Summary
Роль ассортимента (пространственной сегрегации) в эволюционные сценарии могут быть исследованы с помощью простых микробных систем в лаборатории, которые позволяют контролируемой регулировку пространственного распределения. Изменяя плотность Основателем клеток, разнообразный ассортимент уровни могут быть визуализированы с использованием флуоресцентно меченных бактериальных штаммов в колонии биопленки из Сенная палочка.
Introduction
В последние десятилетия, микробы были признаны в качестве социальных сообществ , связанных с различными экосистемами на земле 1,2. В отличие от планктонных культур, используемых в общей лабораторной практике, микробы в среде показывают широкий спектр пространственных структур сообщества в зависимости от экологической обстановке. Простые микробные системы могут быть использованы , чтобы понять последствия пространственных структур на эволюцию социальных взаимодействий 3,4. Публикации в последние 2-3 года с использованием как эукариотических и прокариотических модельные системы проанализировала воздействие пространственных структур на стабильность сотрудничества в рамках микробных популяций 5-8. Кроме того, облигатные взаимодействия между микробами, например , метаболический перекрестное вскармливание, может также изменить пространственное распределение взаимодействующих партнеров 9-11. Влияние пространственной структуры в этих исследованиях в основном исследовали с использованием поверхности с прилипшими сидячих клетки, населяющие так-called биопленки или в колониях, растущих на поверхности агаровой среды. Генетический дрейф приводит к высоким пространственным ассортименту можно наблюдать в микробных колоний , где питательная истощение на краю клеточного деления , опосредованных результатов разложения в ряд генетических узких мест , что обуславливает высокую вероятность локального фиксации для некоторых клоновых linages 12. Генетический дрейф может быть поэтому использованы для изучения роли пространственной сегрегации в микробных колоний.
В окружающей среде биопленки являются многовидовые сообщества окружены собственного производства полимерной матрицы 13. Структура биопленки, функция и стабильность зависят от сложной сети социальных взаимодействий , где обмен бактерии сигналы, матричные компоненты и ресурсы, или конкурируют за пространство и питательные вещества , используя токсины и антибиотики. Сенная палочка является почвой обитания и корневой колонизировать бактерия , которая развивается высокоорганизованными биопленки сообщества 14. По аналогии с социальнойнасекомые, B. Сенная клетки используют разделение труда стратегии, развитие субпопуляции внеклеточного матрикса производителей и каннибалов, подвижных клеток, покоящихся спор и других типов клеток 15,16. Процесс дифференциации является динамическим и может изменяться от условий окружающей среды 17,18.
Стратегии поверхностной колонизации бактериями можно легко манипулировать в лабораторных условиях путем изменения концентрации агара в среде для роста. При низких уровнях агара (0,2-0,3%), бактерии , несущие активный жгутики способны плавать, в то время как полутвердый агар (0,7-1% агара) способствует жгутик инициативе сообщества распространения, называется роятся 19-21. При отсутствии жгутика, некоторые бактериальные штаммы способны перемещаться по полутвердой среде с помощью скольжения, т.е. расширение зависит от роста населения , облегченные матрицей экзополисахарида и других секретируемых гидрофобин соединений 22-24. И, наконец, бактерии, которые являются capablе формы развития биопленки архитектурно сложных колоний на твердой агаровой среде (1,2-2%) 14,17,25. В то время как эти черты рассматриваются в лаборатории за счет точного регулирования условий, в естественной среде обитания эти поверхностные распространяющиеся стратегии могут транзит постепенно от одного к другому в зависимости от условий окружающей среды 26. В то время как сингл на основе Подвижность клеток имеет решающее значение в процессе инициации развития биопленок на границе раздела воздух-жидкость в обоих грамположительных и -отрицательные бактерий 27, сложные колонии биопленки из B. Сенная не зависят от удаления жгутиков моторики 28. Однако пространственная организация в процессе разработки В. зиЫШз колонии биопленки зависит от плотности бактериального инокулята , используемого для инициирования биопленку 8.
Здесь мы используем B. Сенная , чтобы показать , что пространственное разделение во время поверхностной колонизации зависит от механизма уровня населения motiliти (т.е. роения или скольжения), и развитие колонии биопленки зависит от плотности Основателем клеток. Мы представляем флуоресцентную микроскопию инструмент, который можно применять для непрерывного мониторинга микробного роста биопленки, поверхностный колонизацию и ассортимент на макроуровне. Кроме того, способ количественного определения представлен для определения относительного содержания штамма в популяции.
Protocol
1. Подготовка медиакультуры, полутвердые агара и биопленки пластин, Pre-культур
- Средняя Подготовка к Роящиеся и раздвижные
- Растворить 2 г Lenox Broth (LB) и 0,7 г агар-агара в 100 мл ионообменной воды и автоклаве в течение 20 мин при 120 ° С. Используйте небольшие объемы (50-200 мл) для улучшения воспроизводимости между экспериментами.
