Abstract
Opprettholde anlegget seksjon integritet er avgjørende for å studere detaljerte anatomiske strukturer på celle, vev, eller enda organ nivå. Men noen planteceller har stive cellevegger, tøffe fiber og krystaller (kalsiumoksalat, silika, etc.), og høyt vanninnhold som ofte forstyrrer vev integritet under plantevev snitting.
Denne studien etablerer en enkel Hybrid-Cut vev seksjonering metode. Denne protokollen modifiserer en parafinbasert seksjonering teknikk og forbedrer integriteten av vevssnitt fra forskjellige planter. Plantemateriale ble dyppet i parafin før seksjonering i en cryostat ved -16 ° C. Seksjonering ved lav temperatur forherdet parafinblokker, redusert rivende og skrape, og vev integritet vesentlig forbedret. Denne protokollen ble vellykket anvendt til kalsium oksalat-rik Phalaenopsis orkide vev samt gjenstridige vev som reproduksjons organs og blader av ris, mais og hvete. I tillegg kan den høye kvaliteten på vevssnitt fra hybrid-Cut anvendes i kombinasjon med in situ-hybridisering (ISH) for å tilveiebringe romlige uttrykk mønstre av gener av interesse. Som konklusjon, er denne protokollen spesielt nyttig for gjenstridige plantevev inneholdende høye krystall eller silikainnhold. God kvalitet vevssnitt aktiver morfologiske og andre biologiske studier.
Introduction
Parafinbasert seksjonering metoden er en utbredt teknikk for anatomiske studier. Bevaring av intakt vev anatomi er viktig for morfologiske og biologiske studier. Den parafin-embedded seksjonering teknikk er en fordel fordi parafin-embedding beholder celler og vev morfologi. I tillegg kan parafinblokker lagres hensiktsmessig i lange perioder av gangen. Imidlertid er parafin-innleiret snitte ikke egnet for plantemateriale som inneholder intracellulære krystaller. Krystaller i cellene ofte rive parafin bånd og vevsskade integritet under seksjonering.
I motsetning til parafin seksjonering, er cryosectioning relativt rask og deler kan skaffes uten fiksering, serie dehydrering eller innstøpningsmediet infiltrasjon en. Frysesnitt er kompatibel med mange programmer som immunhistokjemi, in-situ hybridisering, og enzymet histokjemi. Den andre fordelen av cryosectioning erat denne metoden ikke går gjennom en potensiell denaturering prosesser som høy temperatur og kjemiske behandlinger, er så cellulære molekyler godt bevart innenfor vev seksjoner 2. Cryosectioning er generelt foretrukket fremfor parafin-baserte seksjonering for studier i animalsk vev. Imidlertid er cryosectioning ikke det første valget i planter fordi kuldegrader noen ganger dannes iskrystaller som påvirker kvaliteten av § integritet. Selv om osmoregulering slik som sukrose oppløsninger, polyetylenglykol (PEG), eller glycerol-3 har blitt rapportert å redusere krystall is formasjon under frysebetingelser, er forbedringen mindre enn optimal.
For å tilpasse til forskjellige miljøer, forskjellige planter har ofte forskjellige vev tekstur og planteceller har utviklet seg til å danne stive cellevegger, harde fibre, og krystaller 4,5. For eksempel, uløselige kalsium oksalat krystaller og silika kropper er ganske vanlig iplanter 6. Silikat organer / krystaller har blitt rapportert å opprettholde anlegget arkitektur, erectness, og forebygge sykdom eller skadedyr i kornplanter 7-9.
Rote orkideer og cut-blomsten orkide markedet er blomstrende, og det er en voksende industri. Phalaenopsis Aphrodite (Orkide) er en av de viktigste eksportprydplanter i Taiwan. Betydelig innsats har blitt gjort for å forstå de morfologiske og fysiologiske endringer av blomstrende prosesser i Phalaenopsis orkideer. Blomster pigger av Phalaenopsis orkideer er initiert fra axillaris knopper på bladet basen. Etter en periode med kjølig romtemperatur (ca en og en halv måned), axillary knopper forstørre, bryte dvalen, og stikker fra bladet base for å utvikle seg til små blomster pigger. For å forstå de fysiologiske, cellulære og molekylære prosesser av pigg initiering, er det viktig å utvikle en robust anatomisk teknikk for å visuaLize vev eller markører på en riktig måte. Men tilstedeværelsen av allestedsnærværende krystaller i orkideer vev, særlig i aksillære knopper, gjør anatomisk arbeidet vanskelig.
Her forsøkte vi å forbedre seksjon integritet gjenstridige plantemateriale som har blitt hittil ansett som teknisk utfordrende. Her viser vi en forbedret protokoll kalt Hybrid-Cut. Det er en parafin-basert snitte metode som utføres ved hjelp av en kryostat. Parafin embedding løser høyt vanninnhold i plantevevet. Seksjonering ved lav temperatur stivner parafinblokken, reduserer krystall rive problem, og forbedrer vev integritet betydelig. Denne protokollen forbedrer vev integritet for gjenstridige planteprøver.
