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Neuroscience

A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An Published: November 14, 2016 doi: 10.3791/54757

Summary

Este protocolo descreve a co-cultura neurônio-astrócito indireta para análise compartimentada das interações neurônio-glia.

Abstract

desenvolvimento neuronal adequada e função é o pré-requisito do desenvolvimento e do cérebro adulto. No entanto, os mecanismos subjacentes à formação altamente controlada e manutenção de redes neuronais complexas não estão completamente compreendidos, até agora. As questões em aberto sobre neurônios na saúde e na doença são diversas e alcance da compreensão do desenvolvimento básico para investigar patologias relacionadas com humanos, por exemplo, doença de Alzheimer e esquizofrenia. A análise mais detalhada dos neurónios pode ser realizado in vitro. No entanto, os neurônios estão exigindo células e precisam do apoio adicional dos astrócitos para a sua sobrevivência a longo prazo. Esta heterogeneidade celular está em conflito com o objectivo de dissecar a análise de neurónios e astrócitos. Apresentamos aqui um ensaio de cultura de células que permite a co-cultura a longo prazo de neurónios e astrócitos primários puros, que partilham o mesmo meio definido quimicamente, sendo fisicamenteseparados. Nesta configuração, as culturas sobreviver por até quatro semanas e o ensaio é adequado para uma diversidade de investigações relativas a interação neurônio-glia.

Introduction

Ao longo das últimas décadas, a interpretação geral da função neuroglia evoluiu a partir da atribuição de um apoio meramente no sentido de um papel regulador activa a respeito da função neuronal 1. Por causa de seu impacto importante na homeostase cerebral na saúde e na doença 2, os astrócitos são de especial interesse para a comunidade científica. Nos últimos anos, uma diversidade de estudos concentraram-se em interacções neurónio-glia in vivo e in vitro 3. No entanto, a maioria dos sistemas de cultura não permitem a análise em separado de ambos os tipos de células e de seus respectivos secretomes.

Várias abordagens explorar o co-cultivo direta dos neurônios e da glia para alcançar a sobrevivência duradoura e de desenvolvimento da rede neuronal fisiologicamente relevante 4-6. O presente protocolo atinge os mesmos objetivos, mantendo ambos os tipos de células separadas fisicamente 7. Em comparação com conditioned média se aproxima de 8,9, o nosso sistema permite estudar a comunicação bidirecional entre neurónios e astrócitos. A expressão de moléculas de sinalização segregadas pode ser monitorizada, enquanto as células maturam no meio compartilhado. Esta possibilidade é especialmente relevante, tal como astrócitos libertam factores solúveis, tais como citoquinas, factores de crescimento e moléculas da matriz extracelular 10,11, regulando desse modo o crescimento neuronal e função 7,12. Assim, foi demonstrado que a adição de trombospondina de células do gânglio retinal in vitro, induz a formação de sinapses 13. No entanto, outros fatores ainda desconhecidos são necessárias para tornar as sinapses funcionais 13. Além disso, as moléculas liberadas por astrócitos têm de ser identificados, a fim de compreender a base de interações neurônio-glia.

A cultura de neurónios e astrócitos primários de ratinho e rato foi previamente descrito 14-16. Aqui nósapresentar uma ferramenta elegante e versátil para combinar ambos os tipos de células em uma abordagem co-cultura indirecta. Uma vez que as duas culturas são fisicamente separadas mas que partilham a mesma forma, o impacto de neurónios, astrócitos e as moléculas solúveis, podem ser analisados ​​separadamente, criando assim uma ferramenta poderosa para estudos de interacção Neuron-glia.

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Protocol

Os experimentos com camundongos estavam em conformidade com a Lei alemã e da Sociedade Alemã de diretrizes neurociência da criação de animais. As comissões de cuidados de animais e utilização do Bochum Ruhr-University concederam as licenças apropriadas.

1. Preparação e Cultivo de Cortical astrócitos

Nota: Conclua estas etapas do protocolo, pelo menos, 7 d antes de prosseguir para as próximas etapas, como as culturas de astrócitos devem desenvolver em monocamadas confluentes antes que os neurônios estão preparados. astrócitos primários são derivados de culturas gliais mistos obtidos a partir de filhotes de rato ao redor dia pós-natal (P) 0-3. Três cérebros (6 córtices) por frasco T75 são para ser usados.

