Abstract
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine leistungsstarke Technik zur Untersuchung der Diffusion von Molekülen in biologischen Membranen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung. FCS kann die molekulare Konzentration und Diffusionskoeffizienten von fluoreszenzmarkierten Molekülen in der Zellmembran zu quantifizieren. Diese Technik hat die Fähigkeit , die molekularen Diffusionseigenschaften von Molekülen in der Plasmamembran von Immunzellen im eingeschwungenen Zustand (dh ohne Prozesse beeinflussen das Ergebnis bei der tatsächlichen Messzeit) zu erforschen. FCS ist für die Diffusion von Proteinen zu studieren, die typisch für die meisten endogenen Proteinen in Konzentrationen exprimiert werden. Hier wird eine einfache und robuste Methode, um die Diffusionsgeschwindigkeit von Zellmembranproteinen auf primären Lymphozyten zu bestimmen, wird demonstriert. Ein effektiver Weg, Messungen an Antikörper gefärbten lebenden Zellen durchzuführen und häufig auftretende Beobachtungen nach dem Erwerb werden beschrieben. Die jüngsten Fortschrittebei der Entwicklung von photostabile Fluoreszenzfarbstoffe können durch Konjugieren der Antikörper von Interesse verwendet werden Farbstoffe geeignet, dass während der Messungen nicht extensiv bleichen. Zusätzlich erlaubt dies für die Detektion von langsam diffundierenden Einheiten, die ein gemeinsames Merkmal der Proteine in Zellmembranen exprimiert wird. Das Analyseverfahren Molekülkonzentration und Diffusionsparameter aus den erzeugten Autokorrelationskurven zu extrahieren, wird markiert. Zusammenfassend ist ein Basisprotokoll für die FCS-Messungen vorgesehen sind; sie kann durch Immunologen mit einem Verständnis für die konfokale Mikroskopie, aber mit keiner anderen bisherigen Erfahrungen von Techniken zur Messung von dynamischen Parametern, wie Molekulardiffusionsraten folgen.
Introduction
Viele Immunzellen Funktionen basieren auf der molekularen Diffusion und Wechselwirkungen innerhalb Membranen. Biologische Membranen sind komplex und viele Faktoren, die für die Funktion von Immunzellen wichtig sein kann , um die Geschwindigkeit der Translationsdiffusion von Proteinen in Zellmembranen 1 beeinflussen kann. Wir haben kürzlich gezeigt , dass die natürliche Killer (NK) Zellen, gehören , Lymphozyten des angeborenen Immunsystems, weisen differentielle Diffusion von beiden untersuchten Proteine an der Zellmembran in Abhängigkeit von dem Zustand der NK - Zell - Aktivierung 2.
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) ist eine Technik, die zur Quantifizierung molekularen Diffusionsraten innerhalb biologischer Membranen fähig ist. Es zeigt die durchschnittliche Diffusionsrate von fluoreszenz Moleküle in einem festen Volumen markiert, üblicherweise im Mittelpunkt eines konfokalen Mikroskops. Es basiert auf der Messung der Schwankungen in der Fluoreszenz, die auf Molekularbewegung auftreten inein System im stationären Zustand. FCS wurde zur Untersuchung der Diffusion von fluoreszierenden Farbstoffen und Proteinen sowohl in Lösung als auch in Lipidmembranen verwendet. Andere Ausgabeparameter die Diffusionsgeschwindigkeit zu beeinflussen auch indirekt werden kann auf diese Weise (zB Konformationsänderungen von Proteinen oder Wechselwirkungen von Molekülen auf Zellmembranen) untersuchten 3, 4. FCS zeichnet sich im Vergleich zu anderen Verfahren aufgrund seiner hohen Empfindlichkeit, so dass die Möglichkeit zur Einzelmolekül-Detektion. Es funktioniert gut für die molekulare Konzentrationen im nanomolaren bis millimolaren Bereich, der für die endogene Expressionsniveaus der meisten Proteine 5 typisch ist. Weiterhin FCS kann eine Approximation der absolute Anzahl von Proteinen innerhalb des untersuchten Volumen geben, während die meisten anderen Techniken nur relative Informationen über die Proteinexpressionsniveaus ergeben. Andere Methoden molekularen Diffusionsraten zu messen, in Membranen Fluo umfassenzenz Erholung nach dem (FRAP), Einzelpartikelverfolgung (SPT), mehrere Pinhole FCS und Bildkorrelationsphotobleaching Methoden. FRAP und Bildkorrelationsverfahren sind ensemble Techniken, die im allgemeinen keine Informationen über die absolute Anzahl der Moleküle 10 geben. Im Vergleich zu SPT ist der Durchsatz von FCS höher in Bezug auf die Bevölkerungsdurchschnitt zu charakterisieren. Die Analyse ist auch weniger anspruchsvoll, da die durchschnittliche Diffusionsgeschwindigkeit der Moleküle innerhalb des Laserfokus wird gemessen, eher als die Geschwindigkeit der einzelnen Moleküle. Auch, es sei denn spezielle Mikroskope sind 11 verfügbar, SPT können keine Informationen über Konzentrationen geben, da Standard - SPT Kennzeichnung sehr gering sein muss für die Identifizierung von einzelnen Molekülen zu ermöglichen. Auf der anderen Seite erfordert FCS die Moleküle untersucht, mobil zu sein. Es wird einfach keine vermeintlichen immobile Fraktionen oder Moleküle sehr langsam bewegen erkennen. Die Diffusionsgeschwindigkeit von Molekülen, diebefinden sich innerhalb der Fokus mehr als etwa ein Zehntel der Akquisitionszeit 3, in FCS - Messungen werden 12 nicht korrekt dargestellt. Daher ist es durch FCS aufgezeichnet Diffusionskoeffizienten sind in der Regel schneller als die Diffusionsraten von Techniken wie FRAP und SPT berichtet werden, wo die Nähe zu unbeweglich und sehr langsam Fraktionen als auch berücksichtigt werden. SPT wird auch eine detailliertere Beschreibung der Variabilität von Diffusionsraten innerhalb der molekularen Population als FCS geben.