Protocol
1. Fiksering og Inkludering
- reagensklargjøring
- 10x Fosfat-buffered saltoppløsning (PBS)
- Legg 80 g NaCl, 2 g KCl, 14,4 g Na HPO 2 til 4, og 2,4 g KH 2PO 4 i 800 ml dobbeltdestillert vann (DDH 2 O) og justere pH til 7,4 med HCl. Legg DDH 2 O i et totalt volum på 1 liter, og deretter legge til 1000 mL dietylpyrokarbonat (DEPC) og ristes kraftig. Lagres PBS over natten ved romtemperatur og autoklav ved 121 ° C i 20 minutter ble følgende dagen.
- 1 x PBS
- Fortynn lager 10 x PBS ved forholdet 1:10 i DDH 2 O for å oppnå en sluttkonsentrasjon på 0,01 M Na HPO 2 til 4, 0,002 M KH 2PO 4, 0,003 M KCl, og 0,13 M NaCl.
- Paraformaldehyde (PFA) fiksativ
Forsiktig: Paraformaldehyde er giftig. Forbered det under en avtrekkshette. Bruk hansker.- For å forberede 250 ml PFA fiksativ, varme 100ml 1x PBS til 70-80 ° C og tilsett 1.750 mL NaOH. Deretter legger 10 g paraformaldehyde og bland godt til det er oppløst. Plasser løsningen på is, og deretter justere pH til 7,2 med H 2 SO 4 (260 - 270 ul av 100 ml) etter avkjøling.
- Juster volumet til 250 ml med 1 x PBS, tilsett 625 ul glutaraldehyd til en sluttkonsentrasjon på 0,25%. Tilsett 250 ul Triton X-100 og 250 mL Tween 20 for å lette inntrengning av fiksativ.
MERK: PFA-fikseringsmiddel kan lagres ved 4 ° C i en måned uten å miste sin evne til fiksering.
- Fremstille forskjellige konsentrasjoner av etanol (30%, 50%, 70%, 85% og 95%) med DEPC-behandlet vann.
- 10x Fosfat-buffered saltoppløsning (PBS)
- Plant prøvetaking
- axillaris knopper
- Bruk modne Phalaenopsis orkide planter på firkløver scenen. fjerne bladene forsiktig ved å rive bladet etter midrib bruker hendene.
- Bruk en skarp skalpell til carefully fjerne aksillære knopper fra bunnen av den tredje eller fjerde blad på monopodial stammen.
- Seed prøve
- Høste modne orkide frøkapslene på 4 måneder etter pollinering. Skjær frøkapslene på langs med en skalpell. Rist åpningen frø pod forsiktig og slipper de tørre frø på filterpapiret.
- Protocorm
- Sow modne orkideer frø på en 1/2 x Murashige og Skoog agar plate, og vokse i en vevskultur rom i en 12 timers lys periode og konstant temperatur på 25 ° C. Smak grønn protocorm 7 uker etter såing.
- Protocorm lignende organer (PLBs)
- Vokse orkideer PLBs på T2 regenerering av agarplater som tidligere beskrevet 10 og anbring under de samme vekstbetingelser som i trinn 1.2.3.1. Utlevering 10 PLBs ved en høyde på 5 - 8 mm.
- Leaf prøve
- Samle blad vev fra en moden Phalaenopsis orkide plante som beskrevet i trinn1.2.1.1.
- Bruk en skarp skalpell for å skjære et lite stykke av blad vev (7 mm lengde x 5 mm bredde) fra den andre nylig utviklede blad.
- root prøve
- Ved hjelp av den samme planten beskrevet i trinn 1.2.1.1, dissekere en cm lengde rotspissen vev ved hjelp av en skarp skalpell.
- Young pigg
- Bruk en skarp skalpell for å kutte små pigg vev fra spissen parti av blomsten stilken 10 cm i lengde.
- Flower knopp
- Vesenet en liten blomst knopp av 5 mm i diameter fra orkidé blomsten stilken. Skjær en del av blomsten knoppen vev lengderetningen (3 mm i tykkelse).
- Leaf vev og spikelet vev av korn avlinger
- Klipp 1 cm lengde bladet bladet vev fra de første nyutviklede blader fra ris, hvete og mais planter.
- Samle 10 spikelets fra planter (ris, hvete og mais) en dag før anthesis.
- axillaris knopper
- Fiksering
- Fix planteprøver umiddelbart ved å overføre dem til et scintillasjonsglass inneholdende 15 ml iskald PFA fiksativ.
- Påføre et vakuum (~ 720 mm Hg) for å planteprøver i et 4 ° C kaldt rom. Hold vakuum i 15 - 20 min (små bobler skal frigis fra prøvene). Gjenta dette trinnet til de fleste vev synke etter utgivelsen av vakuum. Hold vakuum over natten og løsne vakuum sakte neste dag.
