Summary
Dieses Protokoll beschreibt die indirekte Neuron-Astrozyten Co-Kultur für compartmentalized Analyse von Neuron-Glia Interaktionen.
Abstract
Proper neuronaler Entwicklung und Funktion ist die Voraussetzung der Entwicklungs- und adulten Gehirn. Jedoch sind die Mechanismen, die die stark kontrollierten Bildung und Aufrechterhaltung von komplexen neuronalen Netzwerken zugrunde liegenden nicht vollständig bisher verstanden. Die offenen Fragen Neuronen in Gesundheit und Krankheit betreffen , sind vielfältig und das Erreichen von Verständnis der grundlegenden Entwicklung der menschlichen Pathologien zu untersuchen, zum Beispiel Alzheimer-Krankheit und Schizophrenie. Die detaillierte Analyse der Neuronen in vitro durchgeführt werden. Allerdings Neuronen fordern Zellen und brauchen die zusätzliche Unterstützung von Astrozyten für ihre langfristige Überleben. Diese zelluläre Heterogenität in Konflikt mit dem Ziel, die Analyse von Neuronen und Astrozyten zu sezieren. Wir stellen Ihnen hier eine Zellkultur-Assay, der für die langfristige Co-Kultivierung von reinen primären Neuronen und Astrozyten, die die gleiche chemisch definierten Medium gemeinsam nutzen können, während er physisch zu seingetrennt. In diesem Aufbau überleben die Kulturen für bis zu vier Wochen, und der Test ist für eine Vielzahl von Untersuchungen über Neuron-Glia-Interaktion geeignet.
Introduction
In den vergangenen Jahrzehnten hat sich die allgemeine Interpretation von neuroglia Funktion aus der Zuschreibung eines nur unterstützend auf eine aktive regulatorische Rolle in Bezug auf neuronale Funktion 1 entwickelt. Aufgrund ihrer prominenten Auswirkungen auf Gehirn - Homöostase in Gesundheit und Krankheit 2, Astrozyten sind von besonderem Interesse für die wissenschaftliche Gemeinschaft. In den letzten Jahren haben auf Neuron-Glia - Wechselwirkung in vivo und in vitro 3 eine Vielfalt von Studien konzentriert. Doch die meisten der Kultursysteme nicht für die getrennte Analyse der beiden Zelltypen und ihrer jeweiligen secretomes ermöglichen.
Verschiedene Ansätze nutzen die direkte Co - Kultivierung von Neuronen und Glia 4-6 lang anhaltende Überleben und physiologisch relevanten neuronalen Netzwerk Entwicklung zu erreichen. Das vorliegende Protokoll erreicht die gleichen Ziele , während die beiden Zelltypen zu halten 7 physikalisch getrennt. Im Vergleich zu conditioned Medium nähert sich 8,9, unser System ermöglicht die bidirektionale Kommunikation zwischen Neuronen und Astrozyten zu studieren. Die Expression der sekretierten Signalmoleküle können überwacht werden, während die Zellen in dem gemeinsam genutzten Medium maturate. Diese Möglichkeit ist besonders relevant, da Astrozyten lösliche Faktoren freisetzen, wie beispielsweise Zytokinen, Wachstumsfaktoren und extrazelluläre Matrixmoleküle 10,11, wodurch neuronal wachstumsregulierende und Funktion 7,12. Somit wurde gezeigt, dass die Zugabe an retinalen Ganglionzellen in vitro Thrombospondin die Bildung der Synapsen 13 induziert. Jedoch sind auch andere noch unbekannte Faktoren notwendig Synapsen zu machen funktionellen 13. Darüber hinaus haben freigesetzten Moleküle von Astrozyten, um identifiziert zu werden, um die Basis von Neuron-Glia Interaktionen zu verstehen.
Der Anbau von primären Neuronen und Astrozyten aus Maus und Ratte wurde zuvor 14-16 beschrieben. Hier sind wirpräsentieren ein elegantes und vielseitiges Werkzeug beide Zelltypen in einem indirekten Kokultur Ansatz zu kombinieren. Da die beiden Kulturen noch physikalisch getrennt werden, um die gleiche Medium teilen, um die Auswirkungen von Neuronen, Astrozyten und lösliche Moleküle können separat analysiert werden, wodurch ein leistungsfähiges Werkzeug für Neuron-Glia-Interaktionsstudien zu schaffen.
