Abstract
מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה רבת עוצמה ללימוד דיפוזיה של מולקולות בתוך ממברנות ביולוגיות עם רזולוציה גבוהה במרחב ובזמן. FCS יכול לכמת את מקדם ריכוז דיפוזיה מולקולרית של מולקולות שכותרתו fluorescently בקרום התא. טכניקה זו יש את היכולת לחקור את מאפייני דיפוזיה המולקולריים של מולקולות בקרום הפלזמה של תאים חיסוניים מצב יציב (כלומר, בלי תהליכים המשפיעים על התוצאה בזמן המדידה בפועל). FCS מתאים ללימוד דיפוזיה של חלבונים כי הם לידי ביטוי ברמות אופייניות חלבונים אנדוגניים ביותר. כאן, שיטה פשוטה וחזקה כדי לקבוע את קצב הדיפוזיה של חלבוני קרום על לימפוציטים עיקרי באה לידי ביטוי. דרך יעילה לבצע מדידות על תאי חיים מוכתם נוגדן נפוץ תצפיות שהתרחשו לאחר הרכישה מתוארת. הפיתוחים האחרוניםבפיתוח של צבעי ניאון צילום יציב יכול להיות מנוצל על ידי conjugating הנוגדנים של עניין לנכס צבעים שאינם להלבין בהרחבה במהלך המדידות. בנוסף, זה מאפשר זיהוי של גופים להתפוגג אט אט, אשר היא תכונה נפוצה של חלבונים הביע קרום התא. הליך הניתוח כדי לחלץ פרמטרי ריכוז דיפוזיה מולקולריים מן עקומות autocorrelation שנוצרו מודגש. לסיכום, פרוטוקול בסיסי למדידות FCS מסופק; ניתן בעקבותיו ידי אימונולוגים עם הבנה של מיקרוסקופיה confocal אך ללא ניסיון קודם אחרים של טכניקות למדידת פרמטרים דינמיים, כגון שיעורי דיפוזיה מולקולרית.
Introduction
פונקציות תאים חיסוניים רבות מסתמכות על דיפוזיה אינטראקציות מולקולריות בתוך ממברנות. ממברנות ביולוגיות הם מורכבים, וישנם גורמים רבים שעשויים להיות חשובים לתפקוד של תאי מערכת החיסון יכול להשפיע על מהירות של דיפוזיה translational של חלבונים בתוך קרומים תאיים 1. הראינו לאחרונה כי הרג טבעי (NK) תאים, לימפוציטים שייך למערכת החיסון המולדת, להפגין דיפוזיה הפרש של שני חלבונים למדו בבית קרום התא בהתאם למצב של תא NK הפעלה 2.
מתאם ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי (FCS) היא טכניקה כי הוא מסוגל לכימות שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות ביולוגיות. זה מדווח על קצב הדיפוזיה הממוצע של fluorescently שכותרתו מולקולות בנפח קבוע, בדרך כלל מוקד מיקרוסקופ confocal. היא מבוססת על מדידת תנודות קרינה המתרחשת על תנועה מולקולרית במערכת במצב עמיד. FCS כבר בשימוש נרחב ללימוד דיפוזיה של צבעי ניאון וחלבונים, הוא פתרון ובתוך ממברנות שומנים בדם. פרמטרי פלט נוספים המשפיעים על קצב הדיפוזיה יכולים להיות גם למדו בעקיפין בדרך זו (למשל, שינויים קונפורמציה של חלבונים או אינטראקציות של מולקולות על קרום תא) 3, 4. FCS בולטת לעומת טכניקות אחרות בשל הרגישות הגבוהה שלו, מה שמאפשר את האפשרות לגילוי מולקולה בודדת. זה עובד גם עבור ריכוזים מולקולריים nanomolar למגוון millimolar, אשר אופיינית עבור רמות ביטוי אנדוגני של רוב החלבונים 5. יתר על כן, FCS יכול לתת קירוב המספר המוחלט של חלבונים בתוך הנפח למד, בעוד רוב הטכניקות אחרות רק לתת מידע ביחס על רמות ביטוי חלבון. שיטות אחרות כדי למדוד את שיעורי דיפוזיה מולקולרית בתוך ממברנות כוללים fluoהתאוששות rescence לאחר photobleaching (FRAP), חלקיק בודד מעקב (SPT), FCS חריר המרובה, ושיטות התמונה קורלציה. FRAP ושיטות תמונת מתאם טכניקות הרכב, אשר בדרך כלל לא מספקות מידע על מספרם המוחלט של מולקולות 10. לעומת SPT, התפוקה של FCS היא גבוהה ביחס המאפיין את הממוצע באוכלוסייה. הניתוח הוא גם פחות תובעני מאז קצב הדיפוזיה הממוצע של המולקולות הנוכחות בתוך מוקד הליזר נמדד, ולא בשיעור של מולקולות בודדות. כמו כן, אלא אם כן מיקרוסקופים מיוחדים זמינים 11, SPT לא יכול לתת שום מידע על ריכוזי, מאז תיוג SPT תקן חייב להיות נמוך מאוד על מנת לאפשר זיהוי של מולקולות בודדות. מצד השני, FCS מחייב המולקולות הנחקרת להיות ניידות. זה פשוט לא מזהה כל שברים המשוערת נייחים או מולקולות נעו לאט יותר. שיעור דיפוזיה של מולקולותמתגוררים בתוך המוקד שאורכן עולה על עשירית מהזמן הרכישה לא להיות מיוצג כראוי במדידות FCS 3, 12. לכן, מקדמי דיפוזיה שרשמו FCS נוטים להיות מהיר יותר מאשר שיעורי דיפוזיה דיווחו מטכניקות כמו FRAP ו SPT, שבו קרוב ל-נייח איטית מאוד שברים נלקחים בחשבון גם כן. SPT גם ייתן תיאור מפורט יותר של ההשתנות של שיעורי דיפוזיה בתוך האוכלוסייה המולקולרית מ FCS יהיה.