FCS quantifiziert die Schwankung der Fluoreszenzintensität über die Zeit innerhalb des angeregten Volumens. Im Falle von Membran Messungen bedeutet dies zu der beleuchteten Fläche der Membran. In diesem Papier nutzen wir die Tatsache, dass solche Schwankungen durch Moleküle aufweisen Brownsche Diffusion induziert werden und somit in und aus dem Anregungsvolumen bewegt. Es gibt auch mehrere andere mögliche Quellen für die schwankungentionen im Fluoreszenzsignal, wie Blinken oder Gegenwart eines Triplett-Zustand in der Fluorophore, Umweltauswirkungen, bindungs unbinding des Liganden, oder die Bewegung der gesamten Zellmembran. Diese vermeintliche Fehlerquellen müssen in Betracht gezogen werden , wenn ein FCS - Experiment , um die Gestaltung , um genau die Ergebnisse 12, 13 zu interpretieren. Typischerweise seitliche Diffusionsraten in biologischen Membranen sind gering durch Crowding und Interaktionen, sowohl zwischen den Membranproteinen und zwischen Proteinen und dem Zytoskelett. Historisch gesehen , wurde die Verwendung von FCS in Membranen somit durch das Fehlen von photostabilen Fluorophore behindert, die erforderlich sind , während der verlängerten Laufzeiten durch die Anregungsfokus 14 Bleichen zu vermeiden. Doch heute gibt es viele Möglichkeiten für geeignete photostabile Farbstoffe. Signifikante Verbesserungen in Detektoren und anderer Hardware ermöglicht auch die Detektion von fluoreszierenden ProteIns und Farbstoffe von geringer Helligkeit. Hierbei wird ein Basisprotokoll für die Anwendung von FCS murine primären Lymphozyten verwendet, wobei das Protein von Interesse mit einem fluoreszierend markierten Antikörper markiert ist, wird beschrieben. Ein Ansatz, um die Autokorrelationskurven, um zu passen den Diffusionskoeffizienten und die molekulare Dichte wird auch gezeigt, zu extrahieren. Das Protokoll zielt darauf ab, wird leicht gefolgt von Immunologen ohne vorherige Erfahrung von Techniken, um die Diffusion von Molekülen zu untersuchen. Es ist jedoch ein grundlegendes Verständnis für die konfokale Mikroskopie erwartet (um diese grundlegende Verständnis gewinnen, siehe Referenz 15). Dieses Protokoll kann relativ leicht auf andere Suspensionszellen adaptiert werden, die beide Zelllinien und Primärzellen. Für erfahrene Anwender FCS, verfeinerte Analysemethoden existieren, von denen einige in der Diskussion beschrieben werden.
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Protocol
1. Die Färbung für FCS
- Isolieren murinen NK - Zellen aus der Milz - Lymphozyten unter Verwendung von magnetischen Kügelchen Kennzeichnung, gemäß dem Protokoll des Herstellers 16. Verwenden Sie 2-3 x 10 5 Zellen pro Probe für die folgenden Schritte.
HINWEIS: negative Selektion Verwenden Sie die Zielzellpopulation zu bereichern, sie unberührt bleiben, so dass die Zellen allein mit primären Antikörpern markiert werden können. Siehe Referenz 2 für detailliertere Informationen über die Zellisolierung von Mäusen 2. - Für murine Zellen Fc-Rezeptoren exprimieren, blockieren die Fc-Rezeptoren mit dem Antikörper Klon 2.4G2 bei 5 ug / ul in 25 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und 1% fötales Rinderserum (FBS) pro Probe. Inkubieren für 15 min bei Raumtemperatur.
- Herstellung der Antikörpermischung.
- Verwenden Antikörper direkt mit einem Foto stabilen Fluorophor konjugiert. Wenn zwei Antikörper gegen zwei verschiedene ProteineVerwendung Fluorophore verwendet, die gut getrennten Emissionsspektren haben die Übersprechen zu minimieren (zB angeregt durch die 488 und 633 Laser 2, später im Protokoll bezeichnet als die "grünen" und "roten" Laser und Fluorophore bzw. ).
HINWEIS: Wenn eine kommerzielle markierte Antikörper mit photostabilen Fluorophore nicht für die ausgewählten Biomarkern zur Verfügung stehen, Konjugat unmarkierten Antikörper gegen die Fluorophore gemäß den Anweisungen des Herstellers. Siehe Werkstoff - Tabelle für die in dieser Studie verwendeten Antikörper. - Bereiten ein Antikörpergemisch von fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen das Protein oder Proteine von Interesse in PBS + 1% FBS verdünnt. Fügen Sie die Antikörpermischung an jeder Probe auf ein Endvolumen von 50 & mgr; l pro Probe. Inkubieren auf Eis für 45 min im Dunkeln.
HINWEIS: Optimieren der Konzentration der Antikörper im Voraus, um sicherzustellen, dass der Antikörper mit einer sättigenden Konzentration verwendet wird, typischerweise1-10 & mgr; g / ml.
- Verwenden Antikörper direkt mit einem Foto stabilen Fluorophor konjugiert. Wenn zwei Antikörper gegen zwei verschiedene ProteineVerwendung Fluorophore verwendet, die gut getrennten Emissionsspektren haben die Übersprechen zu minimieren (zB angeregt durch die 488 und 633 Laser 2, später im Protokoll bezeichnet als die "grünen" und "roten" Laser und Fluorophore bzw. ).
- Nach der Inkubation die Zellen werden durch 250 ul PBS Zugabe und sie bei 150 × g für 3 min zentrifugiert werden. Überstand verwerfen.
- Wiederholen Sie Schritt 1.4.
- Resuspendieren der Zellen in 200 & mgr; l PBS + 1% FBS. Halten Sie sich auf Eis und im Dunkeln, bis die Erfassung.
HINWEIS: Murine NK-Zellen können für bis zu 10 Stunden auf Eis gehalten werden.
2. Herstellung von Mikroskop-Objektträger Kammerdeckgläser
HINWEIS: Verwenden Sie chambered Abdeckglas Dias oder Gerichte mit der Deckglasdicke, dass das Mikroskop für optimiert wurde, entweder # 1 oder # 1.5. Wenn das Mikroskop nicht für eine bestimmte Dicke ausgerichtet ist, oder wenn es nicht bekannt ist, muss das Mikroskop Kragenring für die aktuelle Dicke Abdeckglas 17 optimiert werden.
- Verdünnte poly-L-Lysin mit destilliertem Wasser in einem Verhältnis von 1:10. Mit 200 & mgr; l verdünntes poly-L-Lysin in die Kammern und inkubiert für 20 min.
- Entferne dasdie Kammer der Luft trocknen poly-L-Lysin durch Aspiration und lassen, indem sie es ohne Deckel bei Raumtemperatur für mindestens 20-30 min verlassen.
3. Starten des FCS-System
Hinweis: Dieses Protokoll bezieht sich auf ein spezifisches Mikroskopsystem und Software (siehe Materialien / Reagenzien Table), obwohl auch andere Konfigurationen Mikroskopie und Software - Pakete verwendet werden können.
- Schalten Sie den konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit dem FCS-Korrelator. Öffnen Sie die Software im "Expertenmodus". Wählen Sie das 40-fache Wassertauchobjektiv.
- Unter dem Reiter, drücken Sie "Acquire" die "Config" und "Scan" Tasten , um die "Configuration Control" zu öffnen und die "Scan Control" Fenster (Fenster A und B in Abbildung 1, respectively). Im Rahmen der "Confocor" Registerkarte, drücken Sie "Messen" zu öffnen Sie die "Messung" Fenster (Fenster C in Abbildung 1).
