Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54757
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Cell Morphology and Molecular Neurobiology, Faculty of Biology and Biotechnology, Ruhr-University

Summary

פרוטוקול זה מתאר את coculture נוירון astrocyte עקיפות ניתוח מידור של נוירון, גליה אינטראקציות.

Abstract

התפתחות עצבית תקינה ותפקוד הוא התנאי ההכרחי של הפיתוח ו במוח הבוגר. עם זאת, המנגנונים להיווצרות מאוד מבוקר ותחזוקה של רשתות נוירונים מורכבות אינם מובנים לחלוטין עד כה. השאלות הפתוחות בנוגע נוירונים בבריאות ובחולי מגווני לכת להבנת ההתפתחות הבסיסית לחקירת פתולוגיות הקשורות אדם, למשל, מחלת אלצהיימר וסכיזופרניה. הניתוח המפורט ביותר של נוירונים יכול להתבצע במבחנה. עם זאת, נוירונים דורשים תאים זקוקים לתמיכה נוספת של האסטרוציטים להישרדות ארוכת הטווח. ההטרוגניות הסלולר זהו בסכסוך במטרה לנתח את הניתוח של נוירונים האסטרוציטים. אנו מציגים כאן assay תא-תרבות המאפשר cocultivation ארוכת הטווח של הנוירונים העיקריים טהור האסטרוציטים, אשר חולקים את אותה בינוני הגדרה כימית, בעת היותו פיזיתמופרד. במצב זה, התרבויות לשרוד במשך עד ארבעה שבועות assay הוא מתאים למגוון של חקירות לגבי האינטראקציה נוירון, גליה.

Introduction

במהלך העשורים האחרונים, הפרשנות הכללית של תפקוד תאי גלייה התפתחה מן הייחוס של תומכת רק לקראת תפקיד רגולציה פעיל בדבר עצבי פונקציה 1. בגלל ההשפעה הבולטת שלהם על הומאוסטזיס המוח בבריאות ובחולי 2, האסטרוציטים הם בעלי עניין מיוחד עבור הקהילה המדעית. בשנים האחרונות, מגוון של המחקרים התמקדו נוירון, גליה אינטראקציות in vivo ו במבחנה 3. עם זאת, רוב מערכות התרבות אינו מאפשרים הניתוח הנפרד של שני סוגי התאים ושל secretomes שלהם.

גישות מספר לנצל את cocultivation הישיר של נוירונים גליה להשיג הישרדות לאורך זמן ופיתוח רשת עצבית רלוונטי מבחינה פיזיולוגית 4-6. הפרוטוקול הנוכחי מגיע את אותן מטרות, תוך שמירה על סוגי תאים הן מופרדות 7 פיזית. לעומת conditioneבינוני ד גישות 8,9, המערכת שלנו מאפשרת ללמוד את בתקשורת דו-כיוונית בין הנוירונים האסטרוציטים. הביטוי של מולקולות איתות מופרשים ניתן לנטר תוך התאים לְהַבשִׁיל במדיום המשותף. הזדמנות זה רלוונטית במיוחד, כמו האסטרוציטים לשחרר גורמים מסיסים, כגון ציטוקינים, גורמי גדילה ומולקולות מטריקס 10,11, ובכך ויסות צמיחה עצבית ולתפקד 7,12. לפיכך, הוכח כי תוספת של thrombospondin לתאי הגנגליון ברשתית במבחנה גורם להיווצרות של סינפסות 13. עם זאת, אחרים עדיין גורמים לא ידועים נחוצים כדי להבהיר סינפסות 13 פונקציונלית. יתר על כן, מולקולות שפורסמו על ידי האסטרוציטים צריכות להיות מזוהות כדי להבין את הבסיס של נוירון, גליה אינטראקציות.

הטיפוח של נוירונים עיקרי האסטרוציטים מעכבר והחולדה תואר בעבר 14-16. הנה אנחנולהציג כלי אלגנטים צדדי לשלב בין שני סוגי התאים בגישת coculture עקיפה. מאז שתי התרבויות מופרדים פיזית עדיין חולקים את אותו בינוני, ההשפעה של נוירונים, האסטרוציטים ומולקולות מסיסים, ניתן לנתח בנפרד, ובכך ליצור כלי רב עוצמה עבור מחקרים אינטראקציה נוירון, גליה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הניסויים עם עכברים היו בהתאם לחוק הגרמני ואת החברה הגרמנית הנחיות Neuroscience של בעלי חיים. ועדות הטיפול וניצול בעלי חיים של בוכום הרור, האוניברסיטה העניקו את האישורים המתאימים.

