Abstract
Gastrulation आकृति विज्ञान गतिशील घटनाओं है कि इस तरह के रूप में ड्रोसोफिला बहुकोशिकीय जानवरों के भ्रूण के विकास के दौरान होने का पहला सेट है। यह रूपात्मक परिवर्तन भी mesenchymal संक्रमण (EMT) को उपकला के रूप में मान्यता प्राप्त है। EMT का अनियंत्रण फाइब्रोसिस और कैंसर मेटास्टेसिस के साथ जुड़ा हुआ है। उभरते सबूत है कि EMT आणविक तंत्र के एक नंबर के द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इस तरह के कई प्रमुख जीन है कि शिखर कसना पर नियंत्रण भी जाना जाता है के रूप में EMT कैंसर मेटास्टेसिस में मनाया में महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। ड्रोसोफिला gastrulation के दौरान EMT तरह, उपकला कोशिकाओं उनके आकार बदलने के लिए प्रेरित किया जा सकता है और विभिन्न अन्य प्रकार की कोशिकाओं की ओर सेल भाग्य को दिशानिर्देश देने में reprogrammed किया। यहाँ हम ड्रोसोफिला gastrulation के एक मजबूत इमेजिंग विधि भ्रूण के विकास के इस चरण के दौरान मॉर्फ़ोजेनेटिक सेलुलर आंदोलनों और सेल भाग्य पहचान की दीक्षा परख करने के लिए प्रदान करते हैं। इस विधि का उपयोग करना, हम पहचान गgastrulation के समय में पक्ष पुनर्व्यवस्था और GFP का उपयोग कर gastrulation के दौरान शिखर कसना के महत्व को प्रदर्शित लेबल डे-cadherin।
Introduction
Gastrulation आकृति विज्ञान गतिशील घटनाओं है कि इस तरह के ड्रोसोफिला 1,2 के रूप में बहुकोशिकीय जानवरों के भ्रूण के विकास के दौरान होने का पहला सेट है। दिलचस्प है, उभरते सबूत से पता चलता है कि इस प्रक्रिया यांत्रिक और आणविक तंत्र 3 के बीच परस्पर क्रिया के माध्यम से नियंत्रित किया जाता है। इसके अलावा, mesenchymal संक्रमण (EMT) है, जो gastrulation में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, के लिए उपकला भी इस तरह के कैंसर मेटास्टेसिस 4-8 के रूप में मानव रोग प्रक्रियाओं में फंसा है। जैसे, कई जीन है कि शिखर कसना पर नियंत्रण भी जाना जाता है के रूप में EMT कैंसर मेटास्टेसिस 9 में मनाया में महत्वपूर्ण कारक हो सकता है। इस प्रकार, gastrulation के समय में शिखर कसना ऊपर उल्लिखित नियामक तंत्र की जांच करने के लिए और कैंसर मेटास्टेसिस के बारे में हमारी समझ को बढ़ाने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। इस तकनीक का लाभ यह है कि हम वास्तविक समय है और इसलिए में gastrulation के समय में सेल आंदोलन का निरीक्षण कर सकते है, हम होगाकैंसर मेटास्टेसिस के रूप में रूप में अच्छी तरह gastrulation में शामिल जीनों स्क्रीन करने में सक्षम।
हालांकि अपेक्षाकृत अनजान, सेल करने वाली कोशिका आसंजन शिखर कसना 1 में एक केंद्रीय भूमिका निभाने के लिए सोचा है। ड्रोसोफिला आनुवंशिकी अच्छी तरह से नियामक आणविक तंत्र की खोज के एकल कोशिका के स्तर की जांच के लिए अनुकूल है। यह मॉडल gastrulation के दौरान शिखर कसना के महत्व को उजागर करने के लिए सक्षम हो जाएगा। इसके अलावा, इस विधि कैंसर मेटास्टेसिस में शामिल जीनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ड्रोसोफिला gastrulation का कब्जा जीना छवियों आगे ऊतक पुनर्व्यवस्था गवर्निंग आणविक तंत्र अधिक से अधिक विस्तार में समझने के लिए हमें सक्षम है। इस के साथ साथ, हम इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए एक सरल विधि की एक व्यापक वर्णन प्रदान करते हैं।
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Protocol
नोट: DE-सीएडी :: GFP 10: ट्रांसजेनिक इस अध्ययन में इस्तेमाल मक्खियों निम्नलिखित शामिल हैं।
1. एप्पल प्लेट की तैयारी
- एक माइक्रोवेव में 12.5 ग्राम अगर, 125 एमएल 100% व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सेब का रस, 12.5 ग्राम ग्लूकोज, और 375 एमएल एच 2 ओ हीट मिश्रण का एक मिश्रण तैयार है और एक 3 सेमी सेल संस्कृति डिश में डाल देना। भविष्य में उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण स्टोर।
- सेब प्लेट तैयार करने के बाद, मक्खियों अंडे बिछाने के लिए अनुमति देने के लिए यह की चोटी पर kneaded खमीर पेस्ट की एक पतली परत जोड़ें।
2. भ्रूण तैयार करना और लाइव इमेजिंग प्रोटोकॉल
- लगभग 50 मक्खियों (25 पुरुषों और 25 महिलाओं) एक बोतल में जगह दोस्त के लिए और बाद में kneaded खमीर में कवर एक सेब प्लेट पर रात भर अंडे देते हैं। बोतल के मुंह पर सेब का रस प्लेट सेट करें। बोतल उल्टा एक मशीन में नीचे रखें। लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ प्लास्टिक की बोतलों ड्रोसोफिला शेयर वें संकेत करने के लिएई अधिक अंडे देना मक्खियों।