- Сразу же после стерилизации, закройте крышку из средней бутылки, чтобы уменьшить испарение и место в 55 ° C инкубаторе в течение не менее 2 ч.
- После того, как температура среды закалила до 55 ° С, заливают 20 мл агара LB среды в 90 мм из полистирола диаметром чашки Петри в лабораторных стерильных капот. Для покадровой экспериментов, заливают 5 мл агара LB среды на 35 мм из полистирола диаметром чашки Петри.
- Закройте чашку Петри, сразу же после заливки, не укладывают не более 4 пластин друг на друга, и пусть агаровой среде затвердеть в течение по крайней мере 1 часа.
- 2xSG Средняя Pвозмещение ущерба для Колонии биопленок
- Растворить 1,6 г питательном бульоне, 0,2 г KCl, 0,05 г MgSO 4 7H 2 O и 1,5 г агар-агара в 100 мл ионообменной воды и автоклаве в течение 20 мин при 120 ° С. Используйте небольшие объемы (50-200 мл) для улучшения воспроизводимости между экспериментами.
- Сразу же после стерилизации, закрыть крышку среды бутылки, чтобы уменьшить испарение и поместить бутылку в 55 ° C инкубаторе в течение по крайней мере 2 часов.
- После того, как температура среды имеет самонастраивающаяся до 55 ° С, добавляют 0,1 мл стерилизованной ультрафильтрацией 1M Са (NO 3) 2 раствор, 0,1 мл стерилизованной ультрафильтрацией 100 мМ раствора MnCl 2, 0,1 мл стерилизованной 1 мМ FeSO 4 раствора, и 0,5 мл стерильный 20% раствор глюкозы.
- В лабораторной стерильной крышкой, влить 20 мл агара 2x SG среды на 90 мм из полистирола диаметром чашки Петри. Для покадровой экспериментов, заливают 5 мл агара LB среды на 35 мм из полистирола диаметром чашки Петри.
- Клосае чашку Петри, сразу после заливки, укладывают пластину на верхней части друг с другом, но не более 4-х пластин, и пусть агаровой среде затвердеть в течение по крайней мере 1 часа.
- Приготовление заквасок
ПРИМЕЧАНИЕ: B. зиЫШз 168, NCIB 3610 производные штаммы , используемые в способах , описанных ниже , конститутивно производят парниковые или красных флуоресцентных белков и были описаны ранее 8,27. Штаммы хранятся обычно в -80 ° C морозильнике.- Инокулируйте закваски из запасов -80 ° С в 3 мл LB-среде, и инкубировать в течение ночи (16-18 ч) при 37 ° C с горизонтальным встряхивании (225 оборотов в минуту). Не инкубировать культуру дольше , чем 18 часов , как дикий изолятов B. зиЫШз в основном склонны к агрегации и образуют биопленку в пробирке.
2. Со-прививка флуоресцентно меченный бактериальными штаммами для поверхности Распространение
- Сушка полутвердых чашки с агаром для роения иСкольжение B. Сенная.
- Сухие агаром для роятся и скольжения в течение 20 мин перед посевом. Сухие пластины , выявленные в ламинарном потоке (см рисунок 1).
Примечание: Бактериальный роение и скольжение зависит от сухости полутвердой агаровой среде. Недостаточная сушка позволяет накопление воды на агаровой среде, что приводит к жгутика-опосредованной плавание. Продолжительное время результаты сушки в отсутствие роения.
- Сухие агаром для роятся и скольжения в течение 20 мин перед посевом. Сухие пластины , выявленные в ламинарном потоке (см рисунок 1).
Рисунок 1:.. Экспериментальный рабочий процесс Общая процедура изображена на рисунке, в том числе подготовка культуральной среды, сушки обнаружения пластины, прививка и флуоресцентной микроскопии (слева направо) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
- Co-прививкабактериальных культур для Роящиеся и раздвижные
- Определение оптической плотности ночных заквасочных культур при 600 нм и смешивать плотности нормализованного парниковые и красного флуоресцентного белка штаммов , продуцирующих B. Сенная NCIB 3610 или его производное Δ карга в 1,5 мл реакционной трубки. Например, смешать 100 мкл штамма 1 с (100 * [OD 600 ночной культуры штамма 1] / [OD 600 ночной культуры штамма 2]) мкл штамма 2. Умеренно вихря (3 сек при максимальной скорости) для равномерное распределение.
Примечание: B. Сенная NCIB 3610 штаммы заражают наблюдать роение, в то время как их производные Δ Хаг используются для скольжения. - Точечный 2 мкл смешанной культуры на середину предварительно высушенного пластины (см рисунок 1) и далее высушить пластину в течение 10 мин после инокуляции.