הכנה טיפוח 1. של האסטרוציטים קורטיקלי

ההערה: בצע את השלבים הבאים של הפרוטוקול לפחות 7 ד לפני שאמשיך את הצעדים הבאים, כמו תרבויות astrocyte צריכות להתפתח monolayers ומחובר לפני נוירונים ערוכים. האסטרוציטים ראשיים נגזרים מתרבויות גליה מעורבות המתקבלות גורי עכבר סביב יום לידה (P) 0-3. שלושה מוחות (6 הקורטקס) לכל בקבוק T75 הם לשמש.

  1. הכן את המדיום astrocyte ידי משלים בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם סרום סוס V / V 10% ו -0.1% v / v gentamycin בתנאים סטריליים. אחסן את המדיום על 4 מעלות צלזיוס עד 2 שבועות.
  2. 3x מעיל T75 צלוחיות wiה 10 מיקרוגרם / מ"ל Poly-D- ליזין (PDL; במים תא-תרבות-כיתה) עבור h 1 לפחות ב 37 מעלות צלזיוס בנוכחות 6% v / v 2 CO. לאחר ציפוי, לשטוף את הצלוחיות פעמים עם פוספט שנאגר מלוח (PBS) כדי להסיר קטיונים מאוגדים, ולהוסיף 9 בינוני astrocyte מיליליטר.
  3. להכנת במוחם, להוסיף 10 תמיסת מלח מאוזן של מ"ל האנק (HBSS) כדי 1X 10 ס"מ צלחת פטרי ו 1 מ"ל HBSS כדי 1x 15 צינור מ"ל (ללא קשר למספר של המוח אשר ישמשו). שמור זוג מספריים כירורגיות, 2 מלקחיים בסדר המשקפת בהישג יד עבור ההליך.
  4. לערוף 3 גורים במהירות עם מספריים כירורגיות ולאסוף ראשי בצלחת 10 ס"מ ריק.
    1. בצע את הכנת הקורטקס תחת המשקפת. שימוש בשני מלקחיים בסדר, להסיר את עור הגב מהגולגולת על קו האמצע, החל מהצוואר לכיוון רמת העיניים. לאחר מכן, המוח עם כלי הדם שלו גלוי תחת הגולגולת.
    2. תקן את הראש בסוף המקורי עם זוג מלקחיים לחתוך את קו האמצע של הגולגולת, החל בסוף האחורי. בהמשך לכך, קליפ את הזכות ואת החצאים השמאלי של הגולגולת כדי לחשוף את המוח.
    3. סגור את קצה מלקחי מיצובו ventrally תחת המוח. הרם את המוח מתוך הגולגולת ולהעביר אותו לתוך צלחת HBSS מלא 10 ס"מ פטרי. המשך באותו אופן עם הדגימה שנותרו עד שכל המוחות נאספים בצלחת.
  5. לאחר איסוף המוח, להתחיל עם הפרדה של קליפת המוח על ידי צובט את למוח האחורי בעזרת זוג מלקחיים כמו זוג מספריים. בצע חתך קו אמצע בין שתי ההמיספרות עם זוג אחד של מלקחיים. בזהירות לתקן את המוח עם מלקחיים לנתק את המוח התיכון ואת נורות חוש הריח באמצעות מלקחיים שניים בסופו של דבר עם חצי קליפת המוח.
  6. תקן חצי אחד של קליפת המוח עם זוג אחד של מלקחיים לקלף את קרומי המוח מן האונות ידי ניתוקם fROM קץ לרוחב ובהמשך מושך אותם מפני השטח של קליפת המוח באמצעות מלקחיים שניים.
  7. הפוך את חצי קליפת המוח עם המשטח בכיוון מטה לכיוון צלחת; בזהירות לנתח ולהסיר את ההיפוקמפוס בצורת חצי סהר באמצעות זוג אחד של מלקחיים. מעביר את הקורטקס היחיד לתוך צינור 15 מיליליטר החרוטים באמצעות מלקחיים סגורים לשאת קליפת פרט.
  8. לאחר איסוף כל הקורטקס, מעבר למכסת מנוע הזרימה למינרית סטרילי ולהתחיל בהכנות לקראת הניתוק של רקמת קליפת המוח.