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Protocol
Die Versuche mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem deutschen Recht und der Deutschen Gesellschaft für Neurologie Leitlinien der Tierhaltung. Die Tierpflege und -nutzung Gremien der Ruhr-Universität Bochum haben die entsprechenden Genehmigungen erteilt.
1. Vorbereitung und Bearbeitung von kortikalen Astrozyten
Hinweis: Führen Sie diese Schritte des Protokolls mindestens 7 d, bevor zu den nächsten Schritten fortfahren, da die Astrozytenkulturen in konfluente Monolayer entwickeln sollten, bevor die Neuronen vorbereitet sind. Primäre Astrozyten aus gemischten Gliazellen Kulturen abgeleitet von Maus Welpen um postnatalen Tag erhalten (P) 0-3. Drei Gehirne (6 Rinden) pro T75-Flasche verwendet werden sollen.
- Bereiten Sie die Astrozyten Medium durch Dulbeccos modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% v / v Pferdeserum und 0,1% v / v Gentamycin unter sterilen Bedingungen zu ergänzen. Speichern das Medium bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen.
- Mantel 3x T75-Flaschen with 10 ug / ml Poly-D-Lysine (PDL; in Zellkultur-grade Wasser) für 2 mindestens 1 h bei 37 ° C in Gegenwart von 6% v / v CO. Nach dem Auftragen waschen die Kolben zweimal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) ungebundene Kationen zu entfernen, und fügen Sie 9 ml Astrozyten Medium.
- Für die Herstellung der Gehirne, mit 10 ml Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 10 cm Petrischale und 1 ml HBSS auf 1x 15 ml-Röhrchen auf 1x (unabhängig von der Anzahl der Köpfe, die verwendet wird). Halten Sie eine chirurgische Schere, 2 feinen Pinzette und ein Fernglas griffbereit für das Verfahren.
- Enthaupten 3 Welpen schnell mit den chirurgischen Schere und sammeln Sie die Köpfe in einem leeren 10-cm-Schale.
- Führen Sie die Vorbereitung der Rinden unter dem Binokular. Mit zwei feinen Pinzette, entfernen Sie die Rückenhaut vom Schädel an der Mittellinie von der Halsbereich ausgehend bis in Richtung der Höhe der Augen. Danach wird das Gehirn mit seinen Blutgefäße unter der Schädel sichtbar.
- Befestigen Sie den Kopf am rostralen Ende mit einem Paar Zangen und einschneiden die Mittellinie des Schädels, der am hinteren Ende beginnen. Anschließend befestigen Sie den rechten und linken Hälften des Schädels, das Gehirn zu belichten.
- Schließen Sie die Spitze der Zange und positionieren es ventral unter dem Gehirn. Heben Sie das Gehirn aus dem Schädel und übertragen sie in die HBSS gefüllte 10 cm Petrischale. Gehen Sie auf die gleiche Weise mit den restlichen Probe, bis alle Gehirne in der Schale gesammelt werden.
- Nachdem die Gehirne zu sammeln, mit der Trennung der Rinden starten, indem Sie die Rautenhirns mit einer Zange wie eine Schere Abschnüren. Führen Sie einen Mittelschnitt zwischen den beiden Hemisphären mit einer Pinzette. Fix vorsichtig das Gehirn mit einer Pinzette und schneiden Sie die Mittelhirns und die Riechkolben eine zweite Pinzette, um am Ende mit den kortikalen Hälften aus.
- Fix eine kortikale Hälfte mit einer Zange und ziehen die Meningen von den Hemisphären durch Lösen sie fROM mit der Seitenkante und sie anschließend von der kortikalen Oberfläche ziehen eine zweite Pinzette.
