for koloni biofilm utvikling uten deksel i en laminær strømninghette i 15 min før vaksinasjonen.
- Utarbeidelse av 10-ganger fortynnet startkulturer for Colony Biofilm
- Bland 100 mL av drivhus og røde fluorescerende protein produserer over natten startkulturer av B. subtilis 168 i et 1,5 ml reaksjonsrøret og svakt vortex i homogen fordeling. Fremstille 10-gangers fortynningsserie i LB-medium.
- Flekk 2 ul av ikke-fortynnet eller 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 fortynnede blandede kulturer på den plate som inneholder biofilm-induserende medium.
NOTE: 6 til 9 biofilm kolonier kan initieres på en enkelt 90 mm petriskål ta hensyn til at koloniene er adskilt i lik avstand fra hverandre. - Inkuber platene ved 30 ° C oppreist stilling for å tillate at fuktighet kondenserer på lokket ogikke på agaroverflaten.
MERK: Inkubasjonstiden for B. subtilis biofilm er mellom 1 til 3 dager. Vanligvis kolonien biofilm av B. subtilis når sin gjennomsnittlige størrelse og komplekse struktur i 2 dager. - For time-lapse eksperimenter, legg et enkeltpodestoff i midten av en 35 mm diameter petriskål og sett formen i en forvarmet scenen inkubasjon kammer innstilt på 30 ° C. Pass på at toppen av petriskål forblir fjernet under hele forsøket. Sett dekselet på scenen kuvøse til 35 ° C for å omgå fuktighet formasjon på toppen av inkubatoren.
4. Fluorescent Mikros Påvisning av merkede Stammer
- Utstyrs beskrivelse for Imaging.
- For å oppdage overflaten kolonisering og fluorescens signal, bruke en motorisert fluorescens stereo zoom mikroskop (se detaljert liste i material tabell) er utstyrt med en 0,5 x PlanApo Mål, to LEDKald lys kilder (ett for fluorescens deteksjon og en for synlig lys), filtersett for GFP (eksitasjon ved 470/40 nm og emisjon på 525/50 nm) og mRFP (eksitasjon ved 572/25 nm og emisjon på 629 / 62 nm), og en høy oppløsning monokrom kamera.
- Utfør bilde oppkjøpet og behandling med passende programvare som er tilgjengelig for stereo zoom mikroskop inkludert flerkanals og time-lapse moduler. For tiden lapse eksperiment, kan du bruke en standard oppvarmingstrinn kuvøse montert til stereo zoom mikroskop med en adapter.
- Imaging av svermende og Sliding Expansion
- Bruk den laveste forstørrelse for å fange den største mulige området av 90 mm plate. Sett opprinnelsen til vaksinasjon (midten av 90 mm petriskål) til hjørnet av det synlige feltet for overvåking radial bakteriell vekst og fluorescens.
- Juster optimal eksponeringstiden avhengig av styrken av det fluorescens-signalet.
MERK: For konstitutivt EXPREssed fluorescens gener i B. subtilis, klima- og rød-fluorescens med 1,5 og 3 sek eksponeringstider kan anvendes, henholdsvis. I tillegg er 10 msek eksponeringstiden hensiktsmessig for synlig lys.
- Bruk forstørrelse som tillater påvisning av hele biofilm kolonien og justere kolonien i midten av synsfeltet.
MERK: Som for svermende og glidende utvidelser, til de optimale eksponeringstider oppdager fluorescens signaler i biofilm kolonier avhenger uttrykket nivået av fluorescerende proteinkodende gener. For de representative resultatene nedenfor, ble drivhus og rød-fluorescens påvises ved hjelp av 1 og 3 sek eksponering mellomrom, henholdsvis. - For time-lapse imaging, få bilder på visse intervaller ved hjelp av konstant eksponeringstider.
- Redd fluorescens stereo innspilte bilder i et filformat som er anerkjent av ImageJ programvare for kvantitativ dataanalyse.
5. Daten analyse
- Å analysere området okkupert av hvert unikt fluorescerende belastning, åpne filen av interesse i ImageJ programvare utvidet med en BioVoxxel plugin.
- Når et vindu som heter "Bio-formater for import" vises der bare alternativene "Åpent hele serien" og "Autoskalering" er valgt, åpne filen ved å klikke på "OK".
MERK: Filene vises som en stabel med tre bilder, ett for hver kanal brukes til å ta et bilde i (grønn-rød-fluorescens og lyse-feltet bilder) mikroskopet. - Separer stabelen i enkeltkanal bilder ved å velge "Image" - "Stacks" - "Stable til bilder" i ImageJ kontrollpanelet.