- Инкубируйте пластин при 37 ° C в вертикальном положении, чтобы избыток влаги конденсируется на крышке, а не на поверхности агара. <бр /> Примечание: Инкубационный время для B. Сенная роятся обычно составляет от 8-16 ч. Как правило, край роя достигает сторону 90 мм чашки Петри, в 8 ч. Раздвижные более медленный процесс и требует, по меньшей мере, от 16 до 42 ч инкубации. После 36 ч, скользящая передняя достигает стороны 90 мм чашки Петри.
- Для покадровой экспериментов, поместите диаметр 35 мм чашки Петри в разогретую стадии инкубационной камере при 37 ° С. Убедитесь, что крышка чашки Петри остается удалены в течение всего периода эксперимента. Установите крышку ступени инкубатора до 40 ° С, чтобы обойти образование влаги в верхней части инкубатора.
- Определение оптической плотности ночных заквасочных культур при 600 нм и смешивать плотности нормализованного парниковые и красного флуоресцентного белка штаммов , продуцирующих B. Сенная NCIB 3610 или его производное Δ карга в 1,5 мл реакционной трубки. Например, смешать 100 мкл штамма 1 с (100 * [OD 600 ночной культуры штамма 1] / [OD 600 ночной культуры штамма 2]) мкл штамма 2. Умеренно вихря (3 сек при максимальной скорости) для равномерное распределение.
3. Со-прививка флуоресцентно меченых бактериальными штаммами с различными начальными Клеточные плотностях
- Сушка чашки с агаром для колонии биопленки Б. Сенная.
- Сухие пластины для развития колонии биопленки без крышки в ламинарном потокекапот в течение 15 мин перед посевом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Недостаточное высушивание в повышенной влажности и плаванием или роения может быть возможным 29. Сушка слишком длинные результаты в небольших биопленки колоний.
- Сухие пластины для развития колонии биопленки без крышки в ламинарном потокекапот в течение 15 мин перед посевом.
- Получение 10-кратно разбавленного Закваски для Колонии биопленок
- Смешайте 100 мкл парниковым и красного флуоресцентного белка с образованием овернайт заквасок из B. Сенная 168 в реакционной пробирке 1,5 мл и слегка вихревая для однородного распределения. Подготовьте 10-кратный серийные разведения в LB среде.
- Пятно 2 мкл неразбавленной или 10 1, 10 2, 10 3, 10 4 , разбавленные смешанные культуры на пластинке , содержащей биопленки индуцирующего среду.
Примечание: от 6 до 9 биопленки колонии могут быть инициированы на одной 90 мм чашки Петри с учетом, что колонии разделены на равном расстоянии друг от друга. - Инкубируйте пластины при температуре 30 ° C в вертикальном положении, чтобы избыток влаги конденсируется на крышке ине на поверхности агара.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации для B. Сенная биопленки составляет от 1 до 3 дней. Как правило, колонии биопленки Б. Сенная достигает среднего размера и сложной структуры в 2 -х дней. - Для покадровой экспериментов, поместите один прививочный материал в середине диаметра чашки Петри 35 мм и поместите блюдо в разогретую до стадии инкубационной камере, установленной на 30 ° C. Убедитесь в том, что верхняя часть чашки Петри остается удалены в течение всего периода эксперимента. Установите крышку ступени инкубатора до 35 ° С, чтобы обойти образование влаги в верхней части инкубатора.
4. флуоресцентной микроскопии Обнаружение меченых Штаммы
- Описание оборудования для работы с изображениями.
- Для обнаружения поверхности колонизацию и сигнала флуоресценции, использовать моторизованный флуоресцентный микроскоп стерео трансфокатора (см подробный список материалов в таблице) , оснащенную Цель 0.5X Planapo, два LEDХолодные источники света (один для обнаружения флуоресценции и один для видимого света), наборы фильтров для GFP (возбуждения при 470/40 нм и эмиссии при 525/50 нм) и MRFP (возбуждение при 572/25 нм и эмиссии при 629 / 62 нм), и монохромная камера высокого разрешения.
- Выполнять сбор и обработку изображений с соответствующим программным обеспечением, доступным для стерео трансфокатора микроскопа, включая многоканальные и покадровой модулей. Для Промежуток времени эксперимента, использовать стандартный нагревательный этап инкубатор, установленный на стерео зум-микроскоп с адаптером.
- Визуализация роятся и сдвинув расширения
- Используйте наименьшее увеличение, чтобы захватить наибольшую возможную площадь 90 мм пластины. Установить происхождение прививки (середина 90 мм чашки Петри) в углу видимой области для контроля радиального расширения и бактериальной флуоресценции.
- Отрегулировать оптимальное время экспозиции в зависимости от силы сигнала флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для конститутивно expressed гены флуоресценции в B. Сенная, зеленовато и красной флуоресценции с 1,5 и 3 сек времени экспозиции можно использовать, соответственно. Кроме того, 10 мс время экспозиции подходит для видимого света.
- С помощью увеличения, который позволяет детектировать всей биопленки колонии и регулировать колонию в середине поля зрения.