- Drehen Sie die kortikale Hälfte mit seiner Oberfläche in Richtung der Schale orientiert nach unten; sorgfältig sezieren und die sichelförmigen Hippocampus mit einer Pinzette entfernen. Übertragen Sie die einzelnen Rinden in den konischen 15 ml-Röhrchen eine geschlossene Zange mit einem individuellen Kortex zu tragen.
- Nachdem alle Rinden, Transit in den sterilen Laminarströmungsabzug zu sammeln und mit den Vorbereitungen für die Dissoziation des Rindengewebe beginnen.
- 1 ml DMEM in ein 2 ml Reaktionsgefäß und Zugabe von 0,1% w / v Papain (30 Einheiten). Inkubieren der Suspension in einem Wasserbad bei 37 ° C, bis eine geklärte Lösung (ca. 3 min) entwickelt. In 0,24 mg / ml L-Cystein und 20 ug / ml DNAse und leicht schütteln.
HINWEIS: Für die Verdauung, ca. 1 ml Enzymlösung benötigt. - Filter (0,22 um Porengröße) zu erhalten 1 ml sterilen Lösung vor der Zugabees dem kortikalen Gewebe. Inkubieren der Röhrchen für 30 min - 1 h bei 37 ° C (dh in einem Wasserbad).
Hinweis: Die Schritte 1,11-1,14 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein. - Um die Verdauung Reaktion zu beenden, 1 mL Astrozyten Medium und sorgfältig das verdaute Gewebe unter Verwendung einer 1 ml Pipette verreiben. Für Verreiben, sanft die Pipette Kolben bewegen, wodurch Ansaugen und die kortikale Gewebesuspension Extrudieren.
- Sobald das Gewebe in eine Einzelzellsuspension dissoziiert worden, 5 ml Astrozyten Medium und Zentrifuge für 5 Minuten bei 216 x g.
- Aspirieren der Überstand vorsichtig von der resultierenden Pellets und Resuspendieren der Zellen in 1 ml Medium Astrozyten.
- Fügen Sie die Zellsuspensionen zu T75-Flaschen aufgefüllt mit 9 ml Astrozyten-Medium (siehe 1.2).
- Inkubieren der Zellen bei 37 ° C im Inkubator in Gegenwart von 6% v / v CO 2. Nach 4 d, führen Sie das erste komplette Mediumwechsel (10 ml). d 3 - Danach wird das Kulturmedium alle 2 ändern.
- Nach 7 d, prüfen Sie, ob die Zellen eine konfluente Monoschicht gebildet haben. Wenn nicht, warten weitere 2 - 3 Tage bis zur vollständigen Einmündung der Kultur erreicht wird.
HINWEIS: Astrozyten große abgeflachte Zellkörper anzuzeigen, am Boden des Kolbens lokalisieren und keine nennenswerten zelluläre Prozesse zu entwickeln. Sie unterscheiden sich von den kleinen Phasenkontrast hellen Vorläuferzellen und Mikroglia die sich auf der Oberseite des Monolayer 17. - Um die Beseitigung der Vorläuferzellen zu erhalten und eine reine Astrozyten Kultur, legen Sie die T75-Flaschen auf einem Orbitalschüttler erhalten und die Kulturen O / N bei 250 Umdrehungen pro Minute schütteln. Sicherzustellen , dass die Temperatur auf 37 ° C eingestellt wird und dass der Filter des Kolbens mit Laborfilm versiegelt 2 Verdampfen des CO zu verhindern.
- Am nächsten Tag absaugen Medium und fügen Sie 10 ml frisches Kulturmedium ergänzt mit 20 & mgr; M Cytosin-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) zu Eliminate Restteilender Zellen.
HINWEIS: Inkubation mit AraC für 2 - 3 d in den Inkubator bei 37 ° C, 6% CO 2 wird in einer reinen Kultur von Astrozyten führen. - Überwachen Sie die Reinheit der Astrozytenkulturen durch visuelle Inspektion unter dem Lichtmikroskop. Wenn Restphasenkontrast heller Vorläuferzellen und Mikroglia noch 17 auf der Oberseite der astrozytären einschichtigen befinden (siehe Schritt 1.16), wiederholen Sie die Schritte 1.18 und 1.19.
