Summary
Denne protokol beskriver indirekte neuron-astrocyt cokultur for opdelte analyse af neuron-glia-interaktioner.
Abstract
Korrekt neuronal udvikling og funktion er forudsætningen for udviklingslandene og den voksne hjerne. Imidlertid er mekanismerne bag meget kontrolleret dannelse og vedligeholdelse af komplekse neuronale netværk, som ikke helt forstået hidtil. De åbne spørgsmål vedrørende neuroner i sundhed og sygdom er mangfoldige og nå fra at forstå den grundlæggende udvikling på at undersøge de menneskelige relaterede patologier, fx Alzheimers sygdom og skizofreni. Kan udføres den mest detaljerede analyse af neuroner in vitro. Men neuroner krævende celler og har brug for ekstra støtte af astrocytter for deres overlevelse på lang sigt. Denne cellulære heterogenitet er i strid med det formål at dissekere analysen af neuroner og astrocytter. Vi præsenterer her en celle-kultur-assay, der muliggør den langsigtede samdyrkning af rene primære neuroner og astrocytter, som deler samme kemisk defineret medium, og samtidig være fysiskadskilt. I denne opsætning kulturerne overleve i op til fire uger, og assayet er egnet til en mangfoldighed af undersøgelser vedrørende neuron-glia interaktion.
Introduction
Igennem de seneste årtier har den generelle fortolkning af neuroglia funktion udviklet sig fra tildeling af en blot støttende over for en aktiv regulerende rolle vedrørende neuronal funktion 1. På grund af deres fremtrædende effekt på hjernens homeostase i sundhed og sygdom 2, astrocytter er af særlig interesse for det videnskabelige samfund. I de sidste par år, har en mangfoldighed af undersøgelser fokuseret på neuron-glia interaktioner in vivo og in vitro 3. Men de fleste af de dyrkningssystemer ikke mulighed for særskilt analyse af begge celletyper og deres respektive secretomes.
Adskillige metoder udnytter direkte samdyrkning af neuroner og glia at opnå langvarig overlevelse og fysiologisk relevant neuronal netværk udvikling 4-6. Den foreliggende protokol når de samme mål, samtidig med at begge celletyper fysisk adskilte 7. Sammenlignet med conditioned medium nærmer 8,9, vores system gør det muligt at studere tovejskommunikation mellem neuroner og astrocytter. Ekspressionen af udskilte signalmolekyler kan overvåges, mens cellerne at modne i fælles medium. Denne mulighed er især relevant, da astrocytter frigive opløselige faktorer, såsom cytokiner, vækstfaktorer og ekstracellulære matrixmolekyler 10,11 for derved at regulere neuronal vækst og funktion 7,12. Således er det blevet vist, at tilsætning af thrombospondin til retina-ganglieceller in vitro inducerer dannelsen af synapser 13. Men er det nødvendigt at gøre synapser funktionelle 13 andre endnu ukendte faktorer. Desuden molekyler frigivet af astrocytter skal identificeres med henblik på at forstå grundlaget for neuron-glia interaktioner.
Dyrkningen af primære neuroner og astrocytter fra mus og rotter er tidligere blevet beskrevet 14-16. Her er vifremlægge en elegant og alsidigt værktøj til at kombinere begge celletyper i en indirekte cokultur tilgang. Da de to kulturer er fysisk adskilt endnu deler den samme medium, virkningen af neuroner, astrocytter og opløselige molekyler, kan analyseres separat, således at der skabes et stærkt værktøj til neuron-glia interaktionsundersøgelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgene med mus var i overensstemmelse med den tyske lov og den tyske Selskab for Neurovidenskab retningslinjer dyrehold. De dyr pleje og udnyttelse udvalg i Ruhr-University Bochum har givet de relevante tilladelser.
1. Forberedelse og Dyrkning af Kortikal Astrocytter
Bemærk: Gennemfør disse trin i protokollen mindst 7 d før du fortsætter til de næste skridt, som de astrocytkulturer skulle udvikle sig til sammenflydende monolag før neuroner er forberedt. Primære astrocytter er afledt af blandede gliaceller kulturer opnået fra museunger omkring postnatal dag (P) 0-3. Tre hjerner (6 cortex) pr T75 kolbe skal anvendes.