- dehydrering
MERK: Bruk den samme flasken fra fiksering gjennom infiltrasjons trinn. Hell eller bruk en pipette til å renne av løsningen i forrige trinn, og erstatte med 15 ml av ny løsning i hetteglasset. Avhengig av strukturen av vev, behandle hardere vev slik som orkideer aksillær knopp, frø, protocorm, og PLB, og den spikelet av ris, hvete, mais og for en lengre tid; behandle mykere vev som orkidé blomsten knopp, ung pigg, blad og rot, og blad av ris, hvete og mais for en kortere tid.- Dehydrere prøver i 15 ml etanol serie ved romtemperatur som følger: 30% etanol i 30 min, 50% etanol i 30 min, 70% etanol i 1 time, 85% etanol i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev, 95% etanol i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev, og 100% etanol to ganger i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev.
MERK: Plant prøver kan lagres i 70% etanol ved 4 ° C i flere måneder.
- Dehydrere prøver i 15 ml etanol serie ved romtemperatur som følger: 30% etanol i 30 min, 50% etanol i 30 min, 70% etanol i 1 time, 85% etanol i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev, 95% etanol i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev, og 100% etanol to ganger i 54 min for hardere vev og 30 min for mykere vev.
- Infiltrere prøver med 15 ml etanol og xylen erstatning blandingen i 54 min hver for hardere vev og 30 min for mykere vev, ved romtemperatur som følger: etanol / xylen erstatning (2: 1, v / v) etanol / xylen erstatning (1 : 1, v / v) etanol / xylen erstatning (1: 2, v / v), og ren xylen substitutt to ganger. Forsiktig: Xylen er giftig. Gjør dette trinnet i avtrekksskap. Infiltrere prøven i flasken med 15 ml xylen erstatning og parafin blanding i en ovn ved 60 ° C over natten for hardere vev, og i 60 min for mykere vev som følger: xylen erstatning / parafin (2: 1, v / v), xylen erstatning / paraffin (1: 1, v / v), og xylen erstatning / paraffin (1: 2, v / v).
- Infiltrere prøven med 15 ml ren parafin to ganger om dagen og inkuber ved 60 ° C i en ovn.
- Gjenta trinn 1.5.3 neste dag.
- Slå på strømmen av vevet embedding sentrum en time på forhånd for å smelte voksen i parafinbeholderen før innstøping vev i en parafinblokken.
- Varm opp metallformene (størrelsen av basis 3,3 cm lengde x 2 cm bredde) på oppvarming skuffen ved 62 ° C, og hell ca. 13 ml av smeltet voks i formen basen.
- Overfør en vevsprøve fra seksjon 1.5.4 i formen med varmet tang og innrette den i ønsket posisjon.
- Flytt moldpå den kjølige plate nøye, og la til voksen er stivnet.
2. Tissue Seksjonering
- Parafin seksjonering metode
- Foreta en voks base ved å plassere en kassett innebygging på toppen av en form (samme størrelse i den seksjon 1.6.2), fylles med smeltet voks og fjerne formen etter at voksen er størknet.
MERK: embedding kassett vil danne en voks base for å forankre prøven parafinblokken. - Trim parafinblokken i en egnet form og størrelse, og plassere noen voks stykker på en flat spatel. Varm voks brikker bruker en alkohol-brenner til voksen smelter og deretter plassere den smeltet voks på voks base i avsnitt 2.1.1 til å følge blokken. Klem den i mikrotom.
- Plasser et nytt blad på mikrotom, og justere vinkelen til 5 grader til rette snitte i mikrotom.
- Skjær prøven parafin blokk i tynne skiver (10 um), som beskrevet tidligere 11. </ Ol>
- Foreta en voks base ved å plassere en kassett innebygging på toppen av en form (samme størrelse i den seksjon 1.6.2), fylles med smeltet voks og fjerne formen etter at voksen er størknet.
- Hybrid-Cut seksjonering metode
- Trim prøven parafin blokk fra trinn 1.6.4 til en kolonne med en trapes flate på toppen til en passende størrelse bruker et barberblad.
- Legg litt Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OCT) til sentrum av kryostaten scenen. Fest parafin blokk til kryostaten trinnet og deretter raskt å orientere vevet blokken i den ønskede stilling.
- Overfør parafin blokk / scene til en cryostat kammer. Tillat oktober å stivne på hurtigfrys bar ved -42 ° C i 10 min. Ikke flytt på blokken under størkning av oktober (figur 2C).
- La cryostat adapter og kammertemperatur for å kjøle ned til -20 ° C og -16 ° henholdsvis C før du fester parafin blokk / scenen til cryostat adapter. § vev til 10 um i tykkelse.