HINWEIS: Die konfluenten Monolayern und reine astrocyte kann für bis zu 14 d in den Inkubator (37 ° C, 6% v / v CO 2) vor dem Fortfahren mit dem nächsten Schritt beibehalten werden. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d. Sammeln Sie nicht, einfrieren und die Astrozyten auftauen, da diese Zellen ihre neuronalen unterstützende Eigenschaften durch den Speichervorgang zu verlieren.
2. Vorbereitung Astrozyten für die indirekte Cokultur
Hinweis: 48 - 72 h, bevor die Neuronen, die Übertragung Astrozyten auf die cel Vorbereitungl-Kultureinsätzen. Im Allgemeinen liefert eine einzelne T75-Kolben eine ausreichende Anzahl von Zellen, die die neuronalen Kulturen mit einer Zubereitung erhalten zu unterstützen.
- So viele Einsätze nach Bedarf in 24-Well-Platten. Mantel jeder Einsatz mit 10 ug / ml PDL (gelöst in Zellkultur-grade Wasser) für etwa 1 h bei 37 ° C, 6% v / v CO 2. Nach der Inkubation waschen die Einsätze zweimal mit PBS. In der Zwischenzeit gehen mit der Herstellung von Astrozyten.
HINWEIS: Die mit PBS gefüllt Einsätzen gehalten werden kann, bis die Astrozyten Zellsuspension zur Verwendung bereit ist. - Saugen Sie das Astrozyten Medium (mit AraC) und waschen Sie die Kultur einmal mit 10 ml PBS jegliche restliche Serum entfernt wird, um sicherzustellen.
- 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) in den Kolben und Inkubieren der Zellen für Trypsinisierung bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für ca. 10 min.
- Kontrolle der Zellablösung durch visuelle Inspektion mit Hilfe eines Mikroskops und facilitate die Ablösung der Zellen durch die Seite der Kolben gegen den Desktop tippen.
Hinweis: Die Schritte 2,5-2,8 sind kritisch und sollten innerhalb von 15 fertig sein - 20 min. - Nach der Trypsinisierung aussetzen erneut die Zellen vorsichtig in 7 ml Astrozyten Medium und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen. Zentrifuge für 5 min bei 216 x g.
- aspirieren vorsichtig den Überstand und Zellpellet in 1 ml Astrozyten Medium.
- Zählen Sie die Zellen unter Verwendung einer Zählkammer.
- Füllen Sie den Boden der Wells der 24-Well-Platte mit 500 & mgr; l Astrozyten Medium und übertragen 25.000 Zellen in 500 & mgr; l Astrozyten Medium in jedem einzelnen Einsatz. Inkubieren der Kultur bei 37 ° C, 6% v / v CO 2.
HINWEIS: Nach 42 bis 72 h die Kulturen ungefähr 100% Konfluenz erreichen. In diesem Stadium ist die Reinheit der Kultur kann durch Immunzytochemie 11 überprüft werden. Die konfluenten Kulturen können die bis fortfahren bis zu 7 d beibehalten werdennächster Schritt. Ändern Sie die Hälfte des Mediums alle 3 d.
3. Herstellung von primären Neuronen im Hippocampus
Hinweis: Primäre Maus Hippocampus-Neuronen sollte von E15.5 abgeleitet werden - E16 Embryonen von timed schwangeren Mäusen.
- Bereiten neuron Medium (MEM mit 10 mM Natriumpyruvat, 0,1% w / v Ovalbumin, 2% v / v B27 Medium zu ergänzen, und 0,1% v / v Gentamicin (steril filtriert)), und Vorbereitungsmedium (HBSS mit 0,6% w / v Glucose und 10 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazin-ethansulfonsäure)). Vorwärmen und pre-äquilibriert das Neuron Medium in Saugflaschen bei 37 ° C, 6% v / v CO 2.
- Das Glas-Deckgläschen (12 mm Durchmesser) in die Vertiefungen von 24-Well-Platten (verwenden, um die speziellen Deckgläsern, die für die Verwendung mit Zellkultureinsätze eingekerbt sind).