FCS מכמת את התנודות של עוצמת קרינה לאורך זמן בתוך הנפח הנרגש. במקרה של מדידות קרום, זה מתרגם ל השטח המואר של הממברנה. במאמר זה, אנו מנצלים את העובדה כי תנודות כאלה הן המושרה על ידי מולקולות המפגינות דיפוזיה בראונית ובכך עוברות פנימה וחוצה של נפח העירור. ישנם גם מספר מקורות אפשריים אחרים עבור fluctuaהמשא ב האות הקרינה, כגון מהבהב או נוכחות של טריפלט ב fluorophores, השפעות סביבתיות, מחייב unbinding של ליגנד, או תנועה של קרום התא כולו. מקורות שגיאה המשוערים אלה צריכים להילקח בחשבון בעת תכנון ניסוי FCS כדי לפרש את התוצאות במדויק 12, 13. בדרך כלל, שיעורי דיפוזיה לרוחב ממברנות ביולוגיות נמוכים בשל צפיפות ואינטראקציות, הוא בין חלבונים בממברנה ובין חלבוני שלד התא. מבחינה הסטורית, השימוש FCS בממברנות ובכך כבר הקשה על ידי חוסר fluorophores צילום יציב, אשר נדרשים כדי למנוע הלבנה בזמני המעבר המורחבים דרך התמקדות עירור 14. עם זאת, היום, יש שפע של אפשרויות עבור צבעי צילום יציב מתאימים. שיפורים משמעותיים גלאי ורכיבי חומרה אחרת גם לאפשר זיהוי של prote הניאוןכל פרטי צבעים של בהירות נמוכה יותר. כאן, פרוטוקול בסיסי עבור היישום של FCS באמצעות לימפוציטים העיקרי בעכברים, שבו החלבון של עניין מסומן עם fluorescently מתויג נוגדן, מתואר. גישה כדי להתאים את עקומות autocorrelation כדי לחלץ את מקדם הדיפוזיה ואת הצפיפות המולקולרית מוצגת גם. הפרוטוקול שיתפשר עוקב אחריו בקלות על ידי אימונולוגים ללא ניסיון קודם של טכניקות ללמוד דיפוזיה של מולקולות. עם זאת, הבנה בסיסית של מיקרוסקופיה confocal צפויה (כדי לקבל הבנה בסיסית זו, ראה התייחסות 15). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם בקלות יחסית לתאי השעיה אחרים, הוא שורות תאי תאים ראשוניים. עבור משתמשים מנוסים יותר FCS, שיטות ניתוח מעודנות יותר להתקיים, שחלקם מתוארים הדיון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. מכתים עבור FCS
- לבודד תאי NK בעכברים מן לימפוציטים טחול באמצעות תיוג חרוז מגנטי, על פי הפרוטוקול של היצרן 16. השתמש 2-3 x 10 5 תאים לדגימה עבור השלבים הבאים.
הערה: השתמש סלקציה שלילית להעשיר את אוכלוסיית תא המטרה, והשאיר אותו ללא פגע, כך התא יכול להיות מתויג באמצעות נוגדנים ראשוניים בלבד. ראה התייחסות 2 לקבלת מידע מפורט יותר על בידוד תא מעכברים 2. - עבור תאים בעכברים המבטאים קולטנים Fc, לחסום את קולטני Fc עם 2.4G2 שיבוט נוגדן ב 5 מיקרוגרם / μl ב 25 μl של תמיסת מלח שנאגרו פוספט (PBS) ו -1% בסרום שור העובר (FBS) לדגימה. דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
- הכנת תערובת נוגדנים.
- נוגדנים השתמש מצומדות ישירות fluorophore צילום יציב. אם שני נוגדנים נגד שני חלבונים שונים2 משמש, fluorophores שימוש שיש ספקטרום פליטה מופרדת היטב כדי למזער את ההצטלבות (למשל, נרגש מן הלייזרים 488 ו 633, בהמשך הפרוטוקול המכונה לייזרים "ירוקים" ו- "אדומים" ו fluorophores, בהתאמה ).
הערה: אם נוגדנים המסחריים שכותרתו עם fluorophores צילום יציב אינם זמינים עבור הסמנים הביולוגיים שנבחרו, נוגדנים ללא תווית המצומד אל fluorophores פי הוראות היצרן. ראה חומרי שולחן הנוגדנים המשמשים במחקר זה. - הכינו תערובת נוגדנים על ידי דילול נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד החלבון או חלבונים בעלי עניין ב PBS + 1% FBS. מוסיפים את תערובת נוגדנים מדגם לנפח סופי של 50 μl לדגימה. דגירה על קרח למשך 45 דקות בחושך.
הערה: מטב את הריכוז של הנוגדנים מראש על מנת להבטיח כי הנוגדן משמש בריכוז להרוות, בדרך כלל1-10 מיקרוגרם / מ"ל.
- נוגדנים השתמש מצומדות ישירות fluorophore צילום יציב. אם שני נוגדנים נגד שני חלבונים שונים2 משמש, fluorophores שימוש שיש ספקטרום פליטה מופרדת היטב כדי למזער את ההצטלבות (למשל, נרגש מן הלייזרים 488 ו 633, בהמשך הפרוטוקול המכונה לייזרים "ירוקים" ו- "אדומים" ו fluorophores, בהתאמה ).
- לאחר דגירה, לשטוף את התאים על ידי הוספת 250 μl של PBS ו צנטריפוגות אותם ב XG 150 במשך 3 דקות. בטל supernatant.
- חזור על שלב 1.4.
- Resuspend התאים 200 μl של PBS + 1% FBS. שמור על הקרח בחושך עד הרכישה.
הערה: תאים Murine NK יכולים להישמר על הקרח עד 10 שעות.
2. הכנת שקופיות coverglass חדרים מיקרוסקופ
שקופיות coverglass החדרים השתמש או מנות עם עובי הזכוכית המכסה כי מיקרוסקופ כבר מותאם, או # 1 או # 1.5: הערה. אם המיקרוסקופ אינו מיושר עבור בעובי מסוים, או אם זה לא ידוע, טבעת מיקרוסקופ הצווארון צריכה להיות מותאמת עבור עובי coverglass הנוכחי 17.
- לדלל פולי- L- ליזין במים מזוקקים על יחס 1:10. הוסף 200 μl של בדילול פולי- L- ליזין לתאי דגירה במשך 20 דקות.
- הסר אתפולי- L- ליזין על ידי שאיפה ולתת אוויר יבש קאמרית מאת עוזב אותו ללא מכסה בטמפרטורת החדר למשך דקות 20-30 לפחות.
3. הפעלת מערכת FCS
הערה: פרוטוקול זה מתייחס למערכת מיקרוסקופ ספציפית ותוכנה (ראה חומרים / ריאגנטים טבלה), למרות setups מיקרוסקופיה אחר וחבילות תוכנה יכולים לשמש גם.
- הפעל את מיקרוסקופ סורק לייזר confocal עם קורלטור FCS. פתח את התוכנה "מצב מומחה". בחר את עדשת הטבילה במי 40X.