Примечание: Что касается роятся и скольжения расширения, оптимальные времена экспозиции для обнаружения сигналов флуоресценции в биопленки колоний зависит от уровня экспрессии флуоресцентного белка кодирующих генов. Для получения репрезентативных результатов ниже, зеленовато и красной флуоресценции была обнаружена с использованием интервалов экспозиции сек 1 и 3, соответственно. - Для получения изображений в заданный промежуток времени, получение изображений через определенные промежутки времени, используя постоянные времени экспозиции.
- Сохранение флуоресценции стереомикроскопа записанные изображения в формате файла, который распознается программным обеспечением ImageJ для количественного анализа данных.
5. DatАнализ
- Для анализа площади, занимаемой каждым по-разному меченого флуоресцентной штамма, откройте интересующий файл в программном обеспечении ImageJ расширенной с BioVoxxel плагин.
- Когда окно называется "Био-форматы Параметры импорта" появляется там, где только опции "Открыть все серии" и "Autoscale" выбраны, откройте файл, нажав кнопку "OK".
Примечание: Файлы отображаются в виде стопки из трех изображений, по одному для каждого канала, используемого для записи изображения в микроскопе (зеленовато-красный флуоресценции и светлого поля изображения). - Разделите стек на отдельные снимки канала, выбрав "Image" - "стеков" - "Стек к изображениям» на панели управления ImageJ.
Примечание: Изображения появляются и пронумерованы, как 1/3 (зеленый канал), 2/3 (красный канал) и 3/3 (светлого поля). Здесь изображение светлого поля исключен из анализа.
- Когда окно называется "Био-форматы Параметры импорта" появляется там, где только опции "Открыть все серии" и "Autoscale" выбраны, откройте файл, нажав кнопку "OK".
- Для анализа изображений, преобразование каждого в 8-битного изображения, выбрав"Изображение" - "Вид" - "8-бит".
- Для того, чтобы определить , занимаемую площадь в 2 пикселя, сбросить масштаб изображений с помощью "Анализ" - "Set Scale". Когда появляется всплывающее окно с различными параметрами масштаба, сбросить масштаб, выбрав "Нажмите для удаления накипи". Отметьте опцию "Global", чтобы удалить масштаб для всех открытых изображений.
- Для удаления фона, нарисуйте овальную область (область интереса, ROI) за пределами флуоресцентной области, используя "овал" инструмент на панели управления ImageJ.
- Для того, чтобы гарантировать, что размер фоновой овал является одинаковым для всех анализируемых изображений, добавить его к менеджеру ROI через [T] символа клавиатуры. Окно ROI менеджер приходит где фон овальная ROI могут быть сохранены с помощью "More" - опции "Сохранить".
- Если фон овальная ROI видна на изображении, измерить интенсивность области, выбрав "Анализ" - "Мера".
Примечание: результаты AПоявится окно, в котором среди прочего интенсивность флуоресценции среднее отображается в столбце "Среднее". - Вычтите значение средней интенсивности флуоресценции фона из изображения с помощью снимите выделение фона овальную ROI, нажав кнопку "Process" - "Math" - "Subtract" и вставив измеренное значение.
- Применить порог к изображению через "Изображение" - "Adjust" - опция "Порог". Выберите метод Оцу и черно-белый (B & W). Отметьте опцию "Темный фон" и использовать пороговое значение, нажав кнопку "Применить".
Примечание: Изменения образа на бинарном изображении, где площадь выше порогового значения показан белым цветом, и что ниже порога показан черным цветом. - Выбрать все выше порога через "Analyze" - вариант "Анализа частиц". В окне с настройками, сохранить параметры по умолчанию и сохранить "Показывать результаты" и "Summarize "варианты проверяются. Нажмите кнопку" OK ", чтобы отобразить сводку в окне результатов и отображение занимаемой площади в столбце" Общая площадь ".
Representative Results
Лабораторные системы бактериальных популяций обеспечивают привлекательный подход для изучения экологических и эволюционных вопросов. Здесь, три режима поверхности колонизацию B. Сенная были использованы для изучения внешнего вида ассортимента населения, т.е. сегрегации генетически идентичны, но флуоресцентно меченый разные штаммы. Роящиеся, которая является жгутик зависимой коллективной поверхности движение B. Сенная, приводит к весьма смешанной популяции. В этих кишащих колоний, зелено- и красных флуоресцентных бактерии колонизировали области были перекрывающиеся (рис 2А). Быстрое заселение поверхность можно проследить во времени (видео Рисунок 1). Во время роения В - Сенная, тонкий слой клеток расширяется от инокуляции центра после нескольких часов инкубации (рис 2В).
