Summary
Этот протокол описывает косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования для анализа на секции нейрон-глиальных взаимодействий.
Abstract
Правильное развитие нейронов и функции является предпосылкой развивающегося и взрослого мозга. Однако механизмы, лежащие в основе высоко контролируемого формирования и поддержания сложных нейронных сетей не совсем понятны до сих пор. Открытые вопросы , касающиеся нейронов в области здравоохранения и болезни разнообразны и идущие от понимания базового развития к исследованию патологий , связанных с человека, например, болезнь Альцгеймера и шизофрения. Наиболее детальный анализ нейронов может быть выполнена в пробирке. Тем не менее, нейроны требуют клетки и нуждаются в дополнительной поддержке астроцитов для их выживания в долгосрочной перспективе. Эта клеточная гетерогенность находится в конфликте с целью расчленения анализа нейронов и астроцитов. Мы представляем здесь анализ клеточной культуры, которая позволяет для долгосрочного совместного культивирования чистых первичных нейронов и астроцитов, которые разделяют ту же химически определенной среде, в то же время физическиразделены. В этой установке, культуры выжить в течение до четырех недель, и анализ подходит для разнообразия исследований, касающихся взаимодействия Нейрон-глии.
Introduction
На протяжении последних десятилетий, общая интерпретация функции нейроглия превратилась из приписывание лишь поддерживает к активной регулирующей роли в отношении функции нейронов 1. Из - за их влияния на видных гомеостаза мозга в здоровье и болезни 2, астроциты представляют особый интерес для научного сообщества. За последние несколько лет, разнообразие исследований были сосредоточены на нейрон-глиальных взаимодействий в естественных условиях и в пробирке 3. Тем не менее, большинство систем культивирования не позволяют проводить раздельный анализ обоих типов клеток и их соответствующих secretomes.
Несколько подходов используют прямое сокультивации нейронов и глии для достижения длительное выживание и физиологически соответствующее развитие нейронной сети 4-6. Настоящий протокол достигает тех же целей, сохраняя при этом оба типа клеток физически разделенных 7. По сравнению с conditioned среда приближается к 8,9, наша система позволяет исследовать двунаправленную связь между нейронами и астроцитов. Экспрессия секретируемых сигнальных молекул может контролироваться в то время как клетки нагноиться в совместно используемой среде. Эта возможность особенно актуальна, так как астроциты выпустить растворимые факторы, такие как цитокины, факторы роста и внеклеточных матричных молекул 10,11, тем самым регулируя нейронную рост и функционирование 7,12. Таким образом, было показано , что добавление к Тромбоспондин ганглиозных клеток сетчатки в пробирке индуцирует образование синапсов 13. Тем не менее, другие еще неизвестные факторы , которые необходимы для визуализации синапсы функциональных 13. Кроме того, молекулы, выпущенные астроцитов должны быть определены для того, чтобы понять основы нейрон-глиальных взаимодействий.
Культивирование первичных нейронов и астроцитов от мышей и крыс было описано ранее 14-16. Мы тутпредставляет элегантный и универсальный инструмент для объединения обоих типов клеток в косвенном сокультивирования подхода. Так как эти две культуры физически разделены еще разделяя ту же среду, влияние нейронов, астроциты и растворимых молекул, могут быть проанализированы по отдельности, создавая тем самым мощный инструмент для исследования взаимодействия нейрон-глия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты с мышами были в соответствии с Законом немецкой и Немецкого общества Neuroscience руководящих принципов животноводства. Комитеты по уходу за животными и использования Рурского университета Бохума предоставили соответствующие разрешения.
1. Подготовка и культивирование корковых астроцитов
Примечание: Выполните следующие действия протокола по меньшей мере за 7 дней, прежде чем перейти к следующему шагу, как астроцитов культуры должны развиться в сливающихся монослоев до того, как нейроны получают. Первичные астроциты получают из смешанных глиальных культур, полученных из мышат мыши вокруг постнатальный день (P) 0-3. Три мозга (6 кортикальных) в Т75 колбы должны быть использованы.
- Подготовьте астроцитов среду, дополнив Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% об / об сыворотки лошади и 0,1% об / об гентамицином в стерильных условиях. Хранить среду при температуре 4 ° С в течение до 2-х недель.