MERK: Bilder vises og er nummerert som 1/3 (grønn kanal), 2/3 (rød kanal) og 3/3 (lyse-feltet). Her er lyse felt bilde ekskludert fra analysen.
- Når et vindu som heter "Bio-formater for import" vises der bare alternativene "Åpent hele serien" og "Autoskalering" er valgt, åpne filen ved å klikke på "OK".
- For å analysere bildene, forvandle hvert inn i en 8-bits bilde ved å velge"Image" - "Type" - "8-bit".
- For å finne ut det okkuperte området i pixel 2, null omfanget av bildene ved hjelp av "Analyze" - "Sett Scale". Når et vindu dukker opp med ulike skaleringsmuligheter, null skalaen ved å velge "Klikk for å fjerne Scale". Sjekk alternativet "global" for å fjerne skalaen for alle åpne bilder.
- Å fjerne bakgrunnen, tegne en oval område (region av interesse, ROI) utenfor fluorescerende området ved hjelp av "Oval" verktøy i ImageJ kontrollpanelet.
- For å sikre at størrelsen på bakgrunnen oval er den samme for alle analyserte bilder, legge den til i ROI leder via [t] tegnet på tastaturet. En vinduet ROI kommer opp der bakgrunnen oval ROI kan lagres via "Mer" - "Lagre" alternativer.
- Hvis bakgrunnen oval ROI er synlig på bildet, måle intensiteten av området ved å velge "Analyze" - "Mål".
MERK: En resultatervindu der blant andre den midlere fluorescens intensitet vises i kolonnen "Mean". - Trekke verdien av den midlere bakgrunns fluorescensintensitet fra bildet ved å fjerne merket bakgrunnen ovale ROI, klikke "Process" - "matte" - "trekke", og å sette den målte verdien.
- Påfør en terskel til bildet via "Image" - "Juster" - "Threshold" alternativet. Velg metoden Otsu og svart-hvitt (B & W). Sjekk "Mørk bakgrunn" og ansette terskelen ved å klikke på "Apply".
MERK: Bildet endres til et binært bilde hvor området over terskelen er vist i hvitt, og at under terskelen vises i svart. - Velg alt over terskelen via "Analyze" - "Analyze Particles" alternativet. I vinduet med innstillingene, holde standardvalgene og holde "Vis resultater" og "Summarize "alternativer sjekket. Klikk" OK "for å vise sammendraget i resultatvinduet og displayet det okkuperte området i kolonnen" Total Area ".
Representative Results
Laboratoriesystemer bakteriepopulasjoner gi en tiltalende måte å utforske økologiske eller evolusjonære spørsmål. Her tre overflaten kolonisering måter B. subtilis ble brukt for å undersøke forekomsten av befolkningen sortiment, dvs. segregering av genetisk identiske, men fluorescens annerledes merket stammer. Sverm, som er et flagell avhengig kollektiv overflate bevegelse av B. subtilis, resulterer i en svært blandet populasjon. I disse svermende kolonier, de klima- og rød-fluorescerende bakterier koloniserte områder ble overlappende (se figur 2A). Den raske overflaten kolonisering kan følges i tid (Video figur 1). Under sverm av B-subtilis, et tynt lag av celler utvides fra inokuleringen sentrum etter noen timers inkubering (se figur 2B).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
Figur 2: Swarming utvidelse av B. . subtilis Det krydde kolonien inneholder klima og rød-fluorescerende stammer som ble blandet 1: 1 før vaksinasjonen. (A) Etter 15 timer, drivhus og rød fluorescens (GFP og RFP, henholdsvis) ble påvist med passende fluorescens filtre. (B) Bilder av tynne lag av sverm B. subtilis vises på utvalgte tidspunkter hentet fra Video Figur 1. Scale bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Imidlertid, når B. subtilis-stammer som mangler funksjonelle flageller, men er i stand til å spre seg ved hjelp av produsert exopolysaccharide, hydrophobin og surfactin, ble flekket på halvfast agarmedium ble de forskjellig merkede stammer separert i visse defstilt sektorer (se figur 3A). Utviklingen av glide kolonien kan tas opp i tid (se Figur 3B eller Video figur 2).