  1. Prepara-se o meio de astrócitos, completando de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) com 10% de soro de v / v de cavalo e 0,1% v / v de gentamicina sob condições estéreis. Armazenar o meio a 4 ° C durante até 2 semanas.
  2. Brasão 3x T75 frascos with 10 ug / ml de poli-D-lisina (PDL; em água-cultura de grau célula) durante pelo menos 1 h a 37 ° C na presença de 6% v / v de CO2. Após o revestimento, os frascos de lavagem duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) para remover catiões não ligados, e adicionar 9 ml de meio de astrócitos.
  3. Para a preparação dos cérebros, adicionar Solução Salina Equilibrada de Hank 10 ml (HBSS) para 1x 10 centímetros de Petri e 1 ml de HBSS a 1 x 15 mL tubo (independentemente do número de cérebros que vai ser utilizado). Manter um par de tesouras cirúrgicas, 2 pinça fina e um binóculo ao alcance para o procedimento.
  4. Decapitar 3 filhotes rapidamente com as tesouras cirúrgicas e recolher as cabeças em um vazio placa de 10 cm.
    1. Realizar a preparação dos córtices sob a binocular. Utilizando duas pinças finas, remover a pele dorsal a partir do crânio na linha mediana, a partir do pescoço para cima em direcção ao nível dos olhos. Depois disso, o cérebro com os seus vasos sanguíneos é visível sob o crânio.
    2. Fixar a cabeça na extremidade rostral com um par de fórceps e inciso linha média do crânio, começando na extremidade posterior. Posteriormente, cortaria a direita e as metades esquerda do crânio para expor o cérebro.
    3. Fechar a ponta do fórceps e posicioná-lo sob ventral do cérebro. Levantar o cérebro fora do crânio e transferi-lo para o HBSS-cheia 10 centímetros de Petri. Proceda da mesma forma com o modelo restantes até que todos os cérebros são recolhidas no prato.
  5. Após a coleta dos cérebros, comece com a separação dos córtices por beliscar fora da parte posterior do cérebro usando um par de fórceps, como um par de tesouras. Executar uma incisão na linha média entre os dois hemisférios com um par de pinças. Cuidadosamente corrigir o cérebro com uma pinça e cortar o mesencéfalo e os bulbos olfatórios utilizando uma segunda pinça para acabar com as metades corticais.
  6. Fix metade cortical com um par de fórceps e descascar as meninges dos hemisférios destacando-los from a aresta lateral e, subsequentemente, puxando-os da superfície cortical utilizando uma segunda pinça.
  7. Virar o meia cortical com a sua superfície orientada para baixo para o prato; dissecar cuidadosamente e remover o hipocampo em forma de crescente, usando um par de fórceps. Transfira os córtices individuais dentro do tubo cônico de 15 mL usando uma pinça fechadas para realizar um córtex individual.
  8. Depois de recolher todos os córtices, o trânsito para a capela de fluxo laminar estéril e começar com os preparativos para a dissociação do tecido cortical.
  9. Adicionar 1 ml de DMEM a um tubo de reacção de 2 mL e adicionar 0,1% w / v de papaína (30 unidades). Incubar a suspensão num banho de água a 37 ° C até que uma solução clarificada desenvolve (cerca de 3 min). Adicionar 0,24 mg / mL L-cisteína e 20 ng / mL DNAse e agitar suavemente.
    NOTA: Para a digestão, aproximadamente, 1 mL de solução de enzima é necessária.
  10. Filtro (0,22 mM tamanho dos poros) para obter uma solução estéril mL antes de adicionar-lo para o tecido cortical. Incubar os tubos durante 30 minutos - 1 hora a 37 ° C (ou seja, em um banho de água).
    NOTA: As etapas 1,11-1,14 são críticos e devem ser concluídas dentro de 15 min.
  11. Para terminar a reacção de digestão, adicionar um meio de astrócitos mL e tritura-se cuidadosamente o tecido digerido utilizando uma pipeta de 1 mL. Para trituração, e mover-se suavemente o êmbolo da pipeta, aspirando assim, e extrusão da suspensão de tecido cortical.
  12. Uma vez que o tecido foi dissociado para uma suspensão de uma única célula, adicionam-se 5 mL de meio de astrócitos e centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
  13. Aspirar o sobrenadante com cuidado a partir do sedimento resultante e voltar a suspender as células em um meio de astrócitos mL.
  14. Adicione as suspensões de células para frascos T75 reabastecidos com 9 meio de astrócitos mL (ver 1.2).
  15. Incubar as células a 37 ° C na incubadora, na presença de 6% v / v de CO2. Após 4 d, realizar a primeira mudança meio completo (10 mL). Depois disso, mudar o meio de cultura a cada 2-3 d.
  16. Após 7 d, verificar se as células formaram uma monocamada confluente. Se não, esperar durante mais de 2 - 3 dias até confluência completa da cultura é atingido.
    NOTA: Os astrócitos exibir grandes corpos celulares achatados, localizar-se no fundo do frasco e não se desenvolvem os processos celulares notáveis. Eles diferem das pequenas células progenitoras brilhantes de contraste de fase e a microglia que residem no topo da monocamada de 17.
  17. A fim de se livrar das células progenitoras e obter uma cultura de astrócitos pura, coloque os frascos T75 em um agitador orbital e agitar as culturas O / N a 250 rpm. Certifique-se de que a temperatura é ajustada a 37 ° C e que o filtro do balão é selada com filme de laboratório para evitar a evaporação do CO 2.
  18. No dia seguinte, Aspirar o meio e adicionar meio de cultura de 10 mL fresco reabastecido com 20 uM citosina-1-β-D-arabinofuranósido (AraC) para Eliminacélulas em divisão residuais te.
    NOTA: incubação com AraC para 2-3 d na incubadora a 37 ° C, 6% de CO 2 vai resultar em uma cultura de astrócitos puro.
  19. Monitorar a pureza das culturas de astrócitos por inspecção visual ao microscópio de luz. Se residual de contraste de fase de células progenitoras brilhante e microglia ainda residem no topo da monocamada astrocitária 17 (veja o passo 1.16), repita os passos de 1,18 e 1,19.
    NOTA: O confluente e monocamadas de astrócitos puros pode ser mantido durante até 14 d na incubadora (37 ° C, 6% v / v de CO2) antes de prosseguir para o próximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d. Não coletar, congelar e descongelar os astrócitos, uma vez que estas células irão perder as suas propriedades favoráveis ​​neuronais através do procedimento de armazenamento.