- בכרטיסייה "רוכש", לחץ על "Config" ו "סריקה" כפתורים כדי לפתוח את "בקרת התצורה" וחלונות "בקרת הסריקה" (חלונות A ו- B באיור 1, בהתאמה). בכרטיסייה "Confocor", לחץ על "מדוד" כדי לפתוח את החלון "מדידה" (חלון C באיור 1).
- צור את התיקייה שבה יישמר FCSמידות. התחל מאגר תמונה חדשה על ידי לחיצה על "חדש" תחת הלשונית "קובץ".
- שימוש בלחצן "לייזר", להדליק את מנורת הלוגן לייזרים רלוונטי עבור fluorophores מרגש (למשל, 488 ננומטר עבור עירור "ירוק" לייזר עירור 633 ננומטר עבור לייזר עירור "אדום").
- בחר מסנני עירור ופליטה מתאימים ולהפעיל את הגלאי המקביל.
- קביעת הגדרות עבור לכידת תמונה, כולל לייזר עירור, מסננים עירור ופליטה, נתיב האור, וגלאי לשמש, בחלון "בקרת תצורה".
- בדומה לכך, ציין את ההגדרות המתאימות עבור מדידות FCS בחלון "מדידה", תחת הלשונית "תצורת המערכת". השתמש כמו הגדרות דומות ככל האפשר עבור הדמיה FCS.
- הפעל את ערוצי גילוי להקלטות FCS על ידי סימון התיבה "CH1" עבור channe הירוקl ו "CH2" עבור הערוץ האדום בחלון "מדידה".
הערה: ההגדרות צריכות להיות מותאמות עבור fluorophore (הים) בשימוש, כמו בניסוי הדמית confocal סטנדרטי. בניסויים הבאים, אותן הגדרות FCS ניתן לעשות שימוש חוזר על ידי פתיחת קובץ FCS הישן, באמצעות תפריט "Confocor" הנפתח בחלק העליון של ממשק המשתמש, ובחירת "פתח קובץ". לחץ "שימוש חוזר" בחלון הרכישה המתעוררים. באופן דומה, הגדרות רכישת תמונה ניתן לטעון על ידי פתיחה נשמרה תמונה והלחיצה "שימוש חוזר".
- מתן עד הליזר יציב לפני ביצוע מדידות FCS. זה יכול לקחת עד 30 דקות עבור לייזרי גז, תוך לייזרים דיודה לייצב מהר. התאם את החריר בזמן ההמתנה.
4. התאמת חריר
- כן 0.2-0.5 מיקרומטר פתרונות של fluorophores או צבעי ניאון מתאים ספקטרום העירור ופליטה של התוויות על הנוגדנים. הבוודאי ידע fluorophores מקדם דיפוזיה 18, 19.
- שים טיפה 50 μl של פתרון עם fluorophore נרגש לייזר ירוק במרכז באר שקופית coverglass החדרים. שים טיפת מים מזוקקים על מטרת מי 40X ולמקם את השקופית. לחץ על כפתור ה "Vis" להתחיל אור הנראה ולהשתמש העינית למצוא ולהתמקד ירידת fluorophore.
הערה: משתמשת באותו שקופית כתמונה למדידות תא מאוחר יותר, מאז שינויים קלים המשוערת עובי זכוכית בין שקופיות יכולות להשפיע על יישור מיקרוסקופ. - מניחים את הפוקוס גם בתוך טיפת הנוזל (10-100 מיקרומטר מלמטה).
- בחלון "מדידה", בחר בכרטיסייה "רכישה". לחץ "מיקום נוכחי" תחת "פוזיציות" (חלון C באיור 1).
- חזור לכרטיסייה "תצורת המערכת" באותו חלון. הגדרת p גבוההower עבור לייזר ירוק.
הערה: כוח ליזר גבוה מתייחס הכח להרוות (כלומר, את אות הניאון אינה מעלה באופן ליניארי אם כוח הליזר הוא גדל עוד יותר). בסביבות 1 כוח הגדרות mW של המערכת, או 5-10% של כוח לייזר מקס, הוא בדרך כלל מספיק. - בדוק את יציבות האות על ידי לחיצה על "התחל". פעולה זו תפתח בחלון נפרד מוצגות עקבות הזמן העקום autocorrelation לשקילה הנוכחית. בדוק כי אות הניאון היא גבוהה ויציבה לאורך זמן, ותנודות המציגות את kHz ולא בטווח הרץ.
- בחר בלחצן "O התאם" בחלון "מדידה". בדוק אם ערוץ זיהוי התקין (ch1 או CH2) נבחר. לחץ "AutoAdjust X." אם העקומה וכתוצאה מכך לא מראה לכל היותר ברורה או המרבי היא בקצה, יש לסמן את האפשרות "הגסה" ולחץ על "AutoAdjust X" שוב. כאשר המסך וכתוצאה מכך-בכיוון x הוא סיים, לעשות את saלי עבור Y על ידי לחיצה על "AutoAdjust י"
- בטלו את הבחירה "גס" חלופי בין התאמת X ו- Y על ידי לחיצה על "AutoAdjust" עד שיש הן מקסימום ברור והערכים אינם משתנים בין מדידות.
- אם תאים מסומנים עם שני fluorophores שונה, לעבור לחדר שבו פתרון fluorophore האדום נוסף. בחר כוח ליזר גבוה עבור הליזר האדום וחזור על שלבי 4.6-4.8 עבור ערוץ העירור וגילוי האדום.
הערה: אם X ו- Y ערכים לסטות בין הערוצים במערכות שבו רק חריר אחד משמש הוא ערוצי הגילוי, בחר ערכי ביניים ולחץ על אישור כדי לקבל את השינויים. הנה, לייזר 488 ננומטר עם מקסימום ב X = 79 ו- Y = 189 ואת לייזר 633 ננומטר עם מקסימום ב X = 80 ו- Y = 188, ערכי X = 80 ו- Y = 189 נבחרו. השילוב של לייזרים 488 ננומטר 633 ננומטר עבור עירור של שני נוגדנים שכותרתו עם fluorophores נרגש 488 ננומטר או 633 ננומטר הוא בחירה טובה, מאזסיכון ההצטלבות ממוזער אם ספקטרום הפליטה לא חופף 2.
5. מדוד את Transit הזמן של חינם Fluorophore
הערה: על ידי קביעת זמן המעבר דרך ההתמקדות (TauD) של fluorophore עם מקדם דיפוזיה ידוע, את גודל נפח זיהוי, ולכן השטח של קרום התא כי הוא בתוך המוקד, ניתן לחשב. חישוב TauD המתואר בשלב 7.2.