- Erstellen Sie einen Ordner mit dem FCS zu speichernMessungen. Starten Sie eine neue Bilddatenbank von "Neu" unter der Registerkarte "Datei" klicken.
- Mit Hilfe der "Laser" Taste, schalten Sie die Halogenlampe und die entsprechenden Laser zur Anregung der Fluorophore (zum Beispiel 488 nm für die "grüne" Anregungslaser und 633 nm Anregung für die "roten" Anregungslaser).
- Wählen Sie geeignete Anregungs- und Emissionsfiltern und die entsprechenden Detektoren aktivieren.
- Geben Sie die Einstellungen für die Bilderfassung, einschließlich der Anregungslaser, Anregungs- und Emissionsfilter, Lichtpfad und Detektoren verwendet werden, in der "Configuration Control" -Fenster.
- In ähnlicher Weise geben Sie die entsprechenden Einstellungen für die FCS-Messungen in der "Messung" Fenster, unter dem "System Configuration" Tab. Verwenden Sie als ähnliche Einstellungen wie möglich für die Bildgebung und FCS.
- Aktivieren Sie die Detektionskanäle für FCS-Aufnahmen von den "Ch1" Feld für die grüne channe Überprüfungl und "Ch2" für den roten Kanal in der "Messung" Fenster.
HINWEIS: Die Einstellungen sollten für den Fluorophor (en) verwendet, wie in einem Standard-konfokalen Abbildungsexperiment optimiert werden. In nachfolgenden Experimenten können die gleichen FCS Einstellungen durch Öffnen eines alten FCS-Datei wieder verwendet werden, mit dem "Confocor" Pull-Down-Menü am oberen Rand der Benutzeroberfläche, und wählen Sie "Datei öffnen". Drücken Sie "Wiederverwendung" in der entstehenden Erfassungsfenster. In ähnlicher Weise können die Einstellungen der Bildaufnahme durch eine gespeicherte Bild zu öffnen und geladen werden Drücken von "Wiederverwendung".
- Warten Sie, bis der Laser vor der Durchführung FCS Messungen stabil ist. Dies kann bis zu 30 Minuten für Gaslaser nehmen, während Diodenlaser schneller stabilisieren. Stellen Sie die Pinhole während des Wartens.
4. Pinhole Anpassung
- Bereiten 0,2-0,5 uM Lösungen von Fluorophoren oder Fluoreszenzfarbstoffe in die Anregungs- und Emissionsspektren der Etiketten auf den Antikörpern entsprechen. DasFluorophore müssen Diffusionskoeffizienten 18 haben bekannt, 19.
- Setzen Sie einen 50 ul Tropfen der Lösung mit dem Fluorophor durch den grünen Laser in der Mitte eines gut in einem Kammerdeckgläser Dia erregt. Ein Tropfen destilliertes Wasser auf dem Wasser Ziel 40X und den Schlitten zu positionieren. Drücken Sie die "Vis" Taste sichtbares Licht zu starten und verwenden Sie das Okular zu finden und konzentrieren sich auf die Fluorophore Tropfen.
HINWEIS: Verwenden Sie den gleichen Schlitten wie für die spätere Zellmessungen, da vermeintliche leichte Variationen in Glasdicke zwischen den Folien des Mikroskops Ausrichtung beeinflussen können. - Setzen Sie den Fokus auch im Inneren des Flüssigkeitstropfen (10-100 & mgr; m von unten).
- In der "Messung" Fenster wählen Sie den "Erwerb" aus. Drücken Sie auf "Aktuelle Position" unter den "Positionen" (Fenster C in Abbildung 1).
- Zurück zum "System Konfiguration" im gleichen Fenster. Stellen Sie einen hohen power für den grünen Laser.
HINWEIS: Eine hohe Laserleistung bezieht sich auf die Sättigungsleistung (dh das Fluoreszenzsignal nicht linear erhöht , wenn die Laserleistung weiter erhöht wird ). Etwa 1 mW von Systemeinstellungen Leistung, oder 5-10% der max Laserleistung ist in der Regel genug. - Testen Sie die Stabilität des Signals durch Drücken der Taste "Start". Es öffnet sich ein separates Fenster mit dem Zeitverlauf und Autokorrelation Kurve für die aktuelle Messung angezeigt wird. Überprüfen Sie, ob das Fluoreszenzsignal hoch ist, über die Zeit stabil ist, und zeigt Schwankungen im kHz statt Hz-Bereich.
- Wählen Sie den "O einstellen" in der "Messung" Fenster. Überprüfen Sie, ob die richtige Erfassungskanal (Ch1 oder Ch2) ausgewählt ist. Drücken Sie "AutoAdjust X." Wenn die resultierende Kurve nicht ein deutliches Maximum ergibt, ist oder die maximale am Rand ist, markieren Sie die "grob" und drücken "AutoAdjust X" wieder. Wenn der resultierende Bildschirm in der x-Richtung beendet ist, tun, um die samich für Y von "AutoAdjust Y." drücken
- De-select "grob" und wechseln zwischen Anpassung X und Y durch "AutoAdjust" drücken, bis beide klare Maxima haben und die Werte ändern sich nicht zwischen den Messungen.
- Wenn Zellen mit zwei unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, zu einer Kammer bewegen, wo roten Fluorophor-Lösung hinzugefügt wurde. Wählen Sie eine hohe Laserleistung für den roten Laser und wiederholen Sie die Schritte 4,6-4,8 für den roten Anregungs- und Detektionskanal.
HINWEIS: Wenn X und Y-Werte zwischen den Kanälen in Systemen abweichen, wo nur ein Pinhole für beide Detektionskanäle verwendet wird, Zwischenwerte auswählen und auf OK drücken, um die Änderungen zu übernehmen. Hier für den 488 nm-Laser mit Maxima bei X = 79 und Y = 189 und der 633-nm-Laser mit Maxima bei X = 80 und Y = 188, Werte X = 80 und Y = 189, wurden ausgewählt. Die Kombination der 488 nm und 633 nm-Laser zur Anregung der beiden mit Fluorophoren markierte Antikörper angeregt durch 488 nm oder 633 nm ist eine gute Wahl, da dieRisiko für Übersprechen, wenn die Emissionsspektren 2 nicht überlappen minimiert.
5. Messen Sie die Transitzeit der Freien Fluorophore
Hinweis: Durch die Durchgangszeit durch den Fokus (Taud) eines Fluorophors mit einem bekannten Diffusionskoeffizienten, die Größe des Detektionsvolumens zu bestimmen, und damit der Bereich der Zellmembran, die im Fokus ist, berechnet werden kann. Die Berechnung der Taud wird in Schritt 7.2 beschrieben.
