Abstract
蛍光相関分光法（FCS）は、高い空間及び時間分解能で生体膜内の分子の拡散を研究するための強力な技術です。 FCSは、細胞膜に蛍光標識された分子の分子濃度及び拡散係数を定量化することができます。この技術は、（プロセスは実際の測定時に結果に影響を与えることなく、すなわち、）定常状態における免疫細胞の原形質膜中の分子の分子拡散特性を探索する能力を有します。 FCSは、ほとんどの内因性タンパク質のための典型的なレベルで発現されるタンパク質の拡散を研究するのに適しています。ここでは、一次リンパ球上の細胞膜タンパク質の拡散速度を決定するための簡単かつ堅牢な方法が示されています。抗体染色生細胞と買収後の一般的に存在する観測に測定を実行するための効果的な方法が記載されています。最近の進歩フォト安定した蛍光色素の開発に測定中に広範囲に漂白しない染料を適切なために目的の抗体を結合することにより利用することができます。また、これは、細胞膜に発現したタンパク質の共通の特徴である、ゆっくりと拡散するエンティティの検出を可能にします。生成された自己相関曲線から分子濃度と拡散パラメータを抽出するための分析手順が強調表示されます。要約すると、FCS測定のための基本的なプロトコルが提供されます。それは、共焦点顕微鏡の理解ではなく、このような分子の拡散速度などの動的パラメータを測定するための技術の無い他の以前の経験と免疫学者を続けることができます。
Introduction
多くの免疫細胞の機能は、分子拡散し、膜内の相互作用に依存しています。生体膜は複雑であり、免疫細胞の機能に重要であり得る多くの因子が細胞膜1内のタンパク質の並進拡散の速度に影響を与えることができます。我々は最近、自然免疫系に属するナチュラルキラー（NK）細胞、リンパ球、NK細胞活性化2の状態に応じて、細胞膜の2つの研究のタンパク質の差拡散を示すことが示されました。
蛍光相関分光法（FCS）は、生体膜内の分子の拡散速度を定量化することが可能な技術です。これは、固定されたボリューム内の蛍光標識された分子の平均拡散速度、共焦点顕微鏡の一般的に焦点を報告します。これは、中分子運動の際に発生する蛍光の変動の測定に基づいています定常状態でのシステム。 FCSは、溶液中及び脂質膜の中に両方の蛍光色素とタンパク質の拡散を研究するために広く使用されています。拡散速度に影響を与える他の出力パラメータは、また、間接的にこの方法で研究することができる（ 例えば、タンパク質または細胞膜上の分子の相互作用の立体構造変化）3、4。 FCSは、単一分子検出のための可能性を可能にする、その高い感度のために他の技術に比べて際立っています。これは、ほとんどのタンパク質5の内因性発現レベルに典型的なミリモルの範囲にナノモル、中の分子の濃度に適しています。他のほとんどの技術が唯一のタンパク質発現レベルについての相対的な情報を提供しながら、さらに、FCSは、研究ボリューム内のタンパク質の絶対数の近似値を与えることができます。膜内の分子拡散速度を測定する他の方法は、フルオが含まれます（FRAP）を光退色後のrescence回復、単一粒子追跡（SPT）は、複数のピンホールFCS、および画像相関方法。 FRAPと画像相関法は、一般の分子10の絶対数についての情報を与えていないアンサンブル技術です。 SPTと比較すると、FCSのスループットは、母集団の平均を特徴付けるの点で高くなっています。レーザー焦点内に存在する分子の平均拡散速度がなく、1つの分子の速度よりも、測定されているので分析も負担が小さいです。特殊な顕微鏡は11用意されていない限り、標準的なSPTの標識は、単一分子の同定を可能にするために非常に低くなければならないためにも、SPTは、濃度に関する情報を与えることはできません。一方、FCSは、研究中の分子がモバイルであることが必要です。それは単に非常にゆっくりと移動し、任意の推定される不動の分画または分子を検出しません。その分子の拡散速度取得時間の10分の1程度が正しくFCS測定3、12で表現されることはありませんよりも長い焦点内に存在します。したがって、FCSによって記録された拡散係数がto-不動-近く、非常に遅い画分も同様に考慮されFRAPとSPT、のような技術から報告拡散速度よりも速くなる傾向があります。 SPTはまた、FCSの意志よりも分子集団内での拡散速度の変動のより詳細な説明を行います。