2. Os astrócitos preparando para o Coculture indireta

Nota: 48 - 72 h antes de preparar os neurônios, astrócitos transferência para o celinserções l-cultura. Geralmente, um único frasco T75 proporciona um número suficiente de células para suportar as culturas neuronais obtidos com uma preparação.

  1. Coloque como muitos inserções conforme necessário para 24 poços placas. Revestimento cada inserção com 10 ug / mL PDL (dissolvido em água de grau de cultura de células) durante cerca de 1 h a 37 ° C, 6% v / v de CO2. Após a incubação, as inserções de lavar duas vezes com PBS. Nesse meio tempo, prosseguir com a preparação de astrócitos.
    NOTA: As inserções cheias com PBS pode ser mantido até que a suspensão de células de astrócitos está pronto para uso.
  2. Aspirar o meio do astrócito (com AraC) e lava-se a cultura de uma vez com 10 mL de PBS para garantir qualquer soro residual é removido.
  3. Adicionar 3 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (ácido etilenodiaminotetracético) aos frascos e incubar as células durante tripsinização a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante cerca de 10 min.
  4. Controlar a separação celular por inspeção visual usando um microscópio e Facilitate o descolamento das células tocando no lado dos frascos contra a área de trabalho.
    NOTA: As etapas 2,5-2,8 são críticos e deve ser concluído dentro de 15 - 20 min.
  5. Após o tratamento com tripsina, gentilmente re-suspender as células em meio de astrócitos 7 mL e transferir a suspensão de células para um tubo de 15 mL. Centrifugar durante 5 minutos a 216 x g.
  6. Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 1 mL de meio de astrócitos.
  7. Contar as células utilizando uma câmara de contagem.
  8. Encha o fundo das cavidades da 24 poços da placa com meio de astrócitos 500 uL e transferir 25.000 células em meio de astrócitos 500 ul em cada inserção individual. Incubar a cultura a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
    NOTA: Depois de 42-72 h as culturas irá atingir cerca de 100% de confluência. Nesta fase, a pureza da cultura pode ser verificada por meio de imunocitoquímica 11. As culturas confluentes podem ser mantidos durante até 7 d até se proceder àpróximo passo. Mudar metade do meio a cada 3 d.