- Plukk vevssnitt med pinsett. Float avsnittene om 800 mL DEPC-behandlet vann i en Poly - L - lysin coated sklie og overføre lysbilder på en varm plate ved 42 ° C.
- La delene å flate på DEPC-behandlet vann ved 42 ° C. Bruk filter papir for å renne av vannet fra kanten.
- Mount vev på lysbildet ved å plassere lysbildet på en 42 ° C varm plate over natten.
3. Tissue Farging
- Deparaffinization
- Samle lysbildene fra den varme platen og legg dem i en farging rack. Tilsett 150 ml xylen i en flekker krukke i avtrekkshette og senk stativet i xylen i 5 min.
- rehydrering
- Fremstille forskjellige konsentrasjoner av etanolløsninger (100%, 95%, 70%, 50% og 30%) i DEPC-behandlet vann og fylle 150 ml oppløsning i atskilte flekker krukker, respektivt.
- Rehydrere prøvene gjennom en serie med avtagende etanolkonsentrasjon, hvert trinn i 3 minutter ved romtemperatur. Overfør lysbildene i farge samle en krukke til en annen krukke som inneholder different etanolkonsentrasjoner: 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol og 30% etanol.
- Etter rehydrering, fordype prøvene i DDH 2 O for 3 min.
- hematoxylin farging
- Flekke vevsprøver ved å involvere vev lysbilder i hematoxylin løsning for 1,5 min.
- Skyll kort i DDH 2 O som inneholder 1 - 2 dråper 12 N saltsyre (HCl) i noen sekunder, og deretter vaske kort i DDH 2 O.
- dehydrering
- Dehydrere prøvene gjennom en serie av økende etanolkonsentrasjoner i 3 minutter ved værelsetemperatur: 30% etanol, 50% etanol, 70% etanol, 95% etanol og 100% etanol. Tøm prøvene med xylen i avtrekksskap i 5 min.
- monterings~~POS=TRUNC
- Drop hensiktsmessig 600 mL av xylen-baserte montering medium på lysbildet. Plasser forsiktig en dekkglass over prøven. Unngå luftbobler dannes for å få gode bilder.
- Tillat lysbildene lufttørke over natten. Observer prøven under et mikroskop neste dag.
Merk: Bildene ble tatt på 25X til 400X forstørrelse avhengig av størrelsen av prøver.
4. I Situ Hybridisering
- probe syntese
- Clone Phalaenopsis Afrodite Actin genet spesifikke koding sekvens bruke primere 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'og 5'AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3 "(for å få 242 bp PCR fragment) og CyclinB1, en gen bestemt kodende sekvens bruke primere 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3' og 5'- ATGAGCATGGCGCTAATACC-3 '(for å få 327 bp PCR-fragment) som beskrevet 12.
- Ligere de spesifikke kodende sekvenser i vektorer (f.eks pGEMT) i henhold til produsentens protokoll.
- Generer digoxigenin (DIG) merket fornuft og antisense sonder bruker SP6 / T7 DIG RNA merking kit i henhold til produsentens anvisningers.
- In situ hybridisering
- Kutt 2. og 3. armhulen bud vevssnitt (10 mm tykkelse) generert ved hjelp av hybrid-Cut-metoden, og montere skiver på belagt lysbilde.
- Deparaffinize vevssnitt i xylen (se 3.1.1), rehydratiseres i avtagende konsentrasjoner av etanol (se 3.2.2), og fordøye med 2 mg / ml proteinase K ved 37 ° C i 30 minutter.
- Utføre in situ hybridisering ifølge protokollen beskrevet tidligere 11,13 med noen modifikasjoner, dvs. med hybridisering temperatur for aktin som 59 ° C og 60 ° C i CyclinB1;. 1. Hybridiser lysbilde med 40 ng DIG-merket RNA-probe.
- Bruk nitro tetrazolium / 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (NBT / BCIP) løsning for å detektere hybridiseringssignaler som beskrevet 11.
Representative Results
Hybrid-Cut Forbedrer integritet vevsdelene
Forstå anatomi av reproduktive floral strukturen er viktig for å undersøke den underliggende mekanismen for blomst innvielse i orkideer. Men akkumulering av intracellulært kalsium oksalat krystaller i Phalaenopsis orkideer gjør slike studier en utfordrende oppgave. For å omgå problemene forbundet med å rive forårsaket av krystaller under snitteprosessen (figur 1), utviklet vi et system vi kalt Hybrid-Cut. Denne protokollen kombinerer tradisjonelle parafin innebygging og cryosection teknikker. Vi testet først Hybrid-Skjær i axillaris knopper av Phalaenopsis orkide fordi de er beryktet for vev stivhet og høy krystall innhold. Axillary knopp vev ble fiksert i 4% PFA (se protokoll, trinn 1.3). Etter serie etanol dehydrering og parafinvoks jegnfiltration, aksillær bud ble innebygd i en parafin blokk. Blokken ble trimmet til en passende størrelse før seksjonering (figur 2A). En liten mengde oktober ble deretter påført på midten av kryostaten trinnet (figur 2B). Parafin blokken ble deretter fulgt til scenen via oktober Scenen ble inkubert i en kryostat i 10 minutter for å sikre fullstendig stivning av oktober før seksjonering (figur 2C) og deretter cryosection ble utført i en -16 ° C kammeret (figur 2D).
