Summary
يصف هذا البروتوكول غير مباشر coculture الخلايا العصبية نجمية لتحليل مجزأة التفاعلات العصبية، الدبقية.
Abstract
تطوير الخلايا العصبية السليمة وظيفة هو شرط أساسي للبلدان النامية والدماغ الكبار. ومع ذلك، فإن الآليات الكامنة وراء تشكيل رقابة شديدة وصيانة شبكات العصبية معقدة وغير مفهومة تماما حتى الآن. الأسئلة المفتوحة المتعلقة الخلايا العصبية في الصحة والمرض متنوعة وتمتد من فهم التنموية الأساسية للتحقيق في الأمراض المتعلقة البشرية، على سبيل المثال، مرض الزهايمر والفصام. التحليل الأكثر تفصيلا من الخلايا العصبية يمكن أن يؤديها في المختبر. ومع ذلك، الخلايا العصبية يطالبون الخلايا وبحاجة إلى دعم إضافي من الخلايا النجمية من أجل البقاء على المدى الطويل. هذا التباين الخلوي في الصراع بهدف تشريح تحليل الخلايا العصبية والخلايا النجمية. نقدم هنا مقايسة لزراعة الخلايا التي تسمح لاستنبات مشترك طويل الأجل من الخلايا العصبية والخلايا النجمية الأساسية النقية، التي تشترك في نفس المتوسطة محددة كيميائيا، في حين يجري جسديامنفصل. في هذا الإعداد، والثقافات البقاء على قيد الحياة لمدة تصل إلى أربعة أسابيع، والاختبار هو مناسبة لمجموعة متنوعة من التحقيقات بشأن تفاعل الخلايا العصبية الدبقية.
Introduction
طوال العقود الماضية، والتفسير العام للوظيفة دبق عصبي قد تطورت من إسناد من مجرد داعم نحو دور تنظيمي فعال بشأن وظيفة الخلايا العصبية 1. لما له من تأثير بارز على توازن الدماغ في الصحة والمرض 2، النجمية ذات أهمية خاصة بالنسبة للمجتمع العلمي. في السنوات القليلة الماضية، ركزت مجموعة متنوعة من الدراسات حول تفاعلات الخلايا العصبية الدبقية في المجراة في المختبر 3. ومع ذلك، فإن معظم أنظمة الثقافة لا تسمح لتحليل منفصل كل أنواع الخلايا وsecretomes كل منهما.
عدة نهج تستغل استنبات مشترك المباشر من الخلايا العصبية والخلايا الدبقية لتحقيق بقاء طويل الأمد وتطوير الشبكة العصبية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية 4-6. هذا البروتوكول تصل إلى نفس الأهداف مع الحفاظ على حد سواء أنواع الخلايا فصلها فعليا 7. مقارنة مع مكيفاتالنهج د المتوسطة 8،9، نظامنا يسمح لدراسة الاتصال ثنائي الاتجاه بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية. يمكن رصد التعبير عن جزيئات يشير يفرز في حين ينضج الخلايا في الوسيط المشترك. هذه الفرصة هي ذات الصلة وخاصة، كما تطلق الخلايا النجمية العوامل القابلة للذوبان، مثل السيتوكينات وعوامل النمو والجزيئات المصفوفة خارج الخلية 10،11، وبالتالي تنظيم نمو الخلايا العصبية وظيفة 7،12. وهكذا، فقد ثبت أن إضافة thrombospondin إلى خلايا الشبكية العقدة في المختبر أن تتجسد في تشكيل نقاط الاشتباك العصبي 13. ومع ذلك، ضرورية لجعل نقاط الاشتباك العصبي وظيفية 13 عوامل أخرى غير معروفة بعد. وعلاوة على ذلك، فإن الجزيئات الصادرة عن الخلايا النجمية يجب أن تحدد من أجل فهم أساس التفاعلات العصبية، الدبقية.