- Mit den gleichen Lösungen für die Pinhole - Einstellung verwendet, stellen Sie die Erfassungszeit auf 30 Sekunden x 2 Wiederholungen unter der "Erwerb" Reiter in der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C).
- Starten Sie eine Messung durch einen Klick auf "Start" in der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster B).
- Durchführen einer Laserleistung Serie für jeden Anregungslaser und dem entsprechenden Fluorophors in der Lösung bei oder nahe Ausgangssättigende Kraft und für jede Messung um die Hälfte zu verringern. Ändern Sie die Laserleistung in der "Systemkonfiguration" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C). Drücken Sie die Schaltfläche "Start" eine Messung zu starten.
Hinweis: Geben Sie die Laserleistung für die kommenden Zellmessungen im unteren Bereich (zB Messung bei 16, 8, 4 und 2 & mgr; W Leistung, vor dem Objektiv) 20. System Lasereinstellungen sind im allgemeinen höher als die Ausgangs Anregungs- und variieren weitgehend in Abhängigkeit von dem Mikroskop und der Qualität der Ausrichtung. In diesem System entspricht die obige Leistungsbereich auf etwa 60-500 & mgr; W von Systemeinstellungen Macht. Es wird empfohlen, einen Leistungsmesser verwenden, um die Leistung vor dem Ziel zum ersten Mal ein neues Mikroskop verwendet wird, zu messen. Die aktuelle maximale Leistung des Lasers wird unter der Schaltfläche "Info" der "Messung" Fenster gefunden. - Schreiben Sie die Zählungen pro Mol nach untencule (CPM, Einheit: kHz) aus jeder Laserleistungsmessung.
- Wenn zwei Detektionskanäle verwendet werden, überprüfen Sie die Fenster, um die Autokorrelationskurve für Übersprechen anzeigt. Verwenden, um eine Lösung nur grüne Fluorophore enthält, die in dem roten Detektionskanal detektiert FCS Autokorrelation zu messen und eine Lösung mit nur rote Fluorophore Detektion im grünen Detektionskanal zu beurteilen. Als Faustregel gilt: Halten Sie die CPM von der "falschen" Fluorophor unter 5% des spezifischen Signals von der richtigen Fluorophors detektiert.
- Überprüfen Sie, ob die Werte verwendet, linear mit der Laserleistung zu skalieren. Sättigung von CPM bei der höchsten Laserleistung (dh etwas niedrigere Werte als die von einer linearen Beziehung erwartet) ist akzeptabel.
HINWEIS: CPM für die höchste Laserleistung gut sein für fast alle Mikroskopsysteme und gemeinsame Fluorophore und kann deutlich höher sein für empfindliche Systeme über 10 sollten. Das erste Mal, wenn ein neu konjugierte fluoreszierende Antikörper verwendet wird, führen Sie eineFCS-Messung des Antikörpers diffundieren frei in Lösung, um die erwarteten CPM zu quantifizieren. Vor der Messung coat die Meßkammer mit 200 & mgr; l Poly-L-Lysin mit Polyethylenglycol gepfropft (verdünnt auf 0,5 mg / ml in PBS) für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und ermöglichen die Kammer an der Luft trocknen. Speichern Sie die Stammlösung im Kühlschrank (bis zu 2 Wochen) und das Pulver Lager in den Gefrierschrank. Am Mikroskop, verdünnte den Antikörper auf 1-10 & mgr; g / ml in PBS. Führen Sie die Schritte 4,2-4,4 und 6,7 in diesem Protokoll. Wenn die Oberfläche nicht mit einer Antihaft-Lösung beschichtet wird, Antikörper mit der Glasoberfläche in Wechselwirkung treten und sich schnell aus der Lösung abgereichert werden.
- Durchführen einer Laserleistung Serie für jeden Anregungslaser und dem entsprechenden Fluorophors in der Lösung bei oder nahe Ausgangssättigende Kraft und für jede Messung um die Hälfte zu verringern. Ändern Sie die Laserleistung in der "Systemkonfiguration" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C). Drücken Sie die Schaltfläche "Start" eine Messung zu starten.
6. Zellmessungen
- Hinzufügen 125 ul der Zellen in PBS + 1% FCS aus dem Antikörper-markierte Zellsuspension (Schritt 1.5) und 150 & mgr; l transparent Rpmi 1640 (RPMI) in eine Vertiefung eines 8-Well-Kammerdeckgläser Folie. Leave die Zellen im Dunkeln bei Messtemperatur für mindestens 20 min vor der FCS-Messungen zu starten.
Hinweis: Dies ist, damit die Zellen an den Boden der Vertiefungen und äquilibrieren die Zellen und Lösung auf die Messtemperatur absetzen und befestigen. - Im "Scan Control" Fenster (Abbildung 1, Fenster B), stellen Sie Zoom 1 und einen schnellen XY - Scan starten , indem Sie den "Fast XY" Taste drücken. Ändern Sie die Laserleistung so, dass es so gering wie möglich ist, während die Zellen noch deutlich sichtbar sind. Zentrieren des Bildes auf einer runden Zelle der durchschnittlichen Helligkeit, wobei die Membran klar definiert ist und es gibt kein fluoreszierendes Signal im Cytoplasma. Zoom in, bis die Zelle größte Teil des Bildes abdeckt.
- Wählen Sie eine neue Zelle, wenn die aktuelle Zelle bewegt oder Displays Ranken, Profile oder extrem hellen Flecken. Halten Sie die gleiche Zoom und Laserleistung für alle im gleichen Experiment erfassten Zellen.
HINWEIS: Eine zerzauste Membran kann auch ein Zeichen der kommenden apo seinPtosis. - Konzentrieren Sie sich auf der Oberseite der Zellmembran. In der "Erwerb" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C), wählen Sie eine Position für die FCS - Messung durch Aktivierung "Fadenkreuz" . Alternativ wählen Sie die Registerkarte "LSM-Bild", das wollte Messfleck in der LSM-Bild zu markieren, und drücken Sie "Position hinzufügen."
HINWEIS: Die Oberseite der Zellmembran nicht durch fluoreszierende Antikörper oder Fluorophore unspezifisch an die Poly-L-lysin gebunden beeinflusst werden. Allerdings ist es wichtig, festzustellen, dass die Zelle nicht während der Messung bewegen (die Ergebnisse zu sehen). - In der "Erwerb" -Register der "Messung" Fenster (Abbildung 1, Fenster C), stellen Sie die Anzahl der Wiederholungen zu 6-10, mit dem "Measure Time" bei 10 Sekunden pro Wiederholung eingestellt.
- Zurück zur "Systemkonfiguration" -Register der "Messung" Fenster. Stellen Sie die Laserleistung für die FCS-Messung unter dem "LAser "Taste. Vor dem Ziel, verwenden Low - Power für Messungen Zelle, im Bereich zwischen 1 und 10 & mgr; W 20.
