Abstract
espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una poderosa técnica para el estudio de la difusión de las moléculas dentro de las membranas biológicas con una alta resolución espacial y temporal. FCS puede cuantificar el coeficiente de concentración y la difusión molecular de moléculas marcadas con fluorescencia en la membrana celular. Esta técnica tiene la capacidad de explorar las características de difusión molecular de las moléculas en la membrana plasmática de las células inmunes en el estado de equilibrio (es decir, sin procesos que afectan el resultado durante el tiempo de medición real). FCS es adecuado para el estudio de la difusión de las proteínas que se expresan en niveles típicos de proteínas más endógenas. Aquí, se demuestra un método sencillo y robusto para determinar la velocidad de difusión de las proteínas de la membrana celular en los linfocitos primarios. se describen Una manera eficaz de realizar mediciones en células vivas de anticuerpos manchados y observaciones que ocurren comúnmente después de la adquisición. Los avances recientesen el desarrollo de los tintes fluorescentes foto-estable pueden ser utilizados por la conjugación de los anticuerpos de interés de apropiarse de tintes que no usar lejía ampliamente durante las mediciones. Además, esto permite la detección de entidades que se difunden lentamente, lo que es una característica común de las proteínas expresadas en las membranas celulares. se pone de relieve el procedimiento de análisis para extraer parámetros de concentración y de difusión molecular a partir de las curvas de autocorrelación generados. En resumen, se proporciona un protocolo básico para las mediciones de FCS; que puede ser seguido por los inmunólogos con una comprensión de la microscopía confocal, pero con ninguna otra experiencia anterior de técnicas para la medición de parámetros dinámicos, tales como velocidades de difusión molecular.
Introduction
Muchas funciones células inmunes se basan en la difusión molecular y las interacciones dentro de las membranas. Las membranas biológicas son complejos, y muchos factores que pueden ser importantes para la función de las células inmunes puede influir en la velocidad de difusión de traslación de las proteínas dentro de las membranas celulares 1. Recientemente, hemos mostrado que las células asesinas naturales (NK), los linfocitos que pertenecen al sistema inmune innato, exhiben la difusión diferencial de dos proteínas estudiadas en la membrana celular en función del estado de activación de las células NK 2.
espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) es una técnica que es capaz de cuantificar las velocidades de difusión molecular dentro de las membranas biológicas. Se informa de la velocidad de difusión media de la etiqueta fluorescente moléculas en un volumen fijo, por lo general en el foco de un microscopio confocal. Se basa en la medición de las fluctuaciones de la fluorescencia que se producen tras el movimiento molecular enun sistema en estado estacionario. FCS ha sido ampliamente utilizado para el estudio de la difusión de los tintes fluorescentes y proteínas, tanto en solución y dentro de las membranas lipídicas. Otros parámetros de salida que afectan a la velocidad de difusión también pueden ser estudiados indirectamente de esta manera (por ejemplo, los cambios conformacionales de proteínas o interacciones de las moléculas en las membranas celulares) 3, 4. FCS se destaca en comparación con otras técnicas debido a su alta sensibilidad, lo que permite la posibilidad para la detección de moléculas individuales. Funciona bien para concentraciones moleculares en el rango nanomolar a milimolar, que es típico de los niveles de expresión endógenos de la mayoría de las proteínas 5. Por otra parte, FCS puede dar una aproximación del número absoluto de proteínas dentro del volumen estudiado, mientras que la mayoría de otras técnicas sólo dan información relativa sobre los niveles de expresión de proteínas. Otros métodos para medir la velocidad de difusión molecular dentro de las membranas incluyen fluocencia de recuperación después de photobleaching (FRAP), solo rastreo de partículas (SPT), múltiples estenopeica FCS, y correlación de imagen métodos. Métodos FRAP y de correlación de imágenes son técnicas por conjuntos, que por lo general no dan información sobre el número absoluto de moléculas 10. En comparación con SPT, el rendimiento de FCS es mayor en lo que se refiere a la caracterización de la media de la población. El análisis también es menos exigente, ya que se mide la velocidad de difusión media de las moléculas presentes en el foco del láser, en lugar de la velocidad de moléculas individuales. También, a menos microscopios especializados están disponibles 11, SPT puede no da ninguna información acerca de las concentraciones, ya etiquetado estándar SPT debe ser muy bajo para permitir la identificación de moléculas individuales. Por otro lado, FCS requiere las moléculas en estudio sean móviles. Simplemente no detectará ningún fracciones inmóviles putativos o moléculas que se mueven muy lentamente. La tasa de difusión de las moléculas queresidir dentro del enfoque más de aproximadamente un décimo del tiempo de adquisición no será representado correctamente en las mediciones de FCS 3, 12. Por lo tanto, los coeficientes de difusión registrados por FCS tienden a ser más rápido que las velocidades de difusión reportados a partir de técnicas como FRAP y SPT, donde se toman las fracciones cercanas al inmóvil y muy lentos en cuenta también. SPT también dará una descripción más detallada de la variabilidad de las tasas de difusión dentro de la población molecular que el FCS.
