Abstract
סעיף צמח שמירה על שלמות חיונית ללימוד מבנים אנטומיים מפורטים על הסלולר, הרקמות, או אפילו ברמת איברים. עם זאת, תאים ולשתול יש קירות תא נוקשים, סיבים קשים וקריסטלים (סידן אוקסלט, סיליקה, וכו '), ואת תכולת מים גבוהה כי לעתים קרובות לשבש שלמות רקמות במהלך חתך רקמות הצמח.
מחקר זה קובע שיטת חתך רקמות פשוט חותך-היברידיות. פרוטוקול זה משנה טכניקת חתך מבוסס פרפין משפר את שלמות סעיפי רקמות מצמחים שונים. רקמות צמח היו מוטבעות פרפין לפני החתך בתוך cryostat ב C -16 °. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מוקשה האבנית פרפין, קריעה מופחתת מגרדת, שלמות רקמות השתפרה משמעותית. פרוטוקול זה יושם בהצלחה לרקמות סחלב Phalaenopsis עשירי סידן אוקסלט וכן רקמות סרבניות כגון orga רבייהns ועלים של אורז, תירס, חיטה. בנוסף, באיכות גבוהה של קטעי רקמה מן-Cut היברידי יכול לשמש בשילוב עם הכלאה באתרו (שאני עורך) כדי לספק דפוסי הביטוי המרחבי של הגנים של עניין. לסיכום, פרוטוקול זה שימושי במיוחד עבור רקמות צמח סרבניות המכילות תוכן קריסטל או סיליקה גבוה. איכות טובה סעיפי רקמות לאפשר מחקרים ביולוגיים מורפולוגיים אחרים.
Introduction
שיטת החתך מבוסס פרפין היא טכניקה בשימוש נרחבת עבור מחקרים אנטומיים. שימור האנטומיה רקמות שלמות חשוב ללימודי מורפולוגיים וביולוגיים. הטכניקה חתכה-מוטבע פרפין יש יתרון משום-הטבעת פרפין שומרת מורפולוגיה תאים ורקמות. בנוסף, בלוקי פרפין ניתן לאחסן בנוחות לתקופות זמן ארוכות. עם זאת, חתך-מוטבע פרפין אינו מתאים רקמות הצמח המכיל גבישי תאיים. קריסטלים בתוך התאים לעתים קרובות לקרוע סרטים פרפין שלמות רקמות נזק במהלך חתך.
בניגוד חתך פרפין, cryosectioning הוא מהיר יחסית וחתכים ניתן להשיג ללא קיבוע, התייבשות סדרתי או הטבעה חדירה 1 בינוני. Cryosections תואם יישומים רבים כגון אימונוהיסטוכימיה, כלאה באתרו, ואנזים היסטוכימיה. היתרון השני של cryosectioning הואהשיטה זו אינה עוברת תהליכי denaturation פוטנציאל כגון טמפרטורה גבוהה טיפולים כימיים, כך מולקולות הסלולר נשמרות היטב בתוך קטעי הרקמה 2. Cryosectioning מעדיף בדרך כלל מעל מבוססי פרפין חתך ללימודים ברקמות בעלי חיים. עם זאת, cryosectioning הוא לא הבחירה הראשונה בצמחים כי טמפרטורה מקפיאה לפעמים גורם להיווצרות גבישי קרח המשפיעים על איכות שלמות סעיף. למרות ויסות האוסמוטי כגון פתרונות סוכרוז, פוליאתילן גליקול (PEG), או גליצרול 3 דווחה להפחית היווצרות קרח קריסטל בתנאי הקפאה, השיפור רחוק מלהיות אופטימלי.
כדי להסתגל לסביבות שונות, צמחים שונים יש לעתים קרובות תאי מרקם צמח רקמות ברורים התפתחו כדי ליצור קירות תא נוקשים, סיבים קשים, וקריסטלים 4,5. לדוגמא, גבישים אוקסלט מסיסים וגופים סיליקה הם די נפוציםצמחים 6. גופי סיליקט / דווחו גבישים כדי לסייע לשמור על אדריכלות צמח, תְמִירוּת, ולמנוע מחלות או מזיקים בצמחי דגנים 7-9.
הסחלבים בעציץ וחותך-הפרח בשוק הסחלב פורח וזה ענף צומח. אפרודיטה Phalaenopsis (סחלב עש) היא אחד צמחי נוי יצוא החשובים ביותר בטייוואן. במאמצים משמעותיים נעשו כדי להבין את השינויים מורפולוגיים פיסיולוגיים של התהליכים הפורחים סחלבי Phalaenopsis. קוצים פרחוניים של סחלבי Phalaenopsis יזומים מן ניצני בית השחי בבסיס עלה. לאחר תקופה של טמפרטורת סביבה מגניבה (כ אחת וחצי חודשים), בלוטות בית השחי להגדלה, לשבור תרדמת, ו לבלוט מהבסיס עלה להתפתח קוצים פרחוניים צעירים. כדי להבין את פיזיולוגיים, הסלולר, ותהליכים מולקולריים חניכת ספייק, זה הכרחי כדי לפתח טכניקת אנטומיים חזקה כדי visuaרקמות או סמנים Lize מבעוד מועד. עם זאת, הנוכחות של גבישים בכל מקום ברקמות סחלב, במיוחד ניצני בית השחי, עושה עבודה אנטומיים קשה.