  9. הוסף 1 מ"ל DMEM לצינור 2 מ"ל התגובה ולהוסיף 0.1% w / v פפאין (30 יחידות). לדגור על השעיית באמבט מים ב 37 ° C עד מפתחת פתרון בהיר (כ -3 דקות). להוסיף 0.24 מ"ג / מ"ל ​​L-ציסטאין 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​DNAse ולנער בעדינות.
    הערה: לעיכול, כ 1 מ"ל של תמיסת אנזים הוא זקוק.
  10. מסנן (0.22 מיקרומטר גודל נקבובי) להשיג 1 פתרון סטרילי מיליליטר לפני ההוספהאותו רקמת קליפת המוח. דגירת הצינורות למשך 30 דקות - 1 שעות ב 37 ° C (כלומר, בתוך אמבט מים).
    הערה: שלבים 1.11 - 1.14 הן קריטיות ואמור להסתיים בתוך 15 דקות.
  11. כדי לסיים את התגובה העיכול, להוסיף בינוני astrocyte מ"ל 1 ובזהירות triturate רקמת מתעכל בעזרת פיפטה 1 מ"ל. לקבלת טחינה דקה, בעדינות להזיז את הבוכנה פיפטה, ובכך aspirating ו לשיחול ההשעיה רקמת קליפת המוח.
  12. לאחר הרקמה כבר ניתק לתוך ההשעיה תא בודד, מוסיפים 5 מ"ל astrocyte בינוני ו צנטריפוגות במשך 5 דקות ב 216 x ז.
  13. לשאוב supernatant בזהירות מן גלולה וכתוצאה ו resuspend התאים במדיום astrocyte 1 מ"ל.
  14. מוסיפים את המתלים תא צלוחיות T75 מתחדש עם 9 בינוני astrocyte מ"ל (ראה 1.2).
  15. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס בחממה בנוכחות נ נ 6% / CO 2. אחרי 4 ד, לבצע את השינוי הבינוני המלא הראשון (10 מ"ל). לאחר מכן, לשנות את המדיום תרבות כל 2 - 3 ד.
  16. לאחר 7 ד, לבדוק אם התאים יצרו בשכבה ומחוברת. אם לא, לחכות עוד 2 - 3 ימים עד מפגש מלא של התרבות מושג.
    הערה: האסטרוציטים להציג גופי תא גדולים ושטוחים, למקם בתחתית הבקבוק ואינו מפתחי תהליכים תאיים בולטים. הם נבדלים מן ובתאים בהירים שלב בניגוד הקטנים microglia המתגוררים על גבי monolayer 17.
  17. על מנת להיפטר ובתאים ולקבל תרבות astrocyte טהור, למקם את צלוחיות T75 על שייקר מסלולית ולנער התרבויות O / N ב 250 סל"ד. ודא שהטמפרטורה מותאם ל -37 מעלות צלזיוס, שהמסנן של הבקבוק הוא חתום עם סרט במעבדה על מנת למנוע אידוי של CO 2.
  18. למחרת, לשאוב את המדיום ולהוסיף בינוני תרבות טרי 10 מ"ל מתחדש עם 20 מיקרומטר ציטוזין-1-β-D-arabinofuranoside (AraC) כדי eliminaתאים המתחלקים שיורית te.
    הערה: דגירה עם AraC עבור 2 - 3 ד בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% CO 2 תגרומנה תרבות astrocyte טהורה.
  19. לפקח על טוהר התרבויות astrocyte ידי בדיקה ויזואלית תחת מיקרוסקופ אור. אם ובתאים בהירים שיורית שלב בניגוד ו microglia עדיין מתגוררים על גבי monolayer astrocytic 17 (ראה שלב 1.16), חזור על שלבי 1.18 ו 1.19.
    הערה: ומחוברות monolayers astrocyte טהור יכול להישמר לתקופה של עד 14 ד בחממה (37 ° C, 6% v / v CO 2) לפני שתמשיך לשלב הבא. שנה וחצי של המדיום כל 3 ד. אל תאסוף, הקפאה להפשיר את האסטרוציטים, כמו תאים אלה יאבדו נכסים התומכים העצביים שלהם באמצעות הליך האחסון.