4752 / 54752fig2.jpg "/>
Рисунок 2: Роящиеся расширение B. . Сенная пожирали колония содержит парниковые и красно-флуоресцентный штаммы , которые были смешаны 1: 1 перед прививкой. (А) Через 15 ч, зелено- и красно-флуоресценции (GFP и RFP, соответственно) были обнаружены с соответствующими фильтрами флуоресценции. (B) Изображения тонкого слоя кишат B. Сенная показаны в выбранные моменты времени , извлеченные из видео Рисунок 1. Шкала бар = 5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Тем не менее, когда Б. Сенная штаммы, которые не имеющие функциональные жгутики , но которые способны распространяться с помощью произведенного экзополисахарида, гидрофобин и сурфактин, были замечены на полутвердой агаровой среде, то по- разному меченых штаммы были разделены в некоторой опрINed сектора (рис 3А). Развитие скользящем колонии могут быть записаны во времени (см Фигура 3В или видеомонитора Рисунок 2).
Рисунок 3: Раздвижные колонии B. . Сенная Колония содержит парниковые и красно-флуоресцентный штаммы , которые были смешаны 1: 1 перед прививкой. (А) Через 24 часа, зелено- и красно-флуоресценции (GFP и RFP, соответственно) были обнаружены с соответствующими фильтрами флуоресценции. (B) Образы B. Сенная скольжения диска показаны в выбранные моменты времени , извлеченные из видео Рисунок 2. Шкала бар = 5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
В то время как уровни ассортимента роения и SLIдинь расширяющиеся колонии не могут быть модифицированы, пространственная сегрегация по-разному меченных флуоресцентными штаммов в биопленки колонии может быть подвержено влиянию плотности Отправной клеток. Когда колония биопленки Б. Сенная была инициирована с высокой плотностью клеток в смешанных популяциях, зелено- и красно-флуоресцентный штаммы показали незначительные или нет пространственный ассортимент (см рисунок 4). Наоборот, когда плотность клеток для инициирования biolfilm был низким, четкие сектора зеленовато и красной флуоресценции может быть обнаружено с помощью флуоресцентной микроскопии. Уровень ассортимент был явно зависит от уровня разбавления инициирующего населения биопленки. Видео Рисунок 3 и 4 представляют расширение колонии для самой низкой и самой высокой разбавления инокулированных штаммов.
Рисунок 4: Ассортимент уровня в колонии биопленки из B. Сенная в. различные начальные плотности клеток Колония биопленки штаммов зеленовато и красных флуоресцентных показаны через 2 дня , которые были привитых с различными начальными плотности клеток (сверху вниз: не разбавлено до 10 5 раз разбавленных инициировании культуры, соответственно). Шкала бар = 5 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Отношение зелено- и красных флуоресцентных штаммов может быть дополнительно количественно с использованием программного обеспечения ImageJ, что позволяет количественную характеристику структуры популяции и конкурентности штаммов, используемых для экспериментов.
Видео Рисунок 1: Временной интервал емкэс роения B. Сенная инициировано с 1: 1 . сочетание зеленой и красной флуоресценцией штаммов (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.) Видео показывает временной ход 10 ч. Шкала бар = 7 мм.
Видео Рисунок 2: Цайтраферы изображения скольжения B. Сенная инициировано с 1: 1 . сочетание зеленой и красной флуоресценцией штаммов (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.) Видео показывает временной ход 24 часов. Шкала бар = 5 мм.
Видео Рисунок 3: Цайтраферы изображения B. Сенная колонии биопленки инициирована с 1: 1 смесь зеленого-. И красно-флюоресцентные штаммы при высоких плотностях клеток (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.) Видео показывает временной ход 48 часов. Шкала бар = 5 мм.
Видео Рисунок 4: Цайтраферы изображения B. зиЫШз колонии биопленки инициирована с 1: 1 смесью зелено- и красных флуоресцентных штаммов при низкой плотности клеток. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.) Видео показывает временной ход 48 часов. Шкала бар = 5 мм.
Discussion
Наличие флуоресцентным инструментов для бактерий облегчает не только изучение гетерогенной экспрессии генов 30,31 и белка локализации 32, но и анализ пространственного распределения штаммов в популяции 8. Флуоресцентные маркеры с достаточно различными возбуждения и излучения длин волн позволяют четко локализовать два штамма, которые в противном случае неотличимы друг от друга при смешивании. Описанный протокол может быть использован для наблюдения за динамикой численности населения в смешанных культурах, например , эксперименты в области конкуренции или синергизм между штаммов или видов. Возможность определения относительных содержаний флуоресцентно меченных штаммов в смешанной популяции не ограничивается поверхности с прилипшими роение, скольжение, или биопленки колонии, но также могут быть использованы для других многоклеточных систем биопленки, в том числе и под водой, поток клеток или воздух-носитель интерфейс биопленок 27,33-35.