כאן אנו בקשנו לשפר שלמות סעיף של רקמות צמח סרבניות כי כבר ראו עד כה מאתגר מבחינה טכנית. כאן אנו מציגים פרוטוקול משופר בשם Hybrid-Cut. זוהי שיטת חתך מבוסס פרפין כי מתבצעת באמצעות cryostat. הטבעת פרפין פותר תכולת מים גבוהה ברקמות צמח. חתך מתחת לטמפרטורה נמוכה מקשה את בלוק פרפין, מפחית קריסטל קורע בעיה, ומשפר שלמות רקמות משמעותית. פרוטוקול זה משפר שלמות רקמות משמעותית עבור דגימות צמח סרבניות.
Protocol
קיבוע 1. והטבעה
- הכנת מגיב
- 10x המלוח פוספט שנאגר (PBS)
- להוסיף 80 גרם NaCl, 2 גרם KCl, 14.4 גרם Na 2 HPO 4, ו -2.4 גרם KH 2 PO 4 ב 800 מ"ל כפול מים מזוקקים (DDH 2 O) ולהתאים את ה- pH ל -7.4 עם HCl. הוסף DDH 2 O ל בהיקף כולל של 1 ליטר, ולאחר מכן להוסיף 1,000 pyrocarbonate diethyl μl (DEPC) ולנער במרץ. חנות PBS לילה בטמפרטורת חדר חיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות למחרת.
- 1x PBS
- לדלל את 10x המניה PBS בשעה 1:10 יחס DDH 2 O כדי לקבל ריכוז סופי של 0.01 M Na 2 4 HPO, 0.002 M KH 2 4 PO, 0.003 M KCl, ו -0.13 M NaCl.
- Paraformaldehyde (PFA) מקבע
זהירות: Paraformaldehyde רעיל. כן זה מתחת למכסת מנוע קטר. יש להשתמש בכפפות.- כדי להכין 250 מ"ל מקבע PFA, לחמם 1001x מ"ל PBS 70 - 80 ° C ולהוסיף 1,750 μl של NaOH. לאחר מכן להוסיף 10 גרם של paraformaldehyde ומערבבים היטב עד שהיא נמסה. מניחים את הפתרון על הקרח ולאחר מכן להתאים את ה- pH ל 7.2 עם H 2 SO 4 (260 - 270 μl עבור 100 מ"ל) לאחר קירור.
- כוון את עוצמת הקול עד 250 מ"ל עם PBS 1x, להוסיף 625 glutaraldehyde μl לריכוז סופי של 0.25%. הוסף 250 μl טריטון X-100 לבין 250 μl 20 Tween כדי להקל על החדירה מקבע.
הערה: מקבע PFA יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד מבלי לאבד את יכולת הקיבעון שלה.
- הכן ריכוזים שונים של אתנול (30%, 50%, 70%, 85%, ו -95%) עם מים שטופלו DEPC.
- 10x המלוח פוספט שנאגר (PBS)
- אוסף צמח מדגם
- ניצני בית השחי
- השתמש צמחי סחלב Phalaenopsis בוגרים בשלב ארבעת עלים. מוציאים בזהירות עלים ידי קריעת עלה בעקבות midrib באמצעות הידיים.
- השתמש אזמל חד carefully להסיר ניצנים בית השחי מבסיס העלה השלישי או הרביעי על גזע monopodial.
- מדגם זרע
- קציר תרמילי זרעי סחלב בוגרים ב 4 חודשים לאחר האבקה. חותכים תרמילי הזרעים longitudinally עם אזמל. Shake תרמיל זרעי פתיחה בעדינות ושחרר את הזרעים היבשים על נייר סינון.
- Protocorm
- לזרוע זרעי סחלב בוגרים על צלחת אגר Murashige ו Skoog 1 / 2x, ולגדול בחדר בתרבית רקמה בתוך תקופה של 12 שעות אור ו טמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס. בואו לטעום protocorm ירוק ב -7 שבועות לאחר הזריעה.
- גופי Protocorm דמוי (PLBs)
- לגדול PLBs סחלב על T2 התחדשות צלחות אגר כפי שתואר לעיל 10 ומקום באותם תנאים לצמיחה כמו בשלב 1.2.3.1. אסוף 10 PLBs בגובה של 5 - 8 מ"מ.