- באמצעות הפתרונות אותו ששימש בהתאמת חריר, להגדיר את זמן הרכישה עד 30 שניות x 2 חזרות תחת הלשונית "רכישת" בחלון "מדידה" (איור 1, חלון C).
- התחל מדידה על ידי לחיצה על "התחל" בחלון "מדידה" (איור 1, חלון B).
- מבצעים סדרה כוח לייזר עבור כל לייזר עירור ואת fluorophore המקבילה פתרון, החל מ או לידלהרוות כוח ולהפחית בחצי לכל מדידה. שנה את כוח לייזר בלשונית "תצורת המערכת" של החלון "מדידה" (איור 1, חלון C). לחצו על כפתור "התחל" כדי להתחיל במדידה.
הערה: כלול את כוח לייזר עבור מדידות תא הקרובה בתחום הנמוך (למשל, למדוד ב 16, 8, 4, ו -2 μW כוח, לפני אובייקטיבי) 20. הגדרות ליזר מערכת הן בכלל גבוה עירור הפלט ויכולות להשתנות תלוי ברובו על המיקרוסקופ ואת איכות היישור. במערכת זו, בטווח הכח מעל התואמת כ 60-500 μW גדרות מערכת של הכח. מומלץ להשתמש במד כוח למדוד את תפוקת החשמל לפני המטרה לראשונה מיקרוסקופ חדש משמש. הכוח המקסימלי הנוכחי של הלייזר נמצא תחת הכפתור "מידע" של החלון "מדידה". - רשום את הספירה לכל שומהcule (CPM, יחיד: KHz) מכל מדידת כוח הליזר.
- אם שני ערוצי גילוי משמשים, לבדוק את החלון המציג את עקומת autocorrelation עבור הצטלבות. השתמש בתמיסה המכילה fluorophores הירוקה היחידה למדוד autocorrelation FCS מזוהה בערוץ זיהוי אדום פתרון עם fluorophores אדום רק להעריך זיהוי בערוץ זיהוי ירוק. ככלל אצבע, לשמור על CPM זוהה מן fluorophore "לא בסדר" מתחת ל -5% של אות המסוימת מן fluorophore הנכונה.
- בדוק שערכי ליניארי עם כוח לייזר המשמש. רוויה של CPM על כוח הליזר הגבוה ביותר (כלומר, ערכים נמוכים במקצת מהצפוי ממערכת יחסים ליניארי) מקובל.
הערה: CPM צריך להיות הרבה מעל 10 עבור כוח הליזר הגבוה ביותר עבור כמעט כל מערכות מיקרוסקופ fluorophores נפוץ ויכול להיות גבוהה משמעותי למערכות רגישות. בפעם הראשונה נוגדן פלורסנט מצומדות חדשה משמש, לבצעמדידת FCS של הנוגדן בחופשיות לשדר בתמיסה לכמת את CPM הצפוי. לפני המדידה, מעיל לתא המדידה עם 200 μl של L- ליזין פולי מורכבים עם פוליאתילן גליקול (מדולל ל 0.5 מ"ג / מ"ל PBS) במשך שעה 1 בטמפרטורת החדר. הסר את הנוזל עם pipet ולאפשר חדר אוויר יבש. שמור את פתרון המניות במקרר (עד 2 שבועות) ומניית האבקה במקפיא. על המיקרוסקופ, לדלל את הנוגדן 1-10 מיקרוגרם / מ"ל ב PBS. בצע את הפעולות 4.2-4.4 ו -6.7 בפרוטוקול זה. אם פני השטח הוא לא מצופים פתרון שאינו מקל, נוגדנים יהיו אינטראקציה עם משטח הזכוכית להיות מדולדלים במהירות מהפתרון.
- מבצעים סדרה כוח לייזר עבור כל לייזר עירור ואת fluorophore המקבילה פתרון, החל מ או לידלהרוות כוח ולהפחית בחצי לכל מדידה. שנה את כוח לייזר בלשונית "תצורת המערכת" של החלון "מדידה" (איור 1, חלון C). לחצו על כפתור "התחל" כדי להתחיל במדידה.
6. מדידות תא
- להוסיף 125 μl של תאים PBS + 1% FCS מן ההשעיה תא שכותרתו נוגדן (שלב 1.5) ו -150 μl של מדיום שקוף רוזוול פארק הזיכרון מכון 1640 (RPMI) לתוך אחד טוב של שקופית coverglass 8-גם מחולק לתאים. Leותעיף התאים בחושך בטמפרטורת מדידה במשך 20 דקות לפחות לפני תחילת מדידות FCS.
הערה: זו היא לאפשר לתאים להתיישב לצרף התחתון של הבארות וכדי לאזן את תאי פתרון לטמפרטורת המדידה. - בחלון "בקרת סריקה" (איור 1, חלון B), להגדיר זום 1 ולהתחיל סריקה XY מהיר על ידי לחיצה על כפתור "מהיר XY". שנה את כוח הליזר כך שזה נמוך ככל האפשר תוך התאים הם עדיין נראו בבירור. מרכז את התמונה על תא סבב בהירות ממוצעת, שבו הממברנה מוגדר בבירור ואין אות ניאון בציטופלסמה. התקרב עד התא מכסה את רוב התמונה.
- בחר תא חדש אם התא שהזרם נע או קנוקנות מציג, extrusions, או כתמים בהירים מאוד. שמור אותו זום כוח לייזר עבור כל התאים שנתפס במשך אותו ניסוי.
הערה: קרום פרע יכול גם להיות סימן של apo הקרובהפטוזיס. - דגש על החלק העליון של קרום התא. בלשונית "רכישה" של חלון "מדידה" (איור 1, חלון C), בחר מיקום עבור המדידה FCS באמצעות הפעלת "Crosshair." לחלופין, בחר את הכרטיסייה "תמונת LSM", לסמן את המקום המדיד רצה בתמונת LSM, ולחץ על "הוסף עמדה."
הערה: החלק העליון של קרום התא לא להיות מושפע נוגדנים ניאון או fluorophores unspecifically מאוגד-פולי- L- ליזין. עם זאת, חשוב לוודא כי התא לא זז במהלך המדידה (לראות את התוצאות). - בלשונית "רכישה" של חלון "מדידה" (איור 1, חלון C), לקבוע את מספר החזרות עד 6-10, עם "זמן מדוד" שקיעה ב- 10 שניות לעמוד חוזרים.
- חזור לכרטיסייה "תצורת המערכת" של החלון "מדידה". התאם את כוח לייזר למדידת FCS תחת "Lכפתור aser ". לפני המטרה, השתמש צריכת חשמל נמוכה למדידות התא, בטווח שבין 1 ל -10 μW 20.
