Abstract
Gastrulation er det første sæt af morfologisk dynamiske begivenheder, der opstår under fosterudviklingen af flercellede dyr såsom Drosophila. Denne morfologiske ændring er også anerkendt som epitelial til mesenkymale overgang (EMT). Dysregulering af EMT er forbundet med fibrose og cancer metastaser. Der er ny dokumentation, at EMT styres af en række molekylære mekanismer. Som sådan mange vigtige gener, der styrer apikale konstriktion også er kendt for at være vigtige faktorer i EMT observeret i cancermetastase. Ligesom EMT under Drosophila gastrulation kan epitelceller induceres til at ændre deres form og omprogrammeres til at omdirigere celle skæbne mod forskellige andre celletyper. Her giver vi en robust imaging metode Drosophila gastrulation at analysere indledningen af morfogenetiske cellulære bevægelser og celle skæbne identifikation i løbet af denne fase af fosterudviklingen. Ved hjælp af denne metode, vi identificerer cell omlejring på tidspunktet for gastrulation og vise betydningen af apikale konstriktion under gastrulation hjælp GFP-mærket DE-cadherin.
Introduction
Gastrulation er det første sæt af morfologisk dynamiske hændelser, der forekommer under embryonisk udvikling af flercellede dyr såsom Drosophila 1,2. Interessant, spirende tegn på, at denne proces er reguleret gennem samspillet mellem mekaniske og molekylære mekanismer 3. Endvidere er epithelial til mesenkymale overgang (EMT), som er en afgørende proces i gastrulation, også impliceret i humane sygdomsprocesser såsom cancermetastase 4-8. Som sådan, mange gener, der styrer apikale konstriktion også er kendt for at være nøglefaktorer i EMT observeret i kræft metastaser 9. Således apikale konstriktion på tidspunktet for gastrulation er en fremragende model til at undersøge de nævnte reguleringsmekanismer og øge vores forståelse af cancer metastaser. Fordelen ved denne teknik er, at vi kan observere cellebevægelse på tidspunktet for gastrulation i real-tid, og derfor vil vi værekan screene gener involveret i gastrulation samt cancermetastase.
Selv relativt ukendt, er celle-til-celle adhæsion menes at spille en central rolle i apikale konstriktion 1. Drosophila genetik er velegnet for enlige undersøgelser celle niveau udforske regulatoriske molekylære mekanismer. Denne model vil gøre det muligt for os at afdække betydningen af apikale konstriktion under gastrulation. Desuden kan denne fremgangsmåde anvendes til at screene gener involveret i cancermetastase. Optagelse af levende billeder af Drosophila gastrulation har endvidere gjort det muligt for os at forstå nærmere de molekylære mekanismer for vævs- omlægning. Heri giver vi en samlet beskrivelse af en simpel metode til at opnå dette.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: De transgene fluer anvendt i denne undersøgelse omfatter følgende: DE-cad :: GFP 10.
1. Fremstilling af Apple Plate
- Der fremstilles en blanding af 12,5 g agar, 125 ml 100% kommercielt tilgængeligt æblesaft, 12,5 g glucose og 375 ml H2O Blandingen opvarmes i en mikrobølgeovn og hæld det i en 3 cm celledyrkningsskål. Opbevar blandingen ved 4 ° C til fremtidig brug.
- Efter tilberedning af æble plade, tilføje et tyndt lag af æltet gær pasta oven på den for at tillade fluerne til at lægge æg.
2. Embryo Forberedelse og live Imaging Protocol
- Placer ca. 50 fluer (25 mænd og 25 kvinder) i en flaske for at parre og efterfølgende lægge æg natten på et æble plade dækket i æltet gær. Indstil æblesaft pladen ved mundingen af flasken. Hold flasken på hovedet i en inkubator. Pak plastik Drosophila lager flasker med aluminiumsfolie til at bede the flyver at lægge flere æg.
- Den næste morgen, erstatte den gamle æblejuice plade med en ny.
- Lad fluerne lægger æg i 3 til 4 timer ved indpakning flasken med aluminiumsfolie.
- Tre til fire timer senere, indsamle embryoner i et foster si fra æblejuice plade ved hjælp af en børste eller bomuld dårlige og vaske dem med PBS. Vask embryoner 2 til 3 gange med PBS i 12 brønds dyrkningsskåle.
- Dechorionate embryoner med 50% blegemiddel i 5 minutter i 12-brønds dyrkningsskåle.
- Efter dechorionation proces, vaske embryoerne 2 til 3 flere gange med PBS.
- Overfør embryoner til en 3 cm cellekultur skål indeholdende PBS og vælg etape 5 embryoner under lup baseret på graden af gennemsigtighed ved deres grænser. Pipette de iscenesatte embryoner ved hjælp af en 200 uL pipettespids.