3. Preparação de primário neurônios do hipocampo

Nota: os neurônios do hipocampo de rato primária deve ser derivado de E15.5 - embriões E16 de ratos grávidas cronometrados.

  1. Preparar o meio neuronal (MEM com piruvato de sódio 10 mM, 0,1% w / v de ovalbumina, 2% v / v de suplemento de meio B27, e 0,1% v / v de gentamicina (filtrado estéril)), e meio de preparação (HBSS com 0,6% w / v de glucose e 10 mM HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-etanossulf único piperazina)). Pré-aquecido e pré-equilibrar a forma neurónio em frascos de filtro a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
  2. Coloque as lamelas de vidro-(12 mm de diâmetro) para os poços de 24 poços-placas (use as lamelas especiais, que são entalhadas para o uso com inserções de cultura de células).
    1. Revestimento durante pelo menos 1 h com 15 ug / ml de poli-DL-ornitina em água (cultura celular de grau) a 37 ° C. Use pelo menos, 500 uL por poço para assegurar queas lamelas estão completamente cobertos. Lavar as cavidades duas vezes com PBS. Deixar o PBS nos poços até plaqueamento das células. Certifique-se de que os poços não sequem.
  3. Para dissecar os hipocampos, prepare 3x 10 cm pratos cheios com meio de preparação e 1x tubo de 2 mL com um meio de preparação mL. Prepare uma tesoura e 2 pinça fina.
  4. Sacrificar o mouse grávida por deslocamento cervical, esterilizar o abdómen por lavagem com 70% v / v de etanol, e abrir o abdômen usando uma tesoura afiada. Excisão do útero frisado cuidadosamente com uma tesoura e transferir o órgão em 1x placa de 10 cm cheios com meio preparação.
  5. Em seguida, retire os embriões do útero. Cuidadosamente inciso do útero e remover a membrana amniótica sem prejudicar os embriões usando 2 fórceps. Em seguida, decapitar cada embrião com um par de tesouras e transferir as cabeças para uma segunda placa de 10 cm com meio de preparação fornecido.
  6. Prosseguir com a preparação das cabeças (semelhante ao preparção descrita em 1,4-1,7).
    1. Imobilizar a cabeça com um par de pinças e incisão no crânio e a pele na região do pescoço próximo da parte posterior do cérebro, perpendicular ao neuroeixo. Usar um segundo par de fórceps para levantar tanto crânio e cobrindo a pele, e dobrar o gorro macio para a extremidade rostral da cabeça, expondo assim o cérebro.
    2. Com a ajuda de uma pinça 2, retire o cérebro da cavidade craniana. Para fazer isso, par próximo 1 de fórceps e separar o cérebro do crânio começando pelos bulbos olfatórios e se movendo em direção à parte posterior do cérebro. Recolher os cérebros em outra placa de 10 cm cheios com meio preparação.
  7. Dissecar a hipocampos a partir das porções do córtex, tal como descrito acima para a preparação de astrócitos (passo 1.6). Remova o hipocampo de cada hemisfério e recolhê-las no tubo de 2 mL cheio com meio de preparação.
  8. Depois de completar a dissecção, transferir o tubo para o banco de fluxo laminar estéril e Digest o tecido do hipocampo com uma solução de digestão mL contendo papaína. Preparar a solução de digestão tal como descrito no passo 1,9-1,10, mas em vez disso utilizar MEM DMEM.
    NOTA: os passos 3,9-3,12 são críticos e devem ser concluídas dentro de 10 - 15 min.
  9. Após a conclusão da digestão, retirar-se cuidadosamente a solução de digestão por sucção suave com uma pipeta.
  10. Lave o hipocampo 3 vezes com meio neurônio adicionando sequencialmente e, posteriormente, aspirando cuidadosamente 1 mL meio de cultura fresco por ciclo de lavagem. Não centrifugar a suspensão de células.
  11. Após o passo de lavagem final, tritura-se cuidadosamente o tecido em 1 ml de meio neuronal.
  12. Contar as células utilizando uma câmara de contagem e a placa 35.000 células em 500 uL de meio por neurónio um único poço de uma de 24 cavidades de placa (a placa mencionado em 3.2).
    NOTA: Opcionalmente, uma alíquota de células podem ser contrastadas com azul de tripano para avaliar a vitalidade da preparação celular. Controlar a densidade de revestimento por inspecionar visuaisiões utilizando o microscópio (tipicamente 90 - 110 células por campo visual de um objectivo padrão 10X).
  13. Neurónios colocar no incubador a 37 ° C, 6% v / v de CO2, durante 1 h.
  14. Publique incubação, tomar as inserções preparados (semeada com monocamadas confluentes de astrócitos) para fora da incubadora (veja o passo 2.8). Trocar o meio por aspiração do meio astrócitos e substituí-lo com 500 ul fresco neurônio médio.
    NOTA: As inserções devem abrigar monocamadas de astrócitos confluentes após 2-3 DIV (dias in vitro).
  15. Coloque as inserções com astrócitos com cuidado para os poços que contêm as culturas de neurônios (passo 3.13) usando uma pinça estéril.
  16. Coloque a co-cultura de neurónios-astrócitos indirecta resultante de volta na incubadora a 37 ° C, 6% v / v de CO2.
    Nota: Sob estas condições, os neurónios podem ser cultivada por até quatro semanas em meio completamente definido. Nenhuma mudança médio é necessário. Para as culturas de longa data, recomenda-se a encher eMtpa poços com água estéril, a fim de reduzir a evaporação a partir da placa bem-24.
  17. Execute in vitro de células análises após períodos de cultura desejada (por exemplo, por imunocitoquímica, PCR, Western Blot, registros eletrofisiológicos (patch clamp ou matriz multieletrodo)) 7,15,18.
    NOTA: O sistema de cultura também é adequado para o tratamento farmacológico aguda e crónica das culturas 11.