- Пальто 3x T75 колб Wiй 10 мкг / мл поли-D-лизин (PDL, в клеточной культуре сорта воды) в течение не менее 1 ч при 37 ° С в присутствии 6% об / об CO 2. После того, как покрытие, мыть колбы дважды фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) для удаления несвязанных катионов, и добавить 9 мл астроцитов среду.
- Для приготовления мозгов, добавляют 10 мл раствора Хенкса сбалансированный солевой раствор (HBSS) до 1х 10 см чашку Петри и 1 мл HBSS до 1х 15 мл трубки (независимо от количества мозгов, который будет использоваться). Держите пару хирургических ножниц, 2 тонких щипцов и бинокля в пределах досягаемости для процедуры.
- Обезглавьте 3 щенков быстро с хирургическими ножницами и собирать головы в пустой 10 см блюдо.
- Выполните подготовку кортикальных под бинокля. С помощью двух тонких щипцов, удалить кожу спины от черепа в средней линии, начиная от шеи вверх к уровню глаз. После этого, мозг с его кровеносных сосудов видна под черепом.
- Зафиксируйте голову на ростральной конце с парой щипцов и надрезать средней линии черепа, начиная с заднего конца. Впоследствии, обрезать правую и левую половины черепа, чтобы разоблачить мозга.
- Закройте кончик пинцетом и поместить его вентрально под мозгом. Поднимите мозг из черепа и передать его в HBSS заполненные 10 см чашку Петри. Продолжайте таким же образом с остальными образца до тех пор, пока все мозги собираются в чашке.
- После сбора мозги, начните с разделения кортикальных зажимая от заднего мозга, используя пару щипцов, как ножницами. Выполните срединный разрез между двумя полушариями с одной парой щипцов. Тщательно исправить мозг с пинцетом и отрезать среднего мозга и обонятельные луковицы с использованием второго пинцет, чтобы в конечном итоге с корковой половинок.
- Закрепите одну корковую половину с одной парой щипцов и кожица мозговые оболочки из полушарий, отделив их еПЗУ боковой край, а затем потянув их от поверхности коры мозга с помощью второго щипцов.
- Флип коркового половину с ее поверхности, обращенной вниз по направлению к тарелке; тщательно проанализируем и удалить в форме полумесяца гиппокамп с помощью одной пары щипцов. Передача одиночных кору в коническую 15 мл трубки, используя один закрытый щипцов для проведения индивидуальной коры головного мозга.
- После сбора всех, транзита кору в стерильный ламинарный и начать с подготовки к диссоциации корковой ткани.
- Добавить 1 мл DMEM к 2 мл реакционной трубки и добавляют 0,1% вес / об папаин (30 единиц). Инкубируют суспензию в водяной бане при 37 ° С до тех пор, пока раствор не выяснены развивается (около 3 мин). Добавить 0,24 мг / мл L-цистеин и 20 мкг / мл ДНКазы и слегка встряхнуть.
Примечание: При проведении ферментации, приблизительно 1 мл раствора фермента необходим. - Фильтр (размер пор 0,22 мкм), чтобы получить 1 стерильный мл раствора перед добавлениемона в корковой ткани. Инкубировать пробирки в течение 30 мин - 1 ч при 37 ° С (то есть, на водяной бане).
Примечание: Шаги 1.11 - 1.14 являются критическими и должны быть завершены в течение 15 мин. - Для прекращения реакции пищеварение, добавьте 1 мл астроцитов среды и тщательно растирают переваренной ткани с использованием 1 мл пипетки. Для растирания, аккуратно переместить поршень пипетки, таким образом, аспирационных и экструзией суспензии корковой ткани.
- После того, как ткань была диссоциируют в одной клеточной суспензии, добавляют 5 мл астроцитов среду и центрифуге в течение 5 мин при 216 х г.
- Аспирируйте супернатант осторожно из полученной гранулы и клетки вновь суспендируют в 1 мл среды астроцитов.
- Добавьте клеточные суспензии в колбах Т75 пополнился 9 мл астроцитов среды (см 1.2).
- Инкубируйте клетки при 37 ° С в инкубаторе в присутствии 6% об / об CO 2. После 4 дней, выполнить первую полную среду изменения (10 мл). После этого изменить культуру среду каждые 2 - 3 d.
- После 7 суток, проверьте, если клетки сформировали сливающийся монослой. Если нет, то ждать еще 2 - 3 дня до полного слияния культуры не достигается.