- מדגם ליף
- אסוף רקמת העלה מצמח סחלב Phalaenopsis בוגרת כמתואר בשלב1.2.1.1.
- השתמש אזמל חד לחתוך חתיכה קטנה של רקמת עלה (רוחב אורך 7 מ"מ x 5 מ"מ) מן העלה חדש שפותח השני.
- מדגם רוט
- באמצעות אותו צמח שמתואר בשלב 1.2.1.1, לנתח 1 ס"מ אורך של רקמת קצה השורש באמצעות אזמל חד.
- ספייק יאנג
- השתמש אזמל חד לחתוך רקמות ספייק צעירים מהחלק קצה הפרח גבעול 10 ס"מ אורך.
- ניצן של פרח
- ובלו ניצן פרח קטן של 5 מ"מ קוטר מ גבעול פרח סחלב. חותכים חלק מן הרקמה ניצן פרח אורכי (3 מ"מ עובי).
- רקמות ליף ורקמות spikelet גידולי תבואה
- חותכי רקמת להב עלה אורך 1 סנטימטר מן העלים חדשים שפותחים הראשונים מאורזים, צמחי חיטה ותירס.
- אסוף 10 spikelets מצמחים (אורז, חיטה ותירס) יום אחד לפני anthesis.
- ניצני בית השחי
- קיבוע
- תקן דגימות צמח מייד באמצעות העברת לתוך בקבוקון נצנץ זכוכית המכיל 15 מיליליטר מקבע PFA קר כקרח.
- החלת ואקום (~ 720 מ"מ כספית) כדי דגימות צמח בחדר 4 ° C מגניב. החזק את הוואקום במשך 15 - 20 דקות (בועות קטנות צריכים לשחרר מן הדגימות). חזור על שלב זה עד שרוב הרקמות לשקוע לאחר שחרורו של ואקום. החזק את ואקום לילה ו לשחרר את הוואקום לאט למחרת.
- התייבשות
הערה: השתמש באותו הבקבוקון מן הקיבעון לאורך שלבי ההסתננות. יוצקים או להשתמש פיפטה כדי לנקז את הפתרון בשלב הקודם ולהחליף עם 15 מ"ל של פתרון חדש לתוך הבקבוקון. בהתאם למרקם של רקמות, לטיפול רקמות קשות כגון ניצן השחי סחלב, זרע, protocorm, ו PLB, ואת spikelet של אורז, חיטה, תירס במשך זמן רב; לטיפול ברקמות רכות כגון ניצן של פרח הסחלב, ספייק צעיר, עלה ושורש, ואת עלה של אורז, חיטה, תירס במשך זמן קצר יותר.- מייבשי דגימות בסדרת אתנול 15 מיליליטר בטמפרטורת חדר כדלקמן: אתנול 30% למשך 30 דקות, 50% אתנול למשך 30 דקות, 70% אתנול עבור שעה 1, 85% אתנול עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות, 95% אתנול עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות, ו 100% אתנול פעמים עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות.
הערה: ניתן לאחסן דגימות צמח באתנול 70% ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים.
- מייבשי דגימות בסדרת אתנול 15 מיליליטר בטמפרטורת חדר כדלקמן: אתנול 30% למשך 30 דקות, 50% אתנול למשך 30 דקות, 70% אתנול עבור שעה 1, 85% אתנול עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות, 95% אתנול עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות, ו 100% אתנול פעמים עבור 54 דקות עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות.
- חדור דגימות עם 15 מיליליטר תערובת תחליף אתנול קסילן במשך 54 דקות כל אחד עבור רקמות קשות ו -30 דקות עבור רקמות רכות, בטמפרטורת חדר כדלקמן: תחליף אתנול / קסילן (2: 1, V / V), אתנול / תחליף קסילן (1 : 1, V / V), תחליף אתנול / קסילן (1: 2, V / V), וממלא קסילן טהור פעמיים. זהירות: קסילן הוא רעיל. האם הצעד הזה במנדף. חדור מדגם בבקבוקון עם 15 מיליליטר תחליף קסילן תערובת פרפין בתנור על 60 מעלות צלזיוס, לילה עבור רקמות קשות, ובמשך 60 דקות עבור רקמות רכות כדלקמן: קסילן תחליף / פרפין (2: 1, V / V), תחליף / פרפין קסילן (1: 1, V / V), וממלא קסילן / פרפין (1: 2, V / V).
- חדור המדגם עם 15 מ"ל פרפין טהור פעמיים ביום ו לדגור על 60 מעלות צלזיוס בתנור.
- חזור על שלב 1.5.3 למחרת.