הערה: הערכים המומלצים הם trade-off בין אות איתור נזקי לתאים. ראה הערת צעד 5.2.1 אחוז כוח ליזר ערכים אלה מתאימים. - התחל מדידת FCS ידי לחיצה על "התחל" (C החלון) "המדידה" החלון. אם מלבין התא משמעותי תחילת המדידה, כפי שזוהה על ידי ירידת העקבות העוצמת ידי יותר מ -30% במהלך 10 השניות הראשונות (דוגמא מוצגת באיור 3 א, פנל תחתון), לעבור לתא אחר ותחתון כוח לייזר למדידות בעתיד.
- אם האות לאיבוד, לשנות את הפוקוס של-בכיוון Z. לאחר המדידה היא מוחלטת, להשתמש בחלון "בקרת הסריקה" (איור 1, חלון B) כדי לבדוק את התא עדיין מרוכז וכי קרום התא נמדד. אם התא דואר עבר, לבטל את המדידה.
- בחלון האוטומטי המתאם שבו המדידה הוצג, בצע מחיקה ידנית חוזרים בודדים המכילים תמרוני התקרבות, לבנה, אשכולות גדולים, או ממצאים אחרים (ראה דוגמאות באיור 3). עושים זאת על ידי סימון אותם, לחיצה ימנית, ובחירת "מחק". שמור את הקובץ הסופי בפורמט .fcs. שמור לפחות ארבע חזרות לכל תא.
- לחלופין, לרכוש תמונה של התא על החלק האמצעי (עם ההיקף הכולל של קרום גלוי) באמצעות חלון "בקרת סריקה". ללכוד את התמונה לאחר מדידת FCS כדי למנוע הלבנה. לחץ על כפתור ה "היחיד" כדי להתחיל את לכידת התמונה.
- אם באמצעות "הוסף עמדה" עבור מיצוב מוקד FCS, לחץ על "סר עמדה" לפני שעברתי אל התא הבא.
- שנה על aliquot חדש של תרחיף תאים לאחר לכל היותר 2 שעות המדידה לשמור על התאים throughou קיימאt הניסוי.
7. ניתוח FCS
- פתח את קבצי .fcs בתוך תוכנה עם יכולת הולמת עקומה (ראה חומרים / ריאגנטים שולחן התוכנה בשימוש בפרוטוקול זה).
הערה: תוכנת FCS שמגיעה עם מיקרוסקופ היא מקום טוב כדי להתוודע הולם בסיסי, אבל תוכנה נוספת יש צורך להתאים דיפוזיה קרום דו ממדים. - ראשית, לקבוע את גודל נפח עירור על ידי ניתוח המדידות fluorophore בחינם. התאם עקום דיפוזיה חינם 3-ממדי אל עקומות autocorrelation 21.
(Eq. 1)
הערה: הגדרה של פרמטרים: N: אומרת מספר הגופים פלורסנט בהיקף המוקדים, τ (טאו): זמן קורלציה, τ D (TauD): זמן מגורים ממוצע בהיקף המוקדים, T 1: הסתברות עבור fluorophores להיות מדינת השלישייה, τ <sub> T: זמן הרפיה עבור מעברי סינגלט-שלישייה, S: יחס בין גובה לרוחב בקוטר עבור נפח המוקד.- חלץ TauD, את זמן המעבר של מולקולות להעביר את הפוקוס.
- השתמש מקדמי דיפוזיה TauD ופורסם ציין (D) של fluorophores המשמש לכיול 18, 19 כדי לחשב את רדיוס חריר (ω).
(Eq. 2)
- ניתוח של עקומות autocorrelation על קרום התא.
- כדי להמחיש את חלק מעקומת המייצג דיפוזיה מולקולרית, בחר מסגרת זמן החל לפני המדרון התלול של עקומת autocorrelation וכלה לאחר המפגשים להתעקם 1 (למשל, 0.001 ל 5 שניות עבור הקולטנים בעכברים, ראה איור 4).
- צור עקומת autocorrelation ממוצעת של חזרות הפרט הצילו in צעד 6.7.2.
- התאם עקום דיפוזיה קרום 2 ממדים לכל בממוצע עקומת autocorrelation באמצעות משוואת 3 3.
(Eq. 3)
הערה: פרמטרי פלט חשובים הן כדלקמן: N הוא המספר הממוצע של מולקולות המתגוררות בתוך אזור הקרום הנרגש. חישוב מחדש צפיפות (N / מיקרומטר 2). D τ (TauD): זמן מגורים ממוצע באזור המוקדים, מוגבל על ידי שני-הממדי של הקרום (ים). חישוב מחדש בזמן מגוריו ממוצעים מקדם דיפוזיה (מיקרומטר 2 / sec) באמצעות רדיוס החריר הנחוש (ω) ואת המשוואה 2. T1 הוא ההסתברות עבור fluorophores להיות טריפלט. הבהירות (CPM) מחושבת על ידי חלוקת העצמה הכוללת הממוצעת של המדידה על ידי נ - אם בכושר טוב אינו מושג בניסיון הראשון, לשנות את הערכים החל ו / או גבולות העליונים ותחתונים עבור המשתנים עד thiהים מושג.
הערה: גבולות עליונים תחתונים אופייניים עבור שיעורי דיפוזיה חלבון בקרומי תאים עיקריים הם 10-500 msec עבור TauD, 0-100% עבור T1, ו 0.1-5 msec עבור TauT1. בחר החל ערכים עבור הולם באמצע במרווחים אלה. החלק של עקומת המייצגים תנודות הקרינה נגזר דיפוזיה ממוקם בדרך כלל בין 1 msec ו 1 שניות (ראה איור 4). בהתאם fluorophore, לפעמים לא יכולה להיות מתנת תהליך שנייה, והוליד autocorrelation בסקלות זמן קצר יותר מאשר פרמטר דיפוזיה. זו נגרמת על ידי מדינה כהה חולפת (שלישייה) או מהבהב (לעתים קרובות להתרחש חלבוני ניאון). מדינת שלישיית מטופלת במשוואה 3, ואת המודל המוצג וכך צריך גם מצביע על התאמה טובה במצבים אלה.
