Abstract
مضان الارتباط الطيفي (FCS) هي تقنية قوية لدراسة انتشار الجزيئات داخل الأغشية البيولوجية مع القرار المكانية والزمانية عالية. FCS يمكن قياس الجزيئي تركيز ومعامل الانتشار من جزيئات fluorescently المسمى في غشاء الخلية. هذه التقنية لديها القدرة على استكشاف خصائص الانتشار الجزيئي للجزيئات في الغشاء البلازمي للخلايا المناعية في حالة مستقرة (أي بدون العمليات التي تؤثر على نتيجة خلال فترة القياس الفعلي). FCS مناسبة لدراسة نشر من البروتينات التي يتم التعبير عنها على مستويات نموذجية للبروتينات الأكثر الذاتية. هنا، ويتجلى طريقة واضحة وقوية لتحديد معدل انتشار للبروتينات غشاء الخلية في الخلايا الليمفاوية الأولية. ووصف وسيلة فعالة لإجراء قياسات على خلايا حية ملطخة الأجسام المضادة والملاحظات التي تحدث عادة بعد الاستحواذ. التطورات الأخيرةفي تطوير الأصباغ الفلورية-صور ثابتة يمكن استخدامها من قبل التصريف الأجسام المضادة التي تهم الأصباغ التي لا التبييض على نطاق واسع خلال القياسات المناسبة. بالإضافة إلى ذلك، وهذا يسمح للكشف عن الكيانات نشرها ببطء، وهي سمة مشتركة من البروتينات التي أعرب عنها في أغشية الخلايا. وسلط الضوء على إجراء تحليل لاستخراج المعلمات التركيز ونشر الجزيئية من منحنيات الارتباط الذاتي التي تم إنشاؤها. وباختصار، يقدم البروتوكول الأساسي لقياس FCS. ويمكن أن يتبعه المناعة مع فهم متحد البؤر المجهري ولكن مع عدم وجود خبرة سابقة أخرى من تقنيات لقياس معلمات الحيوية، مثل معدلات انتشار الجزيئية.
Introduction
العديد من وظائف الخلايا المناعية تعتمد على الانتشار الجزيئي والتفاعلات داخل الأغشية. الأغشية البيولوجية المعقدة، والعديد من العوامل التي قد تكون مهمة لوظيفة الخلايا المناعية يمكن التأثير على سرعة نشر متعدية من البروتينات داخل الأغشية الخلوية 1. وأظهرت لنا مؤخرا أن القاتلة الطبيعية (NK) الخلايا، الخلايا الليمفاوية التابعة للنظام المناعة الفطري، تظهر نشر فرق من اثنين من البروتينات درس في غشاء الخلية تبعا للحالة NK تنشيط الخلايا 2.
مضان الارتباط الطيفي (FCS) هو تقنية قادرة على قياس معدلات انتشار الجزيئية داخل الأغشية البيولوجية. فإنه تقارير متوسط معدل الانتشار وصفت من fluorescently الجزيئات في حجم ثابت، وعادة محور المجهر متحد البؤر. لأنه يقوم على قياس التقلبات في مضان التي تحدث على الحركة الجزيئية فينظام في حالة مستقرة. وقد استخدم على نطاق واسع السفح لدراسة نشر الأصباغ الفلورية والبروتينات، سواء في حل وداخل الأغشية الدهنية. ويمكن أيضا معلمات الإخراج الأخرى التي تؤثر على معدل انتشار دراستها بشكل غير مباشر في هذا الشكل (على سبيل المثال، والتغيرات متعلق بتكوين بروتينات أو تفاعلات الجزيئات على أغشية الخلايا) 3، 4. FCS تبرز مقارنة مع التقنيات الأخرى نظرا لحساسيته العالية، مما يتيح إمكانية الكشف عن جزيء واحد. أنه يعمل بشكل جيد لتركيزات الجزيئية في nanomolar إلى مجموعة millimolar، الذي هو الحال بالنسبة للمستويات التعبير الذاتية لمعظم البروتينات 5. وعلاوة على ذلك، يمكن FCS إعطاء رقم تقريبي لعدد المطلق من البروتينات داخل حجم درس، في حين أن معظم تقنيات أخرى تعطي إلا معلومات النسبية حول مستويات بروتين تعبير. طرق أخرى لقياس معدلات انتشار الجزيئية ضمن تشمل الأغشية فلووانتعاش rescence بعد photobleaching من (FRAP)، جسيم واحد تتبع (SPT)، متعددة الثقب FCS، وارتباط صورة الأساليب. FRAP وارتباط صورة الأساليب هي أساليب المجموعات، والتي عادة لا تعطي معلومات حول العدد المطلق للجزيئات 10. مقارنة SPT، مرت من FCS أعلى فيما يتعلق تميز المتوسط السكان. التحليل هو أيضا أقل تطلبا منذ يقاس معدل انتشار الجزيئات الموجودة داخل التركيز الليزر، بدلا من نسبة الجزيئات واحدة. أيضا، إلا إذا المجاهر المتخصصة المتاحة 11، SPT لا يمكن إعطاء أي معلومات عن تركيزات، منذ معيار العلامات الفرعية يجب أن تكون منخفضة جدا للسماح للتعرف على الجزيئات واحدة. من ناحية أخرى، FCS يتطلب الجزيئات قيد الدراسة لتكون متنقلة. انها ببساطة لن يكشف عن أي كسور أو جزيئات متحركة المفترضة تتحرك ببطء شديد. معدل انتشار الجزيئات التييقيمون في التركيز أطول من أن ما يقرب من عشر اكتساب الوقت لا تكون ممثلة بشكل صحيح في القياسات FCS 3، 12. وبالتالي، معاملات نشر سجلتها FCS تميل إلى أن تكون أسرع من معدلات انتشار ذكرت من التقنيات مثل FRAP والفرعية، حيث يتم أخذ الكسور وثيقة لمتحرك وبطيئة جدا في الاعتبار كذلك. سوف SPT أيضا إعطاء وصفا أكثر تفصيلا من تباين معدلات الانتشار بين السكان الجزيئي من FCS سوف.