وقد وصفت زراعة الخلايا العصبية الابتدائية والخلايا النجمية من الماوس والفئران سابقا 14-16. نحن هناتقديم أداة أنيقة وتنوعا في الجمع بين أنواع الخلايا في نهج coculture غير مباشر. منذ الثقافتين يتم فصل جسديا بعد تقاسم نفس المتوسطة، وتأثير الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والجزيئات القابلة للذوبان، ويمكن تحليلها على حدة، وبالتالي خلق أداة قوية لدراسات التفاعل بين الخلايا العصبية الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وكانت تجارب على الفئران وفقا للقانون الألماني والجمعية الألمانية لعلم الأعصاب المبادئ التوجيهية لتربية الحيوانات. وقد منحت لجان الرعاية الحيوانية والاستفادة من جامعة الرور في بوخوم على التراخيص المناسبة.
1. إعداد وزراعة القشرية النجمية
ملاحظة: إكمال هذه الخطوات لا يقل عن 7 د البروتوكول قبل الشروع في الخطوات المقبلة، والثقافات نجمية ينبغي أن يتطور إلى الطبقات الوحيدة متموجة قبل إعداد الخلايا العصبية. وتستمد الخلايا النجمية الأولية من الثقافات الدبقية المختلطة التي تم الحصول عليها من الجراء الماوس حول يوم ما بعد الولادة (P) 0-3. ثلاثة العقول (6 القشور) في قارورة T75 هي لاستخدامها.
- إعداد المتوسطة نجمية من خلال استكمال Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل ت / ت حصان و 0.1٪ ت / الجنتاميسين ضد تحت ظروف معقمة. تخزين المتوسطة في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- معطف 3X T75 قوارير وايال 10 ميكروغرام / مل بولي-D-ليسين (PDL، في المياه لزراعة الخلايا الصف) لمدة 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية في وجود من 6٪ ت / ت CO 2. بعد طلاء، وغسل القوارير مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) لإزالة الكاتيونات غير منضم، وإضافة 9 مل نجمية المتوسطة.
- لإعداد العقول، وإضافة 10 مل هانك المتوازن محلول الملح (HBSS) إلى 1x أخرى 10 سم طبق بتري و1 مل HBSS ل1x أخرى 15 مل أنبوب (بغض النظر عن عدد من العقول التي سيتم استخدامها). الحفاظ على زوج من مقص جراحي، 2 ملقط غرامة ومجهر في متناول اليد لهذا الإجراء.
- قطع رأس 3 الجراء بسرعة مع مقص جراحي وجمع رؤساء في طبق 10 سم فارغة.
- أداء إعداد القشور تحت مجهر. باستخدام اثنين من ملقط غرامة، وإزالة جلد ظهري من الجمجمة في خط الوسط، بدءا من الرقبة حتى نحو مستوى العينين. بعد ذلك، الدماغ مع أوعيته الدموية مرئيا تحت الجمجمة.
- إصلاح الرأس في نهاية منقاري مع زوج من الملقط وشق خط الوسط من الجمجمة، ابتداء من نهاية الخلفي. وفي وقت لاحق، مقطع من اليمين واليسار نصفي الجمجمة لفضح الدماغ.
- إغلاق غيض من ملقط وضعه البطني تحت الدماغ. رفع الدماغ من الجمجمة وتحويلها إلى طبق بيتري HBSS مليئة 10 سم. الشروع في العمل بنفس الطريقة مع العينات المتبقية حتى يتم جمع كل العقول في طبق.
- بعد جمع العقول، وتبدأ مع فصل القشور عن طريق معسر قبالة الدماغ المؤخر باستخدام زوج من ملقط مثل زوج من مقص. إجراء شق خط الوسط بين نصفي الكرة الأرضية مع زوج واحد من الملقط. بعناية إصلاح الدماغ مع ملقط وقطع الدماغ المتوسط وبصيلات الشم باستخدام ملقط الثانية إلى نهاية المطاف مع نصفي القشرية.
- إصلاح نصف القشرية واحدة مع زوج واحد من ملقط وقشر السحايا من نصفي الكرة الأرضية من خلال فصل لهم وROM الحافة الجانبية وبعد ذلك سحبها من سطح القشرة باستخدام ملقط الثانية.