FCSは興奮ボリューム内の経時的な蛍光強度の変動を定量化します。膜測定の場合には、これは、膜の照明領域に変換されます。本稿では、そのような変動はブラウン拡散を示す分子によって誘導されるため、および励起体積の外に移動しているという事実を利用しています。 fluctuaのためのいくつかの他の可能なソースもあります。このような結合バインド解除、全細胞膜のリガンド、または運動の、点滅またはフルオロフォア、環境への影響で三重項状態の存在のような蛍光シグナルのン、。これらの推定上の誤差源は、正確な結果12、13を解釈するためにFCS実験を設計する際に考慮される必要があります。一般的に、生体膜における横方向の拡散率は、膜タンパク質の間にタンパク質および細胞骨格間の両方、混雑との相互作用に起因する低いです。歴史的には、膜中のFCSを使用することは、従って、励起焦点14を貫通通過時間中に退色を避けるために必要な光安定性蛍光体の欠如によって妨げられてきました。しかし、今日、適切な光安定性染料のためのオプションがたくさんあります。検出器および他のハードウェアの大幅な改善はまた、蛍光proteの検出を可能にします低輝度のインおよび染料。ここでは、目的のタンパク質は、蛍光タグ化抗体で標識されたマウス初代リンパ球を用いたFCSの適用のための基本的な手順について説明します。拡散係数および分子密度を抽出するために自己相関曲線を適合させる手法も示されています。プロトコルは、簡単に分子の拡散を研究するための技術の以前の経験を持つ免疫学者が続くことを目指しています。しかし、共焦点顕微鏡の基本的な理解が期待されている（参照15を参照して 、この基本的な理解を得るために）。このプロトコルは、比較的容易に他の懸濁細胞、細胞株および初代細胞の両方に適合させることができます。より洗練された分析方法が存在し、より経験豊富なFCSユーザーの場合、そのうちのいくつかは、議論に記載されています。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
FCS 1.染色
- 製造業者のプロトコール16に従って、磁気ビーズ標識を用いて脾臓リンパ球からのマウスNK細胞を単離します。次の手順のためのサンプル当たり2-3×10 5個の細胞を使用してください。
注：細胞は、単独で一次抗体を用いて標識することができるように、そのままそれを残して、標的細胞集団を富化するために陰性選択を使用します。マウス2からの細胞の単離の詳細については、参考文献2を参照してください。 - Fc受容体を発現するマウス細胞の場合、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、サンプル当たり、1％ウシ胎児血清（FBS）25μlの中5μg/μlに抗体クローン2.4G2とFc受容体をブロックします。室温で15分間インキュベートします。
- 抗体混合物の調製。
- 直接光安定性蛍光団に結合した抗体を使用してください。もし2つの異なるタンパク質に対する二つの抗体使用され、それ以降のプロトコルで、488と633のレーザ2により励起されたクロストーク（ 例えば、最小化するために十分に分離発光スペクトルを有する使用のフルオロフォアは、それぞれ、「緑」と「赤」レーザーと蛍光団と呼ば）。
注：フォト安定蛍光体で標識市販の抗体が選択されたバイオマーカーのために利用できない場合は、フルオロフォアと共役非標識抗体は、製造元の指示に従って。本研究で用いた抗体のための材料表を参照してください。 - PBS + 1％FBS中で目的のタンパク質またはタンパク質に対する蛍光標識した抗体を希釈することにより、抗体混合物を準備します。サンプルあたり50μlの最終体積に各サンプルに抗体混合物を追加します。暗所で45分間氷上でインキュベートします。
注：典型的には、抗体は、飽和濃度で使用されることを保証するために、事前に抗体の濃度を最適化1-10 / mlの。
- 直接光安定性蛍光団に結合した抗体を使用してください。もし2つの異なるタンパク質に対する二つの抗体使用され、それ以降のプロトコルで、488と633のレーザ2により励起されたクロストーク（ 例えば、最小化するために十分に分離発光スペクトルを有する使用のフルオロフォアは、それぞれ、「緑」と「赤」レーザーと蛍光団と呼ば）。
- インキュベーション後、PBSを250μlを加えることによって細胞を洗浄し、3分間150×gで、それらを遠心。上清を捨てます。
- 繰り返し手順1.4。
- PBS + 1％FBS200μlの細胞を再懸濁します。買収まで氷上、暗所で保管してください。
注：マウスNK細胞は、最大10時間氷上に維持することができます。
顕微鏡チェンカバーガラススライドの調製
注：顕微鏡はのために最適化されていることをカバーガラスの厚さ、＃1または＃1.5のいずれかで使用するチャンバーカバーガラスのスライドや料理。顕微鏡は、特定の厚さのために整列されていない場合、それが不明な場合、あるいは、顕微鏡のカラーリングは、現在のカバーガラスの厚さ17のために最適化される必要があります。
- 1:10に蒸留水でポリ-L-リジンを希釈。室に希釈したポリ-L-リジンの200μLを加え、20分間インキュベートします。
- 削除します吸引によるポリ-L-リジンと少なくとも20〜30分間、室温で蓋なしでそれを残すことによって、チャンバの空気が乾燥してみましょう。
FCSシステムの起動3.