FCS الكمي تذبذب كثافة مضان مع مرور الوقت في حجم متحمس. في حالة قياسات غشاء، وهذا يترجم إلى منطقة مضيئة من الغشاء. في هذه الورقة، ونحن الاستفادة من حقيقة أن مثل هذه التقلبات تكون ناتجة عن جزيئات العارضة نشر البراونية، وبالتالي فهي تتحرك في والخروج من حجم الإثارة. هناك أيضا العديد من مصادر أخرى محتملة للfluctuaستعقد في إشارة مضان، مثل امض أو وجود حالة الثلاثي في fluorophores، والآثار البيئية، ملزم غير ملزم ليجند، أو حركة غشاء الخلية بأكملها. يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند تصميم تجربة FCS من أجل تفسير النتائج بدقة 12، 13 هذه المصادر خطأ المفترضة. عادة، ومعدلات الانتشار الأفقي في الأغشية البيولوجية منخفضة بسبب الازدحام والتفاعلات، سواء بين بروتينات الغشاء وبين البروتينات والهيكل الخلوي. تاريخيا، وبالتالي أعاق استخدام FCS في الأغشية بسبب عدم وجود fluorophores-صور ثابتة، وهي مطلوبة لتجنب التبييض خلال أوقات العبور طويلة من خلال التركيز الإثارة 14. ولكن اليوم، هناك الكثير من الخيارات لالأصباغ صورة مستقرة مناسبة. تحسينات كبيرة في الكشف عن والأجهزة الأخرى تسمح أيضا للكشف عن المتواجد الفلورسنتخصوصيات والأصباغ انخفاض السطوع. هنا، وبروتوكول الأساسية لتطبيق FCS باستخدام الخلايا الليمفاوية الأولية الفئران، حيث يتم وضع علامة على البروتين من الفائدة مع الموسومة fluorescently الأجسام المضادة، وصفت. ويرد أيضا نهجا لتناسب منحنيات الارتباط الذاتي من أجل استخراج معامل الانتشار والكثافة الجزيئية. ويهدف البروتوكول على أن يتبع بسهولة عن طريق المناعة مع عدم وجود خبرة سابقة من التقنيات لدراسة انتشار الجزيئات. ومع ذلك، من المتوقع فهم أساسي من الفحص المجهري متحد البؤر (للحصول على هذا الفهم الأساسي، أنظر المرجع 15). يمكن بسهولة نسبيا أن تتكيف هذا البروتوكول لخلايا تعليق الأخرى، سواء خطوط الخلايا والخلايا الأولية. لمزيد من المستخدمين FCS ذوي الخبرة، وأساليب تحليل أكثر دقة موجودة، وصفها البعض منها في المناقشة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تلطيخ لFCS
- عزل الخلايا القاتلة الطبيعية الفئران من الخلايا الليمفاوية والطحال باستخدام الوسم حبة المغناطيسي، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 16. استخدام 2-3 × 10 5 خلايا لكل عينة للخطوات التالية.
ملاحظة: استخدم اختيار السلبية لإثراء السكان الخلية المستهدفة، مما يجعلها بمنأى، بحيث يمكن أن توصف الخلايا باستخدام الأجسام المضادة الأولية وحدها. أنظر المرجع 2 للحصول على معلومات أكثر تفصيلا عن عزل الخلايا من الفئران 2. - لخلايا الفئران التعبير عن مستقبلات التيسير، منع المستقبلات التيسير مع استنساخ 2.4G2 الأجسام المضادة في 5 ميكروغرام / ميكرولتر في 25 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) و 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) لكل عينة. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد خليط الأضداد.
- استخدام الأجسام المضادة مترافق مباشرة إلى fluorophore-صورة مستقرة. إذا كان اثنان الأجسام المضادة ضد اثنين من البروتينات المختلفةهي المستخدمة، fluorophores استخدام التي لديها فصل جيدا أطياف الانبعاثات لتقليل عبر الحديث (على سبيل المثال، ولع 488 و 633 ليزر 2، في وقت لاحق في البروتوكول ويشار إلى أن أشعة الليزر وfluorophores "الخضراء" و "الحمراء"، على التوالي ).
ملاحظة: إذا الأجسام المضادة التجارية المسمى مع fluorophores-صورة مستقرة لا تتوفر لالمؤشرات الحيوية المختارة، المترافقة الأجسام المضادة غير المسماة إلى fluorophores وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. انظر المواد الجدول لالأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة. - إعداد خليط الأجسام المضادة عن طريق تمييع الأجسام المضادة fluorescently المسمى ضد البروتين أو البروتينات من الاهتمام في برنامج تلفزيوني + 1٪ FBS. إضافة مزيج الأجسام المضادة لكل عينة إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر لكل عينة. احتضان على الجليد لمدة 45 دقيقة في الظلام.
ملاحظة: تحسين تركيز الأجسام المضادة في وقت مبكر لضمان أن يتم استخدام الأجسام المضادة في تركيز تشبع، وعادة1-10 ميكروغرام / مل.
- استخدام الأجسام المضادة مترافق مباشرة إلى fluorophore-صورة مستقرة. إذا كان اثنان الأجسام المضادة ضد اثنين من البروتينات المختلفةهي المستخدمة، fluorophores استخدام التي لديها فصل جيدا أطياف الانبعاثات لتقليل عبر الحديث (على سبيل المثال، ولع 488 و 633 ليزر 2، في وقت لاحق في البروتوكول ويشار إلى أن أشعة الليزر وfluorophores "الخضراء" و "الحمراء"، على التوالي ).
- بعد الحضانة، وغسل الخلايا بإضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي لهم في 150 x ج لمدة 3 دقائق. تجاهل طاف.
- كرر الخطوة 1.4.
- Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني + 1٪ FBS. الحفاظ على الجليد وفي الظلام حتى الاستحواذ.
ملاحظة: يمكن أن تبقى خلايا الفئران NK على الجليد لمدة تصل إلى 10 ساعة.
2. إعداد مجهر غرف ساترة الشرائح
ملاحظة: استخدام الشرائح ساترة غرف أو أطباق مع سماكة الغطاء الزجاجي الذي المجهر وقد الأمثل ل، إما # 1 أو # 1.5. إذا لم يتم محاذاة المجهر لسماكة معينة، أو إذا كان غير معروف، تحتاج حلقة المجهر طوق إلى أن يكون الأمثل للسمك ساترة الحالي 17.
- تمييع بولي-L-ليسين مع الماء المقطر في نسبة 01:10. إضافة 200 ميكرولتر من المخفف بولي-L-ليسين إلى غرف واحتضان لمدة 20 دقيقة.
- مسح البولي-L-يسين بواسطة طموح والسماح للغرفة الهواء الجاف من خلال ترك من دون غطاء في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة على الأقل.
3. بدء تشغيل نظام FCS
ملاحظة: يشير هذا البروتوكول إلى نظام المجهر محددة وبرنامج (انظر المواد / الكواشف الجدول)، على الرغم من الاجهزة المجهر الأخرى وحزم البرمجيات يمكن أن تستخدم أيضا.
- تشغيل متحد البؤر مجهر المسح الضوئي ليزر مع خاسسرح FCS. فتح البرنامج في وضع "الخبراء". حدد عدسة غمر المياه 40X.
- تحت علامة التبويب "اكتساب"، اضغط على "تكوين" وأزرار "مسح" لفتح "مراقبة التكوين" ويندوز "التحكم تفحص" (نوافذ A و B في الشكل 1، على التوالي). تحت علامة التبويب "Confocor"، اضغط على "قياس" لفتح نافذة "القياس" (إطار C في الشكل 1).
- إنشاء مجلد لحفظ FCSقياسات. بدء قاعدة بيانات صورة جديدة بالنقر على "الجديد" تحت علامة التبويب "ملف".
- باستخدام زر "الليزر"، تشغيل مصابيح الهالوجين، وأشعة الليزر ذات الصلة لإثارة fluorophores (على سبيل المثال، 488 نانومتر ل "الأخضر" ليزر الإثارة والإثارة 633 نانومتر ل"حمراء" ليزر الإثارة).
- اختر الإثارة وانبعاث مرشحات مناسبة وتفعيل أجهزة الكشف عن المقابلة.
- تحديد الإعدادات لالتقاط الصور، بما في ذلك الليزر الإثارة، الإثارة وانبعاث المرشحات، ومسار الضوء، وكشف عن لاستخدامها، في إطار "مراقبة التكوين".
- وبالمثل، حدد الإعدادات المناظرة للقياسات FCS في إطار "القياس"، ضمن علامة التبويب "تكوين النظام". استخدام إعدادات مماثلة قدر الإمكان للتصوير وFCS.