- الوجه النصف القشرية مع سطحه الموجهة إلى أسفل نحو الطبق. تشريح بعناية وإزالة الحصين على شكل هلال باستخدام زوج واحد من الملقط. نقل القشور واحدة في أنبوب 15 مل المخروطية باستخدام أحد ملقط مغلقة ليحمل القشرة الفردية.
- بعد جمع كل القشور والعبور إلى معقم غطاء تدفق الصفحي وتبدأ التحضيرات للتفكك النسيج القشرية.
- إضافة 1 مل DMEM إلى أنبوب 2 مل التفاعل وإضافة 0.1٪ ث / ت غراء (30 وحدة). احتضان تعليق في حمام مائي عند 37 درجة مئوية حتى يتطور حل أوضح (حوالي 3 دقائق). إضافة 0.24 ملغ / مل L-السيستين و 20 ميكروغرام / مل الدناز ويهز بلطف.
ملاحظة: للحصول على الهضم، وهناك حاجة إلى ما يقرب من 1 مل من محلول الانزيم. - فلتر (0.22 ميكرون حجم المسام) للحصول على 1 مل من محلول معقم قبل أن يضيفإلى الأنسجة القشرية. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة عند 37 درجة مئوية (أي في حمام مائي).
ملاحظة: الخطوات 1،11-1،14 حاسمة ويجب أن تكتمل في غضون 15 دقيقة. - لإنهاء رد فعل الهضم، إضافة 1 مل نجمية المتوسطة ويسحن بعناية الأنسجة هضمها باستخدام ماصة 1 مل. لسحن، تتحرك بلطف المكبس ماصة، وبالتالي الشفط والبثق تعليق الأنسجة القشرية.
- مرة واحدة وقد تم فصل الأنسجة في تعليق وحيد الخلية، إضافة 5 مل نجمية المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 216 × ز.
- نضح طاف بعناية من بيليه الناتجة عنها، وresuspend الخلايا في 1 مل نجمية المتوسطة.
- إضافة تعليق خلية لقوارير T75 تتجدد مع 9 مل المتوسطة نجمية (انظر 1.2).
- احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في الحاضنة في وجود 6٪ ت / ت CO 2. بعد 4 د، إجراء أول تغيير المتوسطة كاملة (10 مل). بعد ذلك، وتغيير الثقافة المتوسطة كل 2-3 د.
- بعد 7 أيام، تحقق إذا كانت الخلايا شكلت أحادي الطبقة متموجة. إذا لم يكن كذلك، انتظر لمدة 2 آخر - 3 أيام حتى يتم تحقيق التقاء الكامل للثقافة.
ملاحظة: النجمية عرض أجسام الخلايا المسطحة الكبيرة، وتوطين في أسفل القارورة ولا تتطور العمليات الخلوية ملحوظة. وهي تختلف من مرحلة النقيض من الخلايا الاصلية لامعة صغيرة والخلايا الدبقية الصغيرة المقيمة على رأس أحادي الطبقة (17). - من أجل التخلص من الخلايا الاولية والحصول على الثقافة نجمية نقية، وضع قوارير T75 على شاكر المداري ويهز الثقافات O / N في 250 دورة في الدقيقة. تأكد من أن درجة الحرارة يتم ضبط إلى 37 درجة مئوية، والتي أغلقت مصفاة القارورة مع فيلم مختبر لمنع تبخر CO 2.
- في اليوم التالي، نضح المتوسط وإضافة مستنبت 10 مل جديدة تتجدد مع 20 ميكرومتر السيتوزين-1-β-D-arabinofuranoside (أراك) إلى eliminaالشركة المصرية للاتصالات تقسيم الخلايا المتبقية.
ملاحظة: الحضانة مع أراك ل2-3 د في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و6٪ CO 2 يسفر عن ثقافة نجمية نقية. - مراقبة نقاء الثقافات نجمية بالمعاينة البصرية تحت المجهر الضوئي. إذا المتبقية على النقيض من المرحلة الخلايا الاولية مشرق والخلايا الدبقية الصغيرة لا تزال تتواجد على رأس أحادي الطبقة نجمي 17 (راجع الخطوة 1.16)، كرر الخطوات من 1.18 و 1.19.