注：他の顕微鏡セットアップとソフトウェアパッケージを使用することもできるが、このプロトコルは、（ 材料/試薬の表を参照）、特定の顕微鏡システムとソフトウェアを指します。
- FCS相関器との共焦点レーザー走査顕微鏡をオンにします。 「エキスパートモード」でソフトウェアを開きます。 40X水浸レンズを選択します。
- 「取得」タブの下で、押して「構成」と「スキャン」ボタンが「構成管理」と「スキャン制御」ウィンドウ（ 図1におけるウインドウAとB、それぞれ）を開きます。 「Confocor」タブの下で、押して「測定」は「測定」ウィンドウ（ 図1におけるウィンドウC）を開きます。
- FCSを保存するフォルダを作成します。測定。 「ファイル」タブで「新規」をクリックして、新しい画像データベースを起動します。
- 「レーザー」ボタンを使用して、ハロゲンランプ、エキサイティングなフルオロフォアに関連するレーザーをオンにする（例えば、「赤」励起レーザのための「グリーン」励起レーザーと633 nmの励起用の488nm）。
- 適切な励起および発光フィルタを選択し、対応する検出器を作動させます。
- 励起レーザ、励起および発光フィルター、光路、および「構成管理」ウィンドウで、使用する検出器を含む、画像キャプチャの設定を指定します。
- 同様に、「システム設定」タブで、「測定」ウィンドウで、FCS測定のための対応する設定を指定します。イメージングとFCSのためにできるだけ同じ設定を使用します。
- 緑channeは、「Ch1の "チェックボックスをオンにして、FCSの記録のための検出チャネルを活性化リットルと「測定」ウィンドウ内の赤チャンネルのための「CH2」。
注：設定は、標準的な共焦点イメージング実験のように、使用する蛍光色素分子（複数可）のために最適化されるべきです。その後の実験では、同一のFCSの設定は、古いFCSファイルを開いて、ユーザインタフェースの上部にある「Confocor」プルダウンメニューを使用して、選択することによって再利用することができる「ファイルを開く」を新興取得窓で押して "再利用"。同様に、画像取得の設定が保存された画像を開いて押してロードすることができ、「再利用します。」
- レーザーは、FCS測定を行う前に安定するまで待ちます。ダイオードレーザーが速く安定しながら、ガスレーザーのために30分ほどかかる場合があります。待っている間にピンホールを調整します。
4.ピンホール調整
- 抗体上の標識の励起および発光スペクトルに対応するフルオロフォアまたは蛍光染料の0.2〜0.5μM溶液を調製します。ザフルオロフォアは、拡散係数18、19を知られている必要があります。
- チェンカバーガラススライドでウェルの中央に緑色のレーザーによって励起蛍光体で溶液50μl滴を入れてください。 40X水客観的に蒸留水の滴を入れ、スライドを配置。可視光を起動し、検索し、フォアドロップに焦点を当てて眼を使用する「可視」ボタンを押してください。
注：スライド間のガラスの厚さの推定上のわずかな変動は、顕微鏡の位置合わせに影響を与えることができるので、後でセル測定用と同じスライドを使用してください。 - 液滴（底10から100ミクロン）の内側にも焦点を置きます。
- 「測定」ウィンドウで、「取得」タブを選択します。押して「位置」の下の「現在位置」（ 図1におけるウィンドウC）。
- 同じウィンドウ内の「システム設定」タブに戻ります。高Pを設定します緑色レーザ用ower。
注：高いレーザパワー（レーザパワーをさらに増加させると、すなわち、蛍光シグナルが直線的に増加しない）飽和電力をいいます。 1 mWのシステムの設定電力、または最大レーザー出力5〜10％程度、一般的に十分です。 - 押して信号の安定性をテストする "スタート"。これは、電流測定のための時間トレースと自己相関曲線を表示する別のウィンドウを開きます。経時的に安定、蛍光シグナルが高いことを確認し、むしろHzの範囲よりもキロヘルツの変動を示します。
- 「測定」ウィンドウで「O調整」ボタンを選択します。右の検出チャンネル（CH1またはCh2の）が選択されているかどうかを確認してください。押して、「自動調整X.」結果の曲線は、明確な最大値を示していない、または最大のエッジである場合は、もう一度「粗い」オプションを押して、「自動調整X "をマーク。 x方向の表示された画面が終了すると、SAを行います「自動調整Y.」を押して、Y私
- 両方が明確な最大値を持っており、値が測定値との間で変化しなくなるまで「自動調整」を押して調整し、XとYの間の「粗い」と代替の選択を解除します。
- 細胞は、2つの異なるフルオロフォアで標識されている場合は、赤色蛍光体溶液が添加されたチャンバに移動します。赤色レーザーのための高いレーザーパワーを選択し、繰り返しが赤色励起および検出チャネルに対して4.6から4.8を繰り返します。
注：XとYの値は一つだけ、ピンホールが両方の検出チャンネルのために使用されているシステムにおけるチャネル間でずれている場合、中間値を選択して変更を承認し、[OK]を押します。ここで、X = 79とY = 189で最大値と488 nmのレーザー、X = 80とY = 188、値X = 80とY = 189で最大値と633 nmのレーザーのために選択しました。 488 nm以下633nmのによって励起蛍光体で標識2つの抗体の励起用の488nmと633nmのレーザーの組み合わせがあるため、良い選択です発光スペクトルは、2と重ならない場合に、クロストークの危険性が最小限に抑えられます。