- تفعيل قنوات الكشف عن تسجيلات FCS عن طريق التحقق من مربع "CH1" لchanne الخضراءلتر و"CH2" للقناة الحمراء في إطار "القياس".
ملاحظة: يجب أن يكون الأمثل وإعدادات fluorophore (ق) المستخدمة، كما هو الحال في التجربة متحد البؤر التصوير القياسية. في تجارب لاحقة، إعدادات FCS نفسها يمكن إعادة استخدامها من خلال فتح ملف FCS من العمر، وذلك باستخدام القائمة المنسدلة "Confocor" في الجزء العلوي من واجهة المستخدم، واختيار "فتح ملف". اضغط على "إعادة استخدام" في إطار اكتساب الناشئة. وبالمثل، يمكن تحميل إعدادات الحصول على الصور من خلال فتح الصورة المحفوظة والضغط على "إعادة استخدام."
- انتظر حتى الليزر هو مستقر قبل إجراء القياسات FCS. هذا يمكن أن يستغرق ما يصل إلى 30 دقيقة ليزر الغاز، في حين استقرت ليزر ديود أسرع. ضبط الثقب بينما كان ينتظر.
4. الثقب تعديل
- إعداد 0.2-0.5 ميكرومتر حلول fluorophores أو الأصباغ الفلورية المقابلة لالإثارة وانبعاث أطياف التسميات على الأجسام المضادة. الfluorophores يجب أن يكون معروفا معاملات نشر 18 و 19.
- وضع قطرة 50 ميكرولتر من حل مع fluorophore ولع الليزر الأخضر في وسط بئر في شريحة ساترة تشامبيريد. وضعت قطرة من الماء المقطر على الهدف المياه 40X ووضع الشريحة. اضغط على "فيس" الزر لبدء الضوء المرئي واستخدام العدسة العينية لإيجاد والتركيز على انخفاض fluorophore.
ملاحظة: استخدم نفس الشريحة بالنسبة للقياسات الخلية في وقت لاحق، لأن هناك اختلافات طفيفة المفترضة في سماكة الزجاج بين الشرائح يمكن أن تؤثر على محاذاة المجهر. - وضع التركيز جيدا داخل قطرة السائل (10-100 ميكرون من أسفل).
- في إطار "القياس"، حدد "شراء" علامة التبويب. اضغط على "الموقف الحالي" تحت عنوان "مواقف" (إطار C في الشكل 1).
- عودة إلى علامة التبويب "تكوين النظام" في نفس الإطار. تعيين ص عاليةower ليزر خضراء.
ملاحظة: قوة الليزر عالية تشير إلى قوة تشبع (أي إشارة الفلورسنت لا يزيد خطيا إذا تم زيادة قوة الليزر زيادة). حوالي 1 ميغاواط من نظام إعدادات الطاقة، أو 5-10٪ من قوة الليزر القصوى، هو عادة بما فيه الكفاية. - اختبار استقرار إشارة عن طريق الضغط على "ابدأ". هذا وسوف تفتح نافذة منفصلة عرض تتبع الوقت ومنحنى الارتباط الذاتي لقياس الحالي. تأكد من أن إشارة الفلورسنت عالية ومستقرة على مر الزمن، وتبين التقلبات في كيلو هرتز بدلا من النطاق هرتز.
- حدد زر "يا ضبط" في إطار "القياس". تحقق إذا تم تحديد قناة الكشف الصحيحة (CH1 CH2 أو). اضغط على "AutoAdjust اكس." إذا لم منحنى الناتج يظهر كحد أقصى واضح، أو الحد الأقصى هو على حافة، بمناسبة خيار "الخشنة" ثم اضغط على "AutoAdjust X" مرة أخرى. عند الانتهاء من الشاشة مما أدى إلى الأشعة الاتجاه، القيام سالي لY عن طريق الضغط على "AutoAdjust Y."
- دي حدد "الخشنة" وبالتناوب بين تعديل X و Y عن طريق الضغط على "AutoAdjust" حتى لديهما ماكسيما واضح وقيم لا تتغير بين القياسات.
- إذا وصفت الخلايا مع اثنين fluorophores مختلفة، والانتقال إلى غرفة حيث تمت إضافة حل fluorophore الأحمر. حدد قوة الليزر عالية ليزر أحمر وكرر الخطوات من 4،6-4،8 عن الإثارة والكشف عن القناة الحمراء.
ملاحظة: إذا تنحرف X و Y القيم بين القنوات في النظم التي تستخدم الثقب واحد فقط لكل من قنوات الكشف، وتحديد القيم المتوسطة واضغط موافق لقبول التغييرات. هنا، ليزر 488 نانومتر مع ماكسيما في X = 79 و Y = 189 و633 نانومتر ليزر مع ماكسيما في X = 80 و Y = 188، قيم X = 80 و Y = 189 تم اختيارهم. الجمع بين 488 نانومتر و 633 نانومتر ليزر لإثارة اثنين من الأجسام المضادة المسمى مع fluorophores متحمس من قبل 488 نانومتر أو 633 نانومتر هو خيار جيد، لأنيتم التقليل من خطر الإصابة عبر الحديث إذا أطياف الانبعاث لا تتداخل 2.
5. قياس زمن العبور من Fluorophore مجانية
ملاحظة: عن طريق تحديد وقت العبور من خلال التركيز (TauD) من fluorophore مع معامل الانتشار معروف، فإن حجم وحدة التخزين الكشف، وبالتالي فإن مجال غشاء الخلية التي هي في التركيز، ويمكن حساب. يوصف حساب TauD في الخطوة 7.2.
- باستخدام نفس الحلول المستخدمة لتعديل الثقب، ضبط الوقت اقتناء إلى 30 ثانية × 2 يكرر تحت علامة التبويب "اكتساب" في إطار "القياس" (الشكل 1، نافذة C).
- بدء القياس عن طريق النقر على "البدء" في إطار "القياس" (الشكل 1، نافذة B).
- إجراء الليزر سلسلة قوة لكل ليزر الإثارة وfluorophore المقابلة في الحل، ابتداء من الساعة أو بالقرب منهاتشبع الطاقة وخفض بمقدار النصف لكل قياس. تغيير قوة الليزر في "تكوين النظام" علامة التبويب من نافذة "القياس" (الشكل 1، نافذة C). اضغط على زر "ابدأ" لبدء القياس.
ملاحظة: تشمل قوة الليزر للقياسات الخلية القادمة في نطاق أقل (على سبيل المثال، قياس في 16، الطاقة 8 و 4 و 2 مللي واط، قبل الهدف) 20. ضبط الليزر النظام هي في أعلى عام من الإثارة الانتاج، ويمكن أن تختلف إلى حد كبير اعتمادا على المجهر ونوعية المحاذاة. في هذا النظام، ونطاق السلطة أعلاه يتوافق مع ما يقرب من 60 حتي 500 مللي واط من إعدادات نظام الطاقة. ينصح استخدام السلطة متر لقياس انتاج الطاقة قبل هدف أول مرة يتم استخدام المجهر الجديد. وجدت على الطاقة القصوى الحالية ليزر تحت زر "معلومات" من النافذة "القياس". - أكتب التهم لكل مولجزيء (CPM، وحدة: كيلوهرتز) من كل قياس قوة الليزر.