_content "> В то время как Представленная методика является мощным инструментом для обнаружения пространственного распределения деформаций и экспериментов дизайн конкуренции, она также позволяет следующее выражение гена гетерогенности в расширяющихся колоний. Условия культивирования , описанные здесь , применимы для B. Сенная и точных параметров для расширения на агар СМИ может потребовать оптимизации для других видов или штаммов 20. Размещение образцов в инкубационной камере во время формирования изображения позволяет экспериментатору проследить динамику популяций во времени, хотя внимание следует уделить уровню влажности в камере во время инкубации.Методы, описанные здесь, также требуют генетической модификации исследованных штаммов бактерий таким образом, что штаммы выражают флуоресцентные маркеры, которые можно отличить друг от друга. К тому же, помимо того, что явное возбуждение и спектры излучения, рекомендуется, чтобы эти два выбранные флуоресцентные маркеры имеют аналогичные квантгм дает (т.е. отношение поглощенных фотонов, которые испускаются) и выражаются в сопоставимом уровне. Кроме того, изменения относительной интенсивности во времени может быть измерена и нормированы на ранней временной точке эксперимента. Относительное увеличение или уменьшение может быть затем сравниваются между различными флуорофоров с различными квантовыми эффективностью. Для представленной экспериментальной системы, различные зеленовато и красно-флуоресцентные белки были испытаны ранее 36,37 , чтобы выбрать наиболее оптимальных флуоресцентных пар , которые могут быть обнаружены в B. Сенная. Оптимальное время экспозиции должно быть определено для каждого флуоресцентного белка и образца. Определенные плотность ячеек или несколько слоев клеток могут потребоваться для эффективного обнаружения сигнала в пределах популяции. Некоторые флуоресцентные белки могут иметь низкие интенсивности в бактериальных клетках из-за неэффективного экспрессии и / или трансляции белка и тем самым низким квантовым выходом. Такие неэффективные флуоресцентные маркеры могли гвыявлять чувствительность системы и продлить время, необходимое для обнаружения бактериальных штаммов, возможно, что приводит к цитотоксичности возбуждающим светом. Флуоресцентные интенсивности могут быть соответствующим образом модифицированы путем изменения промотор, используемый для экспрессии флуоресцентного гена-репортера кодирования. Уровень экспрессии, который является слишком высоким, может привести к ненужному перепроизводство флуоресцентного белка, приводящей к пагубным затрат пригодности для бактерии. При проведении экспериментов в области конкуренции, следует учитывать стоимость конкретного производства флуоресцентного белка в клетках. Контрольные эксперименты, в которых флуоресцентные маркеры перепутаны между конкурировали штаммов или где два изогенных штаммов, различающиеся только в их флуоресцентных маркеров конкурировали друг с другом, всегда необходимы, чтобы определить, какой-либо уклон в сторону одного маркера. Времена жизни флуоресцентных белков внутри клеток может также повлиять на измеренной интенсивности. Кроме того, аутофлуоресценция определенной бактериальной монетеей может потребоваться использование других, чем описанные здесь различные флуоресцентные маркеры.
Для точного определения пространственных распределений и содержаний различных бактериальных штаммов, фоновый сигнала, приходящего из первого флуоресцентного белка в то время как с помощью фильтра флуоресценции для второго флуоресцентного маркера и наоборот, должны быть индивидуально проверены на образцах монокультуры (содержащих бактерии, воспроизводящая только один маркер ). Это позволяет вычитание перекрытием интенсивности флуоресцентного сигнала. Важно отметить, что, как стереомикроскопа записывает сигнал флуоресценции сверху расширяющейся колонии, представленный протокол удобно определять пространственное расположение в двух измерениях. Архитектура расширяющейся популяции бактерий может привести к различным уровнем флуоресценции (т.е. без морщин подобные структуры могут содержать больше клеток , воспроизводящих более высокие локальные интенсивности флуоресценции). Таким образом, описанный анализ изображений determines пространственное распределение, но не обилие штаммов в определенном месте. Предыдущие протоколы описывают получение образца для роятся 20 или флуоресцентной визуализации динамики популяций в бактериальных колоний 38, но наш протокол сочетает в себе эти методы. Другие методы микроскопии, позволяющие наблюдение трехмерного разрешения структуры популяции (например , конфокальной лазерной сканирующей микроскопии 39,40 или структурированным освещение микроскопии 41) может быть применен для образцов с повышенной структурной сложности. Эти дополнительные методы также поддерживают единый на основе обнаружения клеток штаммов 31 , который не доступен с помощью стереомикроскопов.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась за счет гранта KO4741 / 3-1 из Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Кроме того, лаборатория Á.TK была поддержана грантом карьера интеграции Мари Склодовская Кюри (PheHetBacBiofilm) и предоставить KO4741 / 2-1 от ГПД. TH, AD, RG-М., И EM были поддержаны Международной Макса Планка научной школы, Фонд Александра фон Гумбольдта, Consejo Nacional де Ciencia у TECNOLOGIA-Германской службы академических обменов (КОНАСИТ-DAAD) и JSMC стипендий соответственно.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lennox Broth (LB) | Carl Roth GmbH | X964 | |