5.無料フルオロフォアの通過時間を測定します
注：既知の拡散係数、検出ボリュームのサイズ、焦点内にある細胞膜の、したがって面積を有するフルオロフォアの焦点（TAUD）を介して通過時間を決定することによって、計算することができます。 TAUDの計算は、ステップ7.2に記載されています。
- ピンホール調整に使用したのと同じソリューションを使用して、「測定」ウィンドウ（ 図1、ウインドウC）に「取得」タブの下に30秒×2の繰り返しに取得時間を設定します。
- 「測定」ウィンドウ（図1、ウィンドウB）で「スタート」をクリックすることで、測定を開始します。
- 近くから始まる、各励起レーザと溶液中の対応するフルオロフォアのためのレーザパワーシリーズを実行するか、または電源を飽和し、各測定のために半分に減少します。 「測定」ウィンドウ（ 図1、ウインドウC）の「システム設定」タブで、レーザーパワーを変更します。測定を開始するには、「スタート」ボタンを押してください。
注：下の範囲で今後のセル測定用のレーザーパワーを含め20（ 例えば、目的の前に、16、8、4、および2μW電力で測定）。システムのレーザーの設定は、一般に、出力励起よりも高いと、顕微鏡と、アライメントの品質に応じて大きく変化することができます。このシステムでは、上記電力範囲は、約60から500μWシステム設定の電力に相当します。客観前に新しい顕微鏡が最初に使用された時に電力出力を測定するために、パワーメータを使用することをお勧めします。レーザーの現在の最大電力は、「測定」ウィンドウの「情報」ボタンの下にあります。 - モルあたりのカウントを書き留めcule：各レーザパワー測定から（CPM、単位kHzなど）。
- 2つの検出チャネルを使用する場合、クロストークに対する自己相関曲線を表示するウィンドウをチェックします。検出されたFCSの赤の検出チャネルでの自己相関と緑の検出チャネルでの検出を評価するための唯一の赤の蛍光色素分子を含む溶液を測定する唯一の緑色の蛍光団を含む溶液を使用してください。経験則として、適切な蛍光団からの特定の信号の5％以下に「誤った」フルオロフォアから検出されたCPMを保ちます。
- 値が使用されるレーザパワーで直線的に拡張することを確認してください。最高のレーザーパワーでCPMの飽和（すなわち、直線関係から予想されるよりもわずかに低い値）が許容可能です。
注：CPMがよく、ほとんどすべての顕微鏡システムと共通の蛍光団のための最高のレーザーパワーのために10を超えるべきであると敏感なシステムのために大幅に高くすることができます。新たにコンジュゲート蛍光抗体が使用されて初めて、実行します抗体のFCS測定が自由に期待CPMを定量化するために溶液中で拡散します。測定に先立って、被覆を室温で1時間（0.5 mgをPBS中/ mlに希釈した）ポリエチレングリコールでグラフトされたポリ-L-リジン200μlで測定室。ピペットで液体を除去し、空気乾燥さ室を許可します。 （2週間まで）冷蔵庫、冷凍庫内の粉末の株式に原液を保存します。顕微鏡では、PBS中1-10 / mlのに抗体を希釈します。フォローは、このプロトコルで4.2から4.4と6.7を繰り返します。表面が非粘着性溶液でコーティングされていない場合、抗体は、ガラス表面と相互作用し、急速に溶液から除去します。
- 近くから始まる、各励起レーザと溶液中の対応するフルオロフォアのためのレーザパワーシリーズを実行するか、または電源を飽和し、各測定のために半分に減少します。 「測定」ウィンドウ（ 図1、ウインドウC）の「システム設定」タブで、レーザーパワーを変更します。測定を開始するには、「スタート」ボタンを押してください。
6.セル測定
- 抗体標識細胞懸濁液（ステップ1.5）と8ウェルチャンバーカバーガラススライドの1ウェルに透明Roswell Park Memorial Institute培地1640（RPMI）を150μlからPBS + 1％FCS中の細胞の125μlのを追加します。レFCS測定を開始する前に、少なくとも20分間測定温度で暗所で細胞をaveの。
注：これは、細胞が沈降し、ウェルの底に付着し、測定温度に細胞およびソリューションを平衡化することを可能にすることです。 - 「スキャン制御」画面（ 図1、ウィンドウB）では、ズーム1を設定し、「高速XY」ボタンを押すことにより、高速XYスキャンを開始します。細胞はまだはっきりと見えている間、それは可能な限り低くなるようにレーザーパワーを変更します。膜が明確に定義された平均輝度の円形細胞、上の画像を中心と細胞質には蛍光シグナルはありません。セルは画像のほとんどをカバーするまでにズームイン。
- 現在のセルが移動したり、巻きひげ、押し出し、または非常に明るいスポットが表示されている場合、新しいセルを選択します。同じ実験中に取得し、すべてのセルに対して同じズームおよびレーザーパワーを保管してください。
注：フリル膜はまた、今後のアポの徴候である可能性があります眼瞼下垂。 - 細胞膜の上に焦点を当てます。 「測定」ウィンドウ（ 図1、ウインドウC）の「取得」タブでは、活性化することにより、FCS測定のための位置を選択し、「十字」をまた、LSMの画像に望んでいた測定点をマークし、「LSMイメージ」タブを選択し、Enterキーを押して「位置を追加します。」
注：細胞膜の上部には、非特異的にポリ-L-リジンに結合した蛍光抗体又は蛍光団によって影響されることはありません。しかし、セルが（結果を参照）測定中に移動しないことを確認することが重要です。 - 「測定」ウィンドウ（ 図1、ウインドウC）の「取得」タブでは、繰り返し当たり10秒に設定された「測定時間」で、6月10日にリピート回数を設定します。