Til sammenligning ble en parafinblokk som inneholder en aksillær knopp av Phalaenopsis orkide utsatt for regelmessig mikrotom seksjonering. Som vist i figur 1A, ble kraftig oppriving av parafin bånd observert etter mikrotom snitting. Vevet integritet og cellestruktur ble også svekket (figur 1B). Hybrid-Cut, på den annen side,produsert intakt vevssnitt (figur 3A) med konserverte strukturelle integritet (figur 3B).
Bruk av Hybrid-Kutt til ulike vev P. Aphrodite
For ytterligere å teste amenability av Hybrid-Cut, testet vi ulike vev av Phalaenopsis orkideer. Det er ofte vanskelig å få tak i deler av frø med god integritet vev på grunn av det herdede strøk frø. Ved hjelp av denne protokollen, ble detaljerte strukturer av frø bevart etter seksjonering (Figur 4A). Som vist i figur 4A, protein organer, kunne de vanligste lagringsprodukter 14, være tydelig merket. Hybrid-Cut også jobbet med hell, og viste de detaljerte strukturer i shoot apikale meristem av én måned gammel protocorm (den spirende struktur fra et frø) (figur 4B) ogprotocorm-lignende-organer (PLBs, figur 4C). De intracellulære krystaller ble observert i deler av PLB. Phalaenopsis orkideer har tykke og saftige blader og de utfører CAM-fotosyntese (CAM) -type fotosyntese 15. Den tverrgående delen av bladet bladet viste store mesophyll celler og vaskulære bunter inneholder Margen og barken (figur 4D). Et par åpninger stomatal ble observert på abaxial bladet overflaten på dagtid (figur 4D). Faktisk CAM planter utviklet seg til å maksimere karbon gevinst, men samtidig minimere tap av vann ved å åpne sine stomates i natten under tørre forhold 15,16. Roten apikale meristem av P. Aphrodite er vist i figur 4E. Rotspissen cellene viste seg å inneholde et betydelig antall krystaller, som ble svært godt bevart etter seksjonering (figur 4E). Lengdesnitt av unge blomster pigger gitt information om arkitektur unge blomster primordials (Figur 4F). Videre begerblad, kronblad, labellum, og pollinia kunne klart identifisert fra lengdesnitt av unge blomsterknopper som har fullført differensiering i denne 5 mm blomst knopp (figur 4G). Legg merke til at krystallene ble akkumulert i begerbladene av unge blomsterknopper. Kort sagt, fungerer denne protokollen konsekvent å opprettholde vev integritet og produserer intakt morfologi muliggjør anatomiske og mulige cellulære studier.
Hybrid-Cut Bevarer Tissue Integritet i kornavlinger
Vi har også testet Hybrid-Cut på korn avlinger som ris, hvete og mais som inneholder høy silica innhold 17,18. Som vist i figur 5, ble vevet integriteten av tverrgående partier av ris, hvete og mais blader betydelig forbedret ved Hybro-Cut metode. Xylem, barken, mesophyll celler, stomates, og bulliform celler som styrer rullende av bladet bladet for å unngå vanntap ble klart identifisert fra deler av ris blader. Kranz anatomi, mesophyll celler, og vaskulære bunter av mais blad 19,20 ble klart identifisert. Det var spennende å finne en høy tetthet av stomates på både adaxial og abaxial sider av mais blader (figur 5). Forholdet mellom adaxial og abaxial stomata på 0,7 i mais er blitt rapportert tidligere 21. I tillegg har denne protokollen jobbet også med hell for å gi detaljerte cellen morfologi spikelets fra ris, hvete og mais (figur 6). Spikelets er kjent for å inneholde rikelig silika 9. Normalt som forårsaker vanskeligheter med å gjennomføre vev seksjonering.
In Situ Hybridisering
In-situ hybridisering (ISH) er utviklet for å lokalisere genuttrykksmønster på vevet nivå 11, 22-25. I tillegg kan ISH gi mobilnettet, og i noen tilfeller sub-cellulære, oppløsning av mRNA fordeling i flercellede organismer 26. Under ISH, RNA og vev integritet er viktig å få pålitelige romlig informasjon om det valgte karakterutskriften. Vi testet ISH hjelp av Hybrid-Cut protokollen Actin genet (PATC157348) ble klonet ved hjelp av primere 5'-GGCAGAGTATGATGAATCTGGTCC-3 'og 5'AGGACAGAAGTTCGGCTGGC -3' for å få 242 bp PCR fragment Cyclin B1:.. 1 (PATC146999) genet bestemt kodesekvensen bruker primere 5'-TCGTAGCAAGGTTGCTTGTG-3 'Og 5'ATGAGCATGGCGCTAATACC-3' for å få 327 bp PCR fragment. Etter ISH, Actin og Cyclin B1: 1 genekspresjon ble overvåket hos unge og modne axillaris knopper (Figur 7). Begge genene ble uttrykt i meristematic cellene i 2. og 3. aksillær knopper, med sterkere signaler oppdaget i 3 rd axillaris knopper. Resultatene viste at Hybrid-Cut beholde god anatomi og gi romlig genuttrykk mønster.