| Agar-agar, Kobe I | Carl Roth GmbH | 5210 | |
| Petri dish (90 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Petri dish (35 mm diameter) | any | NA | Use Petri dishes without ventillation cams |
| Difco Nutrient Broth | BD Europe | 234000 | |
| KCl | any | NA | |
| MgSO,4 7H2O | any | NA | |
| Ca(NO3)2 4H2O | any | NA | |
| MnCl24H2O | any | NA | |
| FeSO4 | any | NA | |
| D-Glucose | any | NA | |
| Fluorescence AxioZoom V16 time-lapse microscope | Carl Zeiss Microscopy GmbH | see bellow detailed description | |
| AxioZoom V16 Microscope body | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435080 9030 000 | |
| Phototube Z 100:0 for Axio Zoom V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9020 000 | without eyepieces |
| Fluar Illuminator Z mot Fluorescence intermediate tube for Axio Zoom.V16 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9060 000 | |
| Controller EMS 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435610 9010 000 | |
| System Control Panel SYCOP 3 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435611 9010 000 | |
| Reflector module Z | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435180 9160 000 | For Fluar Illuminator Z mot on Axio Zoom.V16 and SYCOP 3 |
| Filter set 38 HE eGFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489038 9901 000 | EX BP 470/40, BS FT 495, EM BP 525/50 |
| Filter set 63 HE mRFP shift free (E) | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 489063 0000 000 | EX BP 572/25, BS FT 590, EM BP 629/62 |
| Mount S | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435402 0000 000 | |
| Objektive PlanApo Z 0,5x/0,125 FWD 114 mm | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435280 9050 000 | 164 mm parfocal length; M62x0.75 thread at front |
| Coarse/fine drive with profile column | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435400 0000 000 | 490 mm, 10 kg load capacity, compatible with stand bases 300/450 |
| Stand base 450 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435430 9902 000 | |
| Cold-light source Zeiss CL 9000 LED CAN | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 435700 9000 000 | |
| CAN-bus cable | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 457411 9011 000 | 2.5 m length |
| Slit-ring illuminator | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417075 9010 000 | d = 66 mm |
| Flexible light guide 1500 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 417063 9901 000 | 8/1,000 mm |
| Illumination Adapter for light guide | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 1370 927 | |
| Lightguide HXP with liquid fill | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 000000 0482 760 | ø3 mm x 2,000 mm |
| Camera Adapter 60N-C | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426113 0000 000 | 2/3" 0.63X |
| High Resolution Microscopy Camera AxioCam MRm Rev. 3 FireWire | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426509 9901 000 | |
| AxioCam FireWire Trigger Cable Set | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 426506 0002 000 | for direct shutter synchronization |
| ZEN pro 2012 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410135 1002 120 | Blue edition, requires min. Windows 7 64-bit |
| ZEN Module Time Lapse | Carl Zeiss Microscopy GmbH | 410136 1031 110 | |
| Standard Heating Stage Top Incubator | Tokai Hit | INUL-MS1-F1 | |
| Zeiss Stereo Microscope Base Adapter | Tokai Hit | MS-V12 | |
| Softwares | |||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | v 1.49m | |
| BioVoxxel plugin | BioVoxxel | http://www.biovoxxel.de/development/ |
References
- Nadell, C. D., Xavier, J. B., Foster, K. R. The sociobiology of biofilms. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 206-224 (2009).
- West, S. A., Griffin, A. S., Gardner, A., Diggle, S. P. Social evolution theory for microorganisms. Nat Rev Microbiol. 4 (8), 597-607 (2006).
- Kovács, ÁT. Impact of spatial distribution on the development of mutualism in microbes. Front Microbiol. 5, 649 (2014).
- Martin, M., Hölscher, T., Dragoš, A., Cooper, V. S., Kovács, ÁT. Laboratory evolution of microbial interactions in bacterial biofilms. J Bacteriol. , (2016).
- Drescher, K., Nadell, C. D., Stone, H. A., Wingreen, N. S., Bassler, B. L. Solutions to the public goods dilemma in bacterial biofilms. Curr Biol. 24 (1), 50-55 (2014).
- Momeni, B., Waite, A. J., Shou, W. Spatial self-organization favors heterotypic cooperation over cheating. Elife. 2, e00960 (2013).
- van Dyken, J. D., Müller, M. J., Mack, K. M., Desai, M. M. Spatial population expansion promotes the evolution of cooperation in an experimental Prisoner's Dilemma. Curr Biol. 23 (10), 919-923 (2013).
- van Gestel, J., Weissing, F. J., Kuipers, O. P., Kovács, ÁT. Density of founder cells affects spatial pattern formation and cooperation in Bacillus subtilis biofilms. ISME J. 8 (10), 2069-2079 (2014).
- Momeni, B., Brileya, K. A., Fields, M. W., Shou, W. Strong inter-population cooperation leads to partner intermixing in microbial communities. Elife. 2, e00230 (2013).
- Müller, M. J., Neugeboren, B. I., Nelson, D. R., Murray, A. W. Genetic drift opposes mutualism during spatial population expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (3), 1037-1042 (2014).