- Forbered astrocyt medium ved supplering Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% v / v hesteserum og 0,1% v / v gentamycin under sterile betingelser. Opbevar ved 4 ° C i op til 2 uger.
- Coat 3x T75 kolber with 10 ug / ml poly-D-lysin (PDL, i celle-kultur-grade vand) i mindst 1 time ved 37 ° C i nærvær af 6% v / v CO2. Efter coating vaskes kolberne to gange med phosphatbufret saltvand (PBS) for at fjerne ubundne kationer, og tilsæt 9 ml astrocyt medium.
- Til fremstilling af hjerner, der tilsættes 10 ml Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) til 1x 10 cm petriskål og 1 ml HBSS til 1x 15 mL rør (uanset antallet af hjerner, der skal bruges). Hold et par kirurgiske sakse, 2 fine pincet og en kikkert inden for rækkevidde for proceduren.
- Halshugge 3 hvalpe hurtigt med de kirurgiske sakse og indsamle hovederne i en tom 10 cm skål.
- Udfør udarbejdelsen af cortex under kikkerten. Anvendelse af to fine tænger, fjerne den dorsale hud fra kraniet ved midterlinjen, startende fra halsen op mod øjeplanet. Derefter hjernen med dens blodkar er synlige under kraniet.
- Fastgør hovedet ved rostralt ende med en pincet og incise midterlinjen af kraniet, der starter ved den bageste ende. Efterfølgende klip fra højre og venstre side halvdele af kraniet for at eksponere hjernen.
- Luk spidsen af tangen og placere den ventralt under hjernen. Løft hjernen ud af kraniet og overføre det ind i HBSS-fyldte 10 cm petriskål. Gå frem på samme måde med de resterende prøve indtil alle hjerner opsamles i skålen.
- Efter opsamling af hjerner, start med adskillelsen af cortex ved at klemme off baghjerne anvendelse af en tang som en saks. Udfør en midtlinjeincision mellem de to halvkugler med et par pincet. fix forsigtigt hjernen med en pincet og afbrød midthjernen og olfaktoriske pærer der bruger en anden pincet til at ende op med de kortikale halvdele.
- Fix en cortical halvdel med et par pincet og skræl meninges fra halvkugler ved at tage dem from sidekant og efterfølgende trække dem fra kortikale overflade anvendelse af en anden pincet.
- Vend kortikale halvdel med dens overflade orienteret ned mod fadet; forsigtigt dissekere og fjern halvmåneformede hippocampus ved hjælp af en tang. Overfør de enkelte cortex i den koniske 15 ml rør ved hjælp én lukkede pincet til at bære en individuel cortex.
- Efter opsamling alle cortex, transit til den sterile laminar flow hætte og begynde med forberedelserne til dissociation af kortikale væv.
- Tilsæt 1 ml DMEM til et 2 ml reagensglas, og der tilsættes 0,1% vægt / volumen papain (30 enheder). Inkubér suspensionen i et vandbad ved 37 ° C, indtil en klaret opløsning udvikler (ca. 3 minutter). Tilføj 0,24 mg / ml L-cystein og 20 mikrogram / ml DNAse og ryst forsigtigt.
BEMÆRK: fordøjelsen, er ca. 1 ml enzym løsning nødvendig. - Filter (0,22 um porestørrelse) til opnåelse af 1 ml steril opløsning før tilsætningdet til den kortikale væv. Inkuber rørene i 30 minutter - 1 time ved 37 ° C (dvs. i et vandbad).
BEMÆRK: Trin 1,11-1,14 er kritiske og forventes afsluttet inden for 15 min. - For at afslutte fordøjelsen reaktion, tilsættes 1 ml astrocyt medium og omhyggeligt udriv fordøjede væv ved hjælp af en 1 ml pipette. For triturering, forsigtigt flytte pipetten stemplet, hvorved opsugning og ekstrudering af den cortexvæv suspension.
- Når vævet er blevet dissocieret til en enkelt-cellesuspension tilsættes 5 ml astrocyt medium og centrifugeres i 5 minutter ved 216 x g.