- 「測定」ウィンドウの「システム設定」タブに戻ります。 「Lの下FCS測定用レーザパワーを調整しますボタン"ASER。客観前に、1〜10μW20の間の範囲内で、セル測定のための低消費電力を使用します。
注：推奨値は、細胞への信号検出と光損傷との間のトレードオフです。ステップ5.2.1は、これらの値はに対応したレーザパワーの割合を注意してくださいを参照してください。 - 「測定」ウィンドウ（ウィンドウC）で「スタート」を押すことで、FCS測定を開始します。測定の初めに有意に細胞漂白剤場合は、最初の10秒の間に30％以上の強度トレースの低下によって検出されるように（例を図3A、下部パネルに示されている）、別のセルに移動し、下将来の測定のためのレーザパワー。
- 信号が失われた場合、Z方向に焦点を合わせます。測定が完了した後、細胞はまだ中心にあること、および細胞膜を測定したことを確認するために「スキャン制御」画面（ 図1、ウィンドウB）を使用します。番目の場合Eセルは、測定を破棄し、移動しました。
- 測定が表示されている自己相関]ウィンドウで、手動ズームの操縦、漂白、大規模なクラスタ、またはその他の成果物を（ 図3の例を参照してください）が含まれている個々の繰り返しを削除します。 、それらをマーキング右クリックし、選択することによってこれを行い、「削除します。」 .fcs形式の最終的なファイルを保存します。細胞あたり少なくとも4つの反復を保存します。
- 必要に応じて、「スキャン制御」ウィンドウを使用して、（可視膜の全周との）中間部での細胞の画像を取得します。漂白を避けるために、FCS測定後の画像をキャプチャします。画像キャプチャを開始するには、「シングル」ボタンを押してください。
- FCSフォーカス位置決めのために」の位置を追加」を使用している場合、次のセルに移動する前に」の位置を削除」をクリックします。
- 細胞生存しthroughouを維持するために、測定の2時間の最大の後に細胞懸濁液の新たなアリコートに変更実験はt。
7. FCS解析
- （このプロトコルで使用されるソフトウェアのための材料/試薬の表を参照してください）カーブフィッティング機能を持つソフトウェアで.fcsファイルを開きます。
注：顕微鏡に付属しているFCSのソフトウェアは、基本的なフィッティングに慣れるには良い場所ですが、追加のソフトウェアは、2次元の膜拡散に適合することが必要です。 - まず、遊離蛍光団の測定値を分析することによって、励起ボリュームのサイズを決定します。自己相関曲線21から3次元自由拡散曲線をフィット。
（式1）
注：パラメータの定義：N：平均焦点体積内の蛍光エンティティの数、τ（タウ）：相関時間、τのD（TAUD）：焦点体積内の平均滞留時間、T 1：蛍光団のための確率はになるように三重項状態、τ<サブ> T：一重三重項状態遷移のための緩和時間、S：焦点ボリュームの幅直径に対する高さの比。- TAUD、フォーカスを転送する分子のための通過時間を抽出します。
- ピンホールの半径（ω）を計算するためにキャリブレーション18、19に使用される蛍光体のTAUD観察し、公開された拡散係数（D）を使用します。
（式2）
- 細胞膜上の自己相関曲線の分析。
- 分子拡散を表す曲線の一部を可視化するために、（マウス表面受容体のために例えば、0.001〜5秒; 図4を参照）1で自己相関曲線の最も急な勾配の前に始まり、曲線の収束後に終了する時間枠を選択します。
- 私を救った個々の繰り返しの平均自己相関曲線を生成n個のステップ6.7.2。
- 各2次元膜拡散曲線適合式（3）3を用いた自己相関曲線を平均しました。
（式3）
注：Nが励起膜面積内に存在する分子の平均数であり、次のように重要な出力パラメータです。密度（N /μmの2）に再計算します。 τのD（TAUD）：震源域における平均滞留時間、膜（複数可）の2次元性によって制限。決定されたピンホールの半径（ω）を介して拡散係数（μmの2 /秒）に平均滞留時間を再計算し、式（2）T1は、三重項状態になるように蛍光団の確率です。輝度（CPM）は、Nで測定の平均全体的な強度を割ることによって計算されます - 良好なフィットが最初の試みで達成されていない場合は、THIまで開始値および/または変数の上限と下限を変更しますsが達成されます。
注：一次細胞膜におけるタンパク質の拡散速度のための典型的な上下限界はTAUDのための10から500ミリ秒、T1のための0から100パーセント、およびTauT1用0.1-5ミリ秒です。これらの間隔の中央に嵌合するための開始値を選択します。典型的には1ミリ秒と1秒との間に配置される拡散に由来する蛍光変動を表す曲線の部分（ 図4参照します）。フルオロフォアに応じて、時には拡散パラメータより短い時間スケールでの自己相関を生じさせ、第2のプロセスが存在することができます。これは、（多くの場合、蛍光タンパク質のために発生するような）過渡暗状態（トリプレット）または点滅によって引き起こされます。三重項状態は、式（3）に計上され、提示されたモデルは、このようにもこのような状況で良いフィット感を提供する必要があります。
（式1） 
（式2） 
（式3） Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