HINWEIS: Die empfohlenen Werte sind ein Kompromiss zwischen Signalerkennung und Lichtschäden an Zellen. Siehe Schritt 5.2.1 Hinweis den Prozentsatz der Laserleistung diese Werte entsprechen. - Starten Sie eine FCS-Messung von "Start" in der "Messung" Fenster (Fenster C) drücken. Wenn die Zelle Bleichmittel signifikant zu Beginn der Messung, wie durch einen Abfall in der Intensität Spur detektiert um mehr als 30% in den ersten 10 sec (ein Beispiel ist in 3A, untere Tafel dargestellt) bewegen und in eine andere Zelle unteren die Laserleistung für zukünftige Messungen.
- Wenn das Signal verloren geht, stellen Sie den Fokus in der Z-Richtung. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, verwenden Sie die "Scan Control" Fenster (Abbildung 1, Fenster B) zu überprüfen , dass die Zelle noch zentriert ist und dass die Zellmembran gemessen. Wenn the Zelle bewegt hat, um die Messung zu verwerfen.
- In der Autokorrelationsfenster , in dem die Messung angezeigt wird, löschen Sie manuell einzelne Wiederholungen , die das Zoomen Manöver enthalten, Bleichen, große Cluster oder andere Artefakte (siehe Beispiele in Abbildung 3). Tun Sie dies durch Markieren sie der rechten Maustaste, und wählen Sie "Löschen". Speichern Sie die letzte Datei in .fcs Format. Sparen Sie mindestens vier Wiederholungen pro Zelle.
- Gegebenenfalls ein Bild der Zelle an dem Mittelabschnitt (mit dem gesamten Umfang der Membran sichtbar) unter Verwendung des "Scan Control" Fenster erfassen. Nehmen Sie das Bild nach der FCS-Messung Bleichen zu vermeiden. Drücken Sie die "Single", um die Bildaufnahme zu starten.
- Bei der Verwendung von "Add-Position" für den FCS Fokus Positionierung, klicken Sie auf "Entfernen Position", bevor in die nächste Zelle weitergehen.
- Wechseln Sie zu einem neuen Teilmenge der Zellsuspension nach maximal 2 Stunden der Messung die Zellen lebensfähig zu halten throughout das Experiment.
7. FCS-Analyse
- Öffnen Sie die .fcs Dateien in einer Software mit Kurvenanpassung Fähigkeit (siehe Materialien / Reagenzien Tabelle für die Software in diesem Protokoll verwendet).
HINWEIS: Die FCS-Software, die mit dem Mikroskop kommt, ist ein guter Ort, um sich mit Grundbeschlag, aber zusätzliche Software ist notwendig, zweidimensionale Membrandiffusion zu passen. - Zuerst bestimmen die Größe des Anregungsvolumen durch die freie Fluorophor Messungen analysiert. Setzen Sie eine 3-dimensionale freie Diffusionskurve zu den Autokorrelation Kurven 21.
(Gl. 1)
HINWEIS: Definition der Parameter: N die mittlere Anzahl von fluoreszierenden Einheiten im Fokusvolumen, τ (Tau): Korrelationszeit, τ D (Taud): mittlere Verweilzeit im Fokusvolumen, T 1: Wahrscheinlichkeit für die Fluorophore zu sein in die Triplett-Zustand, τ <sub> T: Relaxationszeit für den Singulett-Triplett - Zustandsübergänge, S: Verhältnis von Höhe Durchmesser für das Fokusvolumen zu Breite.- Auszug Taud, die Laufzeit für Moleküle, die den Fokus zu übertragen.
- Verwenden der beobachteten Taud und veröffentlichte Diffusionskoeffizienten (D) von Fluorophoren für die Kalibrierung verwendet , 18, 19 , die Pinhole Radius (ω) zu berechnen.
(Gl. 2)
- Analyse der Autokorrelationskurven auf Zellmembranen.
- Um den Teil der Kurve zu visualisieren molekularen Diffusion darstellt, wählen Sie den Zeitrahmen beginnt vor dem steilsten Neigung der Autokorrelationskurve und endet nach der Kurve Konvergenzen bei 1 (zB 0,001 bis 5 sec für Maus - Oberflächenrezeptoren, siehe Abbildung 4).
- Erzeugen Sie eine durchschnittliche Autokorrelation Kurve der einzelnen Wiederholungen gespeichert in Schritt 6.7.2.
- Passen ein 2-dimensionales Membrandiffusionskurve an jede Autokorrelationskurve gemittelt unter Verwendung von Gleichung 3 3.
(Gl. 3)
HINWEIS: Wichtige Ausgangsparameter sind wie folgt: N die durchschnittliche Anzahl der Moleküle im angeregten Membranbereich befinden. Neu berechnen zu Dichte (N / & mgr; m 2). τ D (Taud): mittlere Verweilzeit im Schwerpunktbereich, begrenzt durch die Zweidimensionalität der Membran (en). Neuberechnen der mittleren Verweilzeit zu einem Diffusionskoeffizienten (& mgr; m 2 / s) über die ermittelte pinhole Radius (ω) und Gleichung 2 T1 ist die Wahrscheinlichkeit für die Fluorophore in dem Triplett - Zustand zu sein. Die Helligkeit (CPM) wird durch Division der durchschnittlichen Gesamtintensität der Messung durch N. berechnet - Wenn eine gute Passform nicht beim ersten Versuch erreicht wird, ändern Sie die Startwerte und / oder die oberen und unteren Grenzwerte für die Variablen bis this erzielt wird.
HINWEIS: Typische oberen Untergrenzen für die Proteindiffusionsraten in primären Zellmembranen sind 10-500 ms für Taud, 0-100% für T1, und 0,1 bis 5 ms für TauT1. Wählen Werte für den Einbau in der Mitte dieser Intervalle beginnen. Der Teil der Kurve , die Fluoreszenzfluktuationen von Diffusions abgeleitet wird typischerweise liegt zwischen 1 ms und 1 s (siehe Abbildung 4). In Abhängigkeit von dem Fluorophor kann es manchmal ein zweiter Prozess vorhanden sein, in kürzeren Zeitskalen Anlass zu Autokorrelation geben als die Diffusionsparameter. Dies wird durch eine vorübergehende Dunkelzustand (Triplett) oder blinkt verursacht (wie oft für fluoreszierende Proteine auftreten). Ein Triplett-Zustand wird in der Gleichung berücksichtigt 3 und das präsentierte Modell sollte damit auch eine gute Passung in diesen Situationen bereitzustellen.