- Mantel für mindestens 1 h mit 15 & mgr; g / ml Poly-DL-Ornithin in Wasser (Zellkultur-grade) bei 37 ° C. Verwenden Sie mindestens 500 & mgr; l pro Vertiefung, um sicherzustellen,die Deckgläser vollständig bedeckt. Waschen Sie die Vertiefungen zweimal mit PBS. Lassen Sie die PBS in den Vertiefungen, bis die Zellen Plattierung. Stellen Sie sicher, dass die Vertiefungen nicht austrocknen.
- Um die hippocampi sezieren, bereiten 3x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt und 1x 2 ml-Röhrchen mit 1 ml Herstellungsmedium. Bereiten Sie Schere und zwei feinen Pinzette.
- Opfere die schwangere Maus durch Genickbruch, sterilisieren den Bauch durch Waschen mit 70% v / v Ethanol, und öffnen Sie den Bauch mit einer scharfen Schere. Excise die wulstigen Gebärmutter vorsichtig mit einer Schere und übertragen Sie die Orgel in 1x 10 cm Teller mit Präparationsmedium gefüllt.
- Dann entfernen Sie die Embryonen aus der Gebärmutter. Vorsichtig die Gebärmutter einzuschneiden und die Eihaut entfernen, ohne dass durch Verwendung von 2 Zange um die Embryonen zu schädigen. Danach enthaupten jeden Embryo mit einer Schere und übertragen Sie die Köpfe in eine zweite 10-cm-Schale mit Präparationsmedium versorgt.
- Fahren Sie mit der Vorbereitung der Köpfe (ähnlich dem preparation beschrieben in 1,4 bis 1,7).
- den Schädel und die Haut im Halsbereich der Nähe des Rautenhirns, die senkrecht zur neuraxis immobilisieren den Kopf mit einer Pinzette und einzuschneiden. Verwenden Sie ein zweites Paar von Zange sowohl Schädel und Deckhaut zu heben, und biegen Sie die weichen Schädelkappe in Richtung des rostralen Ende des Kopfes, wodurch das Gehirn ausgesetzt wird.
- Mit Hilfe von 2 Pinzetten, um das Gehirn von der Schädelhöhle lösen. Dazu an den Riechkolben dies, schließen 1 Pinzette und trennen das Gehirn aus dem Schädel beginnt und in Richtung des Rautenhirns zu bewegen. Sammeln Sie die Gehirne in einem anderen 10-cm-Schale mit Präparationsmedium gefüllt.
- Präparieren Sie die hippocampi aus den Cortex-Einheiten wie oben für die Astrozyten Zubereitung beschrieben (Schritt 1.6). Entfernen Sie den Hippocampus von jeder Hemisphäre und sammeln sie in der 2-ml-Röhrchen mit Präparationsmedium gefüllt.
- Nach der Präparation abgeschlossen, übertragen Sie den Schlauch in den sterilen Laminar-Flow-Bank und Digest die Hippocampus-Gewebe mit 1 ml Aufschlußlösung Papain enthalten. Bereiten Sie die Aufschlusslösung wie in Schritt 1,9 bis 1,10, aber verwenden MEM statt DMEM.
Hinweis: Die Schritte 3,9-3,12 sind kritisch und sollte innerhalb von 10 abgeschlossen sein - 15 min. - Nach Abschluss der Verdauung, zurückziehen sorgfältig die Aufschlußlösung durch vorsichtiges Absaugen mit einer Pipette.
- Waschen Sie die hippocampi 3-mal mit Neuron Medium durch aufeinanderfolgende Zugabe und danach sorgfältig die Entnahme von 1 ml frisches Kulturmedium pro Waschgang. Zentrifuge nicht die Zellsuspension.
- Nach dem letzten Waschschritt sorgfältig verreiben das Gewebe in 1 ml Medium Neurons.
- Zählen Sie die Zellen, die eine Zählkammer mit und Platte 35.000 Zellen in 500 & mgr; l Neuron Medium pro einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte (die Platte erwähnt in 3.2).