典型的な結果は、膜タンパク質のための400ミリ秒に10ミリ秒の範囲内の通過時間との自己相関曲線を生成します。分子の数は、内因的に発現するタンパク質を約200μmの2あたりに0.5の間で変化することができます。 CPMが予想より低くないことを慎重に確認してください。これは、バックグラウンド信号の影響があることを意味します。経験則として、分析のために受理された細胞上のCPM信号が自由に同一のレーザパワーで抗体を拡散させるためのCPMの33％よりも低くするべきではありません。 CPMは、レーザパワーで直線的に拡張する必要があります。一次免疫細胞表面受容体に対する自己相関曲線は0.001と1秒との間の最も急な部分と、滑らかであることが期待されます。代表的な自己相関曲線とそのタイム・トレースについては、 図2を参照してください。
導入部で簡単に述べたように、再FCSが原因で信号を交絡するために貢献する蛍光変動の他の供給源の影響で分子拡散を測定するのに適していないいくつかの例です。 図3は、特定の細胞または測定の繰り返しを破棄すべき例の例を示しています。すでに非常に低い信号（非常に低いCPM）は、セルを廃棄するための原因であることが言及されています。個々のセルを廃棄するための別の理由は、セルが（ 図3A）に移動していることです。効果は測定全体を通してかなりまたは存在する場合に漂白の場合（ 図3B）、または大規模なクラスタが存在する場合（ 図3C）では、測定値は破棄されるべきです。この機能は、1つまたは2つの反復中にのみ存在する場合、これらの個々の反復は、廃棄することができるが、残りの反復はまだ使用されてもよいです。
両方が正しい使用することが重要ですデータに合わせて、また、フィット感が密接に自己相関曲線と重なっていることを慎重に確認するためのモデル。 図4では、良好な悪いカーブフィットの例が示されています。拡散を表す曲線（最も急傾斜部分）の部分には細心の注意を払ってください。開始と曲線の傾斜部分の両端は、モデルによってよくフィットしていることを確認することも重要です。フィットは、細胞を廃棄する最終決定を行う前に、開始値及び/又は（合理的な範囲内）に上限値と下限値を変更する、移動、漂白、又はクラスターのような明白な問題もなく、不良である場合。
図1：FCSソフトウェアインターフェイス。ここに示されているプロトコールに記載されているように、FCS取得および画像化のためのソフトウェアツールを動作させるために必要なメインウィンドウです。ウィンドウA、「構成のControl」ウィンドウには、イメージング用のビーム経路、レーザー・チャネル、およびフィルタのための制御ウィンドウです。ウィンドウBは「スキャン制御」スキャンの設定イメージング用のウィンドウと表示されます。ウィンドウCが「測定」ウィンドウのための窓FCSの測定設定のセットアップ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：H-2D D 主要組織適合性クラスを 拡散の代表的なトレースと自己相関曲線は、 私は新たに単離したマウスNK細胞内の分子表面。図の上のパネルは7倍10秒測定の全体時間トレース全体で時間の関数としての蛍光の変動を示しています。下のパネルは表しこれらの7つの反復からの平均自己相関曲線です。自己相関曲線の高さが焦点体積内の移動、蛍光標識されたH-2D dのエンティティの濃度に反比例します。 x軸曲線の傾きの最も急な部分の値が、振幅の半分は、焦点体積内の蛍光標識されたH-2D dの分子の平均滞留時間を表します。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 問題のあるセルのトレースの例 。トレースによって例示されるような（A）移動する細胞、安定した基礎ルを有していませんVEL。上部パネルは、この時点の後、非常に低い信号によって表されるような全細胞は、約35秒後焦点外に移動した例を示しています。下のパネルでは、効果は数秒の間隔で見かけのうねりで、より微妙です。 （B）細胞は、漂白、時間とともに減少するトレースの高さを表示します。測定終了時と、測定開始時のトレースの高さを比較してください。 （C）大規模なクラスタの存在、微量の急増によって表されます。上のパネルでは、20〜25秒で一つの大きなクラスタが存在しています。下のパネルでは、複数のクラスタは、測定全体に存在しています。提示測定は、参考文献2に公開されたデータセットの一部です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： カーブフィッティングと残差を持つ代表的自己相関曲線。赤と青の縦線は、フィッティングのために使用される時間ウィンドウの範囲を表します。試料の自己相関曲線の2次元拡散モデルの代表的な適合の（A）の例。上のパネルでは、緑の曲線（モデル）は、良好なフィット感を示し、青い曲線（取得自己相関）をオーバーレイします。下のパネルは、カーブフィッティングから残留を示しています。うまく装着されていない1秒の周りの変動は、セル測定のための典型的であり、許容されています。 （B）と同じ自己相関曲線に2次元拡散の悪いフィットの例。フィットされたモデルは、自己相関曲線をオーバーレイしません。また、（AとB）1.下のパネルで収束しないフィッティング曲線からの残留を示しました。残差特にカーブの拡散部のため、悪いフィット感を大幅に大きくなっています。提示された測定は、文献2に公開されたデータセットの一部です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FCSのためのこのプロトコルは、免疫細胞（マウス、ヒト、または他の種）のすべてのタイプの表面分子の分子動力学の評価のために使用することができます。生細胞における単一分子の解像度にダウンFCS対策時空間分子動力学を。分子密度、ならびに目的のタンパク質の拡散速度とクラスタリングのダイナミクスは、自己相関曲線から抽出することができます。