2. האסטרוציטים הכנות לקראת Coculture עקיף

הערה: 48 - 72 שעות לפני הכנת נוירונים, האסטרוציטים העברת celמוסיף l-תרבות. באופן כללי, בקבוקון T75 אחת מספק כמות מספקת של תאי לתמוך תרבויות העצביות שהושגו עם הכנה אחד.

  1. מניחים כמה מוסיף כנדרש לתוך 24 גם צלחות. מעיל אחד להכניס את עם 10 מיקרוגרם / מ"ל PDL (מומס במים תא-תרבות-כיתה) במשך כ 1 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO 2. לאחר הדגירה, לשטוף את הוסיף פעמים עם PBS. בינתיים, להמשיך עם הכנת האסטרוציטים.
    הערה: מוסיף מלא PBS יכול להישמר עד השעית תא astrocyte מוכנה לשימוש.
  2. לשאוב את המדיום astrocyte (עם AraC) ולשטוף את זמן תרבות אחת עם 10 מ"ל PBS כדי לוודא שכל בסרום שיורית מוסר.
  3. הוסף 3 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA (חומצה Ethylenediaminetetraacetic) כדי צלוחיות דגירה תאים עבור trypsinization על 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO 2 למשך כ 10 דקות.
  4. שליטת ניתוק התא על ידי בדיקה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ facilitate ניתוק של התאים על ידי הקשה על הצד של צלוחיות נגד שולחן העבודה.
    הערה: שלבי 2.5 - 2.8 הם קריטיים אמורים להסתיים תוך 15 - 20 דקות.
  5. בעקבות trypsinization, בעדינות מחדש להשעות את התאים בינוני 7 מ"ל astrocyte ולהעביר את ההשעיה לתא צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב g 216 x.
  6. בזהירות לשאוב supernatant ו resuspend התא גלולה במדיום astrocyte 1 מ"ל.
  7. ספירת התאים באמצעות תא ספירה.
  8. מלא את התחתון של הבארות של 24 גם הצלחת עם מדיום astrocyte 500 μL ולהעביר 25,000 תאים במדיום astrocyte 500 μL לתוך כל כנס פרט. דגירת התרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 6% 2 V / V CO.
    הערה: לאחר 42 - 72 שעות התרבויות תגענה כ 100% מפגש. בשלב זה טוהר התרבות ניתן לאמת על ידי immunocytochemistry 11. תרבויות ומחוברות יכול להישמר לתקופה של עד 7 ד עד שתמשיךהצעד הבא. שנה וחצי של המדיום כל 3 ד.

3. הכנת נוירונים בהיפוקמפוס ראשי

הערה: נוירונים בהיפוקמפוס עכבר יסודי צריכים להיגזר E15.5 - עובר E16 של עכברות הרות מתוזמן.