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Representative Results

A análise das culturas neuronais através do sistema de co-cultura indirecta é heterogénea e pode ser realizada em diferentes estágios de maturação da cultura. Devido ao facto de que as células podem ser mantidas durante até 4 semanas, as investigações a longo prazo das culturas são possíveis.

O esquema no painel central esquerdo da Figura 1 demonstra a configuração de co-cultura. Com a utilização deste sistema, imagens de células vivas de ambos os tipos de células pode ser realizada, como exemplificado por imagens de contraste de fase da monocamada de astrócitos (painel superior esquerdo) e a rede neuronal (painel inferior esquerdo). Após a fixação, a avaliação imunocitoquímica é possível, como mostrado na painéis da direita inferior e superior direito.

Os neurónios começar a estabelecer conexões sinápticas a partir de aproximadamente 7 DIV no nosso modelo (dados não apresentados). 14 DIV múltiplas sinapses são formadas dentro de redes neuronais, conforme identificado pela detecção imunocitoquímica combinado de marcadores pré e pós-sinápticos (Figura 1, painel inferior direito). Mais importante, não apenas a quantidade de pontos lacrimais marcador sináptica pode ser visualizada e quantificada utilizando-se esta abordagem, mas também as sinapses, que são mais prováveis ​​de contribuir para a conectividade de rede estruturalmente concluída.

As culturas de astrócitos não só fornecer suporte trófico para os neurónios 11, mas também sintetizam vários fatores secretados 19,20 envolvidos na plasticidade neural. A expressão de um destes factores, ou seja, da metaloproteinase da matriz 2 (MMP2), é demonstrado no painel superior direito da Figura 1. Curiosamente, 2 distintas MMP2-isoformas foram detectadas no meio de co-cultura utilizando Western Blot (Figura 1, painel médio direito ). Potencialmente astrócitos secretam MMP2 nas smédio Hared, afetando assim a plasticidade dos neurônios. Também foram identificadas várias isoformas da tenascina-C, um regulador conhecido do crescimento de axónio, migração e diferenciação celular 21.