ملاحظة: متكدسة والطبقات الوحيدة نجمية نقية لا يمكن الحفاظ عليه لمدة تصل إلى 14 د في الحاضنة (37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. تغيير نصف المتوسط كل 3 د. لا جمع وتجميد والذوبان في الخلايا النجمية، وهذه الخلايا سوف تفقد خصائص داعمة العصبية من خلال إجراء التخزين.
2. النجمية التحضير للCoculture غير المباشر
ملاحظة: 48 - 72 ساعة قبل إعداد الخلايا العصبية، الخلايا النجمية نقل إلى سلإدراج لتر الثقافة. عموما، قارورة T75 واحدة توفر عدد كاف من الخلايا لدعم الثقافات العصبية التي تم الحصول عليها مع إعداد واحد.
- وضع العديد من الملاحق حسب الحاجة إلى 24 جيدا لوحات. معطف كل إدراج مع 10 ميكروغرام / مل PDL (المذاب في الماء لزراعة الخلايا الصف) لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2. بعد الحضانة، وغسل إدراج مرتين مع برنامج تلفزيوني. في غضون ذلك، المضي قدما في إعداد الخلايا النجمية.
ملاحظة: إدراج مليئة برنامج تلفزيوني يمكن أن تبقى حتى تعليق خلية نجمية جاهزا للاستخدام. - نضح المتوسطة نجمية (مع أراك) ويغسل الثقافة مرة واحدة مع 10 مل من برنامج تلفزيوني لضمان إزالة أي مصل المتبقية.
- إضافة 3 مل من التربسين 0.05٪-EDTA (ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل) للقوارير واحتضان الخلايا لمدة trypsinization عند 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2 لحوالي 10 دقيقة.
- السيطرة على مفرزة الخلية عن طريق الفحص البصري باستخدام المجهر وfacilitaالشركة المصرية للاتصالات مفرزة من الخلايا عن طريق التنصت على جانب من قوارير ضد سطح المكتب.
ملاحظة: خطوات 2،5-2،8 حاسمة ويجب أن تنتهي في غضون 15-20 دقيقة. - بعد trypsinization، بلطف إعادة تعليق الخلايا في 7 مل نجمية المتوسطة ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 216 × ز.
- نضح بعناية طاف و resuspend بيليه خلية في 1 مل نجمية المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام غرفة الفرز.
- ملء الجزء السفلي من الآبار للبئر لوحة 24 مع 500 ميكرولتر نجمية المتوسطة ونقل 25،000 الخلايا في 500 ميكرولتر نجمية المتوسطة في كل إدراج الأفراد. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2.
ملاحظة: بعد 42-72 ساعة الثقافات سوف تصل إلى ما يقرب من 100٪ التقاء. في هذه المرحلة على نقاء الثقافة يمكن التحقق من مناعية 11. يمكن الحفاظ على الثقافات متموجة لمدة تصل إلى 7 أيام حتى الشروع فيالخطوة التالية. تغيير نصف المتوسط كل 3 د.
3. إعداد الابتدائية الحصين الخلايا العصبية
ملاحظة: يجب أن تستمد الخلايا العصبية الحصين الماوس الأساسي من E15.5 - الأجنة E16 من الفئران الحوامل توقيت.
- إعداد المتوسطة الخلايا العصبية (MEM مع 10 ملي البيروفات الصوديوم، 0.1٪ ث / ألبومين البيض الخامس، 2٪ ت / ت B27 المتوسطة ملحق، و 0.1٪ جنتاميسين ت / ت (العقيمة تصفيتها))، والمتوسطة إعداد (HBSS مع 0.6٪ ث / الجلوكوز الخامس و 10mm HEPES (4- (2-هيدروكسي) حمض ethanesulfonic -1-بيبيرازين)). قبل دافئة وقبل يوازن المتوسطة الخلايا العصبية في قوارير مرشح على 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2.
- ضع-coverslips الزجاج (12 مم) في الآبار من 24 لوحات جيدا (استخدام لل coverslips الخاصة، والتي حقق لاستخدام مع إدراج ثقافة الخلية).