  1. הכן בינוני נוירון (ממ עם פירובט נתרן 10 מ"מ, 0.1% w / ovalbumin נ, 2 נ% / תוספת בינוני נ B27, ו גנטמיצין 0.1% v / v (לאחר סינון סטרילי)), ובינוניים הכנה (HBSS עם 0.6% w / גלוקוז נ ו HEPES 10mm (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine חומצה ethanesulfonic)). טרום חם מראש לאזן מדיום נוירון צלוחיות מסננות על 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO 2.
  2. מניחים את coverslips זכוכית (12 מ"מ קוטר) לתוך הבארות של 24-היטב צלחות (השתמש coverslips מיוחד, אשר מחורצים לשימוש עם מוסיף תרבית תאים).
    1. מעיל לפחות 1 שעות עם 15 מיקרוגרם / מ"ל ​​Poly-DL-ornithine במים (תא-תרבות-כיתה) על 37 מעלות צלזיוס. השתמש לפחות 500 μL לכל טוב על מנת להבטיח כיאת coverslips מכוסה לחלוטין. לשטוף את הבארות פעמים עם PBS. השאירו את PBS בבארות עד ציפוי התאים. ודא בארות שלא יתייבשו.
  3. כדי לנתח את hippocampi, להכין מאכלים 3x 10 ס"מ מלאים בינוני הכנה 1x 2 צינור מ"ל עם 1 בינוני הכנה מ"ל. כן מספריים 2 מלקחיים בסדר.
  4. להקריב את העכבר בהריון על ידי נקע בצוואר הרחם, לעקר את הבטן על ידי שטיפה עם אתנול 70% v / v, ולפתוח את הבטן באמצעות מספריים חדים. ובלו הרחם חרוז בזהירות במספריים ולהעביר את האיבר לתוך צלחת 1x 10 סנטימטרים מלאים בינוני הכנה.
  5. בשלב הבא, להסיר את העוברים מן הרחם. בזהירות לחתוך את הרחם ולהסיר את amnion מבלי לפגוע עוברי באמצעות 2 מלקחיים. לאחר מכן, לערוף כל עובר עם זוג מספרי ולהעביר את הראש לתוך צלחת 10 סנטימטרים שני שמצורפת בינוני הכנה.
  6. המשך עם הכנת הראשי (בדומה preparation תיאר 1.4 - 1.7).
    1. לשתק את הראש עם זוג מלקחיים לחתוך את גולגולת עור באזור הצוואר קרובה למוח האחורי, בניצב צירה העצבים. השתמש בזוג שני של מלקחיים להרים הן גולגולת עור מכסה, לכופף את כובע הגולגולת הרך לקראת הסוף המקורי של הראש, ובכך לחשוף את המוח.
    2. בעזרת 2 מלקחיים, לנתק את המוח מחלל הגולגולת. כדי לעשות זאת, קרוב 1 זוג מלקחיים ולהפריד את המוח מהגולגולת החל נורות חוש הריח ולנוע לכיוון למוח האחורי. אסוף את המוח בעוד צלחת 10 ס"מ מלאים בינוני הכנה.
  7. לנתח את hippocampi מן moieties קליפת כמתואר לעיל לעריכת astrocyte (שלב 1.6). הסר את hippocampi מן האונה כל ולאסוף אותם בצינור 2 מ"ל מלאים בינוני הכנה.
  8. לאחר שסיים את הנתיחה, להעביר את הצינור אל ספסל diges זרימה למינרית סטריליt הרקמה בהיפוקמפוס עם פתרון העיכול 1 מ"ל המכיל פפאין. הכן את הפתרון העיכול כמתואר בשלב 1.9 - 1.10, אבל להשתמש MEM במקום DMEM.
    הערה: שלבים 3.9 - 3.12 הן קריטיות ואמור להסתיים בתוך 10 - 15 דקות.
  9. לאחר השלמת העיכול, בזהירות למשוך את פתרון העיכול על ידי שאיבה עדינה עם טפטפת.
  10. שטפו את hippocampi 3 פעמים עם המדיום נוירון ידי הוספת ברצף ואילך בזהירות aspirating 1 בינוני תרבות טרי מ"ל לכל מחזור הכביסה. אל בצנטריפוגה השעית התא.
  11. לאחר שלב הכביסה הסופי, בזהירות triturate רקמה במדיום נוירון 1 מיליליטר.
  12. ספירת התאים באמצעות תא ספירת צלחת 35,000 תאי 500 בינוני נוירון μL לכל באר יחיד של 24 גם צלחת (צלחת מוזכרים 3.2).
    הערה: לחלופין, aliquot תא ניתן counterstained עם trypan כחול כדי להעריך את החיוניות של הכנת התא. שליטת צפיפות הציפוי ידי ויזואלית לבדוקיון באמצעות מיקרוסקופ (בדרך כלל 90 - 110 תאים לכל שדה ראייה של מטרת 10X סטנדרטית).
  13. מקום נוירונים בחממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% v / v CO 2 עבור H 1.
  14. פרסם הדגירה, לקחת מחדיר מוכן (זורעים עם monolayers astrocyte ומחוברות) מתוך האינקובטור (ראה שלב 2.8). חילופי הבינוני ידי aspirating מדיום astrocyte והחלפתו 500 μl הבינוני נוירון טרי.
    הערה: מוסיף צריכה נמל monolayers astrocyte ומחובר לאחר 2 - 3 DIV (ימים במבחנה).
  15. מניח את מוסיף עם האסטרוציטים בזהירות לתוך הבארות המכילות את תרבויות נוירון (שלב 3.13) באמצעות מלקחיים סטרילית.
  16. מניח את coculture נוירון astrocyte העקיף הנובע בחזרה לתוך החממה ב 37 מעלות צלזיוס, 6% נ נ / CO 2.
    הערה: בתנאים אלה, נוירונים יכול להיות מתורבת עבור עד 4 שבועות לחלוטין מוגדר בינוני. אין שינוי המדיום הוא הכרחי. עבור תרבויות לטווח זמן, מומלץ למלא דוארבארות mpty עם מים סטריליים על מנת להפחית את האידוי של צלחת 24 גם.
  17. בצע במבחנה תא מנתח לאחר הרצוי תקופות תרבות (למשל, עבור immunocytochemistry, PCR, כתם המערבי, הקלטות אלקטרו (מהדק תיקון או מערך multielectrode)) 7,15,18.
    הערה: מערכת התרבות מתאימה גם לטיפול תרופתי אקוטי וכרוני של התרבויות 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הניתוח של התרבויות העצביות באמצעות מערכת coculture העקיפה מגוון וניתן לבצעו בשלבים שונים של התבגרות התרבות. בשל העובדה כי התאים יכולים להישמר לתקופה של עד 4 שבועות, חקירות ארוכות טווח של התרבויות אפשריות.