Tomados em conjunto, estes resultados demonstram dois exemplos e, assim, fornecer uma prova de princípio para a variedade de investigações de astrócitos, neurónios e a sua comunicação recíproca que pode ser realizado usando o método de co-cultura indirecta aqui descrito.

figura 1
. Figura 1: A indireta Astrocyte-Neuron Coculture sistema permite a análise separada dos astrócitos, neurônios e secretada mediadores moleculares Painel superior, da esquerda: as monocamadas de formulário astrócitos na membrana inserção de cultura de células, contraste de fase; barra de escala: 250 microns Painel superior, à direita:. comotrocytes são imunocoradas para glial fibrilar ácida proteína (GFAP) (murganho clone GA5) e Matrix Metaloprotease 2 (MMP2) (policlonal de coelho); barra de escala:. 250 microns painel Oriente, para a esquerda: o esquema ilustra a instalação co-cultura indirecta. Apesar de duas culturas estão fisicamente separados, eles compartilham o mesmo meio painel Oriente, à direita:. Dois mediadores moleculares secretadas de neurônio-glia interações são revelados no meio de co-cultivo utilizando Western Blot. . Várias isoformas da tenascina C (TNC), um regulador de crescimento de neurites, e MMP2, um modificador de matriz extracelular, são documentados painel de baixo, da esquerda: neurônios primários desenvolver redes altamente interligados por 14 dias de cultivo, contraste de fase; . barra de escala: 250 microns Painel inferior, direita: começando com 14 d in vitro, várias conexões sinápticas são estabelecidas entre os neurônios, como detectado por marcação imunocitoquímica; barra de escala: 50 microns. A co-localização do marcador pré-sináptico fagote (policlonal de coelho) com o pós-sináptica proteína PSD95 andaimes (clone de rato 6G6-1C9) documenta a formação de sinapses estruturalmente concluída. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

O principal objetivo do protocolo atual é a de culturas neuronais e astrócitos completamente separadas, mantendo-os em meio compartilhado. Por esta razão, a pureza das culturas obtidas deverá ser verificada no início do procedimento. Recomendamos o uso de neurônio-específica tubulina, neurofilaments ou proteína NeuN como marcadores neuronais, GFAP como marcador de astrócitos, o antígeno O4 como marcador precursor oligodendrócitos e proteína Iba1 para identificar microglia.

Preste atenção especial ao executar uma etapa crítica do protocolo, conforme especificado por uma "nota" antes da descrição da etapa. Leve em consideração que ambas as culturas primárias de neurónios e astrócitos são bastante sensíveis. Portanto, vários problemas podem surgir no início do procedimento. Se os astrócitos não atingem uma monocamada confluente em frascos T75 após 10 DIV (seção de protocolo 1), verifique os componentes do meio astrócitos (data de expiração para). Além,aumentar a quantidade de tecido cortical preparado para iniciar a cultura (até 10 córtices por frasco). Se os astrócitos não atingem uma monocamada confluente em inserções de cultura de células após 72 h (seção de protocolo 2), verifique os componentes do meio astrócitos e PDL (data de expiração para) .Try ao prato out culturas preparados na hora, determinar a proporção de viável células antes do plaqueamento e ajustar o número de células em conformidade (por exemplo, uso de contraste de azul de tripano). Se baixa sobrevivência de neurónios é detectada após 24 horas, o tecido do hipocampo não foi triturado com cuidado suficiente (passo protocolo 3,11) .Pay atenção para evitar a formação de bolhas quando dissociar o tecido. Se a sobrevivência dos neurônios é significativamente reduzido após 7-14 DIV e se neurônios formam agregados de 3 - 5 células após 7 DIV, use inserções preparada na hora com astrócitos, para verificar a pureza astrócitos por imunocitoquímica, e verificar os componentes do meio neurônio. Se grandes agregados de neurônios (mais de 10 células) são visible, é possível que o tecido do hipocampo não foi suficientemente triturado, resultando na dissociação incompleta (protocolo passo 3.11). Preste atenção à homogeneidade suspensão. Se a cultura neuronal está contaminado com células não-neuronais (microglia, astrócitos, células precursoras de oligodendrócitos, etc.), remover completamente o tecido cortical vizinha adjacente ao hipocampo (passo 3.7) e também verificar os componentes do meio neurónio.