- معطف لا يقل عن 1 ساعة مع 15 ميكروغرام / مل بولي DL-الأورنيثين في الماء (خلية ثقافة الصف) عند 37 درجة مئوية. استخدام لا يقل عن 500 ميكرولتر لكل بئر لضمان أنوتغطي تماما لل coverslips. يغسل الآبار مرتين مع برنامج تلفزيوني. ترك برنامج تلفزيوني في الآبار حتى طلاء الخلايا. تأكد من أن الآبار لا تجف.
- لتشريح الحصين، وإعداد 3X 10 سم أطباق مليئة المتوسطة إعداد و1X أنبوب 2 مل مع 1 حبة متوسطة الحجم إعداد مل. إعداد مقص و 2 ملقط غرامة.
- التضحية الماوس الحوامل خلع عنق الرحم، وتعقيم البطن عن طريق الغسيل مع 70٪ من الإيثانول ت / ت، وفتح البطن باستخدام مقص حاد. استئصال الرحم مطرز بعناية مع مقص ونقل الجهاز إلى 1X صحن 10 سم مملوءة المتوسطة التحضير.
- بعد ذلك، إزالة الأجنة من الرحم. بعناية شق الرحم وإزالة السلى دون الإضرار الأجنة باستخدام 2 ملقط. بعد ذلك، قطع رأس كل جنين مع زوج من مقص ونقل رؤساء في الثاني طبق 10 سم المتوفرة مع متوسط التحضير.
- المضي قدما في التحضير للرؤساء (على غرار preparوصف أوجه في 1،4-1،7).
- لشل حركة الرأس مع زوج من ملقط وشق الجمجمة والجلد في منطقة الرقبة على مقربة من الدماغ المؤخر، عمودي على الجهاز العصبي المركزي. استخدام الزوج الثاني من ملقط لرفع كل من الجمجمة والتي تغطي الجلد، وثني غطاء الجمجمة لينة في نهاية منقاري من الرأس، وبالتالي تعريض الدماغ.
- مع مساعدة من 2 الملقط، فصل المخ من تجويف الجمجمة. للقيام بذلك، زوج وثيق 1 من الملقط وفصل المخ من الجمجمة بدءا من بصيلات الشم والتحرك نحو الدماغ المؤخر. جمع العقول في طبق 10 سم أخرى مليئة المتوسطة التحضير.
- تشريح الحصين من الأنصاف القشرة كما هو موضح أعلاه لإعداد نجمية (الخطوة 1.6). إزالة الحصين من كل نصف الكرة وجمعها في أنبوب 2 مل مليئة المتوسطة التحضير.
- بعد الانتهاء من التشريح، ونقل أنبوب إلى العقيمة الصفحي مقاعد البدلاء تدفق وdigesر الأنسجة قرن آمون مع 1 مل من محلول الهضم تحتوي على غراء. إعداد الحل الهضم كما هو موضح في الخطوة 1،9-1،10، ولكن استخدام MEM بدلا DMEM.
ملاحظة: خطوات 3،9-3،12 حاسمة ويجب أن تكتمل في غضون 10-15 دقيقة. - بعد الانتهاء من عملية الهضم، وسحب بعناية الحل الهضم عن طريق الشفط لطيف مع ماصة.
- غسل الحصين 3 مرات مع المتوسطة الخلايا العصبية عن طريق إضافة بالتتابع وبعد ذلك بعناية الشفط 1 مل مستنبت جديدة في دورة الغسيل. لا أجهزة الطرد المركزي تعليق خلية.
- بعد الخطوة غسل النهائي، يسحن بعناية الأنسجة في 1 مل الخلايا العصبية المتوسطة.
- عد الخلايا باستخدام غرفة العد ولوحة 35،000 الخلايا في 500 ميكرولتر الخلايا العصبية المتوسطة في بئر واحدة من 24 جيدا لوحة (لوحة المذكورة في 3.2).
ملاحظة: اختياريا، يمكن counterstained قسامة الخلايا مع الأزرق التريبان لتقييم حيوية من إعداد الخلية. السيطرة على كثافة الطلاء التي تفقد البصريةأيون باستخدام المجهر (عادة 90-110 خلايا في المجال البصري للهدف 10X قياسي). - مكان الخلايا العصبية في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2 لمدة 1 ساعة.