Figur 1: Tradisjonell Parafin Seksjon forårsaker alvorlig Rivning av Tissue En parafinblokken inneholder en aksillær knopp av Phalaenopsis orkide ble utsatt for regelmessig mikrotom seksjonering.. Ble observert Alvorlig rive av parafin bånd etter tradisjonell mikrotom seksjonering (A) (B). Pilene viser den alvorlige oppriving av vevet stykke. Arrowhead viser krystall organer. Scale bar 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2:. Hybrid-Cut Seksjonering Metode En armhulen knopp vev var fast i PFA og vev var dehydrert, infiltrert med parafinvoks, og innebygd i en parafin blokk. Parafin blokken ble trimmet til en passende størrelse (A). Optimal Cutting Temperatur forbindelse (OCT) ble påført på senteret av kryostaten trinn (B). Parafinblokk ble festet til oktober på kryostaten scenen. Under lav temperatur, parafinblokken ble overholdt kryostaten scenen via OCT (C). Vevssnitt ble seksjonert i kryostaten kammer ved -16 ° C (D). Skala barer representerer 0,5 cm (A), og 1 cm (BD). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Hybrid-Cut Forbedrer § Integrity En parafinblokken inneholder en aksillær knopp av Phalaenopsis orkide ble utsatt for Hybrid-Cut seksjonering (A) og Hybrid-Cut metode produsert seksjoner med utmerket vev integritet (B).. Pilspissen viser endogene krystall organer innebygd i armhulen knopp vev. Scale bar 100 mikrometer.rFå = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bruk av Hybrid-Kutt til ulike vevssnitt av Phalaenopsis orkide Different orkidé. Vevene ble seksjonert ved hjelp av hybrid-Cut-metode, for eksempel lengdesnitt av orkideer frø under den modne trinn (A), lengdesnitt av protocorm (B), lengdesnitt av protocorm lignende legemer (PLB) (C), tverrsnitt av bladet bladet (D), lengdesnitt av rot (E), lengdesnitt av små blomster pigg (F), og lengdesnitt av små blomsterknopper (G). Vevssnitt ble farget av hematoxylin. SC, frø frakk; PB, protein legeme; M,meristem; MP, mor PLB; DP, datter PLB; Ad, adaxial blad overflaten; Ab, abaxial blad overflaten; St, stomata; MC, mesophyll celle; VB, vaskulær bunt; RC, rot cap; fb, blomst knopp; Se, sepal; Pe, petal; La, labellum; Po, pollinia; Ro, rostellum; Ca, callus. Pilspisser viser krystaller. Skala barer representerer 20 mikrometer (AE) og 200 mikrometer (FG). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5:. Hybrid-Cut Bevarer Leaf Tissue Integritet i flere kornavlinger Sammenligning av blad vev ved hjelp av den tradisjonelle parafin metoden (venstre panel) og Hybrid-Cut teknikk utviklet i denne studien (høyre panel). Bildene viser blad tverrgående deler av ris, hvete og mais. MC, mesophyll celle; Ph, barken; St, stomata; BC, bu lliform celle. Pilene viser rive av vev skive. Pilspisser viser silika organer. De blå stiplede sirklene viser Kranz anatomi i C4 mais. Scale barer 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Hybrid-Cut Bevarer Spikelet Tissue Integritet i flere kornavlinger Sammenligning av vev integritet spikelet seksjoner mellom tradisjonelle parafin og Hybrid-Cut metoder. Pilene viser rive av vev skive. Pilspisser indikerer silika organer. Skala barer 20 mikrometer (ris), og 200 mikrometer (hvete og mais). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: In Situ Hybridisering av Actin og CyclinB1; 1 Expression Mønstre i Axillary Bud av Phalaenopsis orkide Tissue skiver av 2 nd axillaris knopper og 3. armhulen bud ble fremstilt ved bruk av Hybrid-Cut metoden.. I alt 40 ng av aktin og CyclinB1, en grave-merket probe ble anvendt for hybridisering. Den forstand probe ble anvendt som en negativ kontroll. Pilene viser reproduksjons meristem av aksillær knopp. Scale barer 100 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Planteceller har stive cellevegger, tøffe fiber, krystaller og høyt vanninnhold som forårsaker vev rivende problemer under plantevev snitting. Selv om parafin-baserte seksjonering er ofte brukt for plantevev, de endogene krystallene ofte rift i plantevevet under snitting (figur 1). På grunn av den iboende høye vanninnholdet i plantecellene, fører kryostat-baserte snitte ofte ødelagte celler og seksjoner sprakk vev.