(Gl. 1) 
(Gl. 2) 
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Representative Results
Ein typisches Ergebnis wird eine Autokorrelationskurve mit einer Durchlaufzeit in dem Bereich von 10 msec bis 400 msec für Membranproteine erzeugen. Die Anzahl der Moleküle können zwischen 0,5 bis etwa 200 pro & mgr; m 2 für endogen exprimierte Proteine variieren. Prüfen Sie sorgfältig, dass die CPM ist nicht geringer als erwartet. Dies kann bedeuten, dass es einen Einfluss des Hintergrundsignals. Als Daumenregel gilt, das CPM-Signal auf Zellen, die für die Analyse angenommen wird, sollte nicht weniger als 33% des CPM für frei Antikörper mit der gleichen Laserleistung diffundieren. Die CPM sollte linear mit der Laserleistung zu skalieren. Die Autokorrelationskurve für primäre Immunzelloberflächenrezeptoren soll glatt sein, mit dem steilsten Teil zwischen 0,001 und 1 Sek. Siehe Abbildung 2 für eine repräsentative Autokorrelation Kurve und deren Zeitverlauf.
Wie kurz in der Einleitung erwähnt, diere gibt mehrere Fälle, in denen FCS zur Messung der molekularen Diffusion durch den Einfluss von anderen Quellen von Fluoreszenzfluktuationen nicht geeignet ist, die dazu beitragen, um das Signal zu verwechseln. Figur 3 zeigt Beispiele von Fällen , in denen eine bestimmte Zelle oder Mess repeat verworfen werden sollte. Es wurde bereits erwähnt, dass ein extrem niedriges Signal (sehr niedrige CPM) für wird bewirken, dass die Zelle zu verwerfen. Ein weiterer Grund für die einzelne Zelle zu verwerfen ist , dass die Zelle (3A) bewegt. Im Fall von Bleich (3B) , oder wenn große Cluster vorhanden sind (3C), sollten die Messungen verworfen werden , wenn die Wirkung beträchtlich oder Gegenwart während der gesamten Messung ist. Wenn diese Funktion nur in einem oder zwei Wiederholungen ist, diese einzelnen Wiederholungen können verworfen werden, aber die restlichen Wiederholungen immer noch verwendet werden können.
Es ist wichtig, sowohl für die korrekte VerwendungModell, um die Daten zu passen, und auch sorgfältig prüfen, ob die Passung eng mit der Autokorrelationskurve überlappt. In Abbildung 4 sind Beispiele für gute und schlechte Kurvenanpassungen gezeigt. Achten Sie besonders auf den Teil der Kurve, die Diffusion (die steil abfallenden Teil). Es ist auch wichtig festzustellen, dass sowohl der Beginn und das Ende des abfallenden Teil der Kurve sind durch das Modell gut ausgestattet. Wenn die Passform ist schlecht, ohne offensichtliche Probleme wie bewegend, Bleichen oder Cluster, ändern Sie die Startwerte und / oder die obere und untere Grenze (innerhalb einer angemessenen Bereich), bevor sie eine endgültige Entscheidung um die Zelle zu verwerfen.
Abbildung 1: FCS Software - Schnittstelle. Gezeigt sind hier die Hauptfenster notwendig, die Software-Tool für FCS Erfassung und Abbildungs zu arbeiten, wie in dem Protokoll beschrieben. Fenster A, die "Konfiguration Control "Fenster ist das Kontrollfenster für den Strahlengang, Laserkanäle und Filter für die Bildgebung. Fenster B ist der" Scan Control "Fenster für die Bildgebung und zeigt die Scan-Einstellungen. Fenster C ist die" Messung "Fenster, das Fenster für die Aufbau der Messeinstellungen FCS. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Spur und Autokorrelation Kurven von H-2D d Major Histocompatibility Klasse Diffundieren I Oberflächenmoleküle in frisch isolierten murinen NK - Zellen. Die obere Platte in der Figur zeigt die Fluoreszenzschwankung als Funktion der Zeit während des gesamten Zeitverlaufs von 10 sec Messungen 7x. Das untere Feld darstellens die gemittelte Autokorrelation Kurve aus diesen sieben Wiederholungen. Die Höhe der Autokorrelationskurve ist umgekehrt proportional zur Konzentration des mobilen fluoreszenzmarkierten H-2D d Entitäten innerhalb des Fokalvolumens. Die x-Achsen - Wert am steilsten Teil der Steigung der Kurve, die Hälfte der Amplitude, stellt die durchschnittliche Verweilzeit von fluoreszenzmarkierten H-2D d Moleküle im fokalen Volumen. Die Messung dargestellt ist ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Beispiele für problematische Zellspuren. (A) Eine bewegliche Zelle, wie sie beispielhaft durch die Spur keine stabile aufweist basal level. Das obere Feld zeigt ein Beispiel, bei dem die gesamte Zelle wurde nach etwa 35 sec unscharf bewegt, wie durch den sehr niedrigen Signal nach diesem Zeitpunkt dargestellt. In der unteren Platte ist die Wirkung subtiler, mit Wellungen offensichtlich in einem Abstand von mehreren Sekunden. (B) Zell Anzeige Bleichen, um die Höhe der Spur mit der Zeit abnimmt. Vergleichen der Höhe der Spur zu Beginn der Messung an, daß am Ende der Messung. (C) Das Vorhandensein von großen Clustern, die von Spitzen in der Spur dargestellt. In der oberen Platte ist ein großer Cluster bei 20-25 sec vorhanden. In der unteren Platte sind mehrere Cluster während der Messung vorhanden. Die Messungen vorgestellt werden sind ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative Autokorrelation Kurven mit Kurvenanpassung und Residuen. Die roten und blauen vertikalen Linien stellen die Grenzen des Zeitfensters für den Einbau verwendet. (A) Beispiel eines repräsentativen Sitz eines 2-dimensionalen Diffusionsmodell zu einer Probe Autokorrelationskurve. In der oberen Platte, die grüne Kurve (das Modell) überlagert die blaue Kurve (die erworbenen Autokorrelation), eine gute Passform anzeigt. Das untere Feld zeigt die Rest aus der Kurvenanpassung. Die Schwankungen um 1 Sekunde, die nicht gut ausgerüstet sind, sind typisch für Zellmessungen und sind erträglich. (B) Beispiel für eine schlechte Passform von 2-dimensionale Diffusion zur gleichen Autokorrelationskurve. Das angepasste Modell überlagern nicht die Autokorrelation Kurve, und es konvergiert nicht bei 1. Die unteren Platten in (A und B) zeigen den Rest aus der Kurvenanpassung. Die Residuensind für die schlechte Passform deutlich größer, insbesondere für die Diffusion des Kurventeils. Die Messung dargestellt ist ein Teil des Datensatzes in Bezug auf 2 veröffentlicht. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Dieses Protokoll für FCS kann für die Bewertung der molekularen Dynamik von Oberflächenmolekülen auf allen Arten von Immunzellen (murine, menschliche oder andere Arten) verwendet werden. FCS Maßnahmen räumlich-zeitliche Molekulardynamik bis auf Einzelmolekülauflösung in lebenden Zellen. Die molekulare Dichte sowie die Diffusionsgeschwindigkeit und clustering Dynamik der Proteine von Interesse, aus den Autokorrelationskurven extrahiert werden.