Примечание: астроциты отображение больших приглаженных клеточных тел, локализуются в нижней части колбы и не развивают заметных клеточных процессов. Они отличаются от небольших фазоконтрастных ярких клеток - предшественников и микроглии , расположенных на верхней части монослоя 17. - Для того, чтобы избавиться от клеток-предшественников и получить чистую культуру астроцитов, поместите Т75 колб на орбитальный шейкер и потрясите культур O / N при 250 оборотах в минуту. Убедитесь , что температура регулируется до 37 ° С , и что фильтр колбы герметизирован лабораторной пленкой для предотвращения испарения CO 2.
- На следующий день, аспирата среду и добавляют 10 мл свежей культуральной среды пополнен с 20 мкМ цитозин-1-β-D-арабинофуранозида (AraC) для eliminaт.е остаточные делящиеся клетки.
Примечание: инкубация с AraC в течение 2 - 3 г в инкубаторе при температуре 37 ° С, 6% СО 2 приведет к чистой астроцитов культуры. - Следить за чистотой Астроцитарная культур путем визуального осмотра под световым микроскопом. Если остаточная фаза-контрастные яркие клетки - предшественники и микроглии по- прежнему находятся на вершине астроцитов монослоя 17 (см шаг 1.16), повторите шаги с 1.18 и 1.19.
Примечание: Вырожденное и чистые астроцитов монослоев может поддерживаться в течение до 14 суток в инкубаторе (37 ° C, 6% v / v 2 CO) , прежде чем перейти к следующему шагу. Изменение половину среды каждые 3 d. Не собирать, замораживании и оттаивании астроцитов, так как эти клетки теряют свои свойства нейрональные поддерживающие через процедуру хранения.
2. Подготовка астроциты для непрямого сокультивирования
Примечание: 48 - 72 часа перед приготовлением нейроны, астроциты передачи на КВЖДл-культуры вставок. Как правило, один Т75 колба обеспечивает достаточное количество клеток для поддержки нейрональных культур, полученных с одним препаратом.
- Поместите столько вставок по мере необходимости в 24-луночных пластин. Шерсть каждая вставка с 10 мкг / мл PDL (растворенный в клеточной культуре сорта воды) в течение приблизительно 1 ч при температуре 37 ° С, 6% об / об СО 2. После инкубации промыть вставки дважды PBS. В то же время, приступить к подготовке астроцитов.
Примечание: Вставки заполненные PBS могут храниться до тех пор, астроцитов клеточная суспензия не готова к использованию. - Аспирируйте астроцитов среды (с AraC) и мыть культуры один раз с 10 мл PBS, чтобы обеспечить любую остаточную сыворотку удаляют.
- Добавить 3 мл 0,05% трипсин-ЭДТА (этилендиаминтетрауксусной кислоты) в колбы и инкубировать клетки для обработки трипсином при 37 ° С, 6% об / об CO 2 в течение примерно 10 мин.
- Управление отряду клеток путем визуального осмотра с помощью микроскопа и facilitaт.е отряд клеток, нажав на сторону колбы против рабочего стола.
Примечание: Шаги 2.5 - 2.8 являются критическими и должны быть завершены в течение 15 - 20 мин. - После обработки трипсином, осторожно повторно приостанавливать клетки в 7 мл среды астроцитов и передачи клеточной суспензии в пробирку 15 мл. Центрифуга в течение 5 мин при 216 х г.
- Тщательно аспирата супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл среды астроцитов.
- Граф клеток с использованием счетной камере.
- Заполните дно лунки 24-луночного планшета с 500 мкл астроцитов среды и передавать 25000 клеток в 500 мкл среды астроцитов в каждую отдельную вставку. Инкубируйте культуру при 37 ° С, 6% об / об CO 2.
Примечание: После того, как 42 - 72 ч культуры достигнет примерно 100% слияния. На этой стадии чистота культуры может быть проверена с помощью иммуноцитохимию 11. Вырожденное культуры не может поддерживаться в течение до 7 суток до приступить кследующий шаг. Изменение половину среды каждые 3 d.
3. Получение первичной нейронах гиппокампа
Примечание: первичных нейронов гиппокампа мыши должна быть получена из E15.5 - E16 эмбрионов, приуроченных беременных мышей.
- Готовят нейронную среду (MEM с добавлением 10 мМ пирувата натрия, 0,1% вес / об овальбумина, 2% об / об B27 средней добавки и 0,1% об / об гентамицин (стерильный фильтрованный)), и средней подготовки (HBSS с 0,6% вес / V глюкозы и 10 мМ HEPES (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазин этансульфоновая кислота)). Предварительно теплый и предварительно уравновешивают нейронную среду в фильтровальных колбах при температуре 37 ° С, 6% об / об CO 2.