- הפעילו את הכוח של hr מרכז 1 הטבעה רקמות מראש כדי להמיס את השעווה המאגר פרפין לפני הטבעה רקמות בתוך גוש פרפין.
- לחמם את תבניות מתכת (גודל של רוחב ס"מ אורך בסיס 3.3 x 2 ס"מ) על מגש ההתחממות ב 62 מעלות צלזיוס, ויוצקים כ 13 מ"ל של שעווה מותכת לתוך הבסיס עובש.
- עבר דגימת רקמה אחת מן הסעיף 1.5.4 לתוך התבנית עם מלקחיים התחממו לכוון אותו אל המיקום הרצוי.
- הזז את התבניתלצלחת המגניבה בזהירות, ולהשאיר עד השעווה הקרושה.
2. רקמות חתך
- שיטת חתך פרפין
- הפוך בסיס שעווה ידי הצבת קלטת הטבעה על החלק העליון של עובש (באותו גודל בסעיף 1.6.2), למלא עם שעווה מותכת ולהסיר את התבנית לאחר השעווה הקרושה.
הערה: הקלטת ההטבעה תהווה בסיס שעווה לעגן מדגם בלוק פרפין. - חתוך את בלוק פרפין לתוך צורה וגודל מתאים, ומניח כמה חתיכות שעווה על מרית שטוחה. מחממים את חתיכות שעווה באמצעות מבער אלכוהול עד נמס שעווה ולאחר מכן למקם את שעווה מותכת על בסיס שעווה בסעיף 2.1.1 לדבוק הבלוק. הצמד אותו microtome.
- מניח להב חדש על microtome, ולהתאים את הזווית עד 5 מעלות כדי להקל על החתך ב microtome.
- חותכים את גוש פרפין מדגם לפרוסות דקות (10 מיקרומטר), כפי שתואר לעיל 11. </ Ol>
- הפוך בסיס שעווה ידי הצבת קלטת הטבעה על החלק העליון של עובש (באותו גודל בסעיף 1.6.2), למלא עם שעווה מותכת ולהסיר את התבנית לאחר השעווה הקרושה.
- Hybrid-חותכים שיטת חתך
- חתוך את בלוק פרפין מדגם משלב 1.6.4 לעמודה עם משטח טרפז בראש לגודל מתאים באמצעות סכין גילוח.
- מוסיפים קצת מתחם טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) למרכז הבמה cryostat. צרף את בלוק פרפין לשלב cryostat ואז במהירות לכוון את גוש רקמה לתוך המיקום הרצוי.
- מעבירים את הבמה פרפין בלוק / אל חדר cryostat. אפשר אוקטובר לגבש על סרגל הקפאה מהיר -42 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. אל תזיז את הבלוק במהלך המיצוק של אוקטובר (איור 2 ג).
- אפשר מתאם cryostat וטמפרטורה קאמרית להתקרר עד -20 ° C ו -16 ° C בהתאמה לפני הצמדת הבמה פרפין בלוק / למתאם cryostat. רקמות סעיף 10 מיקרומטר עובי.
- פיק סעיפים רקמה עם מלקחיים. Float המדורים 800 μl DEPC שטופלו מים פולי - L - COA ליזיןשקופית טד ולהעביר את השקופיות על פלטה חשמלית על 42 מעלות צלזיוס.
- אפשר הסעיפים לשטח על מי DEPC שטופלו על 42 מעלות צלזיוס. השתמש במסנן נייר כדי לנקז את המים מקצה.
- רקמות הר בשקופית על ידי הצבת את השקופית על צלחת ° C חם 42 לילה.
3. רקמות מכתימות
- Deparaffinization
- אסוף את השקופיות מהצלחת החמה ומניח אותם במעמד מכתים. להוסיף 150 מ"ל קסילן לצנצנת מכתים במנדף לטבול מתלה קסילן במשך 5 דקות.
- rehydration
- הכין ריכוזים שונים של פתרונות אתנול (100%, 95%, 70%, 50%, ו -30%) במי DEPC שטופלו ולמלא 150 מיליליטר של תמיסה לצנצנות מכתימות ברורות, בהתאמה.
- רעננותם דגימות באמצעות סדרה של הפחתת ריכוז אתנול, כל צעד במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. מעביר את השקופיות המכתימות מתל צנצנת אחת המכיל עוד צנצנת דריכוזי אתנול ifferent: אתנול 100%, 95% אתנול, 70% אתנול, 50% אתנול, ו אתנול 30%.
- לאחר התייבשות, לטבול את דגימות DDH 2 O 3 דקות.
- מכתים hematoxylin
- דגימות רקמת כתם ידי טבילת שקופיות רקמות בתמיסת hematoxylin עבור 1.5 דקות.
- לשטוף בקצרה DDH 2 O המכיל 1 - 2 טיפות של חומצה הידרוכלורית 12 N (HCl) למשך מספר שניות, ולאחר מכן לשטוף בקצרה DDH 2 O.