- إذا تم استخدام قناتين الكشف، والتحقق من نافذة عرض منحنى الارتباط الذاتي لعبر الحديث. استخدام محلول يحتوي فقط fluorophores الأخضر لقياس الكشف عن الارتباط الذاتي FCS في القناة كشف الحمراء والتوصل إلى حل مع fluorophores الحمراء الوحيدة لتقييم الاكتشاف في القناة كشف الخضراء. وكقاعدة عامة من الإبهام، والحفاظ على الاجتماع التحضيري للمؤتمر الكشف عن fluorophore "خاطئة" أقل من 5٪ من إشارة محددة من fluorophore المناسب.
- تأكد من أن القيم مقياس خطيا مع قوة الليزر المستخدمة. تشبع من الاجتماع التحضيري للمؤتمر على أعلى قوة الليزر (أي القيم أقل قليلا مما كان متوقعا من وجود علاقة خطية) مقبولة.
ملاحظة: يجب أن يكون الاجتماع التحضيري للمؤتمر أعلى بكثير من 10 لأعلى سلطة ليزر لجميع أنظمة المجهر تقريبا وfluorophores المشتركة ويمكن أن يكون أعلى بكثير لأنظمة حساسة. لأول مرة يتم استخدام الأجسام المضادة فلوري مترافق حديثا، وأداء لقياس FCS من الأجسام المضادة نشرها بحرية في حل لقياس الاجتماع التحضيري للمؤتمر المتوقع. قبل القياس، معطف غرفة قياس مع 200 ميكرولتر من بولي-L-يسين المطعمة مع البولي ايثيلين جلايكول (مخفف إلى 0.5 ملغ / مل في برنامج تلفزيوني) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. إزالة السائل مع الماصة والسماح للغرفة في الهواء الجاف. حفظ المحلول في الثلاجة (حتى 2 أسابيع) والأسهم مسحوق في الثلاجة. في المجهر، يخفف من الأجسام المضادة إلى 1-10 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني. اتبع الخطوات من 4،2-4،4 و 6.7 في هذا البروتوكول. إذا لم يتم المغلفة السطح مع حل غير لاصقة، والأجسام المضادة تتفاعل مع سطح الزجاج وأن تنفد بسرعة من الحل.
- إجراء الليزر سلسلة قوة لكل ليزر الإثارة وfluorophore المقابلة في الحل، ابتداء من الساعة أو بالقرب منهاتشبع الطاقة وخفض بمقدار النصف لكل قياس. تغيير قوة الليزر في "تكوين النظام" علامة التبويب من نافذة "القياس" (الشكل 1، نافذة C). اضغط على زر "ابدأ" لبدء القياس.
6. القياسات خلية
- إضافة 125 ميكرولتر من الخلايا في برنامج تلفزيوني + 1٪ FCS من تعليق المسمى الأجسام المضادة الخلايا (الخطوة 1.5) و 150 ميكرولتر من معهد روزويل بارك شفافة التذكارية المتوسطة 1640 (RPMI) إلى جانب واحد من شريحة ساترة غرف 8 جيدا. لوافي الخلايا في الظلام في قياس درجة الحرارة لمدة 20 دقيقة على الأقل قبل بدء القياسات FCS.
ملاحظة: هذا هو السماح للخلايا لتسوية ونعلق على الجزء السفلي من الآبار ولكي تتوازن الخلايا وحل لقياس درجة الحرارة. - في إطار "المسح تحكم" (الشكل 1، نافذة B)، تعيين التكبير 1 وبدء المسح الضوئي XY سريع عن طريق الضغط على زر "XY سريع". تعديل قوة الليزر بحيث يكون في أدنى مستوى ممكن في حين أن الخلايا لا تزال واضحة للعيان. توسيط الصورة على خلية الجولة متوسط السطوع، حيث يتم تعريف غشاء بشكل واضح وليس هناك إشارة الفلورسنت في السيتوبلازم. تكبير حتى تغطي الخلية أكثر من صورة.
- حدد خلية جديدة إذا كانت الخلية الحالية يتحرك أو يعرض المحلاق، سحب، أو النقاط المضيئة للغاية. الحفاظ على نفس التكبير وقوة الليزر لجميع خلايا استولي عليه خلال نفس التجربة.
ملاحظة: غشاء تكدرت يمكن أيضا أن تكون علامة على APO القادمإطراق. - التركيز على الجزء العلوي من غشاء الخلية. في "اكتساب" علامة التبويب "قياس" نافذة (الشكل 1، نافذة C)، وحدد موقف لقياس FCS من خلال تفعيل "التقاطع". بدلا من ذلك، حدد "LSM صورة" علامة التبويب، بمناسبة بقعة القياس المطلوبين في صورة مغلق، ثم اضغط على "أضف الموقف."
ملاحظة: الجزء العلوي من غشاء الخلية لن تتأثر الأجسام المضادة الفلورسنت أو fluorophores ملزمة unspecifically للبولي-L-ليسين. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن الخلية لا تتحرك أثناء القياس (انظر النتائج). - في "اكتساب" علامة التبويب من نافذة "القياس" (الشكل 1، نافذة C)، تعيين عدد من يكرر إلى 6-10، مع "قياس الوقت" وضعت في 10 ثانية لكل تكرار.
- العودة إلى "تكوين النظام" علامة التبويب من نافذة "القياس". ضبط قوة الليزر لقياس FCS تحت "Lعسير زر ". وقبل الهدف، واستخدام الطاقة المنخفضة لقياس الخلية، في نطاق بين 1 و 10 مللي واط 20.
ملاحظة: القيم الموصى بها هي مفاضلة بين الكشف عن إشارة وphotodamage إلى الخلايا. راجع الخطوة 5.2.1 ملاحظة النسبة المئوية للقوة الليزر هذه القيم تتوافق مع. - بدء تشغيل قياس FCS عن طريق الضغط على "ابدأ" في "قياس" نافذة (إطار C). إذا كان التبييض الخلايا بشكل ملحوظ في بداية القياس، والكشف عن انخفاض في تتبع كثافة بأكثر من 30٪ خلال أول 10 ثانية (ويرد مثال في الشكل 3A، اللوحة السفلى)، والانتقال إلى خلية أخرى وأقل قوة الليزر لقياس المستقبل.
- في حالة فقدان إشارة، وضبط التركيز في Z-الاتجاه. بعد قياس كاملة، واستخدام "المسح الضوئي تحكم" نافذة (الشكل 1، نافذة B) للتأكد من أن الخلايا لا تزال تتركز والتي تم قياس غشاء الخلية. إذا والعشرينانتقلت خلية ه، ونبذ القياس.
- في إطار صناعة السيارات في الارتباط حيث يتم عرض قياس احذف يكرر الفردية التي تحتوي على المناورات والتكبير، التبييض، مجموعات كبيرة، أو غيرها من الأعمال الفنية (انظر الأمثلة في الشكل 3). القيام بذلك عن طريق وضع العلامات عليها، النقر بزر الماوس الأيمن واختيار "حذف". حفظ الملف النهائي في شكل .fcs. إنقاذ أربعة أشخاص على الأقل يكرر في كل خلية.
- اختياريا، الحصول على صورة من الخلايا في الجزء الأوسط (مع محيط كامل من غشاء المرئي) باستخدام إطار "التحكم تفحص". التقاط الصورة بعد قياس FCS لتجنب التبييض. اضغط على زر "واحدة" لبدء التقاط الصور.
- في حالة استخدام "إضافة موقف" للتركيز المواقع FCS، انقر فوق "إزالة موقف" قبل الانتقال إلى الخلية التالية.
- تغيير قسامة جديدة من التعليق الخلية بعد بحد أقصى 2 ساعة القياس للحفاظ على خلايا throughou قابلة للحياةر التجربة.