- Поместите стекольных покровные (диаметр 12 мм), в лунки 24-луночных пластин (использовать специальные покровные, которые зазубрены для использования с клеточной культуры вставки).
- Шерсть в течение не менее 1 ч с 15 мкг / мл поли-DL-орнитина в воде (клеточной культуры сорта) при 37 ° С. Используйте по меньшей мере, 500 мкл на лунку, чтобы гарантировать, чтопокровные полностью покрыты. Промыть лунки дважды PBS. Оставьте PBS в лунки до посева клеток. Убедитесь в том, что скважины не высыхают.
- Рассекать гиппокампе, подготовить 3x 10 см блюда, заполненные приготовления среды и 1x 2 мл пробирку с 1 мл препарата среды. Приготовьте ножницы и 2 тонких щипцов.
- Жертвоприношение беременной мыши путем смещения шейных позвонков, стерилизовать живота промывкой 70% об / об этаноле, и открыть живот с помощью острых ножниц. Вырежьте бисерные матка тщательно с ножницами и передать в орган 1x 10 см чашку, наполненную подготовки среды.
- Затем удалите эмбрионов из матки. Аккуратно разрежьте матку и удалить амнион без ущерба для эмбрионов с помощью 2 щипцов. После этого, обезглавить каждого эмбриона с ножницами и перенесите головы во вторую 10-см чашку, поставляемой с приготовления среды.
- Приступить к подготовке руководителей (по аналогии с ДГОвания описано в 1.4 - 1.7).
- Зафиксировать голову с парой щипцов и надрезать черепа и кожи в области шеи близко к задним мозгом перпендикулярно к нейрооси. Используйте вторую пару щипцов, чтобы поднять оба черепа и кожного покрова, и изогнуть мягкую ермолку в направлении ростральной конце головки, тем самым подвергая мозг.
- С помощью 2-х щипцов, отсоединить мозг от полости черепа. Чтобы сделать это, близко 1 пара щипцов и отделить мозг от черепа, начиная с обонятельной луковицы и движется в направлении заднего мозга. Собрать мозги в другой 10 см чашку, наполненную подготовки среды.
- Dissect гиппокампа от кортекса фрагментов, как описано выше для получения астроцитов (этап 1.6). Удалить гиппокампа от каждого полушария и собирают их в 2 мл трубки, заполненной средой подготовки.
- После завершения рассечение, передать трубку к стерильным скамейке ламинарного потока и Digesт ткани гиппокампа с 1 мл раствора, содержащего переваривание папаин. Приготовьте раствор пищеварение, как описано на стадии 1.9 - 1.10, но используют МЕМ вместо DMEM.
Примечание: Шаги 3.9 - 3.12 являются критическими и должны быть завершены в течение 10 - 15 мин. - После завершения пищеварения, осторожно вывести раствор переваривания нежным всасыванием с пипеткой.
- Промыть гиппокампа 3 раза нейрон среды путем последовательного добавления и затем осторожно аспирацией 1 мл свежей культуральной среды в цикле стирки. Не центрифугировать клеточной суспензии.
- После заключительной стадии промывки, тщательно растирают ткани в 1 мл среды нейрон.
- Подсчитайте клеток с использованием счетнокамерное и пластинчатые 35000 клеток в 500 мкл среды нейрон в одной лунке 24-луночного планшета (пластины, упомянутой в разделе 3.2).
Примечание: Необязательно, ячейка аликвоты может быть контрастным трипановым синим, чтобы оценить жизнеспособность клеточного препарата. Контроль плотности металлизации путем визуального осмотрионов с помощью микроскопа (как правило, 90 - 110 клеток на поле зрения стандартного объектива 10X). - Место нейроны в термостате при температуре 37 ° С, 6% об / об СО 2 в течение 1 часа.
- Сообщение инкубации, возьмите подготовленные вставки (затравку сливающийся астроцитов монослоев) из инкубатора (см шаг 2.8). Обмен среды путем аспирационных астроцитов среды и заменив его на 500 мкл свежей среды нейрон.
Примечание: Пластины должны укрывают вырожденные астроцитов монослоев после 2 - 3 DIV (Days in vitro). - Поместите вкладыши с астроциты тщательно в лунки, которые содержат нейронные культуры (этап 3.13) с помощью стерильного пинцета.