- התייבשות
- מייבשים את דגימות באמצעות סדרה של הגדלת ריכוזי אתנול עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר: אתנול 30%, 50 אתנול%, 70 אתנול%, 95% אתנול, ו 100 אתנול%. נקה את הדגימות עם קסילן למכסת מנוע הקטר במשך 5 דקות.
- הַרכָּבָה
- זרוק כראוי 600 μl של הרכבה בינונית מבוסס קסילן לשקופית. בזהירות במקום coverslip על הדגימה. למנוע בועות אוויר להרכיב כדי לקבל תמונות באיכות טובה.
- אפשר השקופיות לאוורר לילה יבש. שימו את הדגימה במיקרוסקופ למחרת.
הערה: תמונות נתפסו בבית 25x הגדלה 400X בהתאם לגודל של דגימות.
4. הכלאה באתרו
- סינתזת Probe
- Clone Phalaenopsis אפרודיטה הגן אקטין ספציפיים באמצעות רצף קידוד פריימרים 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'ו 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' (כדי לקבל 242 נ"ב amplicon PCR) CyclinB1; 1 רצף קידוד גנים ספציפיים באמצעות פריימרים 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 " ו 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(כדי לקבל 327 נ"ב amplicon PCR) כמתואר 12.
- ולקשור את רצפי קידוד הספציפיים לתוך וקטורים (למשל, pGEMT) על פי הפרוטוקול של היצרן.
- צור digoxigenin (DIG) שכותרתו בדיקות השכל antisense באמצעות SP6 / T7 ערכת תיוג DIG RNA על פי הוראה של היצרןים.
- הכלאה באתרו
- חותך את פרוסות רקמת ניצן השחי 2 nd ו -3 rd (10 מיקרומטר עובי) שנוצר באמצעות השיטה ההיברידית-Cut, ו הר פרוס לשקופית מצופית.
- Deparaffinize סעיפים רקמות קסילן (ראה 3.1.1), רעננותם בהפחתת ריכוזי אתנול (ראה 3.2.2), ולעכל עם 2 מ"ג / K proteinase מ"ל ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- בצע הכלאה באתרו לפי הפרוטוקול שתואר לעיל 11,13 עם כמה שינויים, כלומר, עם טמפרטורת הכלאה עבור תקטין כמו 59 מעלות צלזיוס ו -60 מעלות צלזיוס במשך CyclinB1;. 1 להכליא שקופיות עם 40 ng בדיקת RNA שכותרתו DIG.
- השתמש nitroblue tetrazolium / 5-bromo-4-כלורו-3-indolyl פוספט (NBT / BCIP) פתרון לזהות אותות הכלאה כמתואר 11.
Representative Results
Hybrid-Cut משפרת את שלמות סעיפי רקמות
הבנת האנטומיה של המבנה הפרחוני הרבייה חשובה על חקירת המנגנון הבסיסי של חניכת פרחי סחלבים. עם זאת, הצטברות של גבישי אוקסלט תאיים סחלבים Phalaenopsis עושה מחקרים כאלה משימה מאתגרת. כדי לעקוף את הבעיות הקשורות קריעה הנגרמת על ידי גבישים במהלך תהליך חתך (איור 1), פיתחנו מערכת והענקנו Hybrid-Cut. פרוטוקול זה משלב טכניקות הטבעת פרפין מסורתיות cryosection. ראשון בדקנו Hybrid-חותך ניצני בית השחי של סחלב Phalaenopsis כי הם ידועים לשמצה קשיחה רקמות ותוכן קריסטל גבוה. רקמת ניצן השחי נקבעה 4% PFA (ראה פרוטוקול, צעד 1.3). לאחר התייבשות אתנול סדרה ואני שעוות פרפיןnfiltration, באיבו בבית השחי ננעץ בלוק פרפין. הבלוק היה מטופח עד לגודל מתאים לפני החתך (איור 2 א). כמות קטנה של אוקטובר יושמה אז למרכז הבמה cryostat (איור 2 ב). בלוק פרפין אז דבק הבמה באמצעות OCT. הבמה הייתה מודגרות cryostat במשך 10 דקות כדי לאפשר התמצקות מלאה של אוקטובר לפני חתך (איור 2 ג) ולאחר מכן cryosection בוצעה בתוך -16 תא ° C (איור 2 ד).
לשם השוואה, בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון חתך microtome קבוע. כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', קריעה חמורה של סרטי פרפין נצפתה לאחר חתך microtome. שלמות רקמות המבנה התאי נפגע גם (איור 1B). Hybrid-Cut, ומצד שני,סעיפי רקמות ללא פגע פיק (איור 3 א) עם שלמות מבנית השתמרה (האיור 3B).