FCS cuantifica la fluctuación de la intensidad de fluorescencia con el tiempo dentro del volumen excitado. En el caso de mediciones de membrana, esto se traduce en la zona iluminada de la membrana. En este trabajo, utilizamos el hecho de que estas fluctuaciones son inducidas por las moléculas que exhiben difusión browniano y por lo tanto se están moviendo dentro y fuera del volumen de excitación. También hay varias otras fuentes posibles para la fluctuaciones en la señal de fluorescencia, tales como el parpadeo o la presencia de un estado triplete en los fluoróforos, los efectos ambientales, la unión-unbinding del ligando, o el movimiento de la totalidad de la membrana celular. Estas fuentes de error putativo hay que tener en cuenta al diseñar un experimento FCS con el fin de interpretar con precisión los resultados 12, 13. Típicamente, las tasas de difusión lateral en las membranas biológicas son bajos debido a la aglomeración y las interacciones, tanto entre proteínas de membrana y entre las proteínas y el citoesqueleto. Históricamente, el uso de FCS en las membranas de este modo se ha visto obstaculizada por la falta de fluoróforos foto-estable, que son necesarios para evitar la decoloración durante los tiempos de tránsito extiende a través del foco de excitación 14. Sin embargo, hoy en día, hay un montón de opciones para tintes foto-estable adecuados. Mejoras significativas en los detectores y otros equipos también permiten la detección de una prot fluorescenteins y tintes de menor brillo. Aquí, un protocolo básico para la aplicación de FCS utilizando linfocitos primarios murinos, donde la proteína de interés se marca con un anticuerpo marcado con fluorescencia, se describe. También se muestra un enfoque para adaptarse a las curvas de autocorrelación con el fin de extraer el coeficiente de difusión y la densidad molecular. El protocolo tiene como objetivo ser seguido fácilmente por los inmunólogos sin experiencia previa de técnicas para estudiar la difusión de las moléculas. Sin embargo, se espera que una comprensión básica de la microscopía confocal (para obtener este conocimiento básico, véase la referencia 15). Este protocolo puede relativamente fácilmente ser adaptado a otras células en suspensión, las dos líneas celulares y células primarias. Para los usuarios más experimentados FCS, existen métodos de análisis más refinados, algunos de los cuales se describen en la discusión.
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Protocol
1. La tinción para FCS
- Aislar células NK murinas a partir de linfocitos de bazo utilizando etiquetado perla magnética, según el protocolo del fabricante 16. Utilice 2-3 x 10 5 células por muestra para los siguientes pasos.
NOTA: Utilice la selección negativa para enriquecer la población de células diana, dejándola intacta, de modo que las células pueden marcarse con anticuerpos primarios solo. Véase la referencia 2 para obtener información más detallada sobre el aislamiento de células de ratones 2. - Para las células murinas que expresan receptores de Fc, bloquear los receptores Fc con el clon 2.4G2 anticuerpo a 5 g / l en 25 l de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y suero bovino fetal al 1% (FBS) por muestra. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente.
- Preparación de mezcla de anticuerpos.
- Use anticuerpos directamente conjugado con un fluoróforo foto-estable. Si dos anticuerpos contra dos proteínas diferentesson utilizados, fluoróforos uso que tienen espectros de emisión bien separadas para minimizar la diafonía (por ejemplo, excitado por los 488 y 633 láseres 2, más adelante en el protocolo que se refiere como los láseres y fluoróforos "verdes" y "rojos", respectivamente ).
NOTA: Si los anticuerpos marcados con fluoróforos comerciales foto-estable no están disponibles para los biomarcadores seleccionados, conjugados anticuerpos no marcados a los fluoróforos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ver Tabla de Materiales para los anticuerpos utilizados en este estudio. - Preparar una mezcla de anticuerpos mediante la dilución de anticuerpos marcados con fluorescencia contra la proteína o proteínas de interés en PBS + 1% de FBS. Añadir la mezcla de anticuerpo a cada muestra a un volumen final de 50 l por muestra. Incubar en hielo durante 45 min en la oscuridad.
NOTA: optimizar la concentración de los anticuerpos de antemano para asegurar que el anticuerpo se usa a una concentración de saturación, por lo general1-10 mg / ml.
- Use anticuerpos directamente conjugado con un fluoróforo foto-estable. Si dos anticuerpos contra dos proteínas diferentesson utilizados, fluoróforos uso que tienen espectros de emisión bien separadas para minimizar la diafonía (por ejemplo, excitado por los 488 y 633 láseres 2, más adelante en el protocolo que se refiere como los láseres y fluoróforos "verdes" y "rojos", respectivamente ).
- Después de la incubación, se lavan las células mediante la adición de 250 l de PBS y centrifugar ellos en 150 xg durante 3 min. Descartar el sobrenadante.
- Repita el paso 1.4.
- Resuspender las células en 200 l de PBS + 1% de FBS. Mantener en hielo y en la oscuridad hasta la adquisición.
NOTA: Las células NK murina se pueden mantener en hielo durante un máximo de 10 horas.
2. Preparación de compartimentado microscopio cubreobjetos Diapositivas
NOTA: Use las diapositivas de recubrimientos de vidrio cámaras o los platos con el grosor del cubreobjetos que el microscopio ha sido optimizado para, ya sea # 1 o # 1.5. Si el microscopio no está alineada para un cierto espesor, o si es desconocido, el anillo de cuello microscopio debe ser optimizado para el espesor cubreobjetos actual 17.
- Diluir poli-L-lisina con agua destilada en una proporción de 1:10. Añadir 200 l de diluido de poli-L-lisina a las cámaras y se incuba durante 20 min.
- Eliminar elpoli-L-lisina por aspiración y dejar que la cámara de aire seco dejándolo sin una tapa a temperatura ambiente durante al menos 20 a 30 min.
3. Iniciar el Sistema FCS
NOTA: Este protocolo se refiere a un sistema de microscopio específico y software (ver Materiales / reactivos Tabla), aunque también se pueden utilizar otras configuraciones de microscopía y paquetes de software.
- Encienda el microscopio láser confocal de barrido con el correlador de FCS. Abra el software en modo "Experto". Seleccione la lente de inmersión en agua 40X.
- En la pestaña "Adquirir", pulse el botón "Scan" "Config" y abrir el "Control de Configuración" y las "ventanas de Scan Control" (ventanas A y B en la Figura 1, respectivamente). En la pestaña "ConfoCor", pulse "medida" para abrir la ventana "Medición" (ventana de C en la Figura 1).
- Crear una carpeta para guardar el FCSmediciones. Iniciar una nueva base de datos de imagen haciendo clic en "Nuevo" en la pestaña "Archivo".