סכמטית בלוח השמאלי באמצע איור 1 מדגים את ההתקנה cocultivation. עם השימוש במערכת זו, הדמיה תא חי של סוגי תאים שניהם יכולים להתבצע, כפי שהודגם על ידי תמונות בניגוד שלב של monolayer astrocyte (בחלונית הימנית העליונה) ואת הרשת העצבית (הפאנל השמאלי התחתון). לאחר קיבוע, הערכת immunocytochemical אפשרית, כפי שמוצגת בפינה הימנית עליונה ופנלים ימניים תחתונים.

נוירונים להתחיל להקים קשרים סינפטיים החל מ כ 7 DIV במודל שלנו (מידע לא מוצג). ב -14 DIV סינפסות מרובים נוצרות בתוך רשתות נוירונים, כפי שהוגדרו על ידי זיהוי immunocytochemical משולב של סמנים טרום postsynaptic (איור 1, פאנל מימין למטה). חשוב לציין, לא רק את הסכום של puncta סמן הסינפטי ניתן דמיין לכמת באמצעות גישה זו, אלא גם הסינפסות המבניות הושלם, אשר קרוב לוודאי לתרום קישוריות רשת.

תרבויות astrocyte לא רק לספק תמיכה trophic לנוירונים 11, אלא גם לסנתז מספר גורמים המופרשים 19,20 מעורב פלסטיות עצבית. הביטוי של אחד מהגורמים הללו, כלומר מטריצה מטלו 2 (MMP2), בא לידי ביטוי בלוח הימני העליון של איור 1. מעניין לציין, כי 2-isoforms MMP2 הברור אותר מדיום coculture באמצעות כתם מערבי (איור 1, פנל מימין באמצע ). פוטנציאלי האסטרוציטים להפריש MMP2 לתוך היםבינוני hared, ובכך להשפיע על הפלסטיות של נוירונים. כמו כן isoforms המרובה של Tenascin-C, רגולטור ידוע של תולדה האקסון, נדידת תאים והתמיינות 21 זוהו.

יחדיו, תוצאות אלה ממחישות שתי דוגמאות ובכך לספק הוכחה של עיקרון עבור המגוון של חקירות של האסטרוציטים, נוירונים ותקשורת הגומלין שלהם שיכולים להתממש בשיטת cocultivation העקיפה כפי שתתואר בהמשך.

איור 1
. איור 1: המערכת העקיפה astrocyte-Neuron Coculture מאפשרת ניתוח נפרד של האסטרוציטים, נוירונים ומופרש מולקולריים מגשרי לוח למעלה, משמאל: monolayers טופס האסטרוציטים על הממברנה להכניס תרבית תאים, לעומת שלב; סרגל: 250 מיקרון פנל עליון, נכון:. כמוtrocytes הם immunostained עבור חלבון גליה חומציים סיבי (GFAP) (GA5 שיבוט העכבר) ומטריקס Metalloprotease 2 (MMP2) (ארנב polyclonal); סרגל:. 250 מיקרון לוח תיכון, לשמאל: את הערכה ממחישה את התקנת coculture העקיפה. למרות שתי תרבויות מופרדות פיזי, הם חולקים את אותה בינוני לוח תיכון, נכון:. שני מתווכים מולקולריים מופרשים של אינטראקציות גליה נוירון מתגלים במדיום שיתוף הטיפוח באמצעות כתם מערבי. . Isoforms המרובה של Tenascin C (TNC), רגולטור תולדה neurite, ו MMP2, צירוף תאי מטריקס, מתועדים פנל תחתון, לשמאל: הנוירונים עיקריים לפתח בזו קשר הדוק רשתות ב -14 היום ה טיפוח, לעומת שלב; . סרגל: 250 מיקרון הפאנל התחתון, נכון: החל 14 ד במבחנה, קשרים סינפטיים מרובים מבוססים בין נוירונים, כפי שזוהו על ידי תיוג immunocytochemical; סרגל: 50 מיקרון. שיתוף לוקליזציה של הסמן presynaptic בסון (ארנב polyclonal) עם חלבון פיגומים postsynaptic PSD95 (שיבוט העכבר 6G6-1C9) מתעד את היווצרות הסינפסות הושלמה מבחינה מבנית. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

המטרה העיקרית של הפרוטוקול הנוכחי היא תרבויות עצביות ו astrocytic נפרדים לחלוטין, תוך שמירה על אותם במדיום משותף. מסיבה זו, את הטוהר של תרבויות המתקבל צריך להיות מאומת בתחילת ההליך. אנו ממליצים על שימוש של טובולין נוירון ספציפי, neurofilaments או חלבון NeuN כמו סמנים עצביים, GFAP כסמן astrocytic, אנטיגן O4 כסמן מבשר oligodendrocyte ו Iba1 חלבון לזהות microglia.