I denne studien ble det en kombinert parafin-embedding og cryosection protokoll kalt Hybrid-Cut utviklet og god kvalitet vevssnitt ble oppnådd. Denne protokollen løser problemet forbundet med høyt vanninnhold ved å innføre parafin innebygging, og reduserer den rivende virkning ved herding parafinvoks ved lav temperatur under snitting (figur 3). Derfor er denne modifiserte protokollen fordelaktig i enten parafin-baserte seksjonning eller cryosectioning for å bevare anlegget vev integritet.
Dette manuskriptet viser at hybrid-Cut metoden bevarer vevet integritet i mange vev av Phalaenopsis orkide som aksillær knopp, frø, og PLB, etc. som inneholder høye nivåer av krystaller (Tall 3-4). Dessuten er denne protokollen mottakelig for kornavlinger slik som reproduktive organer og blader av ris, mais og hvete som inneholder høysilika (figurene 5-6). Antagelig kan denne protokollen brukes på treaktige planter som inneholder høy fiber.
Generelt er fikse vev grundig svært viktig for hybrid-Cut. Vi har funnet at formaldehyd-alkohol-eddiksyre (FAA) fikser er bedre enn PFA å bevare integriteten av vev noen gjenstridige vev som aksialt knopper, røtter, etc. Imidlertid, PFA fungerer bedre enn FAA for å bevare RNA integritet. Derfor PFA anbefales å fikseprøve for in situ hybridisering (ISH) arbeid. Protokollen er beskrevet her er beregnet for RNA ISH eksperiment. Derfor ble alle reagenser fremstilt for å unngå RNA-degradering ved å eliminere forurensning av RNase DEPC behandling. Hvis Hybrid-Cut delen er for anatomiske studier, vanlig omvendt osmose (RO) vann og dens avledede buffer eller reagenser er akseptabelt.
Reduserende prøvestørrelse og tykkelse til mindre enn 3 mm er nyttig for infiltrering. Videre øker nedsenkningstiden for dehydrering og infiltrasjon er nødvendige for hard tekstur vev. Begrensning av denne protokollen kan skyldes problemer forårsaket av utilstrekkelig fiksering, dehydrering, og infiltrasjon av prøven. Derfor, er justering av behandlingstiden for hvert trinn kritiske for å frembringe god kvalitet parafin blokken. Normalt trenger hardere vev lengre saksbehandlingstid enn mykere vev.
I tillegg viste vi at Hybrid-Cut jobbet med hell i kombinasjon with ISH for å gi romlig fordeling av de valgte transkripter (figur 7). I sammendrag, er denne protokollen nyttig for studier av anlegget anatomi og gir en vev-spesifikk RNA kart over de valgte gener. I tillegg kan den anvendes på andre molekylære studier slik som terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP Nick ende merking (TUNEL) assay, fluorescens in situ hybridisering (FISH), og immunfarging teknikker. Som konklusjon, er dette forbedret vev seksjonering protokoll både nyttig og nyttig for forskere i plantesamfunn.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Embedding Center model EC780-1 | CSA | ||
| Microtome model RM2255 | Leica | ||
| Cryostat model CM 1950 | Leica | ||
| Axio Scope A1 microscope | Zeiss | ||
| Murashige & Skoog medium including vitamins | Duchefa Biochemia | M0222.0050 | |
| RNase free surface decontaminant | Apex | 10-228 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Bio Basic Inc. | D801154 | |
| Sodium chloride (NaCl) | MDBio, Inc. | 101-7647-14-5 | |
| Potassium chloride, crystal (KCl) | J.T. Baker | 7447-40-7 | |
| Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | 7558-79-4 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 7778-77-0 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | 16005 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Showa | 19430160 | |
| Sulfuric acid (H2SO4) | Sigma-Aldrich | 7664-93-9 | |
| Glutaraldehyde solution | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| Polyoxyethylene 20 sorbitan monolaurate (Tween 20) | J.T. Baker | 9005-64-5 | |
| Octyl Phenol Ethoxylate (Triton X100) | J.T. Baker | 9002-93-1 | |
| Glass scintillation vials | Newastar | DG60805-00020 | |
| Desiccator vacuum | Violet Bioscience Inc. | TS-402030 | |
| Rotary vane pump RZ2.5 | Vacuubrand | 36149406 | |
| Ethanol | J.T. Baker | 64-17-5 | |
| Sub-X | Leica Surgipath | 3803670 | Xylene substitute |
| Paraplast Plus | Leica Surgipath | 39602004 | Tissue embedding paraffin |
| SUPERFROST micro slide glass | Matsunami | S7441 | |
| FSC 22 Clear | Leica Surgipath | 3801480 | Optimal Cutting Temperature compound (OCT) |
| Xylenes, Purified | Leica Surgipath | 3803665 | |
| Hematoxylin | Merck | HX305311 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 7647-01-0 | |
| Micromount | Leica Surgipath | 3801731 | Mounting medium |
| pGEM T-easy vector | Promega | A1360 | |
| Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
| SP6/T7 DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11175025910 | |
| NBT/BCIP stock solution | Roche | 11681451001 |
References
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. Cold Spring Harb Protoc. 3, 1-2 (2008).