- أضف الحضانة، واتخاذ إدراج مستعدة (المصنف مع الطبقات الوحيدة متموجة نجمية) من الحاضنة (راجع الخطوة 2.8). تبادل المتوسط عن طريق الشفط المتوسطة نجمية واستبدالها مع 500 ميكرولتر الخلايا العصبية الجديدة المتوسطة.
ملاحظة: يجب أن يدرج المرفأ الطبقات الوحيدة نجمية متكدسة بعد 2-3 DIV (أيام في المختبر). - وضع تدرج مع الخلايا النجمية بعناية في الآبار التي تحتوي على الثقافات الخلايا العصبية (خطوة 3.13) باستخدام ملقط معقم.
- ضع الناتج غير مباشر coculture الخلايا العصبية نجمية العودة إلى الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 6٪ ت / ت CO 2.
ملاحظة: في ظل هذه الظروف، الخلايا العصبية يمكن زراعتها لمدة تصل إلى 4 أسابيع في المتوسط محددة تماما. لا تغيير المتوسطة ضروري. للثقافات منذ فترة طويلة، فمن المستحسن لملء هآبار mpty مع الماء المعقم من أجل تقليل التبخر من جيدا لوحة 24. - أداء في المختبر خلية يحلل بعد المرجوة فترات الثقافة (على سبيل المثال، لمناعية، PCR، وصمة عار الغربية والتسجيلات الكهربية (المشبك التصحيح أو مجموعة multielectrode)) 7،15،18.
ملاحظة: نظام الثقافة هو أيضا مناسبة للعلاج الدوائي الحادة والمزمنة من الثقافات 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تحليل الثقافات العصبية عن طريق نظام coculture غير المباشر المتنوعة ويمكن أن يؤديها في مراحل مختلفة من النضج والثقافة. يرجع ذلك إلى حقيقة أن الخلايا يمكن الحفاظ لمدة تصل إلى 4 أسابيع، وخلال التحقيقات الطويلة الأجل من الثقافات ممكنة.
التخطيطي في اللوحة اليسرى الوسطى من الشكل رقم 1 يوضح الإعداد استنبات مشترك. مع استخدام هذا النظام، تصوير الخلايا الحية من كل من أنواع الخلايا لا يمكن أن يؤديها، كما يتضح من الصور النقيض من المرحلة أحادي الطبقة نجمية (أعلى يسار لوحة) والشبكة العصبية (اللوحة اليسرى السفلى). بعد التثبيت، وتقييم immunocytochemical ممكن، كما هو مبين في أعلى يمين والألواح اليمنى السفلى.
الخلايا العصبية تبدأ في تأسيس اتصالات متشابك ابتداء من الساعة حوالي 7 DIV في نموذجنا (لا تظهر البيانات). بنسبة 14 Dرابعا تتشكل المشابك متعددة داخل الشبكات العصبية، كما حددها كشف immunocytochemical المشترك للعلامات قبل وبعد المشبكي (الشكل 1، لوحة اليمنى السفلى). الأهم من ذلك، ليس فقط كمية نقاط وعلامة متشابك يمكن تصور وكميا باستخدام هذا النهج، ولكن أيضا الانتهاء هيكليا نقاط الاشتباك العصبي، التي من الأرجح أن يساهم في شبكة الاتصال.
الثقافات نجمية ليس فقط تقديم الدعم الغذائي للخلايا العصبية 11، ولكن أيضا توليف عدة عوامل يفرز 19،20 تشارك في اللدونة العصبية. ويتجلى التعبير عن واحد من هذه العوامل، وهي مصفوفة الفلزي 2 (MMP2)، في اللوحة اليمنى العليا من الشكل 1. ومن المثير للاهتمام، تم الكشف عن 2 متميزة MMP2-الإسوية في المتوسط coculture باستخدام ويسترن وصمة عار (الشكل 1، اللوحة اليمنى الوسطى ). يحتمل أن تكون الخلايا النجمية تفرز MMP2 في الصورةمتوسطة hared، مما يؤثر على ليونة من الخلايا العصبية. كما تم تحديد الإسوية متعددة من Tenascin-C، منظم يعرف من ثمرة المحور، هجرة الخلايا والتمايز 21.