- Con el botón "Laser", encienda la lámpara de halógeno y los láseres pertinentes para excitar los fluoróforos (por ejemplo, 488 nm para la excitación láser "verde" y excitación de 633 nm para la excitación láser "rojo").
- Seleccionar filtros de excitación y emisión adecuados y activar los detectores correspondientes.
- Especificar los ajustes de captura de imagen, incluyendo los filtros láser de excitación, excitación y emisión, el recorrido de la luz y detectores para ser utilizado, en la ventana "Control de Configuración".
- Del mismo modo, especifique los ajustes correspondientes para las mediciones de FCS en la ventana "Medición", en la pestaña "Configuración del sistema". Usar una configuración lo más similar posible para obtener imágenes y FCS.
- Activar los canales de detección para las grabaciones FCS marcando la casilla "Ch1" para el Channe verdely "CH2" para el canal rojo en la ventana "Medición".
NOTA: Los ajustes deben ser optimizados para el fluoróforo (s) que se utiliza, como en un experimento de imágenes confocal estándar. En experimentos posteriores, la misma configuración FCS pueden ser reutilizados mediante la apertura de un archivo de FCS de edad, usando el menú desplegable "ConfoCor" en la parte superior de la interfaz de usuario, y seleccionando "Abrir archivo". Pulse "reutilización" en la ventana emergente de adquisición. Del mismo modo, los ajustes de adquisición de imágenes se pueden cargar mediante la apertura de una imagen guardada y presionando "reutilización".
- Espere hasta que el láser es estable antes de realizar mediciones FCS. Esto puede tardar hasta 30 minutos para los láseres de gas, mientras que los láseres de diodo se estabilizan más rápido. Ajustar el agujero mientras espera.
4. Ajuste del agujero de alfiler
- Preparar 0,2-0,5 M soluciones de fluoróforos o colorantes fluorescentes correspondientes a la excitación y espectros de emisión de las etiquetas de los anticuerpos. losfluoróforos deben haber sabido coeficientes de difusión 18, 19.
- Ponga una gota de 50 l de solución con el fluoróforo excitado por el láser verde en el centro de un pozo en un portaobjetos de cristal protector de cámara. Ponga una gota de agua destilada en el objetivo 40X agua y la posición de la corredera. Presione el botón "Mostrar" para comenzar a utilizar la luz visible y el ocular para encontrar y centrarse en la caída de fluoróforo.
NOTA: Utilice la misma diapositiva que para las mediciones de células posteriores, ya que pequeñas variaciones en el espesor del vidrio putativos entre las diapositivas pueden afectar a la alineación microscopio. - Colocar el foco bien dentro de la gota líquida (10-100 micras desde la parte inferior).
- En la ventana de "medición", seleccione la pestaña de "adquisición". Pulse "posición actual" en el capítulo "Posiciones" (ventana de C en la Figura 1).
- Volver a la pestaña "Configuración del sistema" en la misma ventana. Establecer un alto power para el láser verde.
NOTA: una potencia de láser de alta potencia se refiere a la saturación (es decir, la señal fluorescente no aumenta linealmente si la potencia del láser se incrementa aún más). Alrededor de 1 mW de potencia de la configuración del sistema, o el 5-10% de la potencia del láser max, es normalmente suficiente. - Prueba de la estabilidad de la señal pulsando el botón "Inicio". Esto abrirá una ventana separada que muestra la curva del tiempo y la curva de autocorrelación para la medición actual. Compruebe que la señal fluorescente es alto, estable en el tiempo, y que muestra las fluctuaciones en el kHz en lugar de la gama Hz.
- Seleccione el botón "O Ajuste" en la ventana "Medición". Compruebe si se ha seleccionado el canal de detección derecha (CH1 o CH2). Pulse "AutoAdjust X." Si la curva resultante no muestra un máximo claro, o el máximo está en el borde, marque la opción "gruesa" y pulse "AutoAdjust X" otra vez. Una vez finalizada la pantalla resultante en la dirección x, haga lo same para Y pulsando "AutoAdjust Y."
- De-seleccionar "gruesa" y alternar entre el ajuste de X e Y con la tecla "AutoAdjust" hasta que ambos tienen máximos clara y los valores no cambian entre las mediciones.
- Si las células se marcan con dos fluoróforos diferentes, pasar a una cámara en la que se ha añadido la solución fluorocromo rojo. Seleccionar una potencia láser de alta para que el láser rojo y repita los pasos 4,6-4,8 para el canal de excitación y de detección de rojo.
NOTA: Si los valores de X e Y se desvían entre los canales en sistemas en los que se utilice un único ojo de aguja para los dos canales de detección, seleccione valores intermedios y pulse OK para aceptar los cambios. Aquí, por el láser 488 nm con máximos a X = 79 y Y = 189 y el láser 633-nm con máximos a X = 80 y Y = 188, los valores de X = 80 y Y = 189 fueron seleccionados. La combinación de los láseres 488 nm y 633 nm para la excitación de los dos anticuerpos marcados con fluoróforos excitados por 488 nm o 633 nm es una buena elección, ya que lariesgo de diafonía se minimiza si los espectros de emisión no se superpongan 2.
5. Medir el tiempo de tránsito del fluoróforo libre
NOTA: Al determinar el tiempo de tránsito a través del foco (Taud) de un fluoróforo con un coeficiente de difusión conocido, el tamaño del volumen de detección, y por lo tanto el área de la membrana de la célula que está dentro del enfoque, se puede calcular. El cálculo de Taud se describe en el paso 7.2.
- Utilizando las mismas soluciones que se utilizan para el ajuste del agujero de alfiler, establecer el tiempo de adquisición de 30 seg x 2 repeticiones bajo la etiqueta de "adquisición" en la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana C).
- Iniciar una medición haciendo clic en "Inicio" en la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana B).
- Realizar una serie de potencias de láser para cada láser de excitación y el fluoróforo correspondiente en solución, a partir de o cercasaturar la energía y la disminución de por medio para cada medición. Cambiar la potencia del láser en la pestaña "Configuración del sistema" de la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana C). Presione el botón "Inicio" para iniciar una medición.
