Abstract
Gastrulation ist der erste Satz von morphologisch dynamische Ereignisse , die während der embryonalen Entwicklung von mehrzelligen Tieren wie Drosophila auftreten. Diese morphologischen Veränderung wird auch als epitheliale zu mesenchymale Transition (EMT) anerkannt. Dysregulation von EMT mit Fibrose und Krebsmetastasen assoziiert. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass EMT durch eine Reihe von molekularen Mechanismen gesteuert wird. Als solche viele wichtige Gene, die apikal Verengung steuern auch in Krebsmetastasen beobachtet wichtige Faktoren bei der EMT bekannt sind. Wie EMT während der Drosophila gastrulation können Epithelzellen induziert werden , um ihre Form zu verändern und neu programmiert werden Zellschicksal zu verschiedenen anderen Zelltypen umzuleiten. Hier haben wir eine stabile Abbildungsverfahren von Drosophila Gastrulation liefern die Einleitung morphogenetic Zellbewegungen und Zellschicksal Identifikation während dieser Phase der Embryonalentwicklung zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens identifizieren wir cell-Umlagerung zum Zeitpunkt der Gastrulation und die Bedeutung der apikalen Verengung während der Gastrulation zeigen GFP unter Verwendung markierter DE-Cadherin.
Introduction
Gastrulation ist der erste Satz von morphologisch dynamische Ereignisse , die während der embryonalen Entwicklung von mehrzelligen Tieren wie Drosophila 1,2 auftreten. Interessanterweise deutet einiges darauf hin ab , dass dieser Prozess 3 durch das Zusammenspiel zwischen mechanischen und molekularen Mechanismen reguliert wird. Darüber hinaus ist der Epithelial-mesenchymale Transition (EMT), die ein entscheidendes Verfahren in der Gastrulation, wird auch 4-8 in menschlichen Krankheitsprozesse , wie beispielsweise Krebsmetastasen beteiligt ist . Als solche viele Gene , die apikal Verengung steuern auch in Krebsmetastasen 9 beobachtet Schlüsselfaktoren bei der EMT bekannt sind. Somit apikalen Verengung zum Zeitpunkt der Gastrulation ist ein ausgezeichnetes Modell die genannten Regulationsmechanismen zu untersuchen und unser Verständnis von Krebsmetastasen zu verbessern. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass wir die Zellbewegung zum Zeitpunkt der Gastrulation in Echtzeit und daher zu beobachten, sind wir in derkönnen Gene in gastrulation sowie Krebsmetastasen beteiligt zu screenen.
Obwohl relativ unbekannt, Zell-zu-Zell - Adhäsion wird gedacht 1 eine zentrale Rolle in apikalen Verengung zu spielen. Drosophila Genetik ist gut für Einzelzellebene Untersuchungen erforscht regulatorische molekularen Mechanismen geeignet. Dieses Modell ermöglicht es uns, die Bedeutung der apikalen Konstriktion während der Gastrulation aufzudecken. Darüber hinaus kann dieses Verfahren verwendet werden, um Gene in Krebsmetastasierung beteiligt zu screenen. Aufnehmen von Live - Bildern von Drosophila gastrulation aktiviert ferner uns näher , die molekularen Mechanismen zu verstehen , Gewebe Umlagerung regeln. Hier bieten wir eine umfassende Beschreibung eines einfachen Methode, dies zu erreichen.
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Protocol
HINWEIS: Die transgenen Fliegen in dieser Studie verwendet werden , umfassen die folgenden: DE-cad :: GFP 10.
1. Herstellung von Apple Platte
- Bereiten Sie eine Mischung aus 12,5 g Agar, 125 ml 100% im Handel erhältlich Apfelsaft, 12,5 g Glucose und 375 ml H 2 O Das Gemisch wird in einer Mikrowelle und gießen Sie sie in eine 3 cm Zellkulturschale. Lagern Sie die Mischung bei 4 ° C für zukünftige Verwendung.
- Nach der Vorbereitung der Apfelplatte, fügen Sie eine dünne Schicht aus geknetet Hefe-Paste auf ihm die Fliegen zu ermöglichen Ei zu legen.
2. Embryo Vorbereitung und Live-Imaging-Protokoll
- Es werden ca. 50 Fliegen (25 Männer und 25 Frauen) in einer Flasche zu paaren und anschließend legen ihre Eier über Nacht auf einem Apfel Platte in geknetet Hefe bedeckt. Stellen Sie den Apfelsaft Platte an der Mündung der Flasche. Halten Sie die Flasche auf den Kopf in einem Inkubator. Wickeln Sie die Kunststoff Drosophila Vorratsflaschen mit Aluminiumfolie zu veran the fliegt mehr Eier zu legen.