HINWEIS: Optional kann eine Zelle aliquoten mit Trypanblau counterstained werden, um die Vitalität der Zellpräparation zu beurteilen. Kontrollieren Sie die Plattierungsdichte durch visuelle InspektionIon mit dem Mikroskop (in der Regel 90 bis 110 Zellen pro Gesichtsfeld eines Standard-10X-Objektiv). - Ort Neuronen in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2 für 1 h.
- Sende Inkubation, nehmen die vorbereiteten Einsätze (ausgesät mit konfluenten Astrozyten Monolayern) aus dem Inkubator (siehe Schritt 2.8). Tauschen Sie das Medium durch die Astrozyten Medium ansaugt und mit 500 & mgr; l frisches Neuron Medium zu ersetzen.
HINWEIS: Die Einsätze konfluenten Astrozyten Monolayern nach 2 beherbergen sollte - 3 DIV (Tage in vitro). - Legen Sie die Einsätze mit Astrozyten sorgfältig in die Vertiefungen, die die Neuronenkulturen enthalten (Schritt 3.13) mit einer sterilen Zange.
- Platzieren der resultierenden indirekten neuron-Astrozyten Kokultur wieder in den Inkubator bei 37 ° C, 6% v / v CO 2.
HINWEIS: Unter diesen Bedingungen kann Neuronen für bis zu 4 Wochen in vollständig definiertem Medium kultiviert werden. Kein Mediumwechsel notwendig ist. Für Langzeitkulturen, wird empfohlen, e zu füllenMPTY Brunnen mit sterilem Wasser, um die Verdunstung von der 24-Well-Platte zu reduzieren. - Führen Sie in - vitro - Zellanalysen nach Kulturperioden gewünscht (zB für Immunzytochemie, PCR, Western Blot, elektrophysiologischen Ableitungen (Patch - Clamp oder Multielektroden - Array)) 7,15,18.
HINWEIS: Die Kultursystem eignet sich auch für akute und chronische pharmakologische Behandlung der Kulturen 11.
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Representative Results
Die Analyse der neuronalen Kulturen über den indirekten Cokultur-System ist vielfältig und kann in verschiedenen Stadien der Kultur Reifung durchgeführt werden. Aufgrund der Tatsache, dass die Zellen für bis zu 4 Wochen, sind Langzeituntersuchungen der Kulturen möglich aufrechterhalten werden kann.
Das Schema in der Mitte linken Seite von Abbildung 1 zeigt die Co - Kultur - Setup. Mit dem Einsatz dieses Systems kann die Abbildung lebender Zellen beider Zelltypen durchgeführt werden, wie durch Phasenkontrast-Bilder der Astrozyten-Monoschicht (oben links) und das neuronale Netz (unten links Panel) veranschaulicht. wie in oben rechts und unten rechts Platten Nach der Fixierung ist immunzytochemischer Beurteilung möglich ist, gezeigt.
Neurone beginnen synaptischen Verbindungen zu etablieren bei etwa 7 DIV in unserem Modell starten (Daten nicht gezeigt). Mit 14 DIV multiple Synapsen innerhalb neuronaler Netzwerke gebildet, wie durch die kombinierte immunzytochemischen Nachweis von prä- und postsynaptischen Marker identifiziert (Abbildung 1, unten rechts). Wichtig ist, dass nicht nur die Menge der synaptischen Marker puncta werden diesen Ansatz sichtbar gemacht und quantifiziert, sondern auch die strukturell Synapsen abgeschlossen, die am ehesten zu tragen Konnektivität zu vernetzen.