Figur 3: Skyve koloni av B. . subtilis Kolonien inneholder klima og rød-fluorescerende stammer som ble blandet 1: 1 før vaksinasjonen. (A) Etter 24 timer, drivhus og røde fluorescens (GFP og RFP, henholdsvis) ble detektert med passende fluorescencefilter. (B) Bilder av B. subtilis skyve disk vises på utvalgte tidspunkter hentet fra Video Figur 2. Scale bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Mens sortiment nivåer av svermende og SLIding voksende koloniene kan ikke endres, kan den romlige segregering av forskjellig merket fluorescerende stammer i kolonien biofilm bli påvirket av startcelletettheter. Når en koloni biofilm av B. subtilis ble initiert med høy celletetthet på de blandede populasjoner, de klima- og rød-fluorescerende stammer viste liten eller ingen romlig sortiment (se figur 4). Tvert imot, når celletettheten til å initiere biolfilm var lav, kunne klare klima- og røde fluorescens sektorer bli påvist ved fluorescens mikroskopi. Utvalget nivå var tydelig avhengig av fortynning nivå av biofilm initiering av befolkningen. Video Figur 3 og 4 frem kolonien ekspansjon for den laveste og høyeste fortynning av de inokulerte stammer.
Figur 4: Utvalg nivå i koloni biofilm av B. subtilis på. forskjellige innledende celletettheter kolonien biofilm av drivhus og rød-fluorescens stammer vises etter 2 dager som ble inokulert med forskjellige innledende celletettheter (ovenfra til under: ikke-utvannet til 10 fem ganger utvannet initiere kulturer, henholdsvis). Scale bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Forholdet mellom klima- og rød-fluorescerende-stammer kan videre kvantifiseres ved hjelp av ImageJ programvare som gjør at de kvantitative karakterisering av populasjonsstruktur og konkurransekraft av stammene som ble brukt for forsøkene.
Video Figur 1: Tid lapse images av sverm B. subtilis innledet med en. en blanding av klima og rød-fluorescerende stammer (Høyreklikk for å laste ned.) Videoen viser en gang løpet av 10 timer. Scale bar = 7 mm.
Video Figur 2: Tid lapse bilder av skyve B. subtilis innledet med en. en blanding av klima og rød-fluorescerende stammer (Høyreklikk for å laste ned.) Videoen viser et tidsforløp på 24 timer. Scale bar = 5 mm.
Video Figur 3: Tid lapse bilder av B. subtilis koloni biofilmer innledet med 1: 1 blanding av grønn-. Og rød-fluorescerende stammer ved høy celletetthet (Høyreklikk for å laste ned.) Videoen viser et tidsforløp på 48 timer. Scale bar = 5 mm.
Video Figur 4: Tid lapse bilder av B. subtilis koloni biofilmer innledet med 1: 1 blanding av klima og rød-fluorescerende stammer ved lave celletettheter. (Høyreklikk for å laste ned.) Videoen viser et tidsforløp på 48 timer. Scale bar = 5 mm.
Discussion
Tilgjengeligheten av et fluoriserende verktøykasse for bakterier letter ikke bare studiet av heterogene genekspresjon 30,31 og protein lokalisering 32, men også analyse av romlige fordelingen av belastninger innen en populasjon 8. Fluorescent markører med tilstrekkelig forskjellige eksitasjon og emisjonsbølgelengder tillate å tydelig lokalisere to stammer som ellers er umulig å skille fra hverandre når de blandes. Den beskrevne protokollen kan være ansatt for å observere populasjonsdynamikken i blandede kulturer, for eksempel konkurranse eksperimenter eller synergi mellom stammer eller arter. Muligheten til å bestemme de relative Forekomsten av fluorescensmerkede stammer i en blandet populasjon er ikke begrenset til overflaten festet sverm, skyvedører, eller biofilm kolonier, men kan også brukes til andre flercellede biofilmsystemer, inkludert nedsenket, strømmer celle eller luft-medium grensesnitt biofilmer 27,33-35.