(Eq. 1) 
(Eq. 2) 
(Eq. 3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תוצאה אופיינית יפיק עקומת autocorrelation עם זמן המעבר בטווח של 10 מילי-שניות ל -400 מילי-שניות עבור חלבונים בממברנה. מספר מולקולות יכול להשתנות בין 0.5 ל סביב 200 לכל מיקרומטר 2 עבור חלבונים הביע באופן אנדוגני. בדוק היטב כי CPM אינו נמוך מהצפוי. המשמעות יכולה להיות כי קיימת השפעה של אות הרקע. ככלל אצבע, האות CPM על תאים מקובל לניתוח לא צריך להיות נמוך מ -33% של ה- CPM עבור לשדר נוגדנים בחופשיות באותו כוח לייזר. ה- CPM צריך סולם ליניארי עם כוח לייזר. עקומת autocorrelation עבור קולטנים בתא שטח חיסון עיקריים צפויה להיות חלק, עם החלק התלול בין 0.001 ו 1 שניות. ראה איור 2 עבור עקומת autocorrelation נציג עקבות הזמן שלה.
כאמור בקצרה במבוא,מחדש כמה מקרים שבהם FCS אינו מתאים למדידת דיפוזיה מולקולרית עקב השפעת מקורות אחרים של תנודות הקרינה, אשר תורמים בלבול האות. איור 3 מציג דוגמאות של מקרים בהם חזרה התא או מדידה מסוים אמור להיות מושלך. זה כבר הוזכר כי אות נמוכה מאוד (CPM נמוך מאוד) היא הסיבה לזנוח את התא. סיבה נוספת השלכת התא היחיד היא שהתא נע (איור 3 א). במקרה של הלבנה (איור 3 ב) או אם אשכולות גדולים נמצאים (איור 3 ג), המדידות אמורות להיות מושלכות אם ההשפעה ניכרת או בהווה ברחבי המדידה כולה. אם תכונה זו קיימת רק חוזר אחד או שתיים, חוזרת בודד אלה עשויים להיות מושלכים, אבל החוזרים הנותרים רשאים עדיין לשמש.
חשוב גם להשתמש נכוןהמודל כדי להתאים את הנתונים וגם לבדוק בזהירות כי בכושר חופף הדוק עם עקומת autocorrelation. באיור 4, דוגמאות של מתאים עקום טוב ורעים מוצגות. שים לב לסגור את החלק של דיפוזיה המייצג העקום (החלק המשופע ביותר בתלילות). כמו כן, חשוב לוודא כי הן ההתחלה ואת הסוף של חלק המשופע של העקומה הם מצוידים היטב על ידי המודל. אם בכושר רע, בלי בעיות לכאורה כגון מרגשים, לבן, או אשכולות, לשנות את ערכי התחלה ו / או גבולות העליונים ותחתונים (בטווח סביר) לפני קבלת החלטה סופית כדי לבטל את התא.
איור 1: ממשק התוכנה FCS. המוצגים כאן הם החלונות העיקריים הדרושים כדי להפעיל את כלי תוכנה עבור רכישת FCS והדמיה, כמתואר בפרוטוקול. חלון, "עמית התצורהntrol "חלון הוא חלון בקרה נתיב קרן, ערוצי לייזר, ומתקנים לטיהור הדמיה. חלון B הוא" בקרת סריקה "חלון הדמיה ומראה את הגדרות הסריקה. חלון C הוא" חלון מדידה ", החלון עבור התקנה של הגדרות מדידת FCS. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: קורט autocorrelation נציג קימורי לשדר בכיתת histocompatibility הגדולה ד H-2D לי משטח מולקולות בתאי NK בעכברים מבודדים טרי. הפנל העליון של האיור מציג את תנודות קרינה כפונקציה של זמן לאורך כל עקבות הזמן של מדידות שניות 10 7x. הפנל התחתון מייצגזה עקום autocorrelation בממוצע משבע חזרות אלה. הגובה העקום autocorrelation עומד ביחס הפוך לריכוז של fluorescently הנייד שכותרתו H-2D ד ישויות בתוך נפח המוקד. שווי ציר x בחלק התלול של השיפוע העקום, המחצית משרעת, מייצג את זמן מגורים הממוצע של שכותרתו fluorescently H-2D מולקולות ד בתוך נפח המוקד. המדידה המוצגת הנה חלק של ערכת הנתונים שפורסמה בהתייחס 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: דוגמאות של עקבות תא בעייתיות. (א) תא נעים, כפי שהודגם העקבות שלא אורוות הבזליים le vel. הפנל העליון מראה דוגמא שבה התא כולו עבר מחוץ לפוקוס לאחר כ -35 שניות, כפי שהוא מיוצג על ידי האות נמוך מאוד לאחר נקודת זמן זו. בחלונית התחתונה, התוצאה היא יותר עדינה, עם גליות לכאורה בהפרש של כמה שניות. (ב) תא מוצג לבן, בעיצומה של העקבות יורדות עם זמן. השווה את גובה העקבות בתחילת המדידה כי בסוף המדידה. (ג) הנוכחות של אשכולות גדולים, המיוצגים על ידי ספייקים העקבות. בחלונית העליונה, מקבץ גדול אחד בכל 20-25 שניות הוא הווה. בחלונית התחתונה, כמה אשכולות נוכחים לאורך כל המדידה. המדידות המוצגות הן חלק של ערכת הנתונים שפורסמו בהתייחס 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
er.within-page = "1"> 
איור 4: עקומות autocorrelation נציג עם עקומה ראויה ולא שאריות. הקווים האנכיים האדומים וכחולים מייצגים את גבולות חלון הזמן משמש הולם. (א) דוגמא של התאמת נציג מודל דיפוזיה 2-ממדי עקום autocorrelation המדגם. בחלונית העליונה, עקומה ירוקה (המודל) שכבות עקומת הכחול (autocorrelation רכשה), מה שמעיד על התאמה טובה. הפנל התחתון מציג שארית מהעקומה ההולמת. התנודות סביב 1 שניות, אשר אינם מצוידות היטב, אופייניות למדידות תא הם נסבלים. דוגמא (B) של בהתקף רע של דיפוזיה 2 ממדים העקומים autocorrelation אותו. המודל המצויד לא מסתיר את עקומת autocorrelation, וזה לא להתכנס 1. הלוחות הנמוכים ב (A ו- B) מראה שארית מהעקומה ההולמת. השאריותהם גדולים משמעותיים בכושר הרע, במיוחד עבור חלק דיפוזיה של העקום. המדידה המוצגת הנה חלק של ערכת הנתונים שפורסמה בהתייחס 2. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה עבור FCS יכול לשמש להערכת דינאמיקה מולקולארית של מולקולות פני השטח על כל סוגי תאים חיסוניים (Murine, אדם, או מינים אחרים). אמצעי FCS במרחב ובזמן דינאמיקה מולקולארית עד רזולוצית מולקולה בודדת בתאים חיים. הצפיפות המולקולרית, וכן את דינמיקת קצב אשכולות דיפוזיה של החלבונים בעלי עניין, ניתן לחלץ מן עקומות autocorrelation.