Die Astrozytenkulturen nicht nur trophische Unterstützung Neuronen 11, bieten aber auch mehrere sezerniert Faktoren 19,20 in neuronalen Plastizität beteiligt synthetisieren. Die Expression von einer dieser Faktoren, nämlich Matrix - Metalloproteinase - 2 (MMP - 2) wird in der oberen rechten Teil von Abbildung 1 gezeigt. Interessanterweise 2 verschiedene MMP2-Isoformen wurden in der Co - Kultur - Medium unter Verwendung von Western Blot (Abbildung 1, Mitte rechts Platte erkannt ). Astrozyten potentiell MMP2 in die s sekretierenhared Medium, beeinflussen somit die Plastizität von Neuronen. Auch mehrere Isoformen von Tenascin-C, ein bekannter Regulator der Axon - Auswuchs, Zellmigration und Differenzierung 21 identifiziert wurden.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, zwei Beispiele und dadurch liefern Beweis des Prinzips für die Vielzahl von Untersuchungen von Astrozyten, Neuronen und ihre gegenseitige Kommunikation, die hierin beschrieben unter Verwendung des indirekten Co-Kultivierung Verfahren realisiert werden kann.
. Abbildung 1: Die indirekte Astrocyte-Neuron Cokultur - System ermöglicht eine separate Analyse von Astrozyten, Neuronen und sekretierten Molecular Mediators Top Tafel links: die Astrozyten Form Monolayern auf der Zellkultureinsatz Membran, Phasenkontrast; Maßstab: 250 Mikron Top - Panel, rechts:. alstrocytes sind für Gliazellen Säuerlich Fibrillar Protein (GFAP) (Maus Klon GA5) und Matrix-Metalloprotease 2 (MMP-2) (polyklonalen Kaninchen) immunhistochemisch; Maßstab:. 250 Mikron Mitteltafel, links: die Regelung der indirekten Kokultur Einrichtung zeigt. Obwohl zwei Kulturen physisch getrennt sind, teilen sie das gleiche Medium Mitteltafel, rechts. Zwei sezernierte molekulare Mediatoren von Neuron-Glia - Interaktionen werden in dem Co-Kultivierungsmedium unter Verwendung von Western Blot ergab. . Mehrere Isoformen von Tenascin C (TNC), ein Neuritenwachstum Regler und MMP2, einer extrazellulären Matrix Modifikator, werden dokumentiert Bodenplatte, links: primäre Neuronen entwickeln , das vom 14. Tag der Kultivierung, Phasenkontrast stark miteinander verbundene Netzwerke; . Balkenskala: 250 Mikron Bodenplatte, rechts: beginnend mit 14 d in vitro sind mehrere synaptischen Verbindungen zwischen den Neuronen etabliert, wie durch immunzytochemische Markierung detektiert wird ; Maßstab: 50 Mikron. Die Co-Lokalisation des präsynaptischen Marker Fagott (polyklonalen Kaninchen) mit der postsynaptischen PSD95 Gerüstprotein (Maus Klon 6G6-1C9) dokumentiert die strukturell abgeschlossen Synapsen Bildung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das Hauptziel des aktuellen Protokolls ist es, völlig getrennte neuronale und astrozytären Kulturen, während sie in gemeinsam genutzten Medium beibehalten wird. Aus diesem Grund erhalten die Reinheit der Kulturen sollten zu Beginn des Verfahrens überprüft werden. Wir empfehlen die Verwendung von Neuron-spezifischen Tubulin, neurofilaments oder NeuN Protein als neuronale Marker GFAP als astrozytären Marker, O4 Antigen als Oligodendrozyten Vorläufermarker und Iba1 Protein Mikroglia zu identifizieren.