- Pande, S., et al. Privatization of cooperative benefits stabilizes mutualistic cross-feeding interactions in spatially structured environments. ISME J. 10, 1413-1423 (2016).
- Hallatschek, O., Hersen, P., Ramanathan, S., Nelson, D. R. Genetic drift at expanding frontiers promotes gene segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (50), 19926-19930 (2007).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
- Vlamakis, H., Chai, Y., Beauregard, P., Losick, R., Kolter, R. Sticking together: building a biofilm the Bacillus subtilis way. Nat Rev Microbiol. 11 (3), 157-168 (2013).
- Lopez, D., Kolter, R. Extracellular signals that define distinct and coexisting cell fates in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 34 (2), 134-149 (2010).
- Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. Generation of multiple cell types in Bacillus subtilis. FEMS Microbiol Rev. 33 (1), 152-163 (2009).
- Mhatre, E., Monterrosa, R. G., Kovács, ÁT. From environmental signals to regulators: Modulation of biofilm development in Gram-positive bacteria. J Basic Microbiol. , (2014).
- Zhang, W., et al. Nutrient depletion in Bacillus subtilis biofilms triggers matrix production. New J Physics. 16, 015028 (2014).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Morales-Soto, N., et al. Preparation, imaging, and quantification of bacterial surface motility assays. J Vis Exp. (98), (2015).
- Angelini, T. E., Roper, M., Kolter, R., Weitz, D. A., Brenner, M. P. Bacillus subtilis spreads by surfing on waves of surfactant. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (43), 18109-18113 (2009).
- Grau, R. R., et al. A Duo of Potassium-Responsive Histidine Kinases Govern the Multicellular Destiny of Bacillus subtilis. MBio. 6 (4), e00581 (2015).
- Park, S. Y., Pontes, M. H., Groisman, E. A. Flagella-independent surface motility in Salmonella enterica serovar Typhimurium. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1850-1855 (2015).
- van Gestel, J., Vlamakis, H., Kolter, R. From cell differentiation to cell collectives: Bacillus subtilis uses division of labor to migrate. PLoS Biol. 13 (4), e1002141 (2015).
- Abee, T., Kovács, ÁT., Kuipers, O. P., van der Veen, S. Biofilm formation and dispersal in Gram-positive bacteria. Curr Opin Biotechnol. 22 (2), 172-179 (2011).
- Kovács, ÁT. Bacterial differentiation via gradual activation of global regulators. Curr Genet. 62 (1), 125-128 (2016).
- Hölscher, T., et al. Motility, chemotaxis and aerotaxis contribute to competitiveness during bacterial pellicle biofilm development. J Mol Biol. 427 (23), 3695-3708 (2015).
- Seminara, A., et al. Osmotic spreading of Bacillus subtilis biofilms driven by an extracellular matrix. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1116-1121 (2012).
- Patrick, J. E., Kearns, D. B. Laboratory strains of Bacillus subtilis do not exhibit swarming motility. J Bacteriol. 191 (22), 7129-7133 (2009).
- de Jong, I. G., Beilharz, K., Kuipers, O. P., Veening, J. W. Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy. J Vis Exp. (53), e3145 (2011).
- Garcia-Betancur, J. C., Yepes, A., Schneider, J., Lopez, D. Single-cell analysis of Bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry. J Vis Exp. (60), (2012).
- Turnbull, L., et al. Super-resolution imaging of the cytokinetic Z ring in live bacteria using fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM). J Vis Exp. (91), e51469 (2014).
- Barken, K. B., et al. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10 (9), 2331-2343 (2008).
- Oliveira, N. M., et al. Biofilm formation as a response to ecological competition. PLoS Biol. 13 (7), e1002191 (2015).
- Wang, X., et al. Probing phenotypic growth in expanding Bacillus subtilis biofilms. Appl Microbiol Biotechnol. 100, 4607-4615 (2016).
- Detert Oude Weme, R. G., et al. Single cell FRET analysis for the identification of optimal FRET-pairs in Bacillus subtilis using a prototype MEM-FLIM system. PLoS One. 10 (4), e0123239 (2015).
- Overkamp, W., et al. Benchmarking various green fluorescent protein variants in Bacillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, and Lactococcus lactis for live cell imaging. Appl Environ Microbiol. 79 (20), 6481-6490 (2013).
- Stannek, L., Egelkamp, R., Gunka, K., Commichau, F. M. Monitoring intraspecies competition in a bacterial cell population by cocultivation of fluorescently labelled strains. J Vis Exp. (83), e51196 (2014).
- Bridier, A., Briandet, R. Contribution of confocal laser scanning microscopy in deciphering biofilm tridimensional structure and reactivity. Methods Mol Biol. 1147, 255-266 (2014).
- Khajotia, S. S., Smart, K. H., Pilula, M., Thompson, D. M. Concurrent quantification of cellular and extracellular components of biofilms. J Vis Exp. (82), e50639 (2013).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends Microbiol. 23 (4), 233-242 (2015).