- Поместите полученный косвенную нейрон-астроцитов сокультивирования обратно в инкубатор при температуре 37 ° С, 6% об / об CO 2.
Примечание: В этих условиях нейроны могут быть выращены до 4-х недель в полностью определенной среде. Нет средних изменений не требуется. Для длительного времени культур, рекомендуется заполнить еMPTY лунки стерильной водой для того, чтобы уменьшить испарение с 24-луночного планшета. - Выполнить в пробирке клеток анализы после желаемого периода культивирования (например, для иммуногистохимии, ПЦР, Вестерн - блоттинга, электрофизиологических записей (патч зажим или многоэлектродная массив)) 7,15,18.
Примечание: Система культуры также подходит для острого и хронического медикаментозного лечения культур 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Анализ нейрональных культур посредством непрямого системы сокультивирования многогранно и может быть выполнена на различных стадиях культивирования созревания. В связи с тем, что клетки могут сохраняться в течение до 4 недель, долгосрочные исследования культур возможны.
Схема в середине левой панели Рисунок 1 демонстрирует установку сокультивации. При использовании этой системы, живых клеток изображений обоих типов клеток могут быть выполнены, примером фазового контраста картины астроцитов монослоя (верхняя левая панель) и нейронной сети (нижняя левая панель). После фиксации иммуноцитохимическое оценка возможна, как показано в верхнем правом и нижнем правых панелях.
Нейроны начинают устанавливать синаптические связи, начиная с приблизительно 7 DIV в нашей модели (данные не показаны). К 14-DIV множественные синапсы образуются в пределах нейронных сетей, как это определено комбинированным Иммуноцитохимическую обнаружения до и постсинаптических маркеров (рисунок 1, нижняя правая панель). Важно отметить, что не только количество синаптических маркеров Puncta можно визуализировать и количественно, используя этот подход, но и конструктивно законченный синапсов, которые наиболее вероятно, будет способствовать сетевым подключением.
Культуры астроцитов не только обеспечивают трофику поддержку нейронов 11, но и синтезировать несколько секретируемых факторов 19,20 , участвующих в нейронной пластичности. Выражение одного из этих факторов, а именно матриксных металлопротеиназ 2 (MMP2), показано в верхней правой панели, показанной на фиг.1. Интересно отметить , что 2 различных ММР2-изоформ были обнаружены в сокультивирования среде с использованием вестерн - блот (рисунок 1, средняя правой панели ). Потенциально астроциты секретируют ММР2 в сХаред среда, влияя таким образом на пластичность нейронов. Также были выявлены множественные изоформы тенасцину-C, известного регулятора аксонов, миграции и дифференцировки клеток 21.
Взятые вместе, эти результаты показывают два примера, и, таким образом, обеспечивают доказательство принципа для разнообразных исследований астроцитов, нейронов и их взаимного общения, которые могут быть реализованы с использованием косвенного метода совместного культивирования, описанный здесь.
. Рисунок 1: Косвенное астроцитов-Нейрон Система Совместное культивирование Позволяет проводить раздельный анализ астроцитов, Нейроны и секретируется Molecular медиаторов Верхняя панель, слева: астроцитов образуют монослой на культуре клеток вставки мембраны, фазовый контраст; Шкалы: 250 микрон Верхняя панель, справа:. , какtrocytes являются иммунологически для глиальных Кислотные фибриллярных белка (GFAP) (мыши клон GA5) и матричных металлопротеаз 2 (ММР2) (кроличьего поликлонального); Шкалы:. 250 микрон Средняя панель, слева: схема иллюстрирует косвенную установку сокультивирования. Хотя две культуры физически разделены, они разделяют ту же среду Средняя панель, справа. Секретируемые два молекулярных медиаторов нейрон-глиальных взаимодействий проявляются в среде совместного культивирования с использованием Вестерн - блот. . Множественные изоформы тенасцину C (TNC), в аксонов регулятора вырост, и ММР2, внеклеточной матрицы модификатора, задокументированы нижней панели, слева: первичные нейроны развиваются тесно взаимосвязаны сети на 14 - й день культивирования, фазового контраста; . Шкала бар: 250 мкм Нижняя панель, справа: начиная с 14 г в пробирке, множественные синаптические соединения устанавливаются между нейронами, а обнаружены Иммуноцитохимическую маркировки; Шкалы: 50 мкм. Совместная локализация пресинаптического маркера фагота (кроличьего поликлонального) с постсинаптической PSD95 подмости белка (клон мыши 6G6-1C9) документы , формирование структурно заполненный синапсов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Основной целью текущего протокола является полностью отдельными нейронными и астроцитарные культуры, сохраняя при этом их в общей среде. По этой причине, чистота культур, полученных должно быть проверено в начале процедуры. Мы рекомендуем использовать нейрон специфические тубулина, нейрофиламентов или белка NeuN в качестве нейрональных маркеров, GFAP в качестве маркера астроцитов, O4 антиген в качестве маркера предшественника олигодендроцитов и белка Iba1 для выявления микроглии.