معا، وتظهر هذه النتائج مثالين وبالتالي توفر دليل على مبدأ لمجموعة متنوعة من التحقيقات من الخلايا النجمية، الخلايا العصبية والاتصال المتبادل والتي يمكن أن تتحقق باستخدام طريقة استنبات مشترك غير مباشر الموصوفة هنا.
. الشكل 1: يسمح للنجمية-العصبية نظام Coculture غير المباشر لتحليل منفصل من النجمية، الخلايا العصبية ويفرز الجزيئية وسطاء أعلى لوحة، غادر: والطبقات الوحيدة شكل الخلايا النجمية على إدراج غشاء خلية ثقافة، الطوري. شريط مقياس: 250 ميكرون أعلى لوحة، والحق: كماوimmunostained trocytes لالدبقية الحمضية لييفي البروتين (GFAP) (الماوس استنساخ GA5) وماتريكس ميتالوبروتياز 2 (MMP2) (الأرنب بولكلونل)؛ شريط مقياس: 250 ميكرون لوحة الأوسط، يسار: يوضح مخطط الإعداد coculture غير مباشر. على الرغم من ثقافتين يتم فصل جسديا، إلا أنهما يشتركان في نفس المتوسطة لوحة الأوسط، والحق: يتم الكشف عن اثنين من الوسطاء الجزيئية يفرز من التفاعلات العصبية الدبقية في المتوسط شارك في زراعة باستخدام البقعة الغربية. . الإسوية متعددة من Tenascin C (المجلس الوطني الانتقالي)، منظم ثمرة neurite، وMMP2، مصفوفة التعديل خارج الخلية، وثقت لوحة أسفل، يسار: الخلايا العصبية الأولية تطوير شبكات مترابطة للغاية من قبل اليوم ال 14 من زراعة، الطوري. . شريط مقياس: 250 ميكرون أسفل لوحة، والحق: بدءا من 14 د في المختبر، يتم وضع عدة اتصالات متشابك بين الخلايا العصبية، والكشف عن طريق وضع العلامات immunocytochemical. شريط النطاق: 50 ميكرون. شارك في توطين علامة قبل المشبكي الباسون (الأرنب بولكلونل) مع بعد المشبكي البروتين PSD95 السقالات (الماوس استنساخ 6G6-1C9) يوثق تشكيل نقاط الاشتباك العصبي الانتهاء هيكليا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
والهدف الرئيسي من البروتوكول الحالي هو الثقافات العصبية ونجمي منفصلة تماما، مع الحفاظ عليها في متوسطة المشتركة. لهذا السبب، ينبغي التحقق من نقاء الثقافات التي تم الحصول عليها في بداية الإجراء. نحن نوصي باستخدام تويولين الخلايا العصبية محددة، neurofilaments أو البروتين NeuN كعلامات العصبية، GFAP كعلامة نجمي، O4 مستضد كعلامة دبقية قليلة التغصن السلائف والبروتين Iba1 لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة.
إيلاء اهتمام خاص عند تنفيذ خطوة حاسمة من البروتوكول، على النحو المحدد من قبل 'ملاحظة' قبل وصف خطوة. خذ بعين الاعتبار أن كلا من الثقافات الأولية من الخلايا العصبية والخلايا النجمية حساسة نوعا ما. لذلك، قد تنشأ العديد من المشاكل في بداية الإجراء. إذا كانت الخلايا النجمية لا تصل أحادي الطبقة متموجة في قوارير T75 بعد 10 DIV (قسم البروتوكول 1)، والتحقق من مكونات المتوسطة نجمية (للتاريخ انتهاء الصلاحية). بالإضافة الى،زيادة كمية الأنسجة القشرية على استعداد للشروع في ثقافة (ما يصل إلى 10 القشور في قارورة). إذا كانت الخلايا النجمية لا تصل أحادي الطبقة متموجة على إدراج ثقافة الخلية بعد 72 ساعة (القسم بروتوكول 2)، والتحقق من مكونات المتوسطة نجمية وPDL (للتاريخ انتهاء الصلاحية) .Try لوحة من الثقافات الطازجة، وتحديد نسبة قابلة للحياة خلايا قبل الطلاء وضبط أعداد الخلايا وفقا لذلك (على سبيل المثال، استخدام counterstaining التريبان الأزرق). إذا تم الكشف عن بقاء منخفض من الخلايا العصبية بعد 24 ساعة، لم المسحوقة الأنسجة الحصين بلطف بما فيه الكفاية (بروتوكول خطوة 3.11) .Pay الانتباه إلى تجنب تشكيل فقاعات عند عدم الربط بين الأنسجة. إذا تم تخفيض بقاء الخلايا العصبية بشكل كبير بعد 7-14 DIV وإذا تشكل الخلايا العصبية مجاميع من 3-5 خلايا بعد 7 DIV، تستخدم طازجة إدراج مع الخلايا النجمية، لفحص نقاء نجمية بواسطة مناعية، والتحقق من مكونات الخلايا العصبية المتوسطة. إذا مجاميع كبيرة من الخلايا العصبية (أكثر من 10 خلايا) هي ضدisible، فمن الممكن أن الأنسجة الحصين لم المسحوقة بما فيه الكفاية، مما أدى إلى التفكك غير مكتمل (بروتوكول خطوة 3.11). إيلاء الاهتمام لتجانس تعليق. إذا تلوثت ثقافة العصبية مع الخلايا غير العصبية (الخلايا الدبقية الصغيرة، النجمية، خلايا دبقية قليلة التغصن السلائف، الخ)، وإزالة الأنسجة القشرية المجاورة المتاخمة للقرن آمون (الخطوة 3.7) وأيضا التحقق من مكونات الخلايا العصبية المتوسطة.
وcoculture غير المباشرة المقترحة من الخلايا العصبية الابتدائية والخلايا النجمية يوفر أداة مرنة للتحقيق على المدى الطويل من التفاعلات العصبية، الدبقية. الأهم من ذلك، هو الأمثل هذا البروتوكول لخلايا فأر، والذي يفتح أفق لتنفيذ النماذج الوراثية الماوس. بسبب الانفصال الجسدي الكامل من أنواع الخلايا 2، الخلايا العصبية والخلايا النجمية من التراكيب الوراثية المتميزة ويمكن الجمع بين بالطريقة المطلوبة.
بين مجموعة متنوعة من التطبيقات، وهذا النهج يمكن استخدامها لللإستثمارestigate تطوير الشبكات العصبية synaptogenesis، و، نشاط الشبكة وإشارات نجمية الخلايا العصبية. على الرغم من أن استنبات مشترك غير مباشر من الخلايا العصبية والخلايا النجمية يفتح فرصا واسعة لتحليلهم الفصل بين الجنسين وبعيدة المدى إشارة، وعدم وجود اتصال مباشر قد يعرض للخطر تنظيم خفية من اللدونة متشابك 22. وبالتالي، لابد من التعامل مع عدم وجود تفاعل بين نتوءات نجمي والمشابك العصبية بعناية عند استخدام هذا النموذج.
ويستند هذا الفحص على بروتوكولين السابقة لنجمية والاستعدادات العصبية 14،17 وقد تحسنت خلال السنوات الماضية. النهج في الأصل تم إنشاء فأرة الحاسوب 7 و فأر 11 الخلايا. المنشورات السابقة للمختبر توفر توصيف مفصل للفحوصات تتعلق بقاء الخلية، تشكيل المشبك وتوصيف الكهربية من الخلايا الناتجة 7،11،15،18. وعلاوة على ذلك، رانه فحص يمكن تكييفها لإعدادات أخرى، مثل القطب صفائف الدقيقة (الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف) 7. وبالنسبة للتطبيقات المستقبلية، يجب على القارئ أن تنظر في غيرها من البروتوكولات لتحقيق مفصل من تشكيل المشبك 23، فضلا عن تحليل الشرق الأوسط وأفريقيا في المختبر. في الختام، يوفر فحص أداة مرنة للمختبرات التي تركز على جوانب مختلفة من التفاعلات العصبية، الدبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