- Am nächsten Morgen, ersetzen die alten Apfelsaft Platte mit einer neuen.
- Lassen Sie die Fliegen Eier für 3 bis 4 h legen, indem Sie die Flasche mit Alufolie wickeln.
- Drei bis vier Stunden später sammeln die Embryonen in einem Embryo Sieb aus dem Apfelsaft Platte mit einem Pinsel oder Baumwolle schlecht mit und waschen Sie sie mit PBS. Waschen Sie die Embryonen 2 bis 3 mal mit PBS in 12-Well-Kulturschalen.
- Dechorionate die Embryonen mit 50% Bleichmittel für 5 Minuten in 12-Well-Kulturschalen.
- Nach dem dechorionation Prozess, waschen Sie die Embryonen 2 bis 3 mal mit PBS.
- Übertragen Sie die Embryonen auf eine 3 cm Zellkulturschale mit PBS und wählen Sie Stufe 5 Embryonen unter dem Mikroskop auf der Grundlage der Grad der Transparenz an ihren Grenzen. Pipette, um die inszenierten Embryonen mit einer 200 ul Pipettenspitze.
- Als nächstes legen Sie zwei ausgewählten Embryonen auf einem Deckglas und mit fein verdrehten Seidenpapier überschüssiges PBS zu entfernen. Richten Sie die Rückenseite Embryonen nach oben aufdas Deckglas eine fein verdrehten Seidenpapier verwendet wird. Danach, fügen Sie eine feine Nadel und verdrehten Seidenpapier, die Embryonen auf das Deckglas mit Silikonfett verwenden.
- Fügen Sie einen kleinen Tropfen Halocarbonöl 700 auf den Embryonen und legen Sie die Deck die Embryonen den Kopf auf dem gegliederten Schlitten, so dass etwas Platz am unteren Rand der Folie enthält.
- Untersuche die Embryonen ein konfokales Abbildungssystem unter Verwendung eines Argon / 488-Laser, und eine Ölimmersionsobjektiv (63X).
ANMERKUNG: Das Identifizieren des Embryos an der entsprechenden Entwicklungsstadium ist wichtig, Bilder der Gastrulation Ereignis zu erfassen. Unter diesen Bedingungen beobachten fast alle Embryonen entwickeln sich normal bis mindestens Stufe 14. Der analysierte Embryo weiter kultiviert werden, können als Erwachsene zu entwickeln.
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Representative Results
Hier zeigen wir die Gastrulation Ereignisse des Drosophila Embryo und einen allgemeinen Überblick über den Embryo Herstellungsverfahren (1). Zellmembranen verwenden DE-cadherin :: GFP und die Bildgebung von Zellbewegungen markiert ist zum Zeitpunkt der Gastrulation in Drosophila (Abbildung 2) durchgeführt. Da DE-Cadherin GFP Fliegen ermöglichen es uns, die Zellhaftung Kreuzungen zu visualisieren, sind wir mit diesem System Apikalzelle Form und Bewegungen zu verfolgen können. Noch wichtiger ist, ermöglicht dieses System auch uns endogene DE-Cadherin-Expressionsmuster zu verfolgen.
Abbildung 1: Allgemeiner Überblick über das Embryonenherstellungsverfahren. A) Richten Sie Fliegen zur Eiablage. B) sammeln Embryonen und legen Sie sie in einem Embryo Sieb. C) Nach dem Waschening die Embryonen mit PBS, dechorionate sie sofort. D) Bringen Sie die Embryonen auf eine 3 cm Zellkulturschale mit PBS. E) Pipettieren die Embryonen , die in der richtigen Entwicklungsstadium sind und auf einem Deckglas legen. F) Bringen Sie die Embryonen auf das Deckglas mit Vakuumfett. G) Als nächstes einen Tropfen Öl auf die Halogenkohlenstoffdeck hinzufügen. H) legen schließlich das Deckglas auf den Kopf am gegliederten Folie. Die Embryonen sind nun bereit für Zeitraffer-Bildgebung. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Das Ergebnis einer Versuchsdurchführung unter Verwendung von DE-cad :: GFP-basierten Live - Imaging während der Gastrulation. Die Zellmembranen wurden unter Verwendung von DE-Cadherin gekennzeichnet ::GFP und die Bildgebung von Zell - Bewegung wurde dann für etwa 500 s während der Gastrulation von Drosophila erfasst. Apikalzelle Umfänge wurden unter Verwendung des GFP-Fluoreszenz von DE-Cad visualisiert, um die apikalen Bereiche der einzelnen Zellen zu verfolgen, einen repräsentativen Satz von Zeitraffer-Bilder verwendet wird; Maßstabsbalken = 20 & mgr; m. Die Pfeilspitzen zeigen, wo apikalen Verengung und Einstülpung auftreten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
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