NOTA: Incluir la potencia del láser para la medición de células próximas en el rango inferior (por ejemplo, medir a los 16 años, el poder 8, 4 y 2 mW, antes de que el objetivo) 20. ajustes del láser del sistema son en general más alta que la excitación de salida y pueden variar en gran medida dependiendo del microscopio y la calidad de la alineación. En este sistema, el rango de potencia anterior corresponde a aproximadamente 60 a 500 mW de la configuración del sistema de alimentación. Se aconseja el uso de un medidor de potencia para medir la potencia de salida antes de que el objetivo de la primera vez que se utiliza un nuevo microscopio. La potencia máxima actual del láser se encuentra bajo el botón "Info" de la ventana "Medición". - Anote los recuentos por molcule (CPM, Unidad: kHz) de cada medida de la potencia del láser.
- Si se utilizan dos canales de detección, compruebe la ventana que muestra la curva de autocorrelación para la diafonía. Use una solución que contiene sólo fluoróforos verdes para medir detectado autocorrelación FCS en el canal de detección de color rojo y una solución con sólo fluoróforos rojos para evaluar la detección en el canal de detección de verde. Como regla general, mantener el CPM detectada desde el fluoróforo "equivocado" por debajo del 5% de la señal específica del fluoróforo adecuado.
- Compruebe que los valores de la escala linealmente con la potencia del láser utilizado. La saturación de CPM en la potencia del láser más alto (es decir, valores ligeramente más bajos de lo esperado a partir de una relación lineal) es aceptable.
NOTA: CPM debe estar muy por encima de 10 para la potencia del láser más alto por casi todos los sistemas de microscopio y fluoróforos comunes y puede ser significativamente mayor para los sistemas sensibles. La primera vez que se utiliza un anticuerpo fluorescente recién conjugados, realizar unamedición FCS del anticuerpo difundir libremente en solución para cuantificar el CPM esperado. Antes de la medición, capa de la cámara de medición con 200 l de poli-L-lisina injertados con polietilenglicol (diluido a 0,5 mg / ml en PBS) durante 1 hr a temperatura ambiente. Retire el líquido con una pipeta y permitir que la cámara se seque al aire. Guarde la solución de reserva en la nevera (hasta 2 semanas) y la Bolsa de polvo en el congelador. Al microscopio, diluir el anticuerpo a 1-10 g / ml en PBS. Siga los pasos 4.2-4.4 y 6.7 en este protocolo. Si la superficie no está recubierta con una solución que no se pegue, los anticuerpos interactúan con la superficie de vidrio y se agotarán rápidamente de la solución.
- Realizar una serie de potencias de láser para cada láser de excitación y el fluoróforo correspondiente en solución, a partir de o cercasaturar la energía y la disminución de por medio para cada medición. Cambiar la potencia del láser en la pestaña "Configuración del sistema" de la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana C). Presione el botón "Inicio" para iniciar una medición.
6. Mediciones celulares
- Añadir 125 l de células en PBS + 1% de FCS de la suspensión de anticuerpo marcado con células (etapa 1.5) y 150 l de medio de Park Memorial Institute transparente Roswell 1640 (RPMI) en un pocillo de un porta cubreobjetos 8 pocillos cámaras. Leave las células en la oscuridad a temperatura de medición durante por lo menos 20 min antes de iniciar las mediciones de FCS.
NOTA: Esto es para permitir que las células se asienten y se peguen al fondo de los pocillos y se equilibre las células y la solución a la temperatura de medición. - En la ventana "Control Scan" (Figura 1, la ventana B), ajuste de zoom 1 y comenzar una exploración XY rápida pulsando el botón "XY rápida". Modificar la potencia del láser de manera que sea lo más baja posible mientras que las células siguen siendo claramente visible. Centrar la imagen en una célula ronda de brillo medio, donde la membrana está claramente definida y no hay señal fluorescente en el citoplasma. Zoom hasta que la célula cubre la mayor parte de la imagen.
- Seleccione una nueva celda si la celda actual se está moviendo o muestra zarcillos, extrusiones, o puntos extremadamente brillantes. Mantenga la misma zoom y la potencia del láser para todas las células capturadas durante el mismo experimento.
NOTA: Una membrana fruncida también puede ser un signo de próxima apoptosis. - Centrarse en la parte superior de la membrana celular. En la pestaña de "adquisición" de la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana C), seleccione una posición para la medición de FCS mediante la activación de "punto de mira". Como alternativa, seleccione la pestaña "LSM imagen", marque el punto de medición deseado en la imagen LSM, y pulse "Añadir posición."
NOTA: La parte superior de la membrana celular no se verá influenciada por anticuerpos fluorescentes o fluoróforos inespecíficamente unidas a la poli-L-lisina. Sin embargo, es importante cerciorarse de que la célula no se mueven durante la medición (ver los resultados). - En la pestaña de "adquisición" de la ventana "Medición" (Figura 1, la ventana C), establecer el número de repeticiones de 6-10, con el "medir el tiempo" fijado en 10 segundos por repetición.
- Volver a la pestaña "Configuración del sistema" de la ventana "Medición". Ajustar la potencia del láser para la medición FCS bajo la "Laser botón ". Antes de que el objetivo, el uso de baja potencia para las mediciones de células, en el rango entre 1 y 10 mW 20.
NOTA: Los valores recomendados son un compromiso entre la detección de la señal y el daño solar a las células. Vea el paso 5.2.1 Nota el porcentaje de la potencia del láser estos valores corresponden a. - Iniciar una medición de FCS con la tecla "Inicio" en la "medición" de la ventana (ventana de C). Si los agentes de blanqueo de células significativamente en el comienzo de la medición, tal como se detecta por una caída en la traza de intensidad de más de 30% durante la primera 10 sec (un ejemplo se muestra en la Figura 3A, panel inferior), mover a otra celda y menor la potencia del láser para mediciones futuras.