יישום של Hybrid-גזור רקמות שונות של פ אַפְרוֹדִיטָה
כדי להמשיך לבדוק רמת המוכנות של-Cut היברידי, בדקנו רקמות שונות של סחלבים Phalaenopsis. היא לעתים קרובות קשה להשיג חלקים של זרעים עם שלמות רקמות טובה בגלל מעטת הזרע הקשוחה. שימוש בפרוטוקול זה, מבנים מפורטים של זרעים נשתמרו לאחר החתך (איור 4 א). כפי שניתן לראות בתרשים 4A, גופים חלבון, מוצרי אחסון משותף 14, ניתן היה לזהות בבירור. Hybrid-Cut גם עבד בהצלחה והראה המבנים המפורטים של meristem פסגת לירות של protocorm הישן של חודש אחד (המבנה ניבט מזרע) (איור 4 ב) וprotocorm כמו- גופים (PLBs, איור 4C). הגבישים תאיים נצפו קטעי PLB. סחלבים Phalaenopsis יש עלים עבים ועסיסיים, והם מבצעים מטבוליזם של חומצת הטבוריתיים (CAM) -type הפוטוסינתזה 15. הסעיף הרוחבי של להב עלה הראה תאי mesophyll גדולים חבילות וסקולרית המכיל עצה ואת השיפה (איור 4D). פתחי הפיוניות מעטים נצפו על פני העלה abaxial בשעות היום (4D איור). למעשה, צמחי CAM התפתחו על מנת למקסם רווח פחמן אך בו זמנית להקטין את איבוד מים על ידי פתיחת stomates שלהם בלילה בתנאים צחיחים 15,16. Meristem פסגת שורש פ אפרודיטה מוצגת באיור 4E. תאי קצה השורש הופיעו להכיל מספר לא מבוטל של גבישים, אשר מאוד השתמרו היטב לאחר החתך (4E איור). סעיפים אורכים של קוצים פרחוניים צעירים היוו אינפורמטיון על הארכיטקטורה של primordials הפרחוני הצעיר (איור 4F). יתר על כן, עלי גביע, עלי כותרת, שפית, ו pollinia ניתן היה לזהות בבירור ממדור האורך של ניצני פרחים צעירים שסיימו בידול זה 5 מ"מ ניצן של פרח (איור 4G). שים לב כי גבישים שנצברו עליי הגביע של בלוטות פרחוניות צעירות. בקיצור, פרוטוקול זה עובד באופן עקבי כדי לשמור על שלמות רקמות מייצר מורפולוגיה שלמה המאפשר מחקרים הסלולר אנטומיים והאפשריים.
Hybrid-Cut שומר שלמות רקמות ב פלח
גם בדקנו Hybrid-גזור על פלחה כגון אורז, חיטה ותירס המכילים תוכן סיליקה גבוהה 17,18. כפי שניתן לראות בתרשים 5, על שלמות רקמות סעיפים הרוחביים של אורז, חיטה, תירס ועלים שופרה באופן משמעותי על ידי Hy Brid-Cut השיטה. העצה, השיפה, תאי mesophyll, stomates, ותאי bulliform שולט מתגלגל של הלהב עלה כדי למנוע אובדן מים זוהו בבירור ממקטעים של עלים אורזים. האנטומיה קרנץ, תאי mesophyll, וצרורות כלי דם של עלה התירס 19,20 זוהו בבירור. זה היה מסקרן למצוא צפיפות גבוהה של stomates משני צדדי adaxial ו abaxial עלי תירס (איור 5). יחס הפיוניות adaxial ו abaxial של 0.7 תירס דווח בעבר 21. בנוסף, פרוטוקול זה גם עבד בהצלחה לספק את מורפולוגיה התא המפורטת של spikelets מאורז, חיטה, תירס (איור 6). Spikelets ידוע מכיל סיליקה 9 בשפע. בדרך כלל, דבר גורם קושי בקיום חתך רקמות.
ב הכלאה באתרה
= "1"> הגנום וגישות transcriptomic משמשים כדי ויסמנו את הפונקציות של גנים. מתן פריסה המרחבית של תמלילי הגנים של עניין בהקשרים התפתחותיים או סביבתיים חשוב להוסיף תובנה חדשה הפונקציות האפשריות של הגנים. In-situ כלאה (שאני עורך) פותח כדי למקם דפוסי ביטוי גנים ברמת הרקמה 11, 22-25. בנוסף, שאני עורך יכול לספק הסלולר, ובמקרים מסוימים משנה הסלולר, ברזולוציה של הפצת mRNA באורגניזמים רב-תאי 26. במהלך שאני עורך, רנ"א שלם רקמות הוא חיוני כדי להשיג מידע מרחבים אמין על התמליל שנבחר. בדקנו שאני עורך באמצעות פרוטוקול היברידי-Cut הגן אקטין (PATC157348) שובט באמצעות פריימרים 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'ו 5'- AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' כדי לקבל amplicon 242 נ"ב PCR B1 Cyclin:.. 1 (PATC146999) גן ספציפי רצף קידוד פריימרים באמצעות 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'ו 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' כדי לקבל 327 נ"ב amplicon PCR. אחרי שאני עורך, אקטין Cyclin B1: ביטוי גנים 1 היה פיקוח ב ניצני בית השחי צעירים בוגרים (איור 7). גני שניהם באו לידי ביטוי בתאי meristematic של 2 nd ו -3 ניצני rd השחי, עם זוהו אותות חזקים ב 3 rd ניצני בית השחי. תוצאות אלו הראו כי Hybrid-Cut לשמור האנטומיה טובה ולספק דפוס ביטוי גנים מרחבית.