תיוג פלורסנט הוא בעלת חשיבות מרכזית עבור ניסויי FCS מוצלחים. חלבונים של ריבית על קרום התא באופן מסורתי סומנו בתווית באמצעות נוגדנים, ונוגדנים הם בדרך כלל הכי נוחים לשימוש על חלבוני משטח בתאי מערכת חיסוניים נאיביים. נוגדנים ללא תווית חייבים להיות מצומדות ישירות צבעי ניאון תמונה יציבה עם בהירות מולקולרית גבוהה. הבחירה של fluorophore עבור נטיית נוגדן חשובה על איכות המדידות. תוויות תקן cytometry זרימה,כגון והעמסה וצבעים מבוסס Phycoerythrin, אינם מומלצים בשל הלבנה מהירה. תמונה יציבה צבעים עבור נטייה ישירה נוגדנים ניתנים כיום על ידי מספר חברות. היצרנים בדרך כלל מספקים פרוטוקולים משביעי רצון עבור נטייה וטיהור של נוגדן מצומדות וכתוצאה מכך, ואת זה ניתן לעשות זאת בתוך כמה שעות. כמו כן ניתן לבצע FCS באמצעות חלבוני ניאון, אך טיפול מיוחד יש לנקוט כדי לצמצם את כוח הליזר, מאז חלבוני ניאון הם בכלל יותר נוטים הלבנה מאשר fluorophores כימי הצילום יציב ביותר. על פי ניסיון קודם, ביטוי יתר של חלבונים לעתים קרובות מוביל לירידה ניכרת בקצב הדיפוזיה בשל הצפיפות, מה שהופך את השימוש חלבוני ניאון מתאים.
כיול חריר לפני המדידות הוא גם שלב קריטי. Fluorophores המשמש לקביעת גודל נפח המוקדים בוודאי ידע מקדם דיפוזיהs (ראה משוואה 2). השתמש fluorophores חינם מקביל הדוק ספקטרום הפליטה של תוויות נוגדן כדי לקבוע את גודל נפח המוקד. זה חייב להיעשות על מנת להבטיח את יעילות אות האופטימלית וזיהוי נכון של מתאמי צולבים הפוטנציאל בין ערוצי צבע. בצעו סדרת כוח לייזר FCS של fluorophores לשדר באופן חופשי על מנת להבטיח כי המערכת נותנת אות המוצא הצפוי על פני טווח של סמכויות. השווה את CPM באותו כוח לייזר בין ניסויים על מנת להבטיח עקביות בין הניסויים.
בשלב הניתוח, זה הכרחי כדי לשים בטווחים סבירים וערכים מוצאים המשתנה כאשר מתאים הדגמים. השתמש בידע שפורסם בעבר ממערכות תא דומים למצוא נקודת התחלה טובה. באופן תיאורטי, FCS היא טכניקה כמותית, אך מאז תנאים אופטימליים להתרחש לעיתים רחוקות, מידה מסוימת של זהירות יש לנקוט כאשר לפרש את התוצאות. כל סוגי תנודות שיירשמו,ללא קשר למקור של תנודות כאלה. לכן, כדאי שיהיה מידע רב ככל האפשר על המערכת הניסיונית כדי לכלול מקורות שגיאה אפשריים. לדוגמא, תנועה של קרום התא כולו תהיה להצמיח תנודות עם עוד TauD (איור 3 א), ואילו מזהמים משוערים של fluorophores החופשית הפתרון יהיו מפוזרים עם לפחות עשר פעמים קצרות TauD.
ניתן לשנות פרוטוקול בסיסי זה בכמה דרכים. אם שני חלבונים מסומנים עם fluorophores השונה, שיתוף דיפוזיה (אמצעי עקיף של אינטראקציה) ניתן להעריך באמצעות הרחבת המתודולוגיה לזהות את המתאמים הצולבים. המידה שבה חלבונים אלה נקשרים זה לזה בקרום התא מיוצג על ידי הגובה של היחסים העקומים חוצה קשר לגובה של עקומות autocorrelation של ערוצי צבע הבודדים. חוצה קשר מצוין כמו CH1-CH2 בתוכנת המדידה. הקדםניתוח בתרגיל של מתאמים צולבים דורש שולט על הצטלבות ולכן הוא קצת יותר מסובך מאשר הפרוטוקול המובא כאן. תיאור מפורט של איך להמשיך, כהרחבה הפרוטוקול הבסיסי הזה, ניתן למצוא ואח Strömqvist. 13. כדי לייעל את המיצוב של z-הכיוון, FCS סריקה-z יכול לשמש 22. על פי ניסיון קודם, זה כבר משביע רצון לעשות זאת באופן ידני. כמו כן ניתן להתאים מקדמי דיפוזיה מרובים עקום autocorrelation FCS 23. זה דורש ידע מוקדם של מספר תת-אוכלוסיות עם שיעורי דיפוזיה שונים של שיעורי דיפוזיה המשוער של לפחות אחד subpopulations. אחרת, לא יהיה יותר מדי משתנים חינם, אשר יעבד אמינים הולם. דוגמה טיפוסית יהיה חלבון משטח קצב הדיפוזיה אשר האטה ניכרת על ידי קשירה של ליגנד. לבסוף, cleaning העקבות של חריגים בלי חזרות הסרה לגמרי אפשרי 24.
העדר אות ניאון הוא בעיה נפוצה לפתור. עבור לשדר fluorophores בחופשיות, להשתמש מנורת הלוגן כדי לבדוק אם הירידה היא ניאון. אם הירידה היא לא פלורסנט, לערבב קבוצה חדשה של fluorophores עם ריכוז מוגבר מעט (בטווח ננומטר) ונסה שוב. בדקו כי ההתמקדות משתנית בתוך הטיפה פלורסנט, הלייזרים מופעלים בתוכנה, כוח הליזר מספיק, המסננים וגלאי הפליטה הנכונים נבחרים, ואת הערוצים ישירות בחלון "מדידת FCS" מופעלים (ראה שלב 3.6). הפעל את הלייזר ואת להסתכל מהצד חזותית לאשר כי אור לייזר מגיע המדגם. הימנע מישיר מבט אל המקור לייזר. אם מסנן פליטה שנבחרו מקיף את אורך גל לייזר, תריס אוטומטי יחסמו את נתיב האור כדי למנוע נזק הגלאי. אניf כל ההגדרות בסדר אבל אין אור מגיע, הפעל מחדש את הלייזרים, מערכת FCS, והמחשב. שאל את המומחה אם חוסר אות ניאון נמשכת. הליך פשוט חל אם התאים שכותרתו אינו מציגים קרינה. לאשר את קיומו של הקרינה עם מנורת הלוגן; להדליק את לייזרים, בחר את ערוצי לייזר, ולהתאים את כוח לייזר. בחר מיקום על קרום התא, בין אם באמצעות אפשרות "Crosshair" או "הוסף עמדה" (ראה שלב 6.4). Switch to המדגם הבא אם האות הוא עדיין נמוך מדי.