- Si se pierde la señal, ajuste el enfoque en la dirección Z. Después de la medición, utilizar la ventana "Scan Control" (Figura 1, la ventana B) para comprobar que la célula todavía está centrado y que se midió la membrana celular. Si THcélula E se ha movido, desechar la medición.
- En la ventana de auto-correlación que se muestra la medición, eliminar manualmente las repeticiones individuales que contienen las maniobras de zoom, el blanqueado, grandes grupos, u otros artefactos (ver ejemplos en la Figura 3). Para ello, la marca de ellos, con un clic derecho y elegir "Borrar". Guarde el archivo final en formato .fcs. Guardar al menos cuatro repeticiones por célula.
- Opcionalmente, adquirir una imagen de la célula en la sección media (con toda la circunferencia de la membrana visible) utilizando la ventana de "Control Scan". Para capturar la imagen después de la medición de FCS para evitar la decoloración. Presione el botón de "Single" para iniciar la captura de imágenes.
- Si se utiliza "Añadir posición" para el posicionamiento enfoque FCS, haga clic en "Eliminar posición" antes de pasar a la siguiente celda.
- Cambiar a una nueva alícuota de suspensión celular después de un máximo de 2 horas de medida para mantener las células viables throughout el experimento.
7. Análisis FCS
- Abrir los archivos .fcs en un software con capacidad de curva de ajuste (ver Materiales / Reactivos Tabla para el software utilizado en este protocolo).
NOTA: El software de FCS que viene con el microscopio es un buen lugar para familiarizarse con su equipamiento básico, pero el software adicional es necesario para adaptarse a la difusión de la membrana de dos dimensiones. - En primer lugar, determinar el tamaño del volumen de excitación mediante el análisis de las mediciones de fluoróforos libres. Ajustar una curva libre difusión de 3 dimensiones a las curvas de autocorrelación 21.
(Ec. 1)
NOTA: Definición de parámetros: N: número medio de entidades fluorescentes en el volumen focal, τ (Tau): tiempo de correlación, τ D (TAUD): tiempo medio de permanencia en el volumen focal, T 1: probabilidad de que los fluoróforos para estar en el estado triplete, τ <sub> T: tiempo de relajación para las transiciones de estado singlete-triplete, S: relación entre la altura y ancho de diámetro para el volumen focal.- Extraer TAUD, el tiempo de tránsito de moléculas para transferir el foco.
- Usa los coeficientes de difusión observados Taud y publicados (D) de fluoróforos utilizados para la calibración 18, 19 para calcular el radio del agujero de alfiler (ω).
(Ec. 2)
- El análisis de las curvas de autocorrelación en las membranas celulares.
- Para visualizar la parte de la curva que representa la difusión molecular, seleccione el periodo de tiempo antes de comenzar la pendiente más pronunciada de la curva de autocorrelación y terminando después de las convergencias curva en 1 (por ejemplo, 0,001 a 5 seg para receptores de la superficie de murino; véase la Figura 4).
- Generar una curva de autocorrelación promedio de las repeticiones individuales i guardadosn paso 6.7.2.
- Ajustar una curva de difusión de membrana de 2 dimensiones en promedio a cada curva de autocorrelación utilizando la Ecuación 3 3.
(Ec. 3)
NOTA: los parámetros de salida importantes son como sigue: N es el número medio de moléculas que residen en el área de la membrana excitado. Volver a calcular la densidad (N / m 2). τ D (TAUD): tiempo medio de permanencia en el área focal, restringido por la bidimensionalidad de la membrana (s). Volver a calcular el tiempo de residencia promedio para un coeficiente de difusión (m 2 / seg) a través de la radio determinado del agujero de alfiler (ω) y la Ecuación 2. T1 es la probabilidad de fluoróforos para estar en el estado triplete. El brillo (CPM) se calcula dividiendo la intensidad global promedio de la medición por N. - Si un buen ajuste no se logra en el primer intento, cambiar los valores de partida y / o los límites superior e inferior para las variables hasta This se logra.
NOTA: Los límites superior-inferior típicos para velocidades de difusión de proteínas en las membranas celulares primarios son 10-500 milisegundos para TAUD, 0-100% para T1, y 0,1-5 ms para TauT1. Seleccionar a partir de los valores para la instalación en el medio de estos intervalos. La parte de la curva que representa las fluctuaciones de fluorescencia derivados de difusión normalmente se encuentra entre 1 ms y 1 s (véase la Figura 4). Dependiendo del fluoróforo, no puede ser a veces un segundo proceso presente, dando lugar a la autocorrelación a escalas de tiempo más cortas que el parámetro de difusión. Esto es causado por un estado oscuro transitorio (triplete) o parpadeando (como a menudo se produce para proteínas fluorescentes). Un estado de triplete se tiene en cuenta en la ecuación 3, y el modelo presentado por tanto, también debe proporcionar un buen ajuste en estas situaciones.
(Ec. 1) 
(Ec. 2) 
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Representative Results
Un resultado típico generará una curva de autocorrelación con un tiempo de tránsito en el intervalo de 10 mseg a 400 mseg para proteínas de membrana. El número de moléculas puede variar entre 0,5 a alrededor de 200 por m 2 para proteínas expresadas de forma endógena. Compruebe cuidadosamente que el CPM no es menor de lo esperado. Esto puede significar que hay una influencia de la señal de fondo. Como regla general, la señal de CPM en las células que se acepta para el análisis no debe ser inferior al 33% del CPM para difundir libremente los anticuerpos con la misma potencia del láser. El CPM se debe ampliar de forma lineal con la potencia del láser. Se espera que la curva de autocorrelación por los receptores de la superficie celular inmunes primarias a ser suave, con la parte más empinada entre 0,001 y 1 seg. Vea la Figura 2 para una curva de autocorrelación representativa y su traza tiempo.