- अगली सुबह, एक नए के साथ पुराने सेब का रस प्लेट की जगह।
- मक्खियों एल्यूमीनियम पन्नी के साथ बोतल लपेटकर द्वारा 3 से 4 घंटे के लिए अंडे देते हैं।
- तीन से चार घंटे बाद, एक ब्रश या कपास बुरा सेब के रस का उपयोग कर थाली से एक भ्रूण झरनी में भ्रूण इकट्ठा करने और उन्हें पीबीएस से धो लें। 12 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में भ्रूण पीबीएस के साथ 2 से 3 अधिक बार धोएं।
- 12 अच्छी तरह से संस्कृति बर्तन में 5 मिनट के लिए 50% ब्लीच के साथ भ्रूण Dechorionate।
- dechorionation प्रक्रिया के बाद, पीबीएस के साथ भ्रूण 2 से 3 गुना अधिक धो लें।
- एक 3 सेमी सेल संस्कृति पीबीएस और चयन चरण में शामिल उनकी सीमाओं पर पारदर्शिता के स्तर के आधार पर माइक्रोस्कोप के तहत 5 भ्रूण डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण। एक 200 μL विंदुक टिप का उपयोग मंचन भ्रूण पिपेट।
- इसके बाद, एक गिलास coverslip पर दो चयनित भ्रूण जगह है, और पतले मुड़ टिशू पेपर के साथ अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें। भ्रूण पृष्ठीय पक्ष ओरिएंट अप परcoverslip एक पतले मुड़ टिशू पेपर का उपयोग कर। उसके बाद, सिलिकॉन तेल एक ठीक सुई और मुड़ टिशू पेपर का उपयोग के साथ कांच coverslip करने के लिए भ्रूण देते हैं।
- भ्रूण पर हेलोकर्बन तेल 700 की एक छोटी सी बूंद जोड़ें और भ्रूण युक्त उल्टा दांतेदार स्लाइड पर नीचे coverslip जगह, स्लाइड के तल पर कुछ जगह छोड़ने।
- एक confocal इमेजिंग प्रणाली, एक आर्गन / 488 लेजर, और एक तेल विसर्जन उद्देश्य (63X) का उपयोग भ्रूण जांच करते हैं।
नोट: उचित विकास के चरण में भ्रूण की पहचान gastrulation घटना की छवियों पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है। इन शर्तों के तहत निरीक्षण लगभग सभी भ्रूण सामान्य रूप से विकसित कम से कम चरण 14. अप करने के लिए विश्लेषण किया भ्रूण आगे संवर्धित किया जा सकता है एक वयस्क के रूप में विकसित करने के लिए।
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Representative Results
यहाँ, हम ड्रोसोफिला भ्रूण के gastrulation घटनाओं और भ्रूण तैयार करने की प्रक्रिया की एक सामान्य अवलोकन (चित्रा 1) दिखा। कोशिका झिल्ली डे-cadherin :: GFP और सेल आंदोलनों का जीना इमेजिंग ड्रोसोफिला में gastrulation के समय में किया जाता है (चित्रा 2) का उपयोग लेबल रहे हैं। चूंकि डे-cadherin GFP मक्खियों हमें सेल पालन जंक्शनों कल्पना करने के लिए अनुमति देते हैं, हम शिखर सेल आकार और इस प्रणाली का उपयोग आंदोलनों का पता लगाने में सक्षम हैं। इससे भी महत्वपूर्ण बात, इस प्रणाली को भी हमें अंतर्जात डे-cadherin अभिव्यक्ति पैटर्न का पता लगाने के लिए अनुमति देता है।
चित्रा 1: भ्रूण तैयार करने की प्रक्रिया की सामान्य अवलोकन। ए) अंडे बिछाने के लिए मक्खियों सेट करें। बी) भ्रूण लीजिए और उन्हें एक भ्रूण झरनी में जगह है। सी) धोने के बादपीबीएस के साथ भ्रूण हैैं, उन्हें तुरंत Dechorionate। डी) एक 3 सेमी सेल संस्कृति पीबीएस का उपयोग डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण। ई) Pipet भ्रूण कि सही विकास के चरण में हैं और एक coverslip पर उन्हें जगह है। एफ) वैक्यूम तेल का उपयोग कर coverslip करने के लिए भ्रूण संलग्न। जी) अगला coverslip पर हेलोकर्बन तेल की एक बूंद जोड़ें। एच) अंत में coverslip उल्टा दांतेदार स्लाइड पर नीचे जगह है। भ्रूण अब समय चूक इमेजिंग के लिए तैयार हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया का परिणाम डे-सीएडी :: GFP आधारित लाइव इमेजिंग का उपयोग gastrulation के दौरान। कोशिका झिल्ली डे-cadherin का उपयोग कर लेबल थे ::GFP और सेल आंदोलन का जीना इमेजिंग तो ड्रोसोफिला के gastrulation के दौरान लगभग 500 एस के लिए कब्जा कर लिया था। शिखर सेल परिधि आदेश अलग-अलग समय चूक छवियों के एक प्रतिनिधि सेट का उपयोग कोशिकाओं के शिखर क्षेत्रों का पता लगाने के लिए डे-सीएडी के GFP प्रतिदीप्ति का उपयोग कल्पना थे; स्केल बार = 20 माइक्रोन। तीर दिखाने जहां शिखर कसना और invagination होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
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