- Aspirer supernatanten forsigtigt fra den resulterende pellet og resuspender cellerne i 1 ml astrocyt medium.
- Tilsæt cellesuspensioner til T75 kolber genopfyldes med 9 ml astrocyt medium (se 1.2).
- Inkuber cellerne ved 37 ° C i inkubatoren i nærvær af 6% v / v CO2. Efter 4 d, udføre den første komplette medium ændring (10 ml). Derefter ændre dyrkningsmediet hver 2 - 3 i d.
- Efter 7 d, kontrollere, om cellerne har dannet en sammenflydende monolag. Hvis ikke, vente i yderligere 2 - 3 dage, indtil fuldstændig sammenløbet af kulturen er opnået.
BEMÆRK: Astrocytter vise store flade cellelegemer, lokalisere ved bunden af kolben og ikke udvikler bemærkelsesværdige cellulære processer. De adskiller sig fra de små fase-kontrast lyse progenitorceller og mikroglia bosiddende på toppen af monolaget 17. - For at slippe af med de stamceller og få en ren astrocyt kultur, placere T75 kolber på en orbitalryster og ryst kulturer O / N ved 250 rpm. Sikre, at temperaturen justeres til 37 ° C, og at filtret af kolben forsegles med laboratoriefilm at forhindre fordampning af CO2.
- Den næste dag, aspireres mediet, og der tilsættes 10 ml frisk dyrkningsmedium suppleret med 20 pM cytosin-1-β-D-arabinofuranosid (AraC) til elimineringte resterende delende celler.
BEMÆRK: inkubation med AraC til 2 - 3 dage i inkubatoren ved 37 ° C, vil 6% CO2 resultere i en ren astrocyt kultur. - Overvåg renheden af astrocytkulturer ved visuel inspektion under lysmikroskop. Hvis resterende fase-kontrast lyse stamceller og mikroglia stadig bor på toppen af den astrocytisk monolag 17 (se trin 1.16) Gentag trin 1,18 og 1,19.
BEMÆRK: sammenflydende og rene astrocyt monolag kan opretholdes i op til 14 d i inkubatoren (37 ° C, 6% v / v CO 2), inden du fortsætter til næste trin. Skift halvdelen af mediet hver 3 d. Må ikke indsamle, fryse og tø de astrocytter, da disse celler vil miste deres neuronale støttende egenskaber igennem proceduren opbevaring.
2. Forberedelse Astrocytter for indirekte cokultur
Bemærk: 48 - 72 timer, før forberede neuroner, overføre astrocytter til cell-kultur skær. Generelt er en enkelt T75 kolbe leverer et tilstrækkeligt antal celler til at støtte de neuronale kulturer opnået for ét præparat.
- Placer så mange indsatser som nødvendigt i 24-brønds plader. Coat hver indsats med 10 ug / ml PDL (opløst i celle-kultur-grade vand) i ca. 1 time ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2. Efter inkubation vaskes inserterne to gange med PBS. I mellemtiden fortsætte med udarbejdelsen af astrocytter.
BEMÆRK: Indsatserne fyldt med PBS kan holdes indtil astrocyt cellesuspension er klar til brug. - Aspirer astrocyt medium (med AraC) og vaskes kulturen én gang med 10 ml PBS for at sikre enhver rest serum fjernes.
- Tilsættes 3 ml 0,05% trypsin-EDTA (ethylendiamintetraeddikesyre) til kolberne og inkuberes cellerne i trypsinisering ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2 i ca. 10 min.
- Styr celle løsrivelse ved visuel inspektion ved hjælp af et mikroskop og facilitate udstationering af cellerne ved at trykke på siden af kolberne mod skrivebordet.
BEMÆRK: Trin 2,5-2,8 er kritisk og skal være færdig inden for 15 - 20 min. - Efter trypsinisering, forsigtigt igen suspendere cellerne i 7 ml astrocyt medium og overføre cellesuspensionen til en 15 ml rør. Centrifuger i 5 minutter ved 216 x g.
- aspirere omhyggeligt supernatanten og resuspender cellepelleten i 1 ml astrocyt medium.
- Tæl cellerne under anvendelse et tællekammer.
- Fyld bunden af brøndene i 24-brønds-plade med 500 pi astrocyt medium og overføre 25.000 celler i 500 pi astrocyt medium til hver enkelt insert. Inkuber kulturen ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2.
BEMÆRK: Efter 42-72 h vil kulturerne nå ca. 100% sammenløb. På dette stadium renheden af kulturen kan verificeres ved immuncytokemi 11. De sammenflydende kulturer kan opretholdes i op til 7 d indtil videre til detNæste skridt. Skift halvdelen af mediet hver 3 d.
3. Udarbejdelse af Primary hippocampusneuroner
Bemærk: Primær mus hippocampus neuroner bør være afledt af E15.5 - E16 embryoner af timede gravide mus.
- Forbered neuron medium (MEM med 10 mM natriumpyruvat, 0,1% vægt / volumen ovalbumin, 2% v / v B27 medium supplement, og 0,1% v / v gentamicin (sterilfiltreret)), og forberedelse medium (HBSS med 0,6% vægt / v glucose og 10 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre)). Pre-varme og præ-ækvilibrering af neuron medium i sugekolber ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2.
- Placer glas-dækglas (12 mm diameter) i brøndene på 24-brønds-plader (anvende de specielle dækglas, der takkede for brug med cellekultur indsætter).
- Coat i mindst 1 time med 15 ug / ml Poly-DL-ornithin i vand (celle-kultur-kvalitet) ved 37 ° C. Brug mindst 500 pi per brønd for at sikre,dækglassene er helt dækket. Vask brøndene to gange med PBS. Lad PBS i brøndene indtil udpladning af cellerne. Sørg for, at brøndene ikke tørrer ud.
- For at dissekere hippocampusen, forberede 3x 10 cm skåle fyldt med forberedelse medium og 1x 2 ml rør med 1 ml forberedelse medium. Forbered saks og 2 fine pincet.
- Sacrifice den gravide mus ved cervikal dislokation, sterilisere maven ved vask med 70% v / v ethanol, og åbne maven under anvendelse skarp saks. Udskære beaded livmoderen forsigtigt med en saks og overføre orglet i 1x 10 cm skål fyldt med forberedelse medium.
- Dernæst flytte embryoner fra livmoderen. incise forsigtigt livmoderen og fjern amnion uden at skade fostre ved at bruge 2 pincet. Derefter halshugge hver foster med en saks og overføre hovederne ind i en anden 10 cm skål leveres med forberedelse medium.
- Fortsæt med udarbejdelsen af lederne (svarende til prepartion er beskrevet i 1,4-1,7).
- Immobilisere hoved med en pincet og incise kraniet og huden i halsregionen tæt baghjerne, vinkelret i centralnervesystemet. Brug et andet par pincet til at løfte både kraniet og omfatter hud, og bøj bløde kalot mod rostralt af hovedet og derved udsætte hjernen.
- Med hjælp fra 2 pincet, frigøre hjernen fra kraniehulen. For at gøre dette, tæt en pincet og adskille hjernen fra kraniet starter ved olfaktoriske pærer og bevæger sig mod baghjerne. Saml hjerner i en anden 10 cm skål fyldt med forberedelse medium.
- Dissekere hippocampi fra cortex dele som beskrevet ovenfor for astrocyt forberedelse (trin 1.6). Fjern hippocampi fra hver halvkugle og samle dem i 2 ml rør fyldt med forberedelse medium.
- Efter endt dissektion, overføre røret til den sterile laminar flow bænk og Digest den hippocampale væv med 1 ml fordøjelsen indeholdende papain. Forbered fordøjelsen løsning som beskrevet i trin 1,9-1,10, men bruger MEM stedet DMEM.
BEMÆRK: Trin 3,9-3,12 er kritiske og forventes afsluttet inden for 10 - 15 min. - Efter afslutning af fordøjelsen, omhyggeligt trække fordøjelse opløsning ved forsigtig sugning med en pipette.
- Vask hippocampi 3 gange med neuron medium ved sekventielt at tilføje og derefter omhyggeligt opsugning 1 ml frisk dyrkningsmedium pr vaskecyklus. Må ikke centrifugeres cellesuspensionen.
- Efter den sidste vasketrin omhyggeligt tritureres vævet i 1 ml neuron medium.
- Tæl cellerne under anvendelse et tællekammer og pladen 35.000 celler i 500 pi neuron medium pr en enkelt brønd i en 24-brønds-plade (den i 3.2 plade).
BEMÆRK: Eventuelt kan en celle portion blive modfarvet med trypanblåt at vurdere vitalitet af præparatet celle. Styr klædningen tæthed ved visuel inspektionion brug af mikroskopet (typisk 90 - 110 celler pr synsfelt af et standard 10X objektiv). - Placer neuroner i inkubatoren ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2 i 1 time.
- Indsend inkubation tage de forberedte indsatser (podes med sammenflydende astrocyt monolag) ud af kuvøsen (se trin 2.8). Udskift mediet ved opsugning af astrocyt medium og erstatte den med 500 pi frisk neuron medium.
BEMÆRK: Skærene skal havnen sammenflydende astrocyt monolag efter 2 - 3 i DIV (dage in vitro). - Placer skær med astrocytter forsigtigt i brøndene, der indeholder neuron kulturer (trin 3.13) ved hjælp af steril pincet.
- Placer resulterende indirekte neuron-astrocyt cokultur tilbage i inkubatoren ved 37 ° C, 6% volumen / volumen CO2.
BEMÆRK: Under disse betingelser, kan neuroner dyrkes i op til 4 uger i fuldstændig defineret medium. Ingen medium ændring er nødvendig. For lang tid kulturer, anbefales det at fylde empty brønde med sterilt vand for at mindske fordampningen fra 24-brønds-plade. - Udfør in vitro celle analyser efter ønskede kultur perioder (f.eks, for immuncytokemi, PCR, Western blot, elektrofysiologiske optagelser (patch clamp eller multielectrode Array)) 7,15,18.
BEMÆRK: dyrkningssystem er også velegnet til akut og kronisk farmakologisk behandling af kulturerne 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Analysen af de neuronale kulturer via den indirekte cokultur-systemet er mangeartede og kan udføres på forskellige trin i kultur modning. På grund af det faktum, at cellerne kan opretholdes i op til 4 uger, langsigtede undersøgelser af kulturerne er mulige.
Den skematiske i midten venstre panel i figur 1 viser samdyrkning setup. Med brug af dette system, kan udføres af levende celler af begge celletyper, som eksemplificeret ved fasekontrast billeder af astrocyt-monolag (øverste venstre felt) og den neuronale netværk (nederste venstre panel). Efter fiksering immunocytokemisk vurdering er muligt, som vist i øverste højre og nederste højre paneler.
Neuroner begynder at etablere synaptiske forbindelser starter ved ca. 7 DIV i vores model (data ikke vist). Ved 14 DIV flere synapser dannes inden neuronale netværk, som identificeret af den kombinerede immuncytokemisk detektion af præ og postsynaptiske markører (figur 1, nederste højre panel). Vigtigt er det, kan ikke kun mængden af synaptisk markør puncta visualiseres og kvantificeres ved hjælp af denne metode, men også strukturelt afsluttet synapser, der er mest tilbøjelige til at bidrage til netværkstilslutning.
De astrocytkulturer ikke kun give trofisk støtte til neuroner 11, men også syntetisere adskillige secernerede faktorer 19,20 involveret i neural plasticitet. Ekspressionen af en af disse faktorer, nemlig matrix metalloproteinase 2 (MMP2), demonstreres i det øverste højre panel i figur 1. Interessant nok blev påvist 2 forskellige MMP2-isoformer i cokultur medium ved anvendelse af Western Blot (figur 1, midterste højre panel ). Potentielt astrocytter udskiller MMP2 i shared medium, hvilket påvirker plasticitet af neuroner. Også flere isoformer af Tenascin-C, en kendt regulator af axon-udvækst, cellevandring og differentiering 21 blev identificeret.
Tilsammen viser disse resultater to eksempler og dermed fremlægge dokumentation for princippet for de mange forskellige undersøgelser af astrocytter, neuroner og deres gensidige kommunikation, der kan realiseres ved hjælp af den indirekte samdyrkning beskrevet heri.
. Figur 1: Indirekte astrocyt-Neuron cokultur system giver mulighed for separat analyse af Astrocytter, neuroner og udskilt Molekylær mediatorer Top panel, venstre: de astrocytter danner monolag på celledyrkningsinsert membran, fasekontrast; skala bar: 250 mikron Top panel, til højre:. somtrocytes er immunfarvet for glial Surt fibrillært protein (GFAP) (muse klon GA5) og matrixmetalloprotease 2 (MMP2) (kanin polyklonale); skala bar:. 250 mikron Mellemøsten panel, venstre: ordningen illustrerer den indirekte cokultur setup. Selvom to kulturer er fysisk adskilt, de deler den samme medium Mellemøsten panel, til højre:. To udskilte molekylære mediatorer af neuron-glia interaktioner er afsløret i co-dyrkningsmediet ved hjælp Western Blot. . Flere isoformer af Tenascin C (TNC), en neuritvækst regulator, og MMP2, en ekstracellulær matrix modifier, dokumenteres Bundplade, venstre: primære neuroner udvikle meget forbundet netværk af 14 th dag i dyrkning, fasekontrast; . skala bar: 250 mikron Bundfyld, højre: startende med 14 d in vitro, er flere synaptiske forbindelser etableret mellem neuroner, som påvist ved immunocytokemisk mærkning; skala bar: 50 mikrometer. Den co-lokalisering af den præsynaptiske markør Fagot (kanin polyklonale) med den postsynaptiske PSD95 stilladser protein (mus klon 6G6-1C9) dokumenterer strukturelt afsluttet synapser formation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det vigtigste mål for den nuværende protokol er at helt separate neuronale og astrocytiske kulturer, samtidig med at dem i delt medium. Af denne grund bør renheden af kulturerne fremstillet, verificeres ved begyndelsen af proceduren. Vi anbefaler brug af neuron-specifik tubulin, neurofilamenter eller NeuN protein som neuronale markører, GFAP som astrocytisk markør, O4 antigen som oligodendrocyt forløber markør og Iba1 protein til at identificere mikroglia.
Vær særlig opmærksom, når du udfører et afgørende skridt i protokollen, som angivet af en "NOTE" før trin beskrivelse. Tage hensyn til, at begge primære kulturer af neuroner og astrocytter er temmelig følsomme. Derfor kan der opstå flere problemer i begyndelsen af proceduren. Hvis astrocytter ikke når et sammenflydende monolag i T75 kolber efter 10 DIV (protokol afsnit 1), kontrollere komponenterne i astrocyt medium (udløbsdato). Desuden,øge mængden af cortexvæv parat til at indlede kultur (op til 10 cortex per kolbe). Hvis astrocytter ikke når en konfluent monolag på cellekultur indsætter efter 72 h (protokol afsnit 2), skal du kontrollere komponenterne i astrocyt medium og PDL (til udløbsdato) .Try til plade ud frisklavede kulturer, fastlægge andelen af levedygtige celler før udpladning og justere celletal i overensstemmelse hermed (fx bruge trypanblåt modfarvning). Hvis lav overlevelse af neuroner detekteres efter 24 timer blev hippocampus væv ikke tritureret forsigtigt nok (protokol trin 3.11) .Pay opmærksomhed for at undgå dannelsen af bobler, når dissociere vævet. Hvis overlevelsen af neuroner er betydeligt nedsat efter 7-14 DIV og hvis neuroner danner aggregater af 3 - 5 celler efter 7 DIV, benyttes frisk fremstillede indsatse med astrocytter, så tjek for astrocyt renhed ved immunocytokemi, og kontrollere neuron mellemstore komponenter. Hvis store aggregater af neuroner (mere end 10 celler) er visible, er det muligt, at hippocampus væv ikke var tilstrækkeligt findelt, hvilket resulterer i ufuldstændig dissociation (protokol trin 3.11). Vær opmærksom på suspension homogenitet. Hvis neuronal kultur er forurenet med ikke-neuronale celler (mikroglia, astrocytter, oligodendrocyt precursorceller, etc.), helt at fjerne den tilstødende cortexvæv støder op til hippocampus (trin 3.7) og også kontrollere neuron mediumkomponenter.