איור 1: סעיף פרפין מסורתי גורם קריעה חמורה של רקמות בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון חתך microtome קבוע.. קריעה חמורה של סרטי פרפין נצפתה לאחר חתך microtome מסורתי (א) (B). החיצים מראים את הקריעה החמורה של פרוסת הרקמות. ראש החץ מציג את הגופות קריסטל. סרגל קנה מידה -100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. Hybrid-Cut חתך שיטת רקמת ניצן השחי נקבעה PFA והרקמות היו מיובשות, הסתננו עם שעוות פרפין, ומוטבעי בלוק פרפין. בלוק פרפין היה גזוז לגודל מתאים (א). מתחם חיתוך טמפרטורה אופטימלית (אוקטובר) היה מוחל על מרכז הבמה cryostat (B). בלוק פרפין מצורף ב- OCT על במת cryostat. תחת בטמפרטורה נמוכה, בלוק פרפין ששקדו על הבמה cryostat באמצעות אוקטובר (C). בחתכי רקמה היו מחולקים בתא cryostat ב -16 ° C (D). ברים סולם מייצגים 0.5 ס"מ (א), 1 ס"מ (BD). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Hybrid-Cut משפר Integrity סעיף בלוק פרפין המכיל ניצן השחי של סחלב Phalaenopsis היה נתון-Cut ההיברידי חתך (א) ואת השיטה ההיברידית-Cut פיק קטעים עם שלמות רקמות מצוינת (B).. ראש החץ מראה את גופות קריסטל אנדוגני משובצות ברקמת ניצן השחי. סרגל קנה מידה -100 מיקרומטר.r קבל = "_ blank"> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: יישום של Hybrid-חותך סעיפי רקמות שונים של סחלב Phalaenopsis סחלב שונה. רקמות היו מחולקות בשיטת Hybrid-Cut, כגון חתך לאורך של זרע סחלב בשלב הבוגר (א), סעיף אורך של protocorm (B), חתך לאורך של גופי protocorm דמוי (PLB) (ג), סעיף רוחבי של להב עלה (D), חתך לאורך של השורש (E), חתך לאורך של ספייק פרח הצעיר (F), וסעיף אורך של ניצני פרחים צעירים (G). סעיפי רקמות הוכתמו על ידי hematoxylin. SC, קליפת הזרע; PB, גוף חלבון; M,meristem; MP, אמא PLB; עקור, בת PLB; מודעות, משטח עלה adaxial; Ab, משטח עלה abaxial; St, הפיוניות; MC, תא mesophyll; VB, צרור וסקולרית; RC, כובע שורש; FB, ניצן של פרח; Se, עָלֶה גָבִיעַ; Pe, עלה כותרת; La, שפית; פו, pollinia; Ro, rostellum; Ca, יבלת. ראשי חץ להראות גבישים. ברי סולם מייצגים 20 מיקרומטר (AE) ו -200 מיקרומטר (FG). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5:. Hybrid-Cut שומר Integrity רקמת העלה ב פלחה מספר השוואה של רקמת העלה בשיטת פרפין המסורתית (בחלונית הימנית) ואת הטכניקה Hybrid-Cut שפותחה במחקר זה (פאנל הימני). תמונות להראות עלו סעיפים רוחביים של אורז, חיטה, תירס. MC, תא mesophyll; Ph, השיפה; St, הפיוניות; לפנה"ס, bu תא lliform. חצים מראים הקריעה של פרוסת רקמה. ראשי חץ להראות גופות סיליקה. העיגולים מקווקוים הכחולים עולים האנטומיה קרנץ ב תירס C4. סולם bars 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6:. Hybrid-Cut שומר שלמות רקמות Spikelet ב פלחה כמה השוואת שלמות רקמות סעיפים spikelet בין פרפין המסורתי ושיטות Hybrid-Cut. חצים מראים הקריעה של פרוסת רקמה. ראשי חץ עולה גופים סיליקה. ברי סולם 20 מיקרומטר (אורז), ו -200 מיקרומטר (חיטה ותירס). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: באתרו הכלאה של אקטין CyclinB1; 1 דפוסי הביטוי של ובלוטות באד של סחלב Phalaenopsis בחתכי רקמה של ניצן 2 nd ניצנים בית השחי ו -3 rd השחי הוכנו תוך שימוש בשיטת Hybrid-Cut.. סך של 40 ng של אקטין CyclinB1; 1 חללית DIG שכותרתו שמש הכלאה. חללית התחושה שמשה כביקורת שלילית. החצים מצביעים על meristem הרבייה של ניצן השחי. סולם bars 100 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
יש צמחי תאים קירות תא נוקשים, סיבים קשים, קריסטלים, ואת תכולת מים גבוהה כי לגרום לבעיות קריעת רקמות במהלך חתך רקמות צמח. למרות חתך מבוסס פרפין משמש לעתים קרובות עבור רקמות צמח, את הגבישים אנדוגני לעתים קרובות לקרוע את רקמת הצמח במהלך החתך (איור 1). בגלל תכולת מי מטבעם הגבוה בתוך בתאי הצמח, חתך מבוסס cryostat לעתים קרובות גורם לתאי שבור וחתכי רקמות סדוקים.