Die Fluoreszenzmarkierung ist von zentraler Bedeutung für eine erfolgreiche FCS-Experimente. Proteine von Interesse auf der Zellmembran wurden traditionell unter Verwendung von Antikörpern markiert und Antikörper sind häufig am bequemsten für den Einsatz an Oberflächenproteine in naiven Immunzellen. Unbeschriftet Antikörper müssen direkt mit einem hohen Molekular Helligkeit photostabile Fluoreszenzfarbstoffen konjugiert werden. Die Auswahl des Fluorophors für Antikörperkonjugation ist für die Qualität der Messungen wichtig. Standard-Etiketten für die Durchflusszytometrie,wie Fluorescein und Phycoerythrin-Farbstoffe sind nicht auf schnelle Bleiche empfohlen. Foto stabile Farbstoffe für die direkte Konjugation an Antikörper werden derzeit von mehreren Unternehmen zur Verfügung gestellt. Die Hersteller bieten gewöhnlich zufriedenstellende Protokolle für die Konjugation und Reinigung des resultierenden konjugierten Antikörper, und dies kann in einigen Stunden durchgeführt werden. Es ist auch möglich FCS unter Verwendung von fluoreszierenden Proteinen durchzuführen, aber besondere Sorgfalt sollte die Laserleistung, da fluoreszierende Proteine sind im Allgemeinen anfälliger für Bleich- als die meisten photo stabile chemische Fluorophore zu minimieren. Nach den bisherigen Erfahrungen, Überexpression von Proteinen führt oft zu einer erheblichen Abnahme der Rate Diffusion aufgrund crowding, die die Verwendung von fluoreszierenden Proteinen ungeeignet macht.
Pinhole-Kalibrierung vor der Messung ist auch ein entscheidender Schritt. Die Fluorophore zur Bestimmung der Größe des Brennvolumens verwendet wird, muss Diffusionskoeffizienten bekannt sinds (siehe Gleichung 2). freie Fluorophore verwenden eng an die Emissionsspektren der Antikörper markiert entspricht, um die Größe des Brennvolumens zu bestimmen. Dies muss geschehen, um die optimale Signaleffizienz und korrekte Erkennung potentieller Kreuzkorrelationen zwischen den Farbkanälen zu gewährleisten. Führen Sie eine FCS Laserleistung Serie der frei diffundierenden Fluorophore, um sicherzustellen, dass das System das erwartete Ausgangssignal über einen Bereich von Zuständigkeiten gibt. Vergleichen Sie die CPM bei der gleichen Laserleistung zwischen den Experimenten Konsistenz zwischen den Experimenten zu gewährleisten.
In der Analyseschritt ist es wichtig, angemessene Bereiche und Startwerte für die Variablen zu setzen, wenn die Modelle passen. Verwenden Sie bisher veröffentlichten Erkenntnisse aus ähnlichen Zellsystemen gute Ansatzpunkte zu finden. Theoretisch ist FCS eine quantitative Technik, aber da optimalen Bedingungen selten auftreten, muss ein gewisses Maß an Vorsicht geboten, wenn der Interpretation der Ergebnisse. Alle Arten von Schwankungen werden aufgezeichnet,unabhängig von der Herkunft derartiger Schwankungen. Daher ist es sinnvoll, so viele Informationen wie möglich über das Versuchssystem zu haben, um auf mögliche Fehlerquellen auszuschließen. Zum Beispiel wird die Bewegung der gesamten Zellmembran wird führen zu Schwankungen bei längeren Taud (3A), wohingegen putative Verunreinigungen der freien Fluorophore in der Lösung mit mindestens zehnmal kürzer Taud diffundieren.
Dieses Basisprotokoll kann auf verschiedene Weise modifiziert werden. Wenn zwei Proteine mit unterschiedlichen Fluorophoren markiert sind, Co-Diffusion (ein indirektes Maß der Wechselwirkung) kann durch Erweiterung der Methode zum Nachweis der Kreuzkorrelation bewertet werden. Das Ausmaß, in dem diese Proteine miteinander in der Zellmembran binden, wird durch die Höhe der Kreuzkorrelationskurve relativ zu der Höhe der Autokorrelationskurven der einzelnen Farbkanäle dargestellt. Kreuzkorrelation bezeichnet als Ch1-Ch2 in der Messsoftware. die preübungs Analyse der Kreuzkorrelation erfordert Kontrollen für Übersprechen und ist somit etwas komplizierter als das Protokoll hier vorgestellt. Eine ausführliche Beschreibung, wie die , als eine Erweiterung dieses Grundprotokoll ablaufen können in Strömqvist et al. 13. Zur Optimierung kann die Positionierung in der z-Richtung, z-Abtastung FCS 22 verwendet werden. Nach den bisherigen Erfahrungen ist es zufriedenstellend gewesen, dies manuell zu tun. Es ist auch möglich , mehrere Diffusionskoeffizienten zu einer FCS Autokorrelationskurve 23 zu passen. Dies erfordert vorherige Kenntnis der Anzahl von Subpopulationen mit unterschiedlichen Diffusionsraten und der ungefähren Diffusionsraten von mindestens einer der Subpopulationen. Ansonsten wird es zu viele freie Variablen, die die passende unzuverlässig machen wird. Ein typisches Beispiel wäre ein Oberflächenprotein, dessen Diffusionsgeschwindigkeit sein wird erheblich durch die Bindung eines Liganden verlangsamt. Schließlich Reining die Spur von Ausreißern , ohne vollständig zu entfernen Wiederholungen möglich ist 24.
Das Fehlen eines Fluoreszenzsignals ist ein häufiges Problem zu beheben. Für frei Fluorophore diffundieren, verwenden Sie die Halogenlampe zu prüfen, ob der Tropfen fluoresziert. Wenn der Tropfen nicht fluoreszierend ist, mit einer leicht erhöhten Konzentration (im nM-Bereich) und versuchen Sie es erneut eine neue Charge von Fluorophore mischen. Überprüfen Sie, ob der Fokus innerhalb des Fluoreszenzabfall werden die Laser in der Software eingeschaltet ist, wird die Laserleistung ausreichend ist, die richtigen Emissionsfiltern und Detektoren sind so gewählt, und die richtigen Kanäle in der "FCS-Messung" Fenster werden aktiviert (siehe Schritt 3.6). Starten Sie den Laser und sucht von der Seite, um visuell zu bestätigen, dass das Laserlicht die Probe erreicht. Vermeiden Sie direkt in die Laserquelle suchen. Wenn die gewählte Emissionsfilter der Laserwellenlänge umfasst, blockieren eine Blende automatisch den Lichtweg Beschädigung des Detektors zu vermeiden. ichf alle Einstellungen sind in Ordnung, aber kein Licht kommt, Re-Start die Laser, die FCS-System und den Computer. Fragen Sie einen Experten, wenn das Fehlen eines Fluoreszenzsignals weiterhin besteht. Ein vereinfachtes Verfahren gilt, wenn die markierten Zellen nicht Fluoreszenz zeigen. Bestätigen Sie die Anwesenheit von Fluoreszenz mit der Halogenlampe; Schalten Sie den Laser, wählen Sie die Laserkanäle, und stellen Sie die Laserleistung. Wählen Sie eine Position auf der Zellmembran, entweder mit dem "Fadenkreuz" oder "In Position" Option (siehe Schritt 6.4). Wechseln Sie auf die nächste Probe, wenn das Signal immer noch zu niedrig ist.