Den foreslåede indirekte cokultur af primære neuroner og astrocytter giver et alsidigt værktøj til den langsigtede undersøgelse af neuron-glia interaktioner. Vigtigere er denne protokol optimeret til museceller, der åbner perspektiv for gennemførelsen af mus genetiske modeller. På grund af den fuldstændige fysiske adskillelse af de 2 celletyper, kan neuroner og astrocytter fra forskellige genotyper kombineres på den ønskede måde.
Blandt en række applikationer, kan denne fremgangsmåde anvendes til at investigate neurale netværk udvikling, synaptogenese, netværksaktivitet og astrocyt-neuron signalering. Selvom den indirekte samdyrkning af neuroner og astrocytter åbner store muligheder for deres adskilte analyser og langtrækkende signalering, kan den manglende direkte kontakt kompromittere subtile regulering af synaptisk plasticitet 22. Således manglende samspil mellem astrocytiske fremspring og neuronale synapser har at blive behandlet grundigt, når du bruger denne model.
Analysen er baseret på to tidligere protokoller for astrocyt og neuronale forberedelser 14,17 og er blevet forbedret i løbet af de seneste år. Oprindeligt er blevet etableret Tilgangen til mus 7 og rotte 11 celler. Tidligere publikationer laboratoriet en detaljeret karakterisering af analyserne vedrørende celle overlevelse, synapse dannelse og elektrofysiologisk karakterisering af de resulterende celler 7,11,15,18. Endvidere than assay kan tilpasses til andre indstillinger, såsom mikro-elektrode-arrays (MEA) 7. For fremtidige applikationer, bør læseren overveje andre protokoller for detaljeret undersøgelse af synapsedannelse 23, samt for MEA analyse in vitro. Afslutningsvis analysen giver et alsidigt værktøj til laboratorier med fokus på forskellige aspekter af neuron-glia interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| B27 | Gibco (Life Technologies) | 17504-044 | |
| Cell-culture-grade water | MilliQ | ||
| Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) | Sigma-Aldrich | C1768 | CAUTION: H317, H361 |
| DMEM | Gibco (Life Technologies) | 41966-029 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1397 | CAUTION: H317-334 |
| Glucose | Serva | 22700 | |
| HBSS | Gibco (Life Technologies) | 14170-088 | |
| HEPES | Gibco (Life Technologies) | 15630-056 | |
| Horse serum | Biochrom AG | S9135 | |
| L-Cysteine | Sigma-Aldrich | C-2529 | |
| MEM | Gibco (Life Technologies) | 31095-029 | |
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A7641 | CAUTION: H334 |
| Papain | Worthington | 3126 | |
| PBS | self-made | ||
| Poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P0899 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Life Technologies) | 25300054 | |
| Equipment | |||
| 24-well-plates | Thermoscientific/Nunc | 142475 | |
| 24-wells-plate (for the indirect co-culture) | BD Falcon | 353504 | |
| Binocular | Leica | MZ6 | |
| Cell-culture inserts | BD Falcon | 353095 | |
| Centrifuge | Heraeus | Multifuge 3S-R | |
| Counting Chamber | Marienfeld | 650010 | |
| Forceps | FST Dumont (#5) | 11254-20 | |
| glass cover slips (12 mm) | Carl Roth (Menzel- Gläser) | P231.1 | |
| Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i | |
| Micro-tube (2 mL) | Sarstedt | 72,691 | |
| Microscope | Leica | DMIL | |
| Millex Syringe-driven filter unit | Millipore | SLGV013SL | |
| Orbital shaker | New Brunswick Scientific | Innova 4000 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Petri dishes (10 cm) | Sarstedt | 833,902 | |
| pipette (1 mL) | Gilson | Pipetman 1000 | |
| Sterile work bench | The Baker Company | Laminar Flow SterilGARD III | |
| Surgical scissors | FST Dumont | 14094-11 | |
| Syringe | Henry Schein | 9003016 | |
| T75 flask | Sarstedt | 833,911,002 | |
| tube (15 mL) | Sarstedt | 64,554,502 | |
| Water bath | GFL | Water bath type 1004 |
References
- Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
- Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
- Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
- Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
- Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
- Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
- Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
- Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
- Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
- Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
- Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
- Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
- Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
- Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
- Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
- Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
- Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
- Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
- Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).