- Knox, R. B. Freeze-sectioning of plant tissues. Stain Technol. 45, 265-272 (1970).
- Ruan, J. L., et al. An improved cryosection method for polyethylene glycol hydrogels used in tissue engineering. Tissue Eng.: Part C Methods. 19, 794-801 (2013).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J. Calcium oxalate crystals in monocotyledons: A review of their structure and systematics. Ann Bot. 84, 725-739 (1999).
- Prychid, C. J., Rudall, P. J., Gregory, M. Systematics and biology of silica bodies in monocotyledons. Bot. Rev. 69 (4), 377-440 (2004).
- Arnott, H. J., Pautard, F. G. E., Steinfink, H. Structure of calcium oxalate monohydrate. Nature. 208, 1197-1198 (1965).
- Mitani, N., Yamaji, N., Ma, J. F. Identification of maize silicon influx transporters. Plant Cell Physiol. 50, 5-12 (2009).
- Hayasaka, T., Fujii, H., Ishiguro, K. The role of silicon in preventing appressorial penetration by the rice blast fungus. Phytopathology. 98, 1038-1044 (2008).
- Ma, J. F., Yamaji, N. Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends Plant Sci. 11, 392-397 (2006).
- Chen, W., Tang, C., YL, K. Ploidy doubling by in vitro culture of excised protocorms or protocorm-like bodies in Phalaenopsis species. Plant Cell Tiss Org. 98, 229-239 (2009).
- Javelle, M., Marco, C. F., Timmermans, M. In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants. J. Vis. Exp. (57), e3328 (2011).
- Park, D. J. E. PCR Protocols. Methods in Molecular Biology. 687, (2011).
- Lin, H. Y., et al. Genome-wide annotation, expression profiling, and protein interaction studies of the core cell-cycle genes in Phalaenopsis aphrodite. Plant Mol Biol. 84, 203-226 (2014).
- Lee, Y. -I., Yeung, E. C., Lee, N., Chung, M. -C. Embryology of Phalaenopsis amabilis var. formosa: embryo development. Bot Stud. 49, 139-146 (2008).
- Endo, M., Ikusima, I. Diurnal rhythm and characteristics of photosynthesis and respiration in the leaf and root of a Phalaenopsis plant. Plant Cell Physiol. 30, 43-47 (1989).
- Guo, W. J., Lee, N. Effect of leaf and plant age, and day/night temperature on net CO2 uptake in Phalaenopsis amabilis var. formosa. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 131, 320-326 (2006).
- Lewin, J., Reimann, B. Silicon and plant growth. Ann. Rev. of Plant Physiol. 20, 289-304 (1969).
- Kaufman, P. B., et al. Silica in shoots of higher plants. Silicon and siliceous structures in biological systems. Simpson, T. L., Valcani, B. E. , Springer-Verlag. 409-449 (1981).
- Lundgren, M. R., Osborne, C. P., Christin, P. A. Deconstructing Kranz anatomy to understand C4 evolution. J Exp Bot. 65, 3357-3369 (2014).
- Liu, W. Y., et al. Anatomical and transcriptional dynamics of maize embryonic leaves during seed germination. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 3979-3984 (2013).
- Driscoll, S. P., Prins, A., Olmos, E., Kunert, K. J., Foyer, C. H. Specification of adaxial and abaxial stomata, epidermal structure and photosynthesis to CO2 enrichment in maize leaves. J Exp Bot. 57, 381-390 (2006).
- Karlgren, A., Carlsson, J., Gyllenstrand, N., Lagercrantz, U., Sundström, J. F. Non-radioactive in situ Hybridization Protocol Applicable for Norway Spruce and a Range of Plant Species. J. Vis. Exp. (26), (2009).
- Hejatko, J., et al. In situ hybridization technique for mRNA detection in whole mount Arabidopsis samples. Nat Protoc. 1, 1939-1946 (2006).
- Javelle, M., Timmermans, M. C. In situ localization of small RNAs in plants by using LNA probes. Nat Protoc. 7, 533-541 (2012).
- Drea, S., et al. In situ analysis of gene expression in plants. Methods Mol Biol. 513, 229-242 (2009).
- Drea, S., et al. A streamlined method for systematic, high resolution in situ analysis of mRNA distribution in plants. Plant Methods. 1, 8 (2005).