7. تحليل FCS
- فتح ملفات .fcs في برنامج مع القدرة على منحنى المناسب (انظر المواد / الكواشف الجدول لالبرمجيات المستخدمة في هذا البروتوكول).
ملاحظة: البرنامج FCS التي تأتي مع المجهر هو مكان جيد للتعرف على تركيب الأساسية، ولكن برامج إضافية ضروري لتتناسب مع ثنائي الأبعاد نشر الغشاء. - أولا، تحديد حجم وحدة التخزين الإثارة من خلال تحليل القياسات fluorophore الحرة. تناسب منحنى الانتشار مجانا 3-الأبعاد للمنحنيات الارتباط الذاتي 21.
(المعادلة 1)
ملاحظة: تعريف المعلمات: N: يعني عدد من الكيانات الفلورسنت في الحجم البؤري، τ (تاو): وقت الارتباط، τ D (TauD): متوسط فترة بقاء في الحجم البؤري، تي 1: احتمال للfluorophores ليكون في الدولة الثلاثي، τ <فرعية> T: وقت الاسترخاء لانتقالات حالة القميص-الثلاثي، S: نسبة الارتفاع إلى العرض قطرها عن الحجم البؤري.- استخراج TauD، ووقت عبور الجزيئات لنقل التركيز.
- استخدام احظ TauD ونشرت معاملات نشر (د) من fluorophores تستخدم لمعايرة 18 و 19 لحساب نصف قطر الثقب (ω).
(المعادلة 2)
- تحليل المنحنيات الارتباط الذاتي على أغشية الخلايا.
- لتصور جزء من المنحنى الذي يمثل الانتشار الجزيئي، حدد الإطار الزمني ابتداء من قبل أشد انحدار منحنى الارتباط الذاتي وتنتهي بعد التقارب منحنى في 1 (على سبيل المثال، 0،001-5 ثانية لمستقبلات سطح الفئران، انظر الشكل 4).
- إنشاء منحنى متوسط الارتباط الذاتي من يكرر الفردية المحفوظة طن خطوة 6.7.2.
- تناسب منحنى غشاء نشر 2-الأبعاد لكل بلغ متوسط منحنى الارتباط الذاتي باستخدام المعادلة 3 3.
(المعادلة 3)
ملاحظة: معلمات الإخراج مهمة هي على النحو التالي: N هو متوسط عدد جزيئات المقيمين داخل منطقة غشاء متحمس. حساب الكثافة (N / ميكرون 2). τ D (TauD): متوسط فترة بقاء في منطقة الوصل، مقيدة للأبعاد اثنين من غشاء (ق). حساب متوسط فترة بقاء لمعامل الانتشار (ميكرومتر 2 / ثانية) عبر دائرة نصف قطرها مصمم الثقب (ω) ومعادلة 2. T1 هو احتمال لfluorophores أن يكون في حالة الثلاثي. يتم حساب سطوع (CPM) بقسمة متوسط كثافة العامة للقياس من قبل نون - وإذا لم يتحقق مناسبا في المحاولة الأولى، وتغيير القيم بدءا و / أو الحدود العليا والدنيا للمتغيرات حتى ثيويتحقق الصورة.
ملاحظة: حدود النموذجية الأسفل والأعلى لمعدلات انتشار البروتين في أغشية الخلايا الأساسية هي 10-500 ميللي ثانية لTauD، 0-100٪ لT1، و0،1-5 مللي ثانية لTauT1. حدد بدء القيم لتركيب في منتصف هذه الفواصل الزمنية. جزء من المنحنى الذي يمثل تقلبات مضان المستمدة من انتشار يقع عادة بين 1 ميللي ثانية و 1 ثانية (انظر الشكل 4). اعتمادا على fluorophore، يمكن أن يكون هناك في بعض الأحيان عملية الثاني الحالي، مما أدى إلى الارتباط الذاتي في فترات زمنية أقصر من المعلمة نشرها. يحدث هذا بسبب حالة الظلام عابرة (الثلاثي) أو تطرف (كما يحدث في كثير من الأحيان للالبروتينات الفلورية). يتم احتساب فالدولة الثلاثي لفي المعادلة 3، وينبغي أن النموذج المقدم بالتالي توفر أيضا مناسبا في هذه الحالات.
(المعادلة 1) 
(المعادلة 2) 
(المعادلة 3) Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونتيجة نموذجية توليد منحنى الارتباط الذاتي مع الوقت العابر في حدود 10 مللي ثانية إلى 400 مللي ثانية للبروتينات الغشاء. عدد الجزيئات يمكن أن تختلف بين 0.5 إلى نحو 200 في ميكرون 2 للبروتينات وأعرب التطور الطبيعي. التحقق بعناية أن الاجتماع التحضيري للمؤتمر ليس أقل مما كان متوقعا. وهذا قد يعني أن هناك تأثير للإشارة الخلفية. وكقاعدة عامة، لا ينبغي أن يكون إشارة الاجتماع التحضيري للمؤتمر على الخلايا التي يتم قبولها لتحليل أقل من 33٪ من الاجتماع التحضيري للمؤتمر لنزع فتيل بحرية الأجسام المضادة في قوة الليزر نفسها. الاجتماع التحضيري للمؤتمر يجب تحجيم خطيا مع قوة الليزر. ومن المتوقع أن يكون على نحو سلس، مع الجزء أشد بين 0.001 و 1 ثانية منحنى الارتباط الذاتي لمستقبلات سطح الخلايا المناعية الأولية. انظر الشكل 2 لمنحنى الارتباط الذاتي تمثيلا والتتبع وقته.
كما ذكر لفترة وجيزة في المقدمة،إعادة لعدة حالات حيث FCS ليست مناسبة لقياس الانتشار الجزيئي بسبب تأثير مصادر أخرى للتقلبات مضان، التي تساهم في ارباك إشارة. ويبين الشكل 3 أمثلة على الحالات التي يجب التخلص من خلية أو قياس تكرار معين. وقد سبقت الإشارة إلى أنه إشارة منخفضة للغاية (CPM منخفضة جدا) ويسبب لالتخلص من الخلايا. وهناك سبب آخر لالتخلص من الخلايا الفردية هو أن الخلية تتحرك (الشكل 3A). في حالة تبيض (الشكل 3B) أو إذا مجموعات كبيرة موجودة (الشكل 3C)، يجب التخلص من القياسات إذا كان تأثير كبير أو حاضرا خلال قياس كله. إذا كانت هذه الميزة موجودة فقط في واحد أو اثنين من يكرر، قد يتم تجاهل هذه التكرارات الفردية، ولكن ربما لا تزال تستخدم يكرر المتبقية.
ومن المهم على حد سواء استخدام الصحيحنموذج لاحتواء البيانات وأيضا للتحقق بعناية أن يصلح يتداخل بشكل وثيق مع منحنى الارتباط الذاتي. في الشكل (4)، وتظهر أمثلة من نوبات منحنى الجيدة والسيئة. إيلاء اهتمام وثيق من جانب نشر منحنى تمثل (الجزء المنحدرة الأكثر حاد). ومن المهم أيضا للتأكد من أن كلا من بداية ونهاية الجزء المنحدرة من منحنى مهيأة بشكل جيد في النموذج. إذا كان لائقا سيئة، دون مشاكل واضحة مثل الحركة، وتبيض، أو مجموعات، تعديل القيم البداية و / أو الحدود العليا والدنيا (ضمن نطاق معقول) قبل اتخاذ قرار نهائي لتجاهل الخلية.