Achten Sie besonders auf, wenn ein kritischer Schritt des Protokolls durchgeführt wird, wie durch einen "Hinweis" vor dem Schritt Beschreibung angegeben. Berücksichtigen Sie, dass die beiden Primärkulturen von Neuronen und Astrozyten sind ziemlich empfindlich. Daher können verschiedene Probleme zu Beginn des Verfahrens entstehen. Wenn die Astrozyten nicht eine konfluente Monoschicht in T75-Flaschen nach 10 DIV (Protokoll Abschnitt 1) erreichen, überprüfen Sie die Komponenten des Astrozyten Medium (Ablaufdatum). In Ergänzung,erhöhen die Menge der Rindengewebe hergestellt, die Kultur zu initiieren (bis zu 10 cortices pro Flasche). Wenn die Astrozyten nicht erreichen, eine konfluente Monoschicht auf Zellkultur-Einsätzen nach 72 h (Protokoll Abschnitt 2), überprüfen Sie die Komponenten des Astrozyten Medium und PDL (zum Ablaufdatum) .try frisch zubereitete Kulturen zur Platte aus, bestimmen den Anteil der lebenden Zellen vor dem Beschichten und Zellzahlen entsprechend (zB verwenden Trypanblau Gegenfärbelösung) einzustellen. Wenn niedrige Überleben von Neuronen nach 24 h erkannt wird, wurde Hippocampus Gewebe nicht vorsichtig genug (Protokoll Schritt 3.11) .PAY Aufmerksamkeit verrieben, um die Bildung von Blasen zu vermeiden, wenn das Gewebe distanziert. Wenn das Überleben von Neuronen deutlich nach 7 abgesenkt wird - 14 DIV und wenn Neuronen Aggregate von 3 bilden - 5 Zellen nach 7 DIV, verwenden Sie frisch Einsätze mit Astrozyten vorbereitet, überprüfen Sie für Astrozyten Reinheit von Immunzytochemie, und überprüfen Sie die Neuron Mittelkomponenten. Wenn große Aggregate von Neuronen (mehr als 10 Zellen) visible ist es möglich, dass der Hippocampus Gewebe nicht ausreichend verrieben wurde, in unvollständiger Dissoziation resultierende (protocol Schritt 3.11). Achten Sie auf Aussetzung Homogenität. Wenn neuronale Kultur mit nicht-neuronalen Zellen verunreinigt ist (Mikrogliazellen, Astrozyten, Oligodendrozyten - Vorläuferzellen, etc.), vollständig die benachbarten Rindengewebe zum Hippocampus (Schritt 3.7) benachbart zu entfernen und auch die neuron Mediumkomponenten überprüfen.
Die vorgeschlagene indirekte Kokultur von primären Neuronen und Astrozyten stellt ein vielseitiges Werkzeug für die Langzeit-Untersuchung von Neuronen-Glia-Interaktionen. Wichtig ist, dass dieses Protokoll für Maus-Zellen optimiert, die Sicht für die Durchführung der Maus genetischen Modellen öffnet. Aufgrund der vollständigen physischen Trennung der zwei Zelltypen, Neuronen und Astrozyten verschiedener Genotypen können in der gewünschten Weise kombiniert werden.
Unter einer Vielzahl von Anwendungen kann dieser Ansatz verwendet werden, um investigate neuronale Netze Entwicklung, Synaptogenese, Netzwerkaktivität und Astrozyten-Neuron-Signalisierung. Obwohl die indirekte Co - Kultivierung von Neuronen und Astrozyten große Chancen für ihre getrennte Analyse und Langstrecken - Signalisierung öffnet, kann der Mangel an direkten Kontakt die subtile Regulation der synaptischen Plastizität 22 beeinträchtigen. So hat, um den Mangel an Interaktion zwischen astrozytären Vorsprüngen und neuronalen Synapsen sorgfältig behandelt werden, wenn dieses Modell.
Der Assay beruht auf zwei vorangegangenen Protokolle für Astrozyten und neuronalen Präparationen 14,17 und ist im Laufe der letzten Jahre verbessert. Der Ansatz wurde ursprünglich für Maus 7 festgelegt und 11 Zellen von Ratten. Vorherige Veröffentlichungen des Labors bieten eine detaillierte Charakterisierung der Assays in Bezug auf das Überleben der Zellen, die Synapsenbildung und elektro Charakterisierung der resultierenden Zellen 7,11,15,18. Weiterhin ter Assay kann auf andere Einstellungen, wie die Mikroelektrodenanordnungen (MEAs) 7 angepasst werden. Für zukünftige Anwendungen sollte der Leser berücksichtigen andere Protokolle für die detaillierte Untersuchung der Synapsenbildung 23, sowie für die MEA - Analyse in vitro. Abschließend stellt der Test ein vielseitiges Werkzeug für die Laboratorien zu verschiedenen Aspekten der Neuron-Glia Interaktionen konzentriert.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
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- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
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