蛍光標識は、成功したFCS実験のために極めて重要な重要です。細胞膜上で目的のタンパク質は、従来の抗体を用いて標識され、抗体はしばしば、ナイーブ免疫細胞における表面タンパク質の使用のために最も便利です。非標識抗体は、直接、高分子明るさと光安定性の蛍光色素に結合させなければなりません。抗体結合のための蛍光体の選択は、測定の質のために重要です。フローサイトメトリーのための標準的なラベル例えばフルオレセインおよびフィコエリトリン系染料として、急速な漂白に推奨されていません。抗体に直接結合するフォト安定染料は、現在、いくつかの企業によって提供されています。製造業者は、通常、得られたコンジュゲート抗体のコンジュゲーション及び精製のために十分なプロトコルを提供し、これは数時間で行うことができます。蛍光タンパク質を使用してFCSを行うことも可能であるが、蛍光タンパク質は、ほとんどの光安定な化学フルオロフォアより漂白一般的傾向にあるので、特別な注意が、レーザーパワーを最小化するために取られるべきです。以前の経験によれば、過剰発現タンパク質の多くの場合、蛍光タンパク質の使用が適さないによる混雑の拡散速度のかなりの減少をもたらします。
測定の前にピンホールの校正も重要なステップです。焦点体積の大きさを決定するために使用されるフルオロフォアは、拡散係数を知っていなければなりませんS（式2を参照）。焦点体積の大きさを決定するために、抗体の標識の発光スペクトルに密接に対応する遊離フルオロフォアを使用してください。これは、最適な信号効率と色チャネル間の潜在的相互相関の適切な検出を保証するために行わなければなりません。システムは電力の範囲にわたって予想される出力信号を与えることを確実にするために自由に拡散する蛍光団のFCSレーザパワーシリーズを実行します。実験間の一貫性を確保するための実験の間に同じレーザパワーでCPMを比較。
分析工程では、モデルをフィッティングするときの変数のための合理的な範囲や初期値を置くことが不可欠です。良い出発点を見つけるために、同様の細胞系からの以前に発表された知識を使用してください。注意ある程度の結果を解釈する際に注意しなければならない、理論的には、FCSは、定量的な技術であるが、最適な条件はほとんど発生しないからです。変動のすべての種類が記録されます、かかわらず、このような変動の起源の。したがって、可能な誤差源を排除するために実験システムに関するできるだけ多くの情報を有することが有用です。溶液中の遊離蛍光体の推定上の汚染物質が少なくとも10倍短いTAUDに拡散するのに対し、例えば、全細胞膜の動きは、長いTAUD（ 図3A）との変動を生じさせます。
この基本的なプロトコルは、いくつかの方法で変更することができます。二つのタンパク質は、異なる蛍光体で標識されている場合、共拡散（相互作用の間接的な尺度）は、相互相関を検出する方法を拡張することによって評価することができます。これらのタンパク質は、細胞膜において互いに結合する程度は、個々のカラーチャネルの自己相関曲線の高さに対する相互相関曲線の高さで表されます。相互相関は、測定ソフトウェアでCH1〜Ch2のように表されます。プレ相互相関のcise分析は、クロストークのコントロールを必要とするので、やや複雑ここに提示プロトコルよりなります。この基本的なプロトコルの拡張として、続行する方法の詳細な説明は、Strömqvist らに見出すことができます。 13。 z方向の位置決めを最適化するために、z-スキャンFCS 22を使用することができます。これまでの経験によれば、手動でこれを行うには満足しています。 FCSの自己相関曲線23に複数の拡散係数を適合することも可能です。これは、異なる拡散速度を有すると亜集団の少なくとも一つのおおよその拡散速度の亜集団の数の事前知識を必要とします。それ以外の場合は、フィッティング信頼できないをレンダリングしますあまりにも多くの自由変数が存在するであろう。典型的な例は、その拡散速度はかなりリガンドの結合によって減速された表面タンパク質であろう。最後に、cleani完全反復配列を除去することなく、外れ値のトレースをngのは、24可能です。
蛍光シグナルの欠如は、トラブルシューティングするための共通の問題です。自由に蛍光団を拡散させるために、ドロップが蛍光性であるかどうかを確認するためにハロゲンランプを使用します。ドロップが蛍光でない場合、（nM範囲内で）わずかに増加濃度のフルオロフォアの新しいバッチをミックスして、再試行してください。フォーカスが蛍光ドロップ内にある、レーザはレーザパワーが十分であり、ソフトウェアでオンになっていることを確認し、（正しい発光フィルターと検出器が選択され、そして「FCS測定」ウィンドウで右チャンネルが活性化されるステップを参照してください3.6）。レーザーを起動し、視覚的にレーザ光がサンプルに到達したことを確認する側から見て。ストレートレーザ光源に探して避けてください。選択された放射フィルタは、レーザ波長を含む場合は、シャッターが自動的に検出器への損傷を避けるために、光路を遮断します。私Fすべての設定は大丈夫ですが、何の光が、到着していないレーザー、FCSシステム、およびコンピュータを再起動してください。蛍光シグナルの欠如が解消されない場合は、専門家に依頼してください。標識された細胞が蛍光を表示しない場合は簡略化の手順が適用されます。ハロゲンランプと蛍光の存在を確認してください。 、レーザーをオンにしたレーザチャンネルを選択して、レーザーパワーを調整します。いずれかの「十字」または「位置を追加」オプションを（ステップ6.4を参照）を使用して、細胞膜上の位置を選択します。信号は依然として低すぎる場合には、次のサンプルに切り替えます。