الشكل 1: واجهة البرنامج FCS. المعروضة هنا هي النوافذ الرئيسية اللازمة لتشغيل أداة برمجية لاكتساب FCS والتصوير، كما هو موضح في البروتوكول. نافذة لل، و "شركة تكوينntrol "نافذة إطار التحكم عن مسار الشعاع، وقنوات ليزر، والمرشحات للتصوير. النافذة B هو" مسح تحكم "نافذة للتصوير ويظهر إعدادات المسح الضوئي. النافذة C هو" قياس "النافذة، نافذة لل إعداد إعدادات قياس FCS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: أثر الممثل والارتباط الذاتي منحنيات نشرها من الدرجة الرابعة التوافق النسيجي الرئيسية-H 2D أنا سطح الجزيئات في الفئران المعزولة حديثا الخلايا القاتلة الطبيعية. تظهر لوحة العليا في الشكل التقلبات مضان بوصفها وظيفة من الزمن في جميع أنحاء الوقت أثر كاملة من 7X 10 القياسات ثانية. تمثل اللوحة السفلىق منحنى الارتباط الذاتي متوسط من هذه تكرار سبعة. ارتفاع منحنى الارتباط الذاتي يتناسب عكسيا مع تركيز fluorescently المحمول المسمى الكيانات د H-2D في الحجم البؤري. قيمة محور س في الجزء أشد المنحدر من منحنى، نصف السعة، ويمثل متوسط فترة بقاء fluorescently المسمى H-2D جزيئات د في الحجم البؤري. قياس قدم هو جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): أمثلة من آثار خلية إشكالية. (أ) خلية متحركة، كما يتضح من أثر عدم وجود مستقر القاعدية جنيه فيل. تظهر لوحة أعلى على سبيل المثال حيث انتقلت من خلية كاملة من التركيز بعد حوالي 35 ثانية، ممثلا في إشارة منخفضة جدا بعد هذه النقطة الوقت. في اللوحة السفلى، وأثر هو أكثر دقة، مع تموجات واضحة في الفترة الفاصلة من عدة ثوان. (ب) الخلية يعرض التبييض، وارتفاع أثر تناقص مع مرور الوقت. مقارنة ارتفاع التتبع في بداية القياس لأنه في نهاية القياس. (ج) وجود مجموعات كبيرة، ممثلة المسامير في التتبع. في لوحة العلوي، واحدة كتلة كبيرة في 20-25 ثانية موجودة. في اللوحة السفلى، عدة مجموعات موجودة في جميع أنحاء القياس. القياسات المقدمة هي جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
er.within الصفحات = "1"> 
الشكل 4: منحنيات الارتباط الذاتي التمثيلية مع منحنى العظام والبقايا. تمثل خطوط عمودية حمراء وزرقاء حدود النافذة مرة تستخدم لتركيب. (أ) مثال لصالح الممثلين نموذج نشر 2-الأبعاد إلى منحنى عينة الارتباط الذاتي. في لوحة العلوي، ومنحنى الأخضر (نموذج) يعلو منحنى الأزرق (والارتباط الذاتي المكتسبة)، مما يدل على حسن صالح. تظهر لوحة أقل المتبقي من منحنى المناسب. تقلبات حوالي 1 ثانية، والتي لم يتم تركيبها بشكل جيد، هي نموذجية لقياس الخلايا وتكون مقبولة. (ب) مثال من نوبة سيئة للنشر 2-الأبعاد لنفس منحنى الارتباط الذاتي. نموذج المجهزة لا تراكب منحنى الارتباط الذاتي، وأنها لا تتلاقى في 1. في أقل الألواح في (A و B) تظهر المتبقي من منحنى المناسب. المخلفاتهي أكبر بكثير لنوبة سيئة، وخصوصا للمناطق انتشار المنحنى. قياس قدم هو جزء من مجموعة البيانات المنشورة في اشارة 2. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هذا البروتوكول لFCS يمكن استخدامها لتقييم ديناميات الجزيئية لجزيئات على سطح كل أنواع من الخلايا المناعية (الفئران والبشرية، أو الأنواع الأخرى). تدابير FCS الجزيئية ديناميات المكانية والزمانية وصولا الى قرار جزيء واحد في الخلايا الحية. كثافة الجزيئية، فضلا عن معدل الانتشار وتجميع ديناميات البروتينات من الفائدة، يمكن استخلاصها من منحنيات الارتباط الذاتي.
وضع العلامات الفلورية له أهمية محورية للتجارب FCS ناجحة. وقد جرت العادة على تسمية البروتينات من الفائدة على غشاء الخلية باستخدام الأجسام المضادة، والأجسام المضادة وغالبا ما تكون الأكثر ملاءمة للاستخدام على سطح البروتينات في الخلايا المناعية ساذجة. الأجسام المضادة غير المسماة يجب مترافق مباشرة إلى الأصباغ الفلورية صورة مستقرة مع سطوع عالية الجزيئية. اختيار fluorophore لتصريف الأجسام المضادة مهم لجودة القياسات. تسميات موحدة لالتدفق الخلوي،مثل فلوريسئين والأصباغ القائم على فيكوإيريترين، لا ينصح بسبب تبييض السريع. يتم توفير الأصباغ صورة مستقرة للاقتران المباشر إلى أجسام حاليا من قبل العديد من الشركات. دائما ما تقدم الشركات المصنعة للبروتوكولات مرضية للتصريف وتنقية الأجسام المضادة مترافق الناتجة عن ذلك، وهذا يمكن أن يتم في غضون ساعات قليلة. ومن الممكن أيضا لأداء السفح باستخدام البروتينات الفلورية، ولكن ينبغي إيلاء عناية خاصة لتقليل قوة الليزر، منذ البروتينات الفلورية وبشكل عام أكثر عرضة للتبيض من معظم fluorophores الكيميائية صورة مستقرة. وفقا لخبرة سابقة، والإفراط في التعبير عن البروتينات غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كبير في معدل الانتشار بسبب الازدحام، مما يجعل استخدام البروتينات الفلورية غير مناسبة.
معايرة ذات الثقب قبل القياسات هي أيضا خطوة حاسمة. وfluorophores المستخدمة لتحديد حجم وحدة التخزين التنسيق يجب أن يكون معروفا معامل الانتشارالصورة (انظر المعادلة 2). استخدام fluorophores حرة المقابلة ارتباطا وثيقا أطياف الانبعاث من التسميات الأجسام المضادة لتحديد حجم وحدة التخزين البؤري. يجب أن يتم ذلك لضمان الكفاءة إشارة الأمثل وكشف المناسب لالمحتملة عبر الارتباط بين قنوات اللون. إجراء FCS سلسلة قوة الليزر للfluorophores نشرها بحرية للتأكد من أن النظام يعطي إشارة خرج المتوقع على نطاق وبين السلطات. مقارنة الاجتماع التحضيري للمؤتمر في قوة الليزر نفسها بين التجارب لضمان الاتساق بين التجارب.