Обратите особое внимание при выполнении критически важный шаг протокола, как указано в "Примечание" перед описанием шага. Примите во внимание, что обе первичные культуры нейронов и астроцитов весьма чувствительны. Таким образом, некоторые проблемы могут возникнуть в начале процедуры. Если астроциты не достигают сливающийся монослой в T75 колбах после 10 DIV (раздел 1) протокол, проверьте компоненты астроцитов среды (на дату истечения срока действия). К тому же,увеличить количество корковой ткани, подготовленную для инициирования культуры (до 10 кортикальных на колбу). Если астроциты не достигают сливающийся монослой на клеточной культуре вставками через 72 ч (раздел 2 протокола), проверьте компоненты астроцитов среды и PDL (на дату истечения срока действия) .Try к пластине из свежеприготовленные культуры, определить долю жизнеспособных клетки перед металлизированный и корректировать число клеток соответственно (например, использовать трипановым синим counterstaining). Если низкая выживаемость нейронов обнаруживается через 24 ч, гиппокамп ткань не растерли достаточно мягко (шаг протокола 3.11) .Pay внимание, чтобы избежать образования пузырьков, когда отделяя ткани. Если выживание нейронов значительно снижается после того, как 7 - 14 DIV и если нейроны образуют агрегаты из 3 - 5 клеток после 7 DIV, используют свежеприготовленный вставки с астроцитов, проверьте чистоту астроцитов иммуноцитохимически и проверьте компоненты нейрон среды. Если большие агрегаты нейронов (более 10 клеток) visible, вполне возможно, что гиппокамп ткань не была в достаточной степени растирают, что приводит к неполной диссоциации (этап протокола 3.11). Обратите внимание на подвесной однородности. Если нейронная культура загрязнена не-нейрональных клеток (микроглии, астроцитов, клеток - предшественников олигодендроцитов и т.д.), полностью удалить соседнее кортикальной ткани , прилежащей к гиппокампе (этап 3.7) , а также проверить компоненты нейрон среды.
Предлагаемое косвенное Совместное культивирование первичных нейронов и астроцитов обеспечивает универсальный инструмент для долгосрочного исследования нейрон-глиальных взаимодействий. Важно отметить, что этот протокол оптимизирован для мышиных клеток, что открывает перспективы для реализации генетических моделей мыши. Из-за полного физического разделения типов 2 клеток, нейронов и астроцитов несовпадающих генотипы могут быть объединены в желаемом направлении.
Среди различных приложений, этот подход может быть использован для INVestigate развитие нейронных сетей, синаптогенез, сетевую активность и сигнализацию астроцитов-нейрона. Хотя косвенное сокультивации нейронов и астроцитов открывает широкие возможности для их раздельного анализа и передачи сигналов на большие расстояния, отсутствие прямого контакта может поставить под угрозу тонкое регулирование синаптической пластичности 22. Таким образом, отсутствие взаимодействия между астроцитов выступам и нейрональных синапсов лечиться тщательно при использовании этой модели.
Анализ основан на двух предыдущих протоколов для астроцитов и нейрональных препаратов 14,17 и в течение последних лет было улучшено. Подход изначально был создан для мыши 7 и крысы 11 клеток. Предыдущие публикации лаборатории обеспечивают подробную характеристику анализов , касающихся выживания клеток, формирование синапсов и электрофизиологические характеристика полученных клеток 7,11,15,18. Кроме того, тон анализ может быть адаптирован для других настроек, таких как микро-электродных-массивов (МЭС) 7. Для будущих применений, читатель должен рассмотреть другие протоколы для детального изучения формирования синапсов 23, а также для анализа MEA в пробирке. В заключение отметим, что анализ обеспечивает универсальный инструмент для лабораторий, посвященных различным аспектам нейрон-глиальных взаимодействий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