A co-cultura indirecta proposta de neurônios primários e astrócitos fornece uma ferramenta versátil para a investigação a longo prazo de interações neurônio-glia. É importante ressaltar que este protocolo é otimizado para células de rato, o que abre perspectivas para a implementação de modelos genéticos do rato. Por causa da separação física completa dos tipos de células 2, os neurónios e astrócitos de genótipos diferentes podem ser combinadas da maneira desejada.

Entre uma variedade de aplicações, esta abordagem pode ser utilizada com o investigate desenvolvimento de redes neurais, synaptogenesis, a atividade de rede e sinalização astrócito-neurónio. Embora o co-cultura indirecta de neurónios e astrócitos abre grandes oportunidades para sua análise segregada e sinalização de longo alcance, a falta de contacto directo pode comprometer a regulação sutil de plasticidade sináptica 22. Assim, a falta de interacção entre as protuberâncias astrocíticos e sinapses neuronais tem de ser tratada cuidadosamente quando usando este modelo.

O ensaio baseia-se dois protocolos anteriores para astrócitos e preparações neuronais 14,17 e foi melhorado no decurso dos últimos anos. A abordagem foi originalmente estabelecido para rato 7 e rato 11 células. Publicações anteriores do laboratório proporcionar uma caracterização detalhada dos ensaios sobre a sobrevivência celular, a formação de sinapses e caracterização electrofisiológica de as células resultantes 7,11,15,18. Além disso, Tele ensaio pode ser adaptado para outras configurações, tais como as micro-eléctrodos-matrizes (AMA) 7. Para futuras aplicações, o leitor deve considerar outros protocolos para a investigação detalhada da formação de sinapses 23, bem como para análise MEA in vitro. Em conclusão, o teste fornece uma ferramenta versátil para laboratórios com foco em vários aspectos da interação neurônio-glia.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
B27 Gibco (Life Technologies) 17504-044
Cell-culture-grade water MilliQ
Cytosine-β-D-arabinofuranoside (AraC) Sigma-Aldrich C1768 CAUTION: H317, H361
DMEM Gibco (Life Technologies)  41966-029
DNAse Worthington LS002007
Gentamycin Sigma-Aldrich G1397 CAUTION: H317-334
Glucose Serva 22700
HBSS Gibco (Life Technologies) 14170-088
HEPES Gibco (Life Technologies) 15630-056
Horse serum Biochrom AG S9135
L-Cysteine Sigma-Aldrich C-2529
MEM Gibco (Life Technologies) 31095-029
Ovalbumin Sigma-Aldrich A7641 CAUTION: H334
Papain Worthington 3126
PBS self-made
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P0899
Poly-L-ornithine Sigma-Aldrich P3655
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich S8636
Trypsin-EDTA Gibco (Life Technologies) 25300054
Equipment
24-well-plates Thermoscientific/Nunc 142475
24-wells-plate (for the  indirect co-culture) BD Falcon 353504
Binocular Leica MZ6
Cell-culture inserts BD Falcon 353095
Centrifuge Heraeus Multifuge 3S-R
Counting Chamber Marienfeld 650010
Forceps FST Dumont (#5) 11254-20
glass cover slips (12 mm) Carl Roth (Menzel- Gläser) P231.1
Incubator Thermo Scientific Heracell 240i
Micro-tube (2 mL) Sarstedt 72,691
Microscope Leica DMIL
Millex Syringe-driven filter unit Millipore SLGV013SL
Orbital shaker New Brunswick Scientific Innova 4000
Parafilm Bemis PM-996
Petri dishes (10 cm) Sarstedt 833,902
pipette (1 mL) Gilson Pipetman 1000
Sterile work bench The Baker Company Laminar Flow SterilGARD III
Surgical scissors FST Dumont 14094-11
Syringe Henry Schein 9003016
T75 flask Sarstedt 833,911,002
tube (15 mL) Sarstedt 64,554,502
Water bath GFL Water bath type 1004

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Volterra, A., Meldolesi, J. Astrocytes, from brain glue to communication elements: the revolution continues. Nat Rev Neurosci. 6, 626-640 (2005).
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A indireta Neuron-astrócitos Coculture Ensaio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up para a investigação detalhada da Relação Neuron-glia
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Gottschling, C., Dzyubenko, E.,More

Gottschling, C., Dzyubenko, E., Geissler, M., Faissner, A. The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions. J. Vis. Exp. (117), e54757, doi:10.3791/54757 (2016).

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