في خطوة التحليل، فمن الضروري وضع حدود معقولة والقيم انطلاق للمتغيرات عندما تركب النماذج. استخدام المعرفة التي نشرت في وقت سابق من أنظمة خلايا مماثلة للعثور على نقطة انطلاق جيدة. من الناحية النظرية، FCS هو أسلوب الكمية، ولكن منذ الظروف المثلى نادرا ما يحدث، وعلى درجة معينة من الحذر يجب أن يؤخذ عند تفسير النتائج. وسوف يتم تسجيل جميع أنواع التقلبات،بغض النظر عن منشأ هذه التقلبات. وبالتالي، فإنه من المفيد أن يكون أكبر قدر من المعلومات الممكنة حول النظام التجريبي من أجل استبعاد مصادر الخطأ المحتملة. على سبيل المثال، سوف تنقل غشاء الخلية كله يؤدي إلى تقلبات مع أطول TauD (الشكل 3A)، في حين أن الملوثات المفترضة من fluorophores الحرة في الحل ومنتشر مع عشر مرات على الأقل أقصر TauD.
هذا البروتوكول الأساسي يمكن تعديله في عدة طرق. إذا وصفت اثنين من البروتينات مع fluorophores مختلفة، وشارك في نشر (مقياس غير مباشر من التفاعل) يمكن تقييم من خلال توسيع منهجية للكشف عن عبر الارتباط. ويمثل مدى هذه البروتينات تربط مع بعضها البعض في غشاء الخلية من طول منحنى عبر ارتباط نسبة إلى ارتفاع منحنيات الارتباط الذاتي للقنوات الألوان الفردية. يرمز عبر الارتباط كما CH1-CH2 في برنامج القياس. ما قبلتحليل CISE من عبر ارتباط يتطلب ضوابط عبر الحديث وبالتالي فهي إلى حد ما أكثر تعقيدا من بروتوكول المعروضة هنا. وصف مفصل لكيفية المضي قدما، امتدادا لهذا البروتوكول الأساسي، ويمكن العثور عليها في Strömqvist وآخرون. 13. لتحسين المواقع في زي الاتجاه، FCS-مسح ض يمكن استخدام 22. وفقا لتجربة السابقة، فقد كان مرضيا للقيام بذلك يدويا. ومن الممكن أيضا لتتناسب مع عدة معاملات نشر لمنحنى الارتباط الذاتي FCS 23. وهذا يتطلب معرفة سابقة لعدد من الفئات السكانية ذات معدلات الانتشار المختلفة ومعدلات انتشار التقريبية واحد على الأقل من القطعان. خلاف ذلك، سيكون هناك الكثير من المتغيرات الحرة، والتي سوف تجعل من المناسب وغير موثوق بها. ومن الأمثلة النموذجية تكون بروتين السطح الذي تباطأ بشكل ملحوظ بنسبة الربط ليجند معدل الانتشار. وأخيرا، تنظيف ونانوغرام أثر القيم المتطرفة دون تكرار إزالة تماما من الممكن 24.
عدم وجود إشارة الفلورسنت هي مشكلة مشتركة لاستكشاف. لنزع فتيل fluorophores بحرية، استخدام مصابيح الهالوجين لمعرفة ما اذا كان الانخفاض الفلورسنت. إذا كان الانخفاض ليس الفلورسنت، مزيج دفعة جديدة من fluorophores مع زيادة طفيفة في تركيز (ضمن نطاق نانومتر) وحاول مرة أخرى. تأكد من أن يتم داخل قطرة الفلورسنت، وتحول تركيز أشعة الليزر على في البرنامج، وقوة الليزر كافية، ويتم اختيار المرشحات الانبعاثات الصحيحة وكاشفات، ويتم تنشيط القنوات الصحيحة في إطار "FCS القياس" (راجع الخطوة 3.6). بدء تشغيل الليزر والبحث من جانب لتأكيد بصريا أن ضوء الليزر يصل العينة. تجنب النظر مباشرة إلى مصدر الليزر. إذا يشمل تصفية الانبعاثات اختيار الطول الموجي ليزر، ومصراع كتلة تلقائيا مسار الضوء لتجنب الأضرار التي لحقت كاشف. أناو كل الإعدادات على ما يرام ولكن لا يوجد ضوء وصول، وإعادة تشغيل جهاز أشعة الليزر، ونظام FCS، والكمبيوتر. اسأل خبير إذا كان عدم وجود إشارة الفلورسنت لا يزال قائما. وينطبق إجراءات مبسطة إذا كانت الخلايا المسمى لا يتم عرض مضان. تأكد من وجود مضان مع مصابيح الهالوجين. بدوره على الليزر، اختيار القنوات الليزر، وضبط قوة الليزر. تحديد موقف من غشاء الخلية، إما باستخدام "التقاطع" أو خيار "إضافة موقف" (راجع الخطوة 6.4). التبديل إلى عينة المقبلة إذا كانت إشارة لا تزال منخفضة جدا.
أحد الجوانب الهامة للأساس تذبذب التقنية هو أن الجزيئات يجب أن تكون متحركة بشكل معقول ليتم الكشف. تتحرك ببطء شديد أجزاء من الجزيئات أو جزيئات المحاصرين داخل مناطق أصغر من التركيز خلال فترة القياس كله بالتالي لا يمكن قياسها. وهذا يؤدي إلى التقليل ممكن من الكثافة السطحية والمبالغة في تقدير معدل الانتشار. تبيضويمكن أيضا أن تسهم في التقليل المفترض من كل من الكثافة وTauD، منذ الجزيئات سوف يكون لها احتمال أكبر من أن تبييض قتا أطول ينفقون في الحجم البؤري مضيئة ليزر. سيكون تأثير من الخلفية (مضان من خارج البؤري)، من ناحية أخرى، وزيادة مصطنعة عدد الجزيئات الكشف عن ويقلل من الاجتماع التحضيري للمؤتمر قياسها. سابقا، تم تقدير الخطأ الأقصى الكلي في تحديد كثافة المطلق أن يكون حوالي 40٪ 20. ومع ذلك، فمن الممكن عادة لمقارنة العينات البيولوجية المختلفة لبعضها البعض، حيث أن مصادر الخطأ هي، في معظم الحالات، على قدم المساواة في جميع أنحاء التجارب. مصدر الخطأ محتمل آخر هو أن الأجسام المضادة هي الثنائي التكافؤ، وهذا يعني أن كل الأجسام المضادة يمكن أن يحتمل ربط اثنين من الجزيئات المستهدفة. إلا أن الكتاب لم تلتزم هذه الظاهرة، ولكن لا يمكن ضمان أن هذه الميزة العالمية للأجسام أخرى. التأثير المحتمل لثنائية التكافؤ يجبوبالتالي يتم اختبارها بشكل فردي لكل الأجسام المضادة. مزيج من الأجسام المضادة الابتدائية وصفت محددة يجب ألا تستخدم أبدا بسبب المخاطر العالية على إحداث مجموعات الاصطناعية من تسميات اثنين الثنائي التكافؤ المتعاقبة. إذا وبدلا من ذلك تم transfected الخلايا مع إصدارات الفلورسنت المسمى البروتين من البروتين من الفائدة، فإن كل البروتين يكون تسمية واحدة فقط. ومع ذلك، وهذا يتطلب ترنسفكأيشن، وهي ليست دائما مرغوب فيه وربما لا يكون من الممكن (على سبيل المثال، إذا كان استخدام الخلايا المناعية معزولة مباشرة من الدم البشري). وأخيرا، نقطة واحدة FCS لا تسجيل الصور. إذا كانت هناك حاجة الصور للنشر أو لأغراض أخرى، وهذه يجب أن يتم القبض على حدة باستخدام جزء تصوير البرنامج. دائما التقاط الصور بعد القياسات FCS لتجنب التبييض لا لزوم لها على سطح الخلية.