Ein wichtiger Aspekt der Schwankung aufgrund der Technik ist, dass Moleküle maßen mobil sein detektieren. Sehr langsam in Bereichen kleiner ist als der Fokus während der gesamten Messzeit kann daher nicht gemessen werden gefangen Fraktionen von Molekülen oder Moleküle bewegen. Dies führt zu einer möglichen Unterschätzung der Oberflächendichten und einer Überschätzung der Diffusionsgeschwindigkeit. Bleichenkann auch auf eine putative Unterschätzung der Dichte und Taud sowohl beitragen, da Moleküle eine höhere Wahrscheinlichkeit hat, gebleicht die längere Zeit werden sie in den Laser-beleuchteten Fokalvolumen verbringen. Einfluss von dem Hintergrund (Fluoreszenz von außerhalb der Brennebene) würde, andererseits erhöht künstlich die Anzahl der erkannten Moleküle und verringern den gemessenen cpm. Bisher wurde der gesamte maximale Fehler in der absoluten Dichtebestimmung schätzungsweise 20 etwa 40% sein. Jedoch ist es in der Regel möglich, verschiedene biologische Proben miteinander zu vergleichen, da die Fehlerquellen sind in den meisten Fällen gleich in allen Experimenten. Eine weitere potentielle Fehlerquelle ist, dass Antikörper bivalent sind, was bedeutet, dass jeder Antikörper potenziell zu zwei Zielmoleküle binden können. Die Autoren haben dieses Phänomen nicht beobachten, aber es kann nicht garantiert werden, dass dies eine globale Funktion für andere Antikörper ist. Der mögliche Einfluss von Zweiwertigkeit mussdaher individuell für jeden Antikörper getestet werden. Die Kombination von spezifischen primären und sekundären Antikörpern markiert darf niemals induzieren künstlichen Cluster aus zwei aufeinanderfolgenden bivalent Etiketten aufgrund der hohen Risiko verwendet werden. Wenn Zellen statt mit fluoreszierendem Protein-markierte Versionen des Proteins von Interesse transfiziert worden sind, wird jedes Protein nur ein Label. Dies erfordert jedoch die Transfektion, die nicht immer erwünscht ist und auch nicht möglich sein kann (beispielsweise , wenn Immunzellen direkt isoliert aus menschlichem Blut verwendet wird ). Schließlich ist Single-Point-FCS keine Bilder aufgenommen werden. Wenn Bilder für die Veröffentlichung oder für andere Zwecke benötigt werden, müssen diese separat mit dem Abbildungsteil der Software erfasst. Immer erfassen Bilder nach der FCS-Messungen unnötig Bleichen der Zelloberfläche zu vermeiden.
Anders als FCS, traditionellen konfokalen Mikroskopie-basierte, wie FRAP und Bildkorrelationsmethoden können nicht Fluoreszenzfluktuationen quantifizierenauf der Einzelmolekülebene 6. Bildkorrelationsmethoden messen die Anzahl der Moleküle indirekt und mit geringerer Auflösung, aber sie können die Variabilität der molekularen Diffusion und Clustering über den gesamten Bildbereich 25 zu beurteilen. Standard - SPT durch konfokale Mikroskopie gemessen hat eine ideale Höhe der Etikettierung, um Größenordnungen niedriger als FCS 7. Daher kann die Dichte der markierten Proteine nicht durch Standard-SPT gemessen werden. Die Kombination von SPT mit anderen Mikroskopietechniken (zB stochastischen optischen Rekonstruktionsmikroskopie oder Photoaktivierungslokalisierungsmikroskopie) kann die Dichte und Bewegung beurteilt werden, aber es erfordert eine sehr spezielle Farbstoffe oder Proteine 11. Superauflösungstechniken, wie zum Beispiel strukturierte Beleuchtung Mikroskopie und stimulierte Emission Mikroskopie erschöpft ist, erfordern oft fixierten Proben und einer Kombination von primären und sekundären Antikörper für Labeling 26. Localization ist daher sehr präzise, während die Dynamik des Systems kann nicht oft beurteilt werden. Im Vergleich zu den SPT und Superauflösungstechniken, FCS erfordert auch deutlich weniger Rechenleistung und Zeit für die Analyse und Extraktion der Ergebnisse. Die Durchflusszytometrie ist das Zugpferd der Immunologie und kann vorteilhaft mit FCS kombiniert werden. Zellsortierung kann, beispielsweise durch nachfolgende Messungen an ausgewählten Zellpopulationen gefolgt werden, wenn photostabile Farbstoffe vor der Sortierung verwendet worden war. FCS ist daher eine Methode, die allein oder in Kombination mit anderen etablierten Methoden verwendet werden können.
Dieses Protokoll kann verwendet werden, ist derzeit nicht bekannt Funktionen der Immunzelldynamik und Wechselwirkungen innerhalb der Zellmembran auf Einzelmolekülebene zu identifizieren. Darüber hinaus verfügt der gesamten Bevölkerung gegenüber ausgewählten Untermengen verglichen werden. Es hat auch eine mögliche Rolle als Selektionsschritt für die Immunzelltherapie. Da die Messungen tunnicht verbrauchen die Zelle, im Gegensatz zu den meisten anderen Methoden, um die Funktionalität von Immunzellen werden kann potenziell gewonnen und kultiviert für die Untersuchung, einzelne Zellen. Somit wird nach der Analyse der FCS-Kurven können vielversprechende Zellen für zusätzliche Anwendungen extrahiert und erweitert werden, einschließlich der putativen klinischen Anwendungen.
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Acknowledgments
Wir danken Dr. Vladana Vukojević, Zentrum für Molekulare Medizin, Karolinska Institutet für die Aufrechterhaltung des Zeiss Confocor 3 Instrument und hilfreiche Tipps in Bezug auf Zellmessungen. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Vetenskapsrådet (Grant-Nummer 2012- 1629) finanziert werden, Magnus Bergvalls Stiftelse und von Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
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