_content "> Mens present teknikken er et kraftig verktøy for å oppdage romlig fordeling av stammer og designkonkurransen eksperimenter, er det også mulig å følge genuttrykk heterogenitet i voksende kolonier. De dyrkingsforholdene er beskrevet her, gjelder for B. subtilis og de nøyaktige parametere for utvidelse på agar materiale krever optimalisering for andre arter eller stammer 20. Plassering prøvene i en inkubasjon kammer mens bildebehandling tillater eksperimentator å følge populasjonsdynamikk i tid, selv om oppmerksomhet bør gis til fuktighetsnivået i kammeret under inkubasjon.Teknikkene som er beskrevet her krever også den genetiske modifikasjon av de undersøkte bakteriestammer, slik at stammene uttrykker fluorescerende markører som kan skilles fra hverandre. Videre har, foruten å ha distinkte eksitasjon og emisjonsspektra, anbefales det at de to valgte fluorescerende markørene har lik Quantum gir (dvs. forholdet mellom absorberte fotoner som slippes ut) og kommer til uttrykk i et tilsvarende nivå. I tillegg kan relative intensitetsendringer i tid bli målt og normalisert til en tidlig tids punkt av et eksperiment. Den relative økningen eller reduksjonen kan deretter sammenlignes mellom ulike fluorophores med ulike kvante effektivitet. For den presenterte eksperimentelle systemet, ble ulike drivhus og rød-fluorescerende proteiner testet tidligere 36,37 for å velge de mest optimale fluorescerende parene som kan oppdages i B. subtilis. Den optimale eksponeringstiden bør bestemmes for hver fluorescerende protein og prøve. Visse celletettheter eller flere lag av celler som kan være nødvendig for å detektere signalet effektivt inne i populasjonen. Visse fluorescerende proteiner kan ha lave intensiteter i bakteriecellene på grunn av ineffektiv ekspresjon og / eller translasjon av proteinet og således lavt kvanteutbytte. Slike ineffektive fluorescerende markører kan reduce følsomheten av systemet og forlenge den tid som trengs for å detektere de bakteriestammer som muligens resulterer i cytotoksisitet av eksitasjonslyset. De fluoriserende intensiteter kan følgelig modifiseres ved å forandre promoter anvendt for å uttrykke den kodende fluorescerende rapportørgenet. Et uttrykk nivå som er for høyt kan resultere i unødvendig overproduksjon av det fluorescerende protein som fører til skadelige egnethet kostnader for bakterien. Ved utførelse av konkurrerende eksperimenter, bør man ta hensyn til kostnaden av denne fluorescerende protein produksjon i cellene. Kontroll eksperimenter, hvor de fluorescerende markørene er byttet mellom konkurrerte stammer eller hvor to isogene stammer ulike bare i sine fluorescerende markører konkurrerte mot hverandre, er alltid nødvendig for å fastslå noen skjevhet mot en markør. Levetiden på de fluorescerende proteiner i cellene kan også påvirke målt intensitet. I tillegg autofluorescens av visse bakterie species kan kreve bruk av ulike andre enn beskrevet her fluorescerende markører.
Å bestemme nøyaktig den romlige fordelinger og Forekomsten av forskjellige bakteriestammer, må bakgrunnssignal som kommer fra den første fluorescerende protein ved bruk av fluorescens filter for den andre fluoriserende fargestoff og vice versa være individuelt testet på monokultur prøver (inneholdende bakterier som produserer bare en markør ). Dette gjør at subtraksjon av overlappende fluorescerende signalintensiteter. Viktigere, som stereomikroskopet registrerer fluorescens-signalet fra ovenfor det ekspanderende kolonien, er det presentert protokollen praktisk å bestemme den romlige anordning i to dimensjoner. Arkitekturen av ekspanderende bakteriell befolkningen kan føre til varierende fluorescens nivåer (dvs. rynke-lignende strukturer kan inneholde flere celler som viser høyere lokal fluorescensstyrkene). Derfor er den beskrevne analyse av bildene determines den romlige distribusjon, men ikke overflod av stammene innenfor et bestemt sted. Tidligere protokoller beskrev prøveopparbeidelse for svermende 20 eller fluorescens avbildning av populasjonsdynamikk i bakteriekolonier 38, men vår protokoll kombinerer disse teknikkene. Andre mikroskopi teknikker som tillater observasjon av tredimensjonale oppløsning av befolkningsstruktur (f.eks konfokal laser scanning mikros 39,40 eller strukturert belysning mikros 41) kan brukes for prøver med økte strukturelle kompleksiteten. Disse flere teknikker støtter også enkelt celle basert påvisning av stammene 31 som ikke er tilgjengelig ved hjelp stereomicroscopes.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av stipend KO4741 / 3-1 fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Videre ble laboratoriet av Á.TK støttet av en Marie Skłodowska Curie karriere integreringstilskuddet (PheHetBacBiofilm) og gi KO4741 / 2-1 fra DFG. TH, AD, RG-M., Og EM ble støttet av internasjonale Max Planck forskerskole, Alexander von Humboldt fundament, Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología-tyske Academic Exchange Service (CONACyT-DAAD), og JSMC laug, henholdsvis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