Como se ha mencionado brevemente en la introducción, lare varios casos en FCS no es adecuado para la medición de la difusión molecular debido a la influencia de otras fuentes de las fluctuaciones de fluorescencia, que contribuyen a la confusión la señal. La Figura 3 muestra ejemplos de casos en los que una célula o repetición de la medida particular, debe ser desechada. Ya se ha mencionado que una señal extremadamente baja (muy baja CPM) es motivo para descartar la célula. Otra razón para desechar la célula individual es que la célula se está moviendo (Figura 3A). En el caso de blanqueo (Figura 3B) o si están presentes grandes grupos (Figura 3C), las mediciones deben ser desechados si el efecto es considerable o presente a través de toda la medición. Si esta característica está presente sólo en una o dos repeticiones, estas repeticiones individuales pueden ser desechados, pero las repeticiones restantes todavía pueden ser utilizados.
Es importante que ambos utilizan la correctamodelo para ajustar los datos y también para comprobar cuidadosamente que el ajuste coincide estrechamente con la curva de autocorrelación. En la figura 4, se muestran ejemplos de buenos y malos ajustes de curva. Prestar mucha atención a la parte de la curva que representa la difusión (la parte más fuerte pendiente). También es importante determinar que tanto el inicio y el final de la parte inclinada de la curva son bien ajustado por el modelo. Si el ajuste es malo, sin problemas aparentes, tales como móviles, blanqueo, o clusters, modificar los valores de partida y / o los límites superior e inferior (dentro de un rango razonable) antes de tomar una decisión definitiva para descartar la célula.
Figura 1: interfaz de software de FCS. Aquí se presentan los principales ventanas necesarios para operar la herramienta de software para la adquisición de FCS y proyección de imagen, tal como se describe en el protocolo. Una ventana, la "Configuración Control "ventana es la ventana de control de la trayectoria del haz, canales de láser, y filtros para la imagen. Ventana B es el" Control Scan "ventana para la formación de imágenes y muestra los ajustes de escaneo. Ventana C es la" ventana de medición ", la ventana para el configuración de los ajustes de medición de FCS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: trazas de autocorrelación Representante y curvas de difusión re mayor de histocompatibilidad de clase I H-2D superficie moléculas en las células NK recién aisladas murinos. El panel superior de la figura muestra la fluctuación de fluorescencia como una función del tiempo a lo largo de toda la curva del tiempo de 7x 10 mediciones por segundo. El panel inferior representas la curva de autocorrelación promedio de estos siete repeticiones. La altura de la curva de autocorrelación es inversamente proporcional a la concentración de fluorescencia móvil marcado d entidades H-2D dentro del volumen focal. El valor del eje x en la parte más empinada de la pendiente de la curva, la mitad de la amplitud, representa el tiempo de residencia medio de la etiqueta fluorescente H-2D moléculas d dentro del volumen focal. La medición se presenta es una parte del conjunto de datos publicados en la referencia 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ejemplos de restos celulares problemáticos. (A) Una célula en movimiento, como se ejemplifica por la traza no tener un establo le basalvel. El panel superior muestra un ejemplo en toda la célula se ha movido fuera de foco después de aproximadamente 35 segundos, tal como se representa por la señal de muy bajo después de este punto en el tiempo. En el panel inferior, el efecto es más sutil, con ondulaciones evidente en un intervalo de varios segundos. (B) de la célula se presentan blanqueo, la altura de la traza decreciente con el tiempo. Comparación de la altura de la traza en el inicio de la medición para que al final de la medición. (C) La presencia de grandes grupos, representados por los picos de la traza. En el panel superior, un gran grupo a 20-25 seg está presente. En el panel inferior, varios grupos están presentes durante toda la medición. Las mediciones presentadas son una parte del conjunto de datos publicados en la referencia 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Curvas de autocorrelación representativos con ajuste de curvas y residuos. Las líneas verticales rojas y azules representan los límites de la ventana de tiempo utilizada para el montaje. (A) Ejemplo de un ajuste representativo de un modelo de difusión 2-dimensional a una curva muestra autocorrelación. En el panel superior, la curva verde (el modelo) se superpone a la curva azul (la autocorrelación adquirida), lo que indica un buen ajuste. El panel inferior muestra el residual del ajuste de curvas. Las fluctuaciones en torno a 1 segundo, que no están integrados bien, son típicos para las mediciones de células y son tolerables. (B) Ejemplo de un mal ajuste de la difusión 2-dimensional para la misma curva de autocorrelación. El modelo ajustado no superponer la curva de autocorrelación, y no converge a 1. Los paneles inferiores en (A y B) muestran la residual del ajuste de curvas. los residuosson significativamente más grande para el mal ajuste, especialmente para la parte de difusión de la curva. La medición se presenta es una parte del conjunto de datos publicados en la referencia 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo de FCS se puede utilizar para la evaluación de la dinámica molecular de moléculas de la superficie de todos los tipos de células inmunes (murino, humano, u otras especies). Medidas FCS dinámica molecular espacio-temporales abajo a la resolución de una sola molécula en las células vivas. La densidad molecular, así como la dinámica del tipo de difusión y la agrupación de las proteínas de interés, se pueden extraer de las curvas de autocorrelación.