على عكس FCS، المجهري القائم متحد البؤر التقليدية، مثل FRAP، ومنهجيات صورة ارتباط لا يمكن قياس تقلبات مضانعلى مستوى جزيء واحد (6). منهجيات صورة ارتباط قياس عدد جزيئات غير مباشر ومع دقة أقل، ولكنها يمكن تقييم التغير في الانتشار الجزيئي والتجميع على المنطقة بأسرها المصورة 25. معيار SPT قياسها بواسطة المجهر متحد البؤر ديه مستوى مثالي من وضع العلامات، وأوامر من حجم أقل من FCS 7. ولذلك، فإن الكثافة من البروتينات المسمى لا يمكن أن يقاس معيار الفرعية. الجمع بين SPT مع تقنيات المجهر الأخرى (على سبيل المثال، ستوكاستيك المجهر إعادة البناء الضوئي أو تنشيط ضوئي توطين المجهر) يسمح للكثافة وحركة على أن يقسم، ولكنه يتطلب الأصباغ متخصصة جدا أو البروتينات 11. تقنيات فائقة الدقة، مثل عينات غالبا ما تتطلب ثابت منظم إضاءة المجهر والانبعاث المستحث المنضب المجهر، ومزيج من التعليم الابتدائي والأجسام المضادة الثانوية للlabelinز 26. وبالتالي توطين دقيق جدا، في حين أن ديناميات النظام لا يمكن في كثير من الأحيان يتم تقييمها. بالمقارنة مع اللجنة الفرعية وتقنيات فائقة الدقة، كما يتطلب FCS أقل بكثير طاقة الكمبيوتر والوقت لتحليل واستخراج النتائج. التدفق الخلوي هو العمود الفقري لعلم المناعة ويمكن الجمع بين ايجابيا مع FCS. يمكن، على سبيل المثال، ينبغي اتباعها الفرز الخلية عن طريق القياسات اللاحقة على السكان الخلية المحددة إذا استخدمت-صورة مستقرة الأصباغ قبل الفرز. FCS بالتالي هو المنهجية التي يمكن استخدامها وحدها أو بالاشتراك مع الأساليب الأخرى.
ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد ملامح غير معروفة حاليا ديناميات الخلايا المناعية والتفاعلات داخل غشاء الخلية على مستوى جزيء واحد. وعلاوة على ذلك، ملامح السكان كله مقابل فرعية مختارة يمكن مقارنتها. كما أن لديها دور محتمل كخطوة اختيار العلاج الخلايا المناعية. منذ القياسات تفعللا تستهلك الخلية، على عكس معظم وسائل أخرى للتحقيق في وظيفة الخلايا المناعية، يمكن أن الخلايا الفردية المحتمل أن تعافى ومثقف. وهكذا، وبعد تحليل منحنيات FCS، خلايا واعدة يمكن استخراج وتوسيعها لتطبيقات إضافية، بما في ذلك التطبيقات السريرية المفترضة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر الدكتور Vladana Vukojeviç، مركز الطب الجزيئي، معهد كارولينسكا للصيانة وثيقة زايس Confocor 3 و للحصول على نصائح مفيدة بشأن القياسات الخلية. وقد تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من Vetenskapsrådet (منحة رقم 2012- 1629)، ماغنوس Bergvalls stiftelse، ومن STIFTELSEN كلايس Groschinskys minnesfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
- Goni, F. M. The basic structure and dynamics of cell membranes: an update of the Singer-Nicolson model. Biochim Biophys Acta. 1838, 1467-1476 (2014).
- Bagawath-Singh, S., et al. Cytokines Induce Faster Membrane Diffusion of MHC Class I and the Ly49A Receptor in a Subpopulation of Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, (2016).
- Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy for the study of membrane dynamics and protein/lipid interactions. Methods. 46, 116-122 (2008).
- Machan, R., Wohland, T. Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems. FEBS Lett. 588, 3571-3584 (2014).
- Mutze, J., Ohrt, T., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy in vivo. Laser Photon Rev. 5, 52-67 (2011).
- Lidke, D. S., Wilson, B. S. Caught in the act: quantifying protein behaviour in living cells. Trends Cell Biol. 19, 566-574 (2009).
- Manzo, C., Garcia-Parajo, M. F. A review of progress in single particle tracking: from methods to biophysical insights. Rep Prog Phys. 78, 124601 (2015).
- Wiseman, P. W. Image correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 336-348 (2015).
- Sankaran, J., Shi, X., Ho, L. Y., Stelzer, E. H., Wohland, T. ImFCS: a software for imaging FCS data analysis and visualization. Opt Express. 18, 25468-25481 (2010).
- Liu, P., Ahmed, S., Wohland, T. The F-techniques: advances in receptor protein studies. Trends Endocrinol Metab. 19, 181-190 (2008).
- Manley, S., et al. High-density mapping of single-molecule trajectories with photoactivated localization microscopy. Nat Methods. 5, 155-157 (2008).
- Bacia, K., Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: principles and applications. Cold Spring Harb Protoc. , 709-725 (2014).
- Haustein, E., Schwille, P. Fluorescence correlation spectroscopy: novel variations of an established technique. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 36, 151-169 (2007).
- Widengren, J., Thyberg, P. FCS cell surface measurements--photophysical limitations and consequences on molecular ensembles with heterogenic mobilities. Cytometry A. 68, 101-112 (2005).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. J Cell Biol. 172, 9-18 (2006).
- Meinhardt, K., et al. Influence of NK cell magnetic bead isolation methods on phenotype and function of murine NK cells. J Immunol Methods. 378, 1-10 (2012).
- Bacia, K., Schwille, P. Practical guidelines for dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat Protoc. 2, 2842-2856 (2007).
- Gendron, P. O., Avaltroni, F., Wilkinson, K. J. Diffusion coefficients of several rhodamine derivatives as determined by pulsed field gradient-nuclear magnetic resonance and fluorescence correlation spectroscopy. J Fluoresc. 18, 1093-1101 (2008).
- Petrasek, Z., Schwille, P. Precise measurement of diffusion coefficients using scanning fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 94, 1437-1448 (2008).
- Stromqvist, J., et al. A modified FCCS procedure applied to Ly49A-MHC class I cis-interaction studies in cell membranes. Biophys J. 101, 1257-1269 (2011).
- Widengren, J., Mets, U., Rigler, R. Fluorescence Correlation Spectroscopy of Triplet-States in Solution - a Theoretical and Experimental-Study. J Phys Chem. 99, 13368-13379 (1995).
- Humpolickova, J., et al. Probing diffusion laws within cellular membranes by Z-scan fluorescence correlation spectroscopy. Biophys J. 91, L23-L25 (2006).
- Guo, S. M., et al. Bayesian approach to the analysis of fluorescence correlation spectroscopy data II: application to simulated and in vitro data. Anal Chem. 84, 3880-3888 (2012).
- Ries, J., et al. Automated suppression of sample-related artifacts in Fluorescence Correlation Spectroscopy. Opt Express. 18, 11073-11082 (2010).
- Chiu, C. L., et al. Intracellular kinetics of the androgen receptor shown by multimodal Image Correlation Spectroscopy (mICS). Sci Rep. 6, 22435 (2016).
- Wegel, E., et al. Imaging cellular structures in super-resolution with SIM, STED and Localisation Microscopy: A practical comparison. Sci Rep. 6, 27290 (2016).