במחקר הנוכחי, פרוטוקול פרפין הטבעה ו cryosection בשילוב בשם Hybrid-Cut פותח וקטעי רקמה באיכות טובות התקבלו. פרוטוקול זה פותר את הבעיה קשורה תכולת מים גבוהה על ידי החדרת הטבעת פרפין, ומצמצם את אפקט הקריעה על ידי הקשחת פראפין תחת בטמפרטורה נמוכה במהלך החתך (איור 3). לכן, פרוטוקול שונה זו יש יתרון על פני משני sectio פרפין המבוססנינג או Cryosectioning עבור שמירה על שלמות רקמות הצמח.
כתב יד זה מדגים כי השיטה ההיברידית-Cut משמר שלמות רקמות ברקמות רבות של סחלב Phalaenopsis כגון ניצן השחי, זרע, ו PLB, וכו 'המכילות רמות גבוהות של גבישים (איורים 3-4). יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן פלח כגון איברי רבייה ועלים של אורז, תירס, חיטה המכילים סיליקה גבוהה (איורים 5-6). יש להניח, פרוטוקול זה ניתן להחיל את וודי צמחים המכילים סיבים תזונתיים גבוהים.
באופן כללי, רקמת תיקון ביסודיות חשובה מאוד על Cut ההיברידי. מצאנו כי חומצת פורמלדהיד-חומצי-אלכוהול (FAA) מקבע עדיף PFA כדי לשמור על שלמות הרקמה של רקמות סרבניות מסוימות כגון בלוטות axially, שורשים, וכו 'עם זאת, PFA עובד טוב יותר מאשר ה- FAA בשימור שלמות RNA. לכן PFA מומלץ לתקןמדגם עבור כלאה באתרו (שאני עורך) עבודה. הפרוטוקול המתואר כאן נועד לניסוי RNA שאני עורך. לכן, כל ריאגנטים הוכנו כדי למנוע השפלה RNA על ידי ביטול זיהום RNase ידי טיפול DEPC. אם סעיף Hybrid-Cut הוא ללימודי אנטומיים, אוסמוזה ההפוכה רגילים (RO) מי חיץ הנגזרות שלה או ריאגנטים כשרים.
צמצום דגימת גודל ועובי כדי פחות מ -3 מ"מ מועיל עבור חדירה. יתר על כן, זמן טבילה גובר התייבשות וחדירה נחוץ רקמות מרקם קשות. הגבלת פרוטוקול זה עלולה עקב בעיות שנגרמות על ידי קיבעון לקוי, התייבשות, וחדירה של דגימה. לכן, התאים זמן עיבוד בכל צעד קריטי לייצר בלוק פרפין באיכות טובה. בדרך כלל, רקמה קשה צריכה עוד זמן עיבוד מאשר רקמה רכה.
בנוסף, הראינו כי Hybrid-Cut עבד בהצלחה wi שילובשאני עורך ה לספק פריסה המרחבית של התמלילים שנבחרו (איור 7). לסיכום, פרוטוקול זה שימושי לחקר אנטומיה של צמח ומספק מפת RNA ספציפי רקמות של הגנים הנבחרים. בנוסף הוא עשוי להיות מיושם על מחקרים מולקולריים אחרים כגון תיוג סוף מסוף deoxynucleotidyl transferase dUTP ניק (TUNEL) assay, הקרינה הכלאה באתרו (FISH), וטכניקות immunostaining. לסיכום, פרוטוקול חתך רקמות משופר זו הוא גם שימושי ומועיל לחוקרים בקהילות צמח.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