El marcaje fluorescente es de importancia fundamental para el éxito de los experimentos de FCS. Las proteínas de interés en la membrana celular tradicionalmente se han etiquetado usando anticuerpos, y los anticuerpos son a menudo más conveniente para el uso en las proteínas de superficie en las células inmunitarias ingenuas. anticuerpos no marcados deben ser conjugados directamente a los tintes fluorescentes foto-estable con un brillo de alto peso molecular. La selección del fluoróforo para la conjugación de anticuerpo es importante para la calidad de las mediciones. etiquetas estándar para citometría de flujo,tales como fluoresceína y colorantes a base de ficoeritrina, no se recomiendan debido a la decoloración rápida. colorantes foto-estable para la conjugación directa con anticuerpos son proporcionados actualmente por varias empresas. Los fabricantes suelen proporcionar protocolos satisfactorios para la conjugación y la purificación del anticuerpo conjugado resultante, y esto se puede hacer en un par de horas. También es posible llevar a cabo FCS al uso de proteínas fluorescentes, pero se debe tener especial cuidado para minimizar la potencia del láser, ya que las proteínas fluorescentes son en general más propensos a la decoloración de los fluoróforos la mayoría de químicos foto-estable. De acuerdo con la experiencia previa, la sobre expresión de las proteínas a menudo conduce a una disminución considerable en la velocidad de difusión por la aglomeración, lo que hace el uso de proteínas fluorescentes inadecuado.
la calibración del agujerito antes de las mediciones también es un paso crítico. Los fluoróforos utilizados para determinar el tamaño del volumen focal deben haber conocido coeficiente de difusións (véase la Ecuación 2). Utilice fluoróforos libres correspondientes de cerca a los espectros de emisión de las etiquetas de anticuerpos para determinar el tamaño del volumen focal. Esto debe hacerse para asegurar la eficiencia óptima de la señal y la detección apropiada de posibles correlaciones cruzadas entre canales de color. Llevar a cabo una serie de potencias de láser FCS de los fluoróforos que se difunden libremente para asegurar que el sistema da la señal de salida esperada en un rango de potencias. Comparar la CPM en la misma potencia del láser entre los experimentos para asegurar la coherencia entre los experimentos.
En la etapa de análisis, es esencial para poner rangos razonables y los valores de partida para las variables durante el montaje de los modelos. Utilizar los conocimientos publicados previamente de sistemas de células similares a encontrar buenos puntos de partida. En teoría, FCS es una técnica cuantitativa, pero dado que las condiciones óptimas rara vez se producen, un cierto grado de precaución tiene que tener cuidado al interpretar los resultados. Se registrarán todos los tipos de fluctuaciones,con independencia del origen de estas fluctuaciones. Por lo tanto, es útil tener la mayor cantidad de información posible sobre el sistema experimental con el fin de excluir posibles fuentes de error. Por ejemplo, el movimiento de toda la membrana de la célula dará lugar a las fluctuaciones con más Taud (Figura 3A), mientras que los contaminantes putativos de los fluoróforos libres en la solución se difundirán con al menos diez veces más corto Taud.
Este protocolo básico puede ser modificado de varias maneras. Si dos proteínas están etiquetados con diferentes fluoróforos, co-difusión (una medida indirecta de la interacción) se puede evaluar mediante la ampliación de la metodología para detectar la correlación cruzada. La medida en que estas proteínas se unen entre sí en la membrana celular está representada por la altura de la curva de correlación cruzada respecto a la altura de las curvas de autocorrelación de los canales de color individuales. La correlación cruzada se denota como Ch1-CH2 en el software de medición. el preanálisis CISE de correlación cruzada requiere controles para la diafonía y es por tanto algo más complicado que el protocolo que se presenta aquí. Una descripción detallada de la forma de proceder, como una extensión a este protocolo básico, se puede encontrar en Strömqvist et al. 13. Para optimizar el posicionamiento en la dirección z, z FCS-escanear se pueden utilizar 22. De acuerdo con la experiencia previa, ha sido satisfactorio para hacerlo manualmente. También es posible instalar varios coeficientes de difusión a una curva de autocorrelación FCS 23. Esto requiere el conocimiento previo del número de subpoblaciones con diferentes velocidades de difusión y de las velocidades de difusión aproximado de al menos una de las subpoblaciones. De lo contrario, habrá demasiadas variables libres, que hará que el poco fiable apropiado. Un ejemplo típico sería una proteína de superficie cuya velocidad de difusión se ralentiza considerablemente por la unión de un ligando. Finalmente, cleaning de la traza de los valores atípicos y sin quitar por completo repeticiones es posible 24.
La falta de una señal fluorescente es un problema común de solucionar. Para difundir libremente fluoróforos, utilice la lámpara halógena para comprobar si la caída es fluorescente. Si la caída no es fluorescente, mezclar un nuevo lote de fluoróforos con un ligero aumento de la concentración (en el rango nM) y vuelve a intentarlo. Compruebe que el foco está dentro de la gota fluorescente, los láseres se encienden en el software, la potencia del láser es suficiente, los filtros y detectores de emisión correctas son elegidos, y se activan los canales adecuados en la ventana "FCS Medición" (ver paso 3.6). Iniciar el láser y mira desde el lado para confirmar visualmente que la luz del láser llega a la muestra. No mire directamente a la fuente de láser. Si el filtro de emisión seleccionado abarca la longitud de onda de láser, un obturador bloqueará automáticamente la trayectoria de la luz para evitar daños en el detector. yof todos los ajustes están bien, pero llega ninguna luz, volver a encender el láser, el sistema de FCS, y el equipo. Preguntar a un experto si la falta de una señal fluorescente persiste. Un procedimiento simplificado se aplica si las células marcadas no muestran fluorescencia. Confirmar la presencia de fluorescencia con la lámpara de halógeno; encender los láseres, seleccionar los canales de láser, y ajustar la potencia del láser. Seleccione una posición en la membrana celular, ya sea usando el "punto de mira" o la opción "Añadir posición" (véase el paso 6.4). Cambiar a la siguiente muestra si la señal es demasiado baja.