היבט חשוב אחד של בסיס התנודות של הטכניקה הוא כי מולקולות צריכות להיות נייד סביר כדי להתגלות. לאט לאט נע שברים של מולקולות או מולקולות הלכודות בתוך אזורים קטנים יותר מאשר להתמקד במהלך זמן המדידה כולו יכול ולכן לא ניתן למדוד. זה מוביל הערכה נמוכה מדי אפשרית של צפיפויות שטח יתר של קצב הדיפוזיה. הַלבָּנָהגם יכול לתרום הערכה נמוכה מדי משוערת של שתי הצפיפות TauD, מאז תהיינה למולקולות יש הסתברות גבוהה יותר להיות מולבן הזמן הארוך יותר הם מבלים בהיקף מוקדי מואר הליזר. שפעת מהרקע (קרינה מחוץ במישור המוקד) הייתה, מצד השני, באופן מלאכותי להגדיל את מספר מולקולות מאותרות להקטין את CPM נמדד. בעבר, השגיאה המקסימלי הכוללת בקביעת הצפיפות המוחלטת הייתה מוערכת כ 40% 20. עם זאת, זה בדרך כלל ניתן להשוות דגימות ביולוגיות שונות זו מזו, מאז מקורות השגיאה הם, ברוב המקרים, שווים לאורך כל הניסויים. מקור נוסף שגיאה הוא כי פוטנציאל נוגדנים הם דו ערכיים, כלומר כל נוגדן יכול להיקשר פוטנציאל לשתי מולקולות מטרה. המחברים לא להסתכל על תופעה זו, אבל זה לא יכול להיות מובטח כי זוהי תכונה עולמית נוגדנים אחרים. ההשפעה הפוטנציאלית של bivalence חייבולכן להיבדק בנפרד עבור כל נוגדן. השילוב של נוגדנים משני עיקריים ומסומנים ספציפיים לעולם אין להשתמש בשל הסיכון הגבוה של גרימת אשכול מלאכותיות משתי תוויות דו ערכיות רצופות. אם תאים במקום כבר transfected עם גרסאות חלבון שכותרתו ניאון של החלבון של עניין, כל חלבון תהיה רק תווית אחת. עם זאת, זה דורש transfection, וזה לא תמיד רצוי ולא יכול להיות אפילו אפשרי (למשל, אם באמצעות תאים חיסוניים מבודדים ישירות דם אדם). לבסוף, נקודה אחת FCS לא להקליט תמונות. אם תמונות נדרשות לפרסום או לכל מטרה אחרת, אלה חייבים להיות בשבי בנפרד באמצעות חלק ההדמיה של התוכנה. תמיד ללכוד תמונות לאחר מדידות FCS כדי למנוע הלבנה מיותרת של השטח פני התא.
בניגוד FCS, מיקרוסקופיה confocal המבוסס מסורתית, כגון FRAP, ומתודולוגיות קורלציה התמונה אינו יכול לכמת תנודות קרינהברמת המולקולה הבודדה 6. מתודולוגיות מתאם תמונה למדוד את מספר מולקולות בעקיפין ועם רזולוציה נמוכה יותר, אבל הם יכולים להעריך את ההשתנות של דיפוזיה מולקולריות אשכולות מעל אזור ההדמיה כולו 25. יש תקן SPT נמדד על ידי מיקרוסקופ confocal רמה אידיאלית של תיוג, סדרי גודל נמוך יותר FCS 7. לכן, הצפיפות של חלבונים שכותרתו לא ניתן למדוד על ידי תקן SPT. השילוב של SPT עם שיטות מיקרוסקופיה אחרות (למשל, מיקרוסקופיה אופטית שחזור סטוכסטיים או במיקרוסקופ לוקליזציה photoactivation) מאפשרת הצפיפות והתנועה תוערכנה, אבל זה דורש צבעים מאוד מיוחדים או חלבונים 11. טכניקות סופר-רזולוציה, כגון מיקרוסקופיה תאורה מובנה ועורר מדולדל פליטה מיקרוסקופיה, לעיתים קרובות דורשים דגימות קבועות שילוב של הראשוני נוגדנים משני עבור labelinז 26. לוקליזציה לכן זה מאוד מדויק, תוך הדינמיקה של המערכת לא יכולה להיות מוערכת לעתים קרובות. בהשוואה SPT וטכניקות ברזולוציה סופר, FCS גם דורש כוח המחשב פחות משמעותית וזמן לניתוח והפקת תוצאות. Cytometry זרימה היא סוס העבודה של אימונולוגיה ניתן לשלב לטובה עם FCS. מיון תא יכול, למשל, להיות ואחריו מדידות עוקבות על אוכלוסיות תאים נבחרים, אם צבעי צילום יציב נוצלו לפני המיון. FCS היא אפוא מתודולוגיה שניתן להשתמש בהם לבד או בשילוב עם שיטות מבוססות אחרות.
פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות תכונות לפי שעה לא ברור של דינמיקת תא חיסון ואינטראקציות בתוך קרום התא ברמת המולקולה הבודדה. יתר על כן, תכונות של אוכלוסיות שלמות לעומת תת שנבחר ניתן להשוות. כמו כן, יש תפקיד אפשרי כצעד בחירה עבור טיפול בתאי חיסון. מאז המדידות לעשותלא לצרוך את התא, בניגוד לרוב שיטות אחרות לבדיקת הפונקציונליות של תאי חיסון, תאים בודדים ניתן לשחזר פוטנציאל ותרבותי. לכן, לאחר הניתוח של עקומות FCS, תאים מבטיחים ניתן לחלץ והרחיבו עבור יישומים נוספים, כוללים יישומים קליניים משוערים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר Vladana Vukojeviç, מרכז לרפואה מולקולרית, קרולינסקה לשמירה על המכשיר Zeiss Confocor 3 ועבור עצות מועילות לגבי מדידות תא. מחקר זה מומן על ידי מענקים Vetenskapsrådet (מספר מענק 2012- 1629), מגנוס Bergvalls stiftelse, ומן Stiftelsen קלאס Groschinskys minnesfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