- Herefter sættes to udvalgte embryoner på et dækglas, og fjerne overskydende PBS med fint snoet papir væv. Orientere embryoner dorsale side op pådækglasset ved anvendelse af en fint snoet papirserviet. Efter at fastgøre embryoner til dækglas med silicium fedt med en fin nål og snoet papir væv.
- Tilføj en lille dråbe carbonhalogenid olie 700 på embryoner og placere dækglasset indeholder embryoner op og ned på indrykket dias, efterlader noget plads i bunden af slæden.
- Undersøge fostre ved hjælp et konfokalt afbildningssystem, en argon / 488 laser, og en olieimmersionsobjektiv (63X).
BEMÆRK: Identificering embryoet på et passende udviklingstrin er vigtigt at indfange billeder af gastrulation begivenhed. Under disse betingelser, observere næsten alle embryoner udvikle sig normalt op til mindst trin 14. Det analyserede embryo kan dyrkes yderligere at udvikle sig som en voksen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her viser vi de gastrulation begivenheder i Drosophila embryo og en generel oversigt over embryo forberedelse procedure (figur 1). Cellemembraner mærket ved anvendelse af DE-cadherin :: GFP og billeddannelse af celle- bevægelser udføres på tidspunktet for gastrulation i Drosophila (figur 2). Da DE-cadherin GFP fluer giver os mulighed for at visualisere celleadhærens vejkryds, er vi i stand til at spore apikal celle form og bevægelser ved hjælp af dette system. Endnu vigtigere, dette system gør det også muligt for os at spore endogene DE-cadherinekspression mønstre.
Figur 1: Generel oversigt af Embryo Forberedelse Procedure. A) Opsætning fluer til æglægning. B) Saml embryoner og placere dem i et foster si. C) Efter vasking embryoner med PBS, straks dechorionate dem. D) Overfør embryonerne til en 3 cm celledyrkningsskål anvendelse af PBS. E) Pipetter embryonerne, der er på den korrekte udviklingsstadiet og placere dem på et dækglas. F) Fastgør embryoner til dækglasset anvender vakuum fedt. G) Næste tilføje en dråbe carbonhalogenid olie på dækglasset. H) Endelig placere dækglasset på hovedet på den indskårne slide. De embryoner er nu klar til time-lapse billeddannelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Resultat af en eksperimentel procedure udnytte DE-cad :: GFP-baserede Live Imaging Under gastrulation. Cellemembraner blev mærket under anvendelse af DE-cadherin ::GFP og live billeder af celle bevægelse blev derefter fanget i ca. 500 sek i gastrulation af Drosophila. Apikale celle perimetre blev visualiseret under anvendelse af GFP-fluorescens i DE-Cad for at spore de apikale områder af individuelle celler under anvendelse af et repræsentativt sæt af time-lapse billeder; Scale bar = 20 um. Pilene viser, hvor apikale konstriktion og indkrængning forekomme. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
- Haruta, T., Warrior, R., Yonemura, S., Oda, H. The proximal half of the Drosophila E-cadherin extracellular region is dispensable for many cadherin-dependent events but required for ventral furrow formation. Genes Cells. 15 (3), 193-208 (2010).
- Oda, H., Takeichi, M. Evolution: structural and functional diversity of cadherin at the adherens junction. J. Cell Biol. 193 (7), 1137-1146 (2011).
- Fernandez-Sanchez, M. E., Serman, F., Ahmadi, P., Farge, E. Mechanical induction in embryonic development and tumor growth integrative cues through molecular to multicellular interplay and evolutionary perspectives. Methods Cell Biol. 98, 295-321 (2010).
- Alderton, G. K. Metastasis: Epithelial to mesenchymal and back again. Nat. Rev. Cancer. 13 (1), 3 (2013).
- Fabregat, I., Malfettone, A., Soukupova, J. New Insights into the Crossroads between EMT and Stemness in the Context of Cancer. J. Clin. Med. 5 (3), (2016).
- Serrano-Gomez, S. J., Maziveyi, M., Alahari, S. K. Regulation of epithelial-mesenchymal transition through epigenetic and post-translational modifications. Mol. Cancer. 15, (2016).
- Yu, A. Q., Ding, Y., Li, C. L., Yang, Y., Yan, S. R., Li, D. S. TALEN-induced disruption of Nanog expression results in reduced proliferation, invasiveness and migration, increased chemosensitivity and reversal of EMT in HepG2 cells. Oncol. Rep. 35 (3), 1657-1663 (2016).
- Zheng, X., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition is dispensable for metastasis but induces chemoresistance in pancreatic cancer. Nature. 527 (7579), 525-530 (2015).
- Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. J. Clin. Invest. 119 (6), 1420-1428 (2009).
- Huang, J., Zhou, W., Dong, W., Watson, A. M., Hong, Y. Directed, efficient, and versatile modifications of the Drosophila genome by genomic engineering. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (20), 8284-8289 (2009).