שים לב מיוחד בעת ביצוע שלב קריטי של הפרוטוקול, כפי שצוין על ידי 'הערה' לפני תיאור הצעד. קח בחשבון כי הן התרבויות העיקריות של נוירונים האסטרוציטים הן די רגישות. לכן, כמה בעיות שעלולות להתעורר בתחילת ההליך. אם האסטרוציטים אינם מגיעים בשכבה ומחוברות ב T75 צלוחיות לאחר 10 DIV (סעיף פרוטוקול 1), לבדוק את הרכיבים של המדיום astrocyte (עבור תאריך תפוגה). בנוסף,להגדיל את כמות רקמת קליפת המוח מוכן ליזום את התרבות (עד 10 הקורטקס לכל בקבוק). אם האסטרוציטים אינם מגיעים בשכבה ומחוברת על מוסיף תרבית תאים לאחר 72 שעות (סעיף פרוטוקול 2), לבדוק את הרכיבים של מדיום astrocyte ו PDL (עבור תאריך תפוגה) .Try לצלחת החוצה תרבויות מוכנות טרי, לקבוע את שיעור קיימא תאים לפני ציפוי ולהתאים מספרים סלולריים בהתאם (למשל, להשתמש counterstaining trypan כחול). אם הישרדות נמוך של נוירונים מזוהה אחרי 24 שעות, רקמת ההיפוקמפוס לא triturated ובעדינות יתרה (שלב פרוטוקול 3.11) תשומת לב .Pay כדי למנוע היווצרות של בועות כאשר dissociating הרקמה. אם ההישרדות של נוירונים הוא הוריד באופן משמעותי לאחר 7 - 14 DIV ואם נוירונים ליצור אגרגטים של 3 - 5 תאים לאחר 7 DIV, השתמש מוכן מוסיף טרי עם האסטרוציטים, לבדוק טוהר astrocyte ידי immunocytochemistry, ולבדוק את המרכיבים בינוני נוירון. אם אגרגטים גדול של נוירונים (יותר מ -10 תאים) הוא נisible, יתכן כי רקמת ההיפוקמפוס לא triturated מספיק, וכתוצאה מכך ניתוק שלם (שלב פרוטוקול 3.11). שים לב ההומוגניות השעיה. אם התרבות העצבית היא מזוהם עם תאים שאינם עצביים (microglia, האסטרוציטים, תאים מבשרים oligodendrocyte, וכו '), להסיר לחלוטין את רקמת קליפת המוח השכנה סמוכה בהיפוקמפוס (שלב 3.7) וגם לבדוק את הרכיבים הבינוניים נוירון.

Coculture העקיף המוצע של הנוירונים עיקריים האסטרוציטים מספק כולים צדדיים לחקירה ארוכת הטווח של נוירון, גליה אינטראקציות. חשוב לציין, פרוטוקול זה הוא מותאם במיוחד בתאי עכבר, אשר פותח פרספקטיבה ליישום מודלים גנטיים עכבר. בגלל ההפרדה הפיסית המלאה של 2 סוגי התאים, נוירונים האסטרוציטים של גנוטיפים ברורים ניתן לשלב בצורה הרצויה.

בין מגוון של יישומים, גישה זו יכולה לשמש כדי INVestigate פיתוח רשתות עצביות, synaptogenesis, פעילות ברשת איתות astrocyte-נוירון. למרות cocultivation העקיף של נוירונים האסטרוציטים פותח הזדמנויות אדירות עבור ניתוח הפרדה שלהם ואיתות ארוך טווח, חוסר קשר ישיר עלול לפגוע בוויסות העדינה של פלסטיות הסינפטית 22. לפיכך, חוסר אינטראקציה בין בליטות astrocytic וסינפסות העצבית צריך להתייחס בזהירות בעת שימוש במודל זה.