技術の変動基準の1つの重要な態様は、分子を検出することが合理的に移動しなければならないことです。非常にゆっくりと全体の測定時間中にフォーカスよりも小さな領域内に捕捉された分子または分子の画分を動かす従って測定することはできません。これは、表面密度の可能な過小評価と拡散率の過大評価をもたらします。漂白分子は、それらがレーザー照射焦点体積内で過ごす時間が漂白されているのより高い確率を持っていますので、また、密度とTAUD両方の推定上の過小評価に寄与することができます。背景（焦点面の外側からの蛍光）の影響は、一方で、人工的に検出された分子の数を増加させ、測定されたCPMを減少させるであろう。これまでは、絶対密度の決意で合計最大誤差は約40〜20％であると推定されました。誤差源は、ほとんどの場合、実験を通して等しいので、お互いに異なる生物学的サンプルを比較することが通常可能です。別の潜在的なエラー源は、抗体は、各抗体は、潜在的に2つの標的分子に結合することができることを意味し、二価であることです。著者らは、この現象を観察しなかったが、これは他の抗体のための世界的な機能があることを保証することはできません。二価の潜在的な影響なければなりませんしたがって、各抗体について個別に試験すること。特定の一次および標識二次抗体の組み合わせは、2つの連続した二価のラベルから人工クラスタを誘発する危険性が高いために使用してはなりません。細胞ではなく、目的のタンパク質の蛍光タンパク質で標識されたバージョンでトランスフェクトされた場合は、すべてのタンパク質は、1つのラベルだけを持つことになります。しかし、これは必ずしも望ましくないとさえ可能でないかもしれない、トランスフェクションを必要とする（ 例えば、直接にヒト血液から単離された免疫細胞を使用する場合）。最後に、シングルポイントFCSは、画像を記録しません。画像が公開または他の目的のために必要とされる場合、これらは、ソフトウェアの撮像部を用いて別々に捕捉されなければなりません。常に細胞表面の不要な漂白を避けるために、FCS測定後の画像を取り込みます。
FCSは異なり、例えば、FRAP、画像相関方法として、従来の共焦点系顕微鏡は、蛍光の変動を定量化することができません単一分子レベル6で。画像相関法が間接的に低い解像度を有する分子の数を測定するが、それらは全体の画像化された領域25の上に分子拡散およびクラスタリングのばらつきを評価することができます。共焦点顕微鏡により測定した標準SPTは、標識の理想的なレベル、FCS 7よりも低い桁違いを持っています。したがって、標識されたタンパク質の濃度は、標準的なSPTによって測定することができません。他の顕微鏡技術とSPTの組み合わせ（ 例えば、確率的光学再構築顕微鏡または光活性化局在顕微鏡）は、密度と動きを評価することができますが、それは非常に特殊な染料やタンパク質11が必要です。このような構造化照明顕微鏡などの超解像技術、および発光枯渇顕微鏡を刺激し、多くの場合、固定したサンプルとlabelinのための一次および二次抗体の組み合わせを必要としますグラム26。システムのダイナミクスが頻繁に評価することはできないが局在化は、したがって、非常に正確です。 SPTと超解像技術と比較すると、FCSはまた、結果の分析および抽出のために大幅に少ないコンピュータパワーと時間を要します。フローサイトメトリーは、免疫学の主力であり、良好FCSと組み合わせることができます。光安定性色素が選別前に使用された場合、細胞選別は、例えば、選択された細胞集団のその後の測定によって追跡することができます。 FCSは、このように、単独で、または他の確立された方法と組み合わせて使用することができる方法です。
このプロトコルは、単一分子レベルでの細胞膜内の免疫細胞の動態との相互作用の現在未知の機能を同定するために用いることができます。また、選択されたサブセット対全集団の特徴を比較することができます。それはまた、免疫細胞療法の選択ステップとして潜在的な役割を有しています。測定は行うので、電池を消費し、免疫細胞の機能を調べるための最も他の方法とは異なり、個々の細胞は、潜在的に回収して培養することができるではありません。したがって、FCS曲線の分析の後、有望な細胞を抽出することができると推定される臨床用途を含む付加的な用途に拡大しました。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
我々はツァイスConfocor 3機器のメンテナンスのため、およびセル測定に関する役立つヒント博士Vladanaブコエビッチ、分子医学センター、カロリンスカ研究所に感謝します。この研究はVetenskapsrådet（承認番号2012- 1629年）、マグナスBergvallsのstiftelseから、とStiftelsenクレスGroschinskysのminnesfondからの助成金によって賄われていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