Un aspecto importante de la base de fluctuación de la técnica es que las moléculas tienen que ser razonablemente móvil a detectar. fracciones de moléculas o moléculas atrapadas dentro de las áreas más pequeñas que el enfoque durante todo el tiempo de medición se mueve muy lentamente, por lo tanto no puede ser medido. Esto conduce a una posible subestimación de las densidades de superficie y una sobreestimación de la velocidad de difusión. El blanqueamientotambién puede contribuir a una subestimación putativo de tanto la densidad como Taud, ya que las moléculas tendrán una probabilidad más alta de ser blanqueada el tiempo que pasan en el volumen focal láser iluminada. Influencia del fondo (fluorescencia desde fuera del plano focal) sería, por el contrario, aumentar artificialmente el número de moléculas detectadas y disminuir el CPM medido. Anteriormente, se estimó que el error máximo total en la determinación de la densidad absoluta a ser alrededor del 40% 20. Sin embargo, por lo general es posible comparar las diferentes muestras biológicas entre sí, ya que las fuentes de error son, en la mayoría de los casos, igual a lo largo de los experimentos. Otra fuente de error potencial es que los anticuerpos son bivalentes, lo que significa que cada anticuerpo potencialmente puede unirse a dos moléculas diana. Los autores no observaron este fenómeno, pero no se puede garantizar que esta es una característica global para otros anticuerpos. La posible influencia de la bivalencia debePor lo tanto, se analizarán por separado para cada anticuerpo. La combinación de anticuerpos primaria y secundaria marcado específico no debe ser utilizado debido al alto riesgo de inducir grupos artificiales a partir de dos etiquetas sucesivas bivalentes. Si las células en su lugar han sido transfectadas con versiones de proteínas marcadas con fluorescencia de la proteína de interés, cada proteína tendrá sólo una etiqueta. Sin embargo, esto requiere la transfección, lo que no siempre es deseable y puede incluso no ser posible (por ejemplo, si el uso de células inmunes directamente aisladas de la sangre humana). Por último, de un solo punto de FCS no se graban imágenes. Si se requieren imágenes para su publicación u otros fines, estos deben ser capturados por separado utilizando la parte de formación de imágenes de software. capturar siempre las imágenes después de las mediciones de FCS para evitar la decoloración innecesaria de la superficie celular.
A diferencia de FCS, microscopía confocal tradicional basado, como FRAP, y metodologías de correlación imagen no puede cuantificar las fluctuaciones de fluorescenciaa nivel de una sola molécula 6. Metodologías correlación de imágenes miden el número de moléculas indirectamente y con resolución más baja, pero pueden evaluar la variabilidad de la difusión molecular y la agrupación sobre toda el área de captación de imagen 25. SPT estándar, medido por microscopía confocal tiene un nivel ideal de etiquetado, órdenes de magnitud inferior a 7 FCS. Por lo tanto, la densidad de proteínas marcadas no se puede medir por la norma SPT. La combinación de tubos sin soldadura con otras técnicas de microscopía (por ejemplo, la microscopía óptica de reconstrucción estocástica o fotoactivación microscopía de localización) permite que la densidad y el movimiento que deben evaluarse, pero requiere tintes muy especializadas o proteínas 11. técnicas de super-resolución, como las muestras a menudo requieren fijos Estructurado por microscopía de iluminación y emisión estimulada agota la microscopía, y una combinación de primaria y secundaria de anticuerpos para Labeling 26. Por lo tanto, la localización es muy preciso, mientras que la dinámica del sistema no pueden a menudo ser evaluados. En comparación con SPT y las técnicas de super-resolución, FCS también requiere significativamente menos potencia de los ordenadores y el tiempo para el análisis y la extracción de los resultados. La citometría de flujo es el caballo de batalla de la inmunología y se pueden combinar favorablemente con FCS. la clasificación de células puede, por ejemplo, ser seguido por mediciones posteriores sobre las poblaciones de células seleccionadas si colorantes foto-estable se habían utilizado antes de la clasificación. FCS es, pues, una metodología que puede ser utilizado solo o en combinación con otros métodos establecidos.
Este protocolo se puede utilizar para identificar las características desconocidas en la actualidad de la dinámica de células inmunes y las interacciones dentro de la membrana celular en el nivel de una sola molécula. Además, las características de poblaciones enteras frente a subconjuntos seleccionados se pueden comparar. También tiene un papel potencial como una etapa de selección para la terapia celular inmune. Dado que las mediciones hacenno consumir la célula, a diferencia de otros métodos para investigar la funcionalidad de las células inmunes, las células individuales potencialmente pueden ser recuperados y se cultivaron. Por lo tanto, después de que el análisis de las curvas de FCS, las células prometedoras pueden ser extraídos y expandido para aplicaciones adicionales, incluyendo las aplicaciones clínicas putativos.
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Acknowledgments
Agradecemos al Dr. Vladana Vukojevic, Centro de Medicina Molecular, Instituto Karolinska para el mantenimiento del instrumento Zeiss ConfoCor 3 y para consejos útiles con respecto a las mediciones de células. Este estudio fue financiado por becas de Vetenskapsrådet (número de concesión 2012- 1629), Magnus Bergvalls Stiftelse, y desde Stiftelsen Claes Groschinskys minnesfond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MACS NK Cell Isolation Kit mouse II | Miltenyi Biotec NordenAB | 130-096-892 | Negative selection of NK cells |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Adlrich | F7524 | Heat inactivated |
| Phosphate Buffered Saline | - | - | Made in house |
| Roswell Park Memorial Institute medium 1640 | PAA The Cell Culture Company | E15-848 | Transparent medium |
| Antibody clone 2.4G2 | Thermo Fischer Scientific | 553140 | For blocking Fc-receptors. |
| Anti-Ly49A antibody | Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647 | ||
| Clone JR9.318 | |||
| Anti-H-2Dd antibody | BD Pharmingen | 558915 | Conjugated in house to MFP488 |
| Clone 34.5.8S | |||
| MFP488 | Mobiotech | MFP-A2181 | Fluorescent dye for antibody conjugation. |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Diluted in distilled water (1.10) |
| Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa) | SuSoS AG | PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) | Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml. |
| Rhodamine 110 chloride | Sigma-Aldrich | 432202 | Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19 |
| Alexa fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A20006 | Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20 |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM510 | |
| Software: Confocor 3 | Zeiss | ||
| Software: Matlab with curve fitting toolbox | Matlab | Version R2013b | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo-scientific | 155411 | 8 wells, 1.0 borosilicate bottom |
References
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