Assay הוא מבוסס על שני פרוטוקולים קודמים עבור astrocyte והכנות עצביות 14,17 ו שופר במהלך השנים האחרונות. הגישה במקור הוקמה לעכבר 7 וחולדה 11 תאים. פרסומים קודמים של המעבדה לספק אפיון מפורט של מבחני בנוגע הישרדות התא, היווצרות הסינפסה אפיון אלקטרו של תאים והתוצאה 7,11,15,18. יתר על כן, לאהוא assay ניתן להתאים הגדרות אחרות, כגון 7 מיקרו-אלקטרודות-מערכים (MEAs). ביישומים עתידיים, הקורא צריך לשקול פרוטוקולים אחרים עבור המחקר המפורט של תהליך היווצרות הסינפסה 23, כמו גם לניתוח MEA במבחנה. לסיכום, assay מספק כולים צדדיים למעבדות התמקדות בהיבטים שונים של אינטראקציות גליה נוירון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell-culture-grade water MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24-well-plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro-tube (2 mL) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 mL) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 mL) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
  2. Barreto, G. E., Gonzalez, J., Torres, Y., Morales, L. Astrocytic-neuronal crosstalk: implications for neuroprotection from brain injury. Neurosci Res. 71, 107-113 (2011).
  3. Araque, A., Carmignoto, G., Haydon, P. G. Dynamic signaling between astrocytes and neurons. Annu Rev Physiol. 63, 795-813 (2001).
  4. Dityatev, A., et al. Activity-dependent formation and functions of chondroitin sulfate-rich extracellular matrix of perineuronal nets. Dev Neurobiol. 67, 570-588 (2007).
  5. Robinette, B. L., Harrill, J. A., Mundy, W. R., Shafer, T. J. In vitro assessment of developmental neurotoxicity: use of microelectrode arrays to measure functional changes in neuronal network ontogeny. Front Neuroeng. 4, 1 (2011).
  6. Voigt, T., Opitz, T., de Lima, A. D. Synchronous Oscillatory Activity in Immature Cortical Network Is Driven by GABAergic Preplate Neurons. J Neurosci. 21 (22), 8895-8905 (2001).
  7. Geissler, M., Faissner, A. A new indirect co-culture set up of mouse hippocampal neurons and cortical astrocytes on microelectrode arrays. J Neurosci Methods. 204, 262-272 (2012).
  8. Yu, C. Y., et al. Neuronal and astroglial TGFbeta-Smad3 signaling pathways differentially regulate dendrite growth and synaptogenesis. Neuromolecular Med. 16, 457-472 (2014).
  9. Yu, P., Wang, H., Katagiri, Y., Geller, H. M. An in vitro model of reactive astrogliosis and its effect on neuronal growth. Methods Mol Biol. 814, 327-340 (2012).
  10. Kucukdereli, H., et al. Control of excitatory CNS synaptogenesis by astrocyte-secreted proteins Hevin and SPARC. PNAS. 108, E440-E449 (2011).
  11. Pyka, M., Busse, C., Seidenbecher, C., Gundelfinger, E. D., Faissner, A. Astrocytes are crucial for survival and maturation of embryonic hippocampal neurons in a neuron-glia cell-insert coculture assay. Synapse. 65, 41-53 (2011).
  12. Navarrete, M., Araque, A. Basal synaptic transmission: astrocytes rule! Cell. 146, 675-677 (2011).
  13. Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
  14. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  15. Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. J Neurosci. 33, 7742-7755 (2013).
  16. Dzyubenko, E., Gottschling, C., Faissner, A. Neuron-Glia Interactions in Neural Plasticity: Contributions of Neural Extracellular Matrix and Perineuronal Nets. Neural Plast. 2016, 5214961 (2016).
  17. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. J Cell Biol. 85, 890-902 (1980).
  18. Pyka, M., et al. Chondroitin sulfate proteoglycans regulate astrocyte-dependent synaptogenesis and modulate synaptic activity in primary embryonic hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 33, 2187-2202 (2011).
  19. Eroglu, C. The role of astrocyte-secreted matricellular proteins in central nervous system development and function. J Cell Commun Signal. 3, 167-176 (2009).
  20. Ethell, I. M., Ethell, D. W. Matrix metalloproteinases in brain development and remodeling: synaptic functions and targets. J Neurosci Res. 85, 2813-2823 (2007).
  21. Theocharidis, U., Long, K., ffrench-Constant, C., Faissner, A. Prog Brain Res. Dityatev, A. lexander, Wehrle-Haller, B. ernhard, Asla, P. itkänen 214, Elsevier. 3-28 (2014).
  22. Dityatev, A., Rusakov, D. A. Molecular signals of plasticity at the tetrapartite synapse. Curr Opin Neurobiol. 21, 353-359 (2011).
  23. Ippolito, D. M., Eroglu, C. Quantifying synapses: an immunocytochemistry-based assay to quantify synapse. JoVe. , (2010).

Tags

Neuroscience גיליון 117 ההיפוקמפוס תרבית תאים coculture עקיף נוירונים בהיפוקמפוס האסטרוציטים synaptogenesis
את assay Coculture Neuron-astrocyte העקיפה: An<em&gt; במבחנה</em&gt; הגדרה לחקירה המפורטת של נוירון, גליה אינטראקציות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gottschling, C., Dzyubenko, E.,… More

Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter