Molekylär diffusion i plasmamembran primära lymfocyter Mätt genom fluorescenskorrelationsspektroskopi

Abstract

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en kraftfull teknik för att studera diffusion av molekyler inom biologiska membran med hög spatial och temporal upplösning. FCS kan kvantifiera den molekylära koncentrationen och diffusionskoefficienten av fluorescensmärkta molekyler i cellmembranet. Denna teknik har förmågan att utforska de molekylära diffusionsegenskaper av molekyler i plasmamembranet av immunceller i stationärt tillstånd (det vill säga, utan processer som påverkar resultatet under själva mättid). FCS är lämplig för att studera diffusion av proteiner som uttrycks på nivåer som är typiska för de flesta endogena proteiner. Här är en enkel och robust metod för att bestämma diffusionshastigheten av cellmembranproteiner på primära lymfocyter påvisats. Ett effektivt sätt att utföra mätningar på antikropps färgade levande celler och vanligt förekommande observationer efter förvärvet beskrivs. De senaste framstegeni utvecklingen av fotostabila fluorescerande färgämnen kan utnyttjas genom att konjugera antikropparna av intresse till lämpliga färgämnen som inte bleka utför under mätningarna. Dessutom möjliggör detta för påvisande av långsamt diffunderande enheter, vilket är en vanlig egenskap hos proteiner som uttrycks i cellmembran. Förfarandet analys för att extrahera koncentrations- och spridningsparametrar molekyl från de genererade autokorrelationskurvorna är markerat. Sammanfattningsvis är en grundläggande protokollet för FCS mätningar tillhandahålls, det kan följas av immunologer med en förståelse för konfokalmikroskopi men med någon annan tidigare erfarenhet av metoder för att mäta dynamiska parametrar, såsom molekylär diffusion priser.

Introduction

Många immunceller funktioner är beroende av molekylär diffusion och interaktioner inom membran. Biologiska membran är komplexa, och många faktorer som kan vara viktiga för funktionen av immunceller kan påverka hastigheten på translationell diffusion av proteiner inom cellulära membran ^1. Vi visade nyligen att naturliga mördarceller (NK), lymfocyter som tillhör det medfödda immunförsvaret, uppvisar differentiell diffusion av två studerade proteiner på cellmembranet beroende på tillståndet hos NK-cellsaktivering ^2.

Fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) är en teknik som är i stånd att kvantifiera molekylär diffusion priser inom biologiska membran. Den rapporterar den genomsnittliga diffusionshastigheten för fluorescensmärkt molekyler i en fixerad volym, typiskt i fokus för ett konfokalt mikroskop. Den är baserad på mätning av fluktuationer i fluorescens som uppstår på molekylär rörelse iett system i stabilt tillstånd. FCS har använts i stor utsträckning för att studera spridningen av fluorescerande färgämnen och proteiner, både i lösning och i lipidmembran. Andra utgångsparametrar som påverkar diffusionshastigheten kan också indirekt studeras på detta sätt (t.ex., konformationsändringar i proteiner eller interaktioner av molekyler på cellmembran) ^{3, 4.} FCS står ut i förhållande till andra tekniker på grund av dess höga känslighet, vilket gör att möjligheten till enda molekyl detektering. Det fungerar bra för molekylära koncentrationer i nanomolar till millimolar intervall, vilket är typiskt för endogena expressionsnivåer av de flesta proteiner ^5. Dessutom kan FCS ge en approximation av det absoluta antalet proteiner i den studerade volymen, medan de flesta andra tekniker ger endast relativ information om proteinuttrycksnivåer. Andra metoder för att mäta molekylär diffusion priser inom membran innefattar fluometoder rescence återhämtning efter fotoblekning (FRAP), enda partikel spårning (SPT), flertal hål FCS och bildkorrelations. FRAP och bildkorrelationsmetoder är ensembletekniker, som i allmänhet inte ger information om det absoluta antalet molekyler ^10. Jämfört med SPT, är genomströmningen av FCS högre i fråga om karakterisering av befolkningsgenomsnittet. Analysen är också mindre krävande eftersom den genomsnittliga diffusionshastigheten för de molekyler som är närvarande i den laserfokus mäts, snarare än graden av enskilda molekyler. Dessutom, om inte särskilda mikroskop finns ^11, SPT kan inte ge någon information om koncentrationer, eftersom standard SPT märkningen måste vara mycket låg för att möjliggöra identifiering av enskilda molekyler. Å andra sidan, kräver FCS de molekyler under studie för att vara mobila. Det kommer helt enkelt inte upptäcka några förmodade orörliga fraktioner eller molekyler som rör sig mycket långsamt. Diffusionshastigheten för molekyler somuppehålla sig inom fokus längre än ungefär en tiondel av förvärvstiden inte vara korrekt representerade i FCS mätningar ^{3, 12.} Därför diffusionskoefficienter registrerats av FCS tenderar att vara snabbare än diffusion som rapporterats från tekniker som FRAP och SPT, där nära till orörliga och mycket långsamma fraktioner beaktas också. SPT kommer också att ge en mer detaljerad beskrivning av variationen i diffusionshastigheter inom molekylär befolkningen än FCS kommer.

FCS kvantifierar fluktuationer i fluorescensintensiteten över tiden inom upphetsad volym. I fallet med membran mätningar, översätter detta till det belysta området av membranet. I detta dokument använder vi det faktum att sådana variationer induceras av molekyler som uppvisar Brownsk diffusion och därmed flyttar in och ut ur exciteringsvolymen. Det finns också flera andra möjliga källor för fluctuationer i fluorescenssignalen, såsom blinkande eller närvaron av en triplett tillstånd i fluoroforer, miljöeffekter, bindnings ej bindande av liganden, eller förflyttning av hela cellmembranet. Dessa förmodade felkällor måste beaktas när man utformar en FCS experiment för att korrekt tolka resultaten ^{12, 13.} Typiskt, lateral diffusion priser i biologiska membran är låga på grund av trängsel och interaktioner, både mellan membranproteiner och mellan proteiner och cytoskelettet. Historiskt sett har användningen av FCS i membran därmed hämmats av brist på fotostabila fluoroforer, som krävs för att undvika blekning under de förlängda transittider genom excitation fokus ^14. Men i dag, det finns gott om alternativ för lämpliga fotostabila färgämnen. Betydande förbättringar i detektorer och annan hårdvara gör det också möjligt att upptäcka fluorescerande proteins och färgämnen med lägre ljusstyrka. Här, en grundläggande protokollet för tillämpning av FCS med användning av murina primära lymfocyter, där proteinet av intresse är märkt med en fluorescensmärkta antikroppen, beskrivs. Ett tillvägagångssätt för att passa autokorrelationskurvor för att extrahera diffusionskoefficienten och molekyldensiteten visas också. Protokollet syftar till att lätt följt av immunologer med ingen tidigare erfarenhet av tekniker för att studera spridningen av molekyler. Emellertid är en grundläggande förståelse för konfokalmikroskopi förväntas (för att få denna grundläggande förståelse, se referens ^15). Detta protokoll kan relativt lätt anpassas till andra suspensionsceller, både cellinjer och primära celler. För mer erfarna FCS användare, finns mer förfinade analysmetoder, av vilka några beskrivs i diskussionen.

Protocol

1. Färgning för FCS

1. Isolera murina NK-celler från mjältlymfocyter med hjälp av magnetisk pärla märkning, enligt tillverkarens protokoll ^16. Använd 2-3 x 10 ⁵ celler per prov för följande steg.
   Anmärkning Använd negativ selektion för att berika målcellspopulationen och lämnar den orörd, så att cellerna kan märkas med användning av primära antikroppar enbart. Se mer detaljerad information om cellisolering från möss ² referens ^2.
2. För murina celler som uttrycker Fc-receptorer, blockera Fc-receptorer med antikroppen klonen 2.4G2 vid 5 | ig / | il i 25 | il fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och 1% fetalt bovint serum (FBS) per prov. Inkubera i 15 min vid rumstemperatur.
3. Framställning av antikropp-blandning.
   1. Använd antikroppar direkt konjugerad till en foto stabil fluorofor. Om två antikroppar mot två olika proteinerska man använda fluoroforer som har väl separerade emissionsspektra för att minimera överhörning (t.ex. exciteras av de 488 och 633 lasrar ^2, senare i protokollet kallade "gröna" och "röda" lasrar och fluoroforer, respektive ).
      OBS: Om kommersiella antikroppar märkta med fotostabila fluoroforer är inte tillgängliga för de valda biomarkörer, konjugerade omärkta antikroppar mot fluoroforema enligt tillverkarens anvisningar. Se Material Tabell för de antikroppar som användes i denna studie.
   2. Förbereda en antikroppsblandningen genom att späda fluorescensmärkta antikroppar mot proteinet eller proteiner av intresse i PBS + 1% FBS. Lägga till mix-antikropp till varje prov till en slutlig volym av 50 | j, l per prov. Inkubera på is under 45 minuter i mörker.
      OBS: Optimera koncentrationen av antikropparna i förväg för att säkerställa att antikroppen användes vid en mättande koncentration, typiskt1-10 ^ g / ml.
4. Efter inkubation, tvätta cellerna genom tillsats av 250 pl av PBS och centrifugera dem vid 150 xg under 3 min. Kassera supernatanten.
5. Upprepa steg 1,4.
6. Resuspendera cellerna i 200 | il PBS + 1% FBS. Håll på is och i mörker tills förvärvet.
   OBS: Murin NK-celler kan hållas på is under upp till 10 timmar.

2. Beredning av mikroskop Chambered coverglass Slides

OBS: Använd kamrar coverglass diabilder eller rätter med täckglasets tjocklek att mikroskopet har optimerats för antingen # 1 eller # 1,5. Om mikroskopet inte är i linje för en viss tjocklek, eller om det är okänt, behöver mikroskopet flänsringen kan optimeras för den aktuella coverglass tjocklek ^17.

1. Späd poly-L-lysin med destillerat vatten i ett 1:10 förhållande. Tillsätt 200 pl av utspätt poly-L-lysin till kamrarna och inkubera i 20 min.
2. Ta bortpoly-L-lysin genom aspiration och låt kammaren lufttorka genom att lämna den utan lock vid rumstemperatur under åtminstone 20 till 30 min.

3. Starta FCS System

OBS: Detta protokoll avser en specifik mikroskopsystem och programvara (se Material / reagenser tabell), även om andra mikroskopi inställningar och programvarupaket kan också användas.

1. Slå på konfokala laserskanning mikroskop med FCS korrelatorn. Öppna programmet i "expertläge". Välj 40X nedsänkning i vatten lins.
2. Under fliken "Hämta", tryck på "Config" och "Scan" för att öppna "Configuration Control" och "Scan Control" fönster (fönster A och B i figur 1 respektive). Under "Confocor" -fliken, tryck "Measure" öppna "Measurement" fönster (fönster C i figur 1).
3. Skapa en mapp för att spara FCSmätningar. Starta en ny bilddatabas genom att klicka på "New" under "File" -fliken.
4. Använda "Laser" -knappen, slå på halogenlampan och relevanta lasrar för spännande fluoroforema (till exempel 488 nm för den "gröna" excitation laser och 633 nm excitation för den "röda" excitation laser).
5. Välj lämpliga excitations- och emissionsfilter och aktivera motsvarande detektorer.
   1. Ange inställningar för bildfångst, inklusive excitation laser, excitation och emissionsfilter, ljusvägen, och detektorer som ska användas i "Configuration Control" fönstret.
   2. På samma sätt, ange motsvarande inställningar för FCS mätningar i "Measurement" fönster under "Systemkonfiguration" -fliken. Använd så liknande inställningar som möjligt för avbildning och FCS.
   3. Aktivera detekteringskanaler för FCS inspelningar genom att markera "Ch1" rutan för den gröna channel och "CH2" för den röda kanalen i "Measurement" fönstret.
      OBS: Inställningarna bör optimeras för fluoroforen (er) som används, som i en vanlig konfokal avbildning experiment. I efterföljande experiment, kan samma FCS inställningar återanvändas genom att öppna en gammal FCS-fil med "Confocor" rullgardinsmenyn längst upp i användargränssnittet, och välja "Öppna fil." Tryck på "återanvändning" i den framväxande förvärvsfönstret. På samma sätt kan bildupptagning inställningar laddas genom att öppna en sparad bild och trycka på "återanvändning."
6. Vänta tills lasern är stabil innan du utför FCS mätningar. Detta kan ta upp till 30 minuter för gaslasrar, medan diodlasrar stabilisera snabbare. Justera hål medan du väntar.

4. Pinhole Justering

1. Förbereda 0,2-0,5 ^ M lösningar av fluoroforer eller fluorescerande färgämnen som motsvarar den excitations- och emissionsspektra av etiketterna på antikropparna. Defluoroforer måste ha vetat diffusionskoefficienter ^{18, 19.}
2. Sätt en 50 l droppe lösning med fluoroforen exciteras av den gröna lasern i centrum av en brunn i en kammarcoverglass bild. Sätt en droppe destillerat vatten på 40X vatten objektiv och placera bilden. Tryck på "Vis" knappen för att starta synligt ljus och använda okulära att hitta och fokusera på fluoroforen droppe.
   OBS: Använd samma glas som för senare mätningar cell eftersom förmodade små variationer i glastjocklek mellan diabilder kan påverka mikroskop inriktning.
3. Placera fokus väl inne i flytande droppe (10-100 pm från botten).
4. I "Measurement" fönstret, välj "Acquisition" -fliken. Tryck på "Nuvarande position" under "Positioner" (fönster C i figur 1).
5. Gå tillbaka till "System Configuration" fliken i samma fönster. Ställ en hög power för grön laser.
   ANMÄRKNING: En hög lasereffekt hänvisar till mätt effekten (dvs., inte den fluorescerande signalen inte ökar linjärt om lasereffekten ökas ytterligare). Omkring 1 mW systeminställningar makt, eller 5-10% av max lasereffekt, typiskt nog.
6. Testa stabiliteten av signalen genom att trycka på "Start". Detta kommer att öppna ett separat fönster som visar tidskurva och autokorrelationskurva för den aktuella mätningen. Kontrollera att den fluorescerande signalen är hög och stabil över tiden och visar fluktuationer i kHz snarare än Hz.
7. Välj "O Justera" -knappen i "Measurement" fönstret. Kontrollera om rätt detekteringskanalen (Ch1 eller Ch2) har valts. Tryck på "AutoAdjust X." Om den resulterande kurvan inte visar en tydlig maximum, eller den maximala är vid kanten, markera "grov" och tryck på "AutoAdjust X" igen. När den resulterande skärmen i x-riktningen är avslutad, gör samig för Y genom att trycka på "AutoAdjust Y."
8. De-välj "grov" och växla mellan att justera X och Y genom att trycka på "AutoAdjust" tills båda har tydliga maxima och värdena inte förändras mellan mätningarna.
9. Om celler är märkta med två olika fluoroforer, flytta till en kammare där röd fluoroforen lösning har tillsatts. Välj en hög lasereffekt för röd laser och upprepa steg från 4,6 till 4,8 för den röda excitation och detekteringskanal.
   OBS: Om X och Y-värdena avviker mellan kanalerna i system där endast ett litet hål används för båda detekteringskanaler väljer mellanliggande värden och tryck OK för att godkänna ändringarna. Här, för 488 nm laser med maxima vid X = 79 och Y = 189 och 633 nm laser med maxima vid X = 80 och Y = 188 värden X = 80 och Y = 189 valdes ut. Kombinationen av 488 nm och 633 nm lasrar för excitation av två antikroppar märkta med fluoroforer upphetsad av 488 nm eller 633 nm är ett bra val, eftersomrisk för överhörning minimeras om emissionsspektra inte överlappar ^två.

5. Mät Transit Tid Free fluoroforen

OBS: Genom att bestämma överföringstiden genom fokus (TauD) av en fluorofor med en känd diffusionskoefficient, storleken på detekteringsvolymen, och därmed det område av cellmembranet som befinner sig innanför fokus, kan beräknas. Beräkningen av TauD beskrivs i steg 7,2.

1. Genom att använda samma lösningar som används för hål justering ställa förvärvstiden till 30 sek x 2 upprepningar under "Förvärv" -fliken i "Measurement" fönstret (Figur 1, fönster C).
2. Starta en mätning genom att klicka på "Start" i "Measurement" fönstret (Figur 1, fönster B).
   1. Utför en lasereffekt serie för varje excitation laser och motsvarande fluoroforen i lösning, börjar vid eller näramättar makt och minskar med hälften för varje mätning. Ändra lasereffekten i "System Configuration" -fliken i "Measurement" fönstret (Figur 1, fönster C). Tryck på "Start" -knappen för att starta en mätning.
      OBS: Ta med lasereffekt för de kommande cell mätningar i det lägre intervallet (t.ex. mäta på 16, 8, 4, och två iW makt, innan målet) ^20. System laser inställningar är i allmänhet högre än utgångs excitation och kan variera i hög grad beroende på mikroskopet och kvaliteten av anpassning. I detta system motsvarar ovanstående effektområdet till cirka 60-500 iW systeminställningar makt. Det rekommenderas att använda en effektmätare för att mäta uteffekten innan målet för första gången en ny mikroskop används. Den nuvarande maximal effekt av lasern finns under "Info" -knappen på "Measurement" fönstret.
   2. Skriv ner de räknas per molCule (CPM, enhet: kHz) från varje lasereffektmätning.
   3. Om två detekteringskanaler används, kontrollera fönster som visar autokorrelationskurvan för överhörning. Använd en lösning som endast innehåller gröna fluoroforer att mäta upptäckt FCS autokorrelation i den röda detekteringskanalen och en lösning med bara röda fluoroforer att bedöma upptäckt i den gröna detekteringskanal. Som en tumregel, hålla CPM detekteras från "fel" fluorofor under 5% av den specifika signalen från korrekt fluoroforen.
   4. Kontrollera att värdena skalas linjärt med lasereffekt används. Mättnad av CPM på högsta lasereffekt (dvs något lägre värden än förväntat från ett linjärt förhållande) är acceptabelt.
      OBS: CPM bör vara väl över 10 för den högsta lasereffekt för nästan alla mikroskop system och gemensamma fluoroforer och kan vara betydligt högre för känsliga system. Första gången en ny konjugerad fluorescerande antikropp används, utföra enFCS mätning av antikroppen fritt diffunderar i lösning för att kvantifiera den förväntade CPM. Före mätningen, täcka mätkammaren med 200 | il av poly-L-lysin ympade med polyetylenglykol (utspädd till 0,5 mg / ml i PBS) i 1 timme vid rumstemperatur. Avlägsna vätskan med en pipett och tillåta kammaren lufttorka. Spara förrådslösning i kylskåpet (upp till 2 veckor) och pulvret lager i frysen. Vid mikroskopet, späd antikroppen till 1-10 | ig / ml i PBS. Följ steg 4,2-4,4 och 6,7 i detta protokoll. Om ytan inte är belagd med ett icke vidhäftande lösning kommer antikroppar interagera med glasytan och snabbt utarmas från lösningen.

6. Cell Mätningar

1. Lägg 125 | il celler i PBS + 1% FCS från antikroppen-märkta cellsuspensionen (steg 1,5) och 150 | j, l av transparent Roswell Park Memorial Institute-medium 1640 (RPMI) till en brunn i en 8-brunnars chambered coverglass slide. leave cellerna i mörker vid temperaturmätning under minst 20 minuter innan FCS mätningar.
   OBS: Detta är för att tillåta cellerna att sedimentera och fäst till botten av brunnarna och att jämvikta cellerna och lösning på temperaturmätning.
2. I "Scan Control" fönstret (Figur 1, fönster B), ställ in zoom 1 och starta en snabb XY skanning genom att trycka på "Snabb XY" -knappen. Modifiera lasereffekten så att den är så låg som möjligt medan cellerna fortfarande är klart synliga. Centrera bilden på en rund cell i genomsnittlig ljusstyrka, där membranet är klart definierat och det finns ingen fluorescerande signal i cytoplasman. Zooma så att cellen täcker större delen av bilden.
3. Välj en ny cell om den aktuella cellen rör sig eller visar rankor, profiler, eller extremt ljusa fläckar. Behålla samma zoom och lasereffekt för alla celler som tagits under samma experiment.
   OBS: En ruggig membran kan också vara ett tecken på kommande apoptos.
4. Fokusera på toppen av cellmembranet. I "Förvärv" -fliken i "Measurement" fönstret (Figur 1, fönster C), välja en position för FCS mätning genom att aktivera "Crosshair". Alternativt kan du välja den "LSM Image" fliken, markera önskade mätpositionen i LSM bilden, och tryck på "Lägg till plats."
   OBS: Den övre delen av cellmembranet kommer inte att påverkas av fluorescerande antikroppar eller fluoroforer ospecifikt bundna till poly-L-lysin. Det är emellertid viktigt att förvissa sig om att cellen inte rör sig under mätningen (se resultaten).
5. I "Förvärv" -fliken i "Measurement" fönstret (Figur 1, fönster C), ange antalet upprepningar till 6-10 med "Mät Time" satt till 10 sekunder per upprepning.
6. Gå tillbaka till "System Configuration" -fliken i "Measurement" fönstret. Justera lasereffekt för FCS mätning under "LAser "-knappen. Innan målet, använder låg effekt för mätningar cell i intervallet mellan 1 och 10 ^ W ^20.
   OBS: De rekommenderade värdena är en avvägning mellan signaldetektering och fotoskador till celler. Se steg 5.2.1 Notera andelen lasereffekt dessa värden motsvarar.
7. Starta en FCS mätningen genom att trycka på "Start" i "Measurement" fönster (fönster C). Om cell blekmedel betydligt i början av mätningen, som upptäckts av en nedgång i intensiteten spår med mer än 30% under de första 10 sek (ett exempel visas i figur 3A, lägre panelen), flytta till en annan cell och lägre lasereffekten för framtida mätningar.
   1. Om signalen går förlorad, justera fokus i Z-riktningen. När mätningen är klar, använd "Scan Control" fönstret (Figur 1, fönster B) för att kontrollera att cellen fortfarande är centrerad och att cellmembranet mättes. Om the cell har flyttat, kasta mätningen.
   2. I autokorrelationsfönster där mätningen visas, manuellt ta bort enskilda upprepningar som innehåller zoom manövrar, blekning, stora kluster, eller andra artefakter (se exempel i Figur 3). Gör detta genom att markera dem, högerklicka och välja "Ta bort". Spara sista filen i .fcs format. Spara minst fyra upprepningar per cell.
8. Eventuellt, förvärvar en bild av cellen vid mittsektionen (med hela omkretsen av membranet synlig) med hjälp av "Scan Control" fönstret. Ta bilden efter FCS mätningen för att undvika blekning. Tryck på knappen "Single" för att starta Bildinsamling.
9. Om du använder "Lägg till plats" för FCS fokus positionering, klicka på "Ta bort läge" innan vi går vidare till nästa cell.
10. Byt till en ny portion av cellsuspensionen efter högst två timmar av mätning för att hålla cellerna livskraftiga throughout experimentet.

7. FCS Analys

1. Öppna .fcs filer i ett program med kurvanpassning kapacitet (se Material / reagenser Tabell för den programvara som används i detta protokoll).
   OBS! FCS programvara som medföljer mikroskopet är ett bra ställe att bekanta sig med grundläggande montering, men ytterligare programvara är nödvändigt att montera tvådimensionell membran diffusion.
2. Först bestämmer storleken på exciteringsvolymen genom att analysera de fria fluoroforen mätningarna. Passa en 3-dimensionell fri diffusion kurva till autokorrelationskurvorna ^21.
   (Ekv. 1)
   OBS: Definition av parametrar: N: betyda antal fluorescerande enheter i fokalvolymen, τ (Tau): korrelationstiden, τ _D (TauD): genomsnittlig uppehållstid i fokalvolymen, T 1: sannolikheten för de fluoroforer för att vara i triplettillstånd, τ <sub> T: relaxationstiden för sing-triplett tillståndsövergångar, S: förhållandet mellan höjd och bredd diameter bränn volym.
   1. Utdrag TauD, överföringstiden för molekyler att överföra fokus.
   2. Använda de observerade TauD och publicerade diffusionskoefficienter (D) av fluoroforer används för kalibrering ^{18, 19} för att beräkna den pinhole radie (ω).
      (Ekv. 2)
3. Analys av autokorrelationskurvor på cellmembran.
   1. För att visualisera den del av kurvan som representerar molekylär diffusion, välj tidsramen börjar före den brantaste lutningen på autokorrelationskurvan och slutar efter kurvan likheter på ett (t ex 0,001 till 5 sekunder för murina ytreceptorer, se Figur 4).
   2. Generera en genomsnittlig autokorrelationskurva av de enskilda upprepningar sparade in steg 6.7.2.
   3. Montera en 2-dimensionell membran diffusion kurva till varje genomsnittliga autokorrelationskurvan med ekvation 3 ^3.
      (Ekv. 3)
      OBS: Viktiga utgångsparametrar är följande: N är det genomsnittliga antalet molekyler som är bosatta inom det excite membranyta. Räkna om till densitet (N / ^ m ^2). τ _D (TauD): genomsnittliga uppehållstiden i det prioriterade området, begränsas av två dimensionerna av membranet (s). Räkna om den genomsnittliga uppehållstiden till en diffusionskoefficient (^ m ² / sek) via den bestämda pinhole radie (ω) och ekvation 2. T1 är sannolikheten för fluoroforer att vara i triplettillståndet. Ljusstyrka (CPM) beräknas genom att dividera den genomsnittliga totala intensiteten av mätningen av N.
   4. Om en bra passform inte uppnås vid första försöket, ändra startvärden och / eller de övre och undre gränserna för variablerna tills this uppnås.
      OBS: Typiska övre lägre gränser för protein diffusion priser i primära cellmembran är 10-500 ms för TauD, 0-100% för T1, och 0,1-5 msek för TauT1. Välj startvärden för montering i mitten av dessa intervall. Den del av kurvan som representerar fluorescensfluktuationer som härrör från diffusion vanligen ligger mellan 1 ms och en sekund (se Figur 4). Beroende på fluorofor, kan det ibland vara en andra process närvarande, vilket ger upphov till autokorrelation på kortare tidsskalor än diffusion parametern. Detta orsakas av en övergående mörkt tillstånd (triplett) eller blinkar (som ofta förekommer för fluorescerande proteiner). En triplett tillstånd redovisas i ekvation 3, och den presenterade modellen bör därför också ge en bra passform i dessa situationer.

Representative Results

Ett typiskt resultat kommer att generera en autokorrelationskurva med en genomgångstid i intervallet 10 ms till 400 ms för membranproteiner. Antalet molekyler kan variera mellan 0,5 till omkring 200 per | j, m ² för endogent uttryckta proteiner. Kontrollera noga att CPM inte är lägre än väntat. Detta kan innebära att det finns en påverkan av bakgrundssignalen. Som en tumregel bör CPM signalen på celler som accepteras för analys inte vara lägre än 33% av CPM för fritt diffunderar antikroppar på samma lasereffekt. CPM ska skalas linjärt med lasereffekten. Autokorrelationskurvan för primära immun cellytreceptorer förväntas vara smidig, med den brantaste delen mellan 0,001 och 1 sek. Se figur 2 för en representativ autokorrelation kurva och dess tidskurva.

Som nämnts i korthet i inledningen, denre finns flera fall där FCS är inte lämplig för mätning av molekylär diffusion på grund av påverkan av andra källor till fluorescensfluktuationer, som bidrar till confounding signalen. Figur 3 visar exempel på fall där en särskild cell eller mätning upprepning ska kasseras. Det har redan nämnts att en extremt låg signal (mycket låg CPM) är anledning till att kasta bort cellen. Ett annat skäl för att kassera den enskilda cellen är att cellen är i rörelse (figur 3A). I fallet med blekning (figur 3B) eller om stora kluster är närvarande (figur 3C), bör mätningarna kasseras om effekten är betydande eller närvarande under hela mätningen. Om den här funktionen finns bara i en eller två upprepningar, kan dessa enskilda upprepningar kasseras, men de återstående upprepningarna kan fortfarande användas.

Det är viktigt att båda använder den korrektamodell för att passa data och även att noga kontrollera att passformen överlappar tätt med autokorrelationskurvan. I figur 4, är exempel på bra och dåliga kurvan passar visas. Ägna stor uppmärksamhet åt den del av kurvan som representerar diffusion (den mest brant sluttande delen). Det är också viktigt att förvissa sig om att både början och slutet av den lutande delen av kurvan är väl utrustade med modellen. Om passningen är dålig, utan uppenbara problem som att flytta, blekning, eller kluster, ändra utgångsvärden och / eller de övre och nedre gränserna (inom ett rimligt intervall) innan ett slutligt beslut att göra sig av cellen.

Figur 1: FCS mjukvarugränssnitt. Här visas de viktigaste fönstren är nödvändiga för att driva verktyg för FCS förvärv och bildbehandling, som beskrivs i protokollet. Fönster A, "Konfigurations Control "fönster är kontrollfönstret för strålbanan, laserkanaler och filter för avbildning. Fönster är ett" Scan Control "fönster för avbildning och visar skanningsinställningarna. Fönster C är" Measurement "fönster, fönstret för installationen av inställningar FCS mätnings. klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2: Representant spår och autokorrelationskurvor för diffuserande H-2D ^d MHC klass I ytmolekyler i nyisolerade murina NK-celler. Det övre fältet i figuren visar fluorescens fluktuation som en funktion av tiden under hela tidskurva för 7x 10 sec mätningar. Den undre panelen representerarär den genomsnittliga autokorrelationskurvan från dessa sju upprepningar. Höjden av autokorrelationskurvan är omvänt proportionell mot koncentrationen av mobila fluorescensmärkt H-2D ^{'^} enheter i den fokalvolymen. X-axeln värdet vid den brantaste delen av lutningen på kurvan, halv av amplituden, representerar den genomsnittliga uppehållstiden för fluorescensmärkt H-2D ^{'^} molekyler i fokalvolymen. Mätningen presenteras är en del av datamängden som publicerades i hänvisning ^2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: Exempel på problematiska cell spår. (A) En rörlig cell, såsom exemplifieras av kurvan att inte ha en stabil basal level. Den övre panelen visar ett exempel där den hela cellen har flyttat ut ur fokus efter ca 35 sek, såsom representeras av den mycket låga signalen efter denna tidpunkt. I den nedre panelen, är effekten mer subtil, med vågformerna uppenbara vid ett intervall på några sekunder. (B) Cell visar blekning, höjden på spår minskar med tiden. Jämföra höjden på spåret vid början av mätningen till att vid slutet av mätningen. (C) Förekomsten av stora kluster, företrädd av spikar i spåret. I den övre panelen, är ett stort kluster vid 20-25 sek närvarande. I den nedre panelen, flera kluster är närvarande under hela mätningen. Mätningarna presenteras är en del av datamängden som publicerades i hänvisning ^2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: representativa autokorrelationskurvor med kurvpassning och restprodukter. De röda och blå vertikala linjerna representerar gränserna för tidsfönstret som används för montering. (A) Exempel på en representativ passning av en två-dimensionell diffusionsmodell till ett prov autokorrelationskurva. I den övre panelen, den gröna kurvan (modell) ligger över den blå kurvan (den förvärvade autokorrelationen), vilket indikerar en bra passform. Det undre fältet visar den kvarvarande från kurvanpassning. Svängningarna cirka 1 sekund, som inte är utrustade väl, är typiska för mätningar cell och är acceptabel. (B) Exempel på en dålig passning av två-dimensionell diffusion till samma autokorrelationskurvan. Den anpassade modell inte överlagra autokorrelationskurvan, och det inte konvergerar på 1. De lägre panelerna i (A och B) visar rest från kurvan montering. residualernaär betydligt större för den dåliga passform, särskilt för diffusion delen av kurvan. Mätningen presenteras är en del av datamängden som publicerades i hänvisning ^2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Detta protokoll för FCS kan användas för bedömningen av de molekylära dynamiken i ytmolekyler på alla typer av immunceller (murin, human eller andra arter). FCS mäter spatio-temporala molekyldynamik ner till enda molekyl upplösning i levande celler. Den molekylära densitet, liksom diffusionshastigheten och klusterdynamik av proteinerna av intresse, kan extraheras från autokorrelationskurvor.

Den fluorescerande märkningen är av central betydelse för framgångsrika FCS experiment. Proteiner av intresse på cellmembranet har traditionellt varit märkt med användning av antikroppar, och antikroppar är ofta mest praktiskt för användning på ytproteiner i naiva immunceller. Omärkta antikroppar måste vara direkt konjugerad till fotostabila fluorescerande färger med en hög molekyl ljusstyrka. Valet av fluoroforen för antikroppskonjugering är viktigt för kvaliteten på mätningarna. Standard etiketter för flödescytometri,såsom fluorescein och fykoerytrin-baserade färgämnen, rekommenderas inte på grund av snabb blekning. Foto stabila färgämnen för direkt konjugering till antikroppar tillhandahålls för närvarande av flera företag. Tillverkarna brukar ge tillfredsställande protokoll för konjugering och rening av den resulterande konjugerade antikroppen, och detta kan göras på ett par timmar. Det är också möjligt att utföra FCS med hjälp av fluorescerande proteiner, men särskild försiktighet bör vidtas för att minimera lasereffekt, eftersom fluorescerande proteiner är i allmänhet mer benägna att blekning än de mest fotostabila kemiska fluoroforer. Enligt tidigare erfarenhet, över-expression av proteiner ofta leder till en avsevärd minskning av diffusionshastigheten till följd av ansamling, vilket gör användningen av fluorescerande proteiner olämpliga.

Pinhole kalibrering före mätningarna är också ett viktigt steg. Fluoroforema används för att bestämma storleken på bränn volymen måste ha känt diffusionskoefficients (se ekvation 2). Använda gratis fluoroforer nära motsvarar emissionsspektra av antikropps etiketter för att bestämma storleken på bränn volymen. Detta måste göras för att säkerställa optimal signal effektivitet och korrekt detektering av potentiella korskorrelationerna mellan färgkanaler. Utför en FCS lasereffekt serie av fritt diffunderande fluoroforer för att säkerställa att systemet ger den förväntade utsignalen över ett område av befogenheter. Jämför CPM på samma lasereffekt mellan experiment för att säkerställa överensstämmelse mellan experiment.

I analysen steg, är det viktigt att sätta rimliga intervall och startvärden för variabler vid montering av modellerna. Använd tidigare publicerade kunskap från liknande cellsystem för att hitta bra utgångspunkter. Teoretiskt är FCS en kvantitativ teknik, men eftersom optimala förhållanden förekommer sällan, har en viss grad av försiktighet ska iakttas vid tolkning av resultaten. Alla typer av fluktuationer kommer att registreras,oavsett varifrån dessa svängningar. Därför är det bra att ha så mycket information som möjligt om den experimentella system för att utesluta eventuella felkällor. Till exempel, kommer rörelse av hela cellmembranet ge upphov till svängningar med längre TauD (figur 3A), medan förmodade föroreningar hos de fria fluoroforer i lösningen kommer att diffundera med minst tio gånger kortare TauD.

Denna grundprotokollet kan modifieras på flera sätt. Om två proteiner är märkta med olika fluoroforer, kan sam-diffusion (ett indirekt mått på interaktion) att bedömas genom att expandera den metod för att detektera korskorrelationen. Den utsträckning i vilken dessa proteiner binder till varandra i cellmembranet representeras av höjden på korskorrelationskurvan i förhållande till höjden av autokorrelationskurvorna för de enskilda färgkanaler. Korskorrelation betecknas Ch1-Ch2 i mätningen programvara. precise analys av korskorrelation kräver kontroller för överhörning och är därmed något mer komplicerad än den i protokollet presenteras här. En detaljerad beskrivning av hur man ska gå, som en förlängning till denna grundläggande protokoll, kan återfinnas i Strömqvist et al. ^13. För att optimera positioneringen i z-riktningen, kan z-scanning FCS användas ^22. Enligt tidigare erfarenheter, har det varit tillfredsställande att göra detta manuellt. Det är också möjligt att montera flera diffusionskoefficienter till en FCS autokorrelationskurva ^23. Detta kräver tidigare kunskap om antalet subpopulationer med olika diffusionshastigheter och av de ungefärliga diffusionshastigheter hos åtminstone en av de subpopulationer. I annat fall kommer det att finnas alltför många fria variabler, vilka kommer att meddela beslaget opålitliga. Ett typiskt exempel skulle vara ett ytprotein, vars diffusionshastighet avsevärt bromsas av bindning av en ligand. Slutligen cleaning spår av extremvärden utan att helt ta bort upprepningar är möjlig ^24.

Avsaknaden av en fluorescerande signal är ett vanligt problem att felsöka. För fritt spridande fluoroforer, använd halogenlampan för att kontrollera om nedgången är fluorescerande. Om nedgången inte är fluorescerande, blanda en ny sats av fluoroforer med en något ökad koncentration (inom nM) och försök igen. Kontrollera att fokus inom fluorescerande droppe, lasrarna är påslagna i programvaran, är lasereffekten tillräcklig, är rätt emissionsfilter och detektorer valda och de rätta kanalerna i "FCS Measurement" fönster är aktiverad (se steg 3,6). Starta lasern och tittar från sidan för att visuellt bekräfta att laserljuset når provet. Undvik att titta rakt in i laserkällan. Om den valda filteremissions omfattar laservåglängden, kommer en slutare automatiskt blockera ljusvägen för att undvika skador på detektorn. jagf alla inställningar är bra men inget ljus kommer, åter starta lasrar, FCS-systemet, och datorn. Fråga en expert om bristen på en fluorescerande signal kvarstår. Ett förenklat förfarande gäller om de märkta cellerna inte visar fluorescens. Bekräfta närvaron av fluorescens med halogenlampan; slå på lasrar väljer laserkanaler och justera lasereffekten. Välj en position på cellmembranet, antingen med hjälp av "Crosshair" eller "Lägg till plats" alternativet (se steg 6,4). Växla till nästa prov om signalen fortfarande är för låg.

En viktig aspekt av fluktuation grundval av teknik är att molekyler måste vara rimligt mobil som skall detekteras. Mycket långsamt rörliga fraktioner av molekyler eller molekyler fångade inom områden som är mindre än fokus under hela mättiden kan därför inte mätas. Detta leder till en eventuell underskattning av ytan täthet och en överskattning av diffusionshastigheten. Blekningkan också bidra till en förmodad underskattning av både densiteten och TauD, eftersom molekyler kommer att ha en högre sannolikhet att blekt desto längre tid de tillbringar i laserbelyst fokalvolymen. Påverkan från bakgrunden (fluorescens från utanför fokalplanet) skulle, å andra sidan, på konstgjord väg öka antalet detekterade molekyler och minska den uppmätta CPM. Tidigare var den totala maximala felet i den absoluta densitet bestämningen uppskattas till cirka 40% ^20. Emellertid är det vanligen möjligt att jämföra olika biologiska prov med varandra, eftersom de felkällor är, i de flesta fall, är lika i hela experimenten. En annan potentiell felkälla är att antikroppar är bivalenta, vilket innebär att varje antikropp potentiellt kan binda till två målmolekyler. Författarna observerade inte detta fenomen, men det kan inte garanteras att detta är en global funktion för andra antikroppar. Inverkan av bivalence måsteDärför testas individuellt för varje antikropp. Kombinationen av specifika primära och märkta sekundära antikroppar får aldrig användas på grund av den höga risken för att inducera artificiella kluster från två på varandra följande bivalenta etiketter. Om celler har istället transfekterats med fluorescerande protein-märkta versioner av proteinet av intresse, kommer varje protein har endast en etikett. Emellertid kräver denna transfektion, vilket inte alltid är önskvärd och kanske inte ens är möjlig (t.ex., om användning av immunceller direkt isolerade från humant blod). Slutligen innehåller en enda punkt FCS inte spela in bilder. Om bilderna krävs för publicering eller annat ändamål, måste dessa fångas separat med hjälp av avbildnings del av programvaran. fånga alltid bilder efter FCS mätningar för att undvika onödig blekning av cellytan.

Till skillnad från FCS, traditionell konfokal baserad mikroskopi, såsom FRAP och bildkorrelationsmetoder kan inte kvantifiera fluorescensfluktuationervid enda molekyl nivå ^6. Bild korrelationsmetoder mäta antalet molekyler indirekt och med lägre upplösning, men de kan bedöma variationen i molekylär diffusion och klustring över hela avbildade området ^25. Standard SPT mätt med konfokalmikroskopi har ett idealiskt nivå märkning, tiopotenser lägre än FCS ^7. Därför kan tätheten av märkta proteiner inte mätas med standard SPT. Kombinationen av SPT med andra mikroskopi tekniker (t.ex. stokastiska optisk rekonstruktion mikroskopi eller fotoaktivering lokalisering mikroskopi) kan densiteten och rörelse som skall bedömas, men det kräver mycket specialiserade färgämnen eller proteiner ^11. Super-upplösning tekniker, såsom strukturerade belysning mikroskopi och stimulerad emission utarmat mikroskopi, kräver ofta fasta prover och en kombination av primär och sekundära antikroppar för labeling ^26. Lokalisering är således mycket exakt, medan dynamiken i systemet inte ofta kan bedömas. I jämförelse med SPT och super-upplösningstekniker, FCS kräver också betydligt mindre datorkraft och tid för analys och utvinning av resultaten. Flödescytometri är arbetshästen i immunologi och kan med fördel kombineras med FCS. Cellsortering kan exempelvis följas av efterföljande mätningar på utvalda cellpopulationer om fotostabila färgämnen hade använts före sortering. FCS är således en metod som kan användas ensamma eller i kombination med andra etablerade metoder.

Detta protokoll kan användas för att identifiera närvarande okända funktioner i immunceller dynamik och interaktioner inom cellmembranet vid den enda molekyl nivå. Dessutom kan egenskaperna hos hela befolkningen kontra utvalda delmängder jämföras. Den har också en potentiell roll som ett selektionssteg för immuncellterapi. Eftersom mätningarna görinte förbrukar cellen, till skillnad från de flesta andra metoder för att undersöka funktionaliteten hos immunceller, kan enskilda celler potentiellt utvinnas och odlas. Således, efter analysen av FCS kurvor, lovande celler kan extraheras och expanderat för ytterligare applikationer, inklusive förmodade kliniska tillämpningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MACS NK Cell Isolation Kit mouse II	Miltenyi Biotec NordenAB	130-096-892	Negative selection of NK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma-Adlrich	F7524	Heat inactivated
Phosphate Buffered Saline	-	-	Made in house
Roswell Park Memorial Institute medium 1640	PAA The Cell Culture Company	E15-848	Transparent medium
Antibody clone 2.4G2	Thermo Fischer Scientific	553140	For blocking Fc-receptors.
Anti-Ly49A antibody			Monoclonal antibody made in house and conjugated in house to Alexa fluor 647
Clone JR9.318
Anti-H-2Dd antibody	BD Pharmingen	558915	Conjugated in house to MFP488
Clone 34.5.8S
MFP488	Mobiotech	MFP-A2181	Fluorescent dye for antibody conjugation.
Poly-L-Lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Diluted in distilled water (1.10)
Poly-L-Lysine (20 kDa) grafted with polyethylene glycol (2 kDa)	SuSoS AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)	Diluted in PBS (pH 7.4) to 0.5 mg/ml.
Rhodamine 110 chloride	Sigma-Aldrich	432202	Known diffusion coefficient: 3.3 × 10−10 m2/sec 19
Alexa fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A20006	Known diffusion coefficient: 4.4 × 10−10 m2/sec 20
Confocal microscope	Zeiss	LSM510
Software: Confocor 3	Zeiss
Software: Matlab with curve fitting toolbox	Matlab	Version R2013b
Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Thermo-scientific	155411	8 wells, 1.0 borosilicate bottom