Abstract
낭 배기는 초파리와 같은 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 이 형태 학적 변화는 중간 엽 전이 (EMT)로 상피로 인식되고 있습니다. EMT의 조절 곤란이 섬유화와 암 전이와 관련된다. EMT 분자 메커니즘들에 의해 제어된다 신흥 증거가있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 주요 유전자도 알려진 바와 같이 암 전이에서 관찰 된 EMT 중요한 요소가 될 수 있습니다. 초파리 낭배 동안 EMT와 마찬가지로, 상피 세포는 그 모양을 변경하도록 유도 될 수 있으며, 다양한 세포 유형으로 세포의 운명을 리디렉션 재 프로그램 될 수있다. 여기에서 우리는 배아 발달의이 단계에서 형태 형성 세포 이동 및 세포 운명 식별의 개시를 분석하기 위해 초파리 낭 배기의 강력한 이미징 방법을 제공한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 C를 식별엘의 낭배시의 재 배열 및 GFP를 이용 낭배 동안 정점 수축의 중요성을 입증은 DE-cadherin의 표지.
Introduction
낭 배기는 초파리 1, 2 등의 다세포 동물의 배아 개발하는 동안 발생하는 형태 학적으로 동적 이벤트의 첫 번째 집합입니다. 흥미롭게도, 증거 신흥 것은이 과정이 기계 및 분자 메커니즘 (3) 사이의 상호 작용을 통해 조절되는 것이 좋습니다. 또한, 낭 배기에 중요한 과정입니다 중간 엽 전이 (EMT)로 상피는 또한 암 전이 4-8로 인간의 질병 과정에 연루되어있다. 혀끝의 수축을 제어 등, 많은 유전자가 또한 알려진 바와 같이 암 전이 9에서 관찰 된 EMT의 핵심 요소가 될 수 있습니다. 따라서, 낭배시의 정점 수축은 전술 한 조절 메커니즘을 조사하는 암 전이에 대한 이해를 향상시키는 우수한 모델이다. 이 기술의 이점은 우리는 따라서 실시간에서 낭배시 세포의 움직임을 관찰 할 수 있다는 우리 것암 전이뿐만 아니라 낭 배기에 관여하는 유전자를 선별 할 수.
비교적 알려지지 않지만, 세포 간 접착 정점 수축 1에서 중심 역할을하는 것으로 생각된다. 초파리 유전학은 잘 규제 분자 메커니즘을 탐구 단일 세포 수준의 연구에 적합합니다. 이 모델은 낭배 동안 혀끝의 수축의 중요성을 발견 할 수있게됩니다. 또한,이 방법은 암의 전이에 관여하는 유전자를 선별 할 수있다. 초파리의 낭배의 캡처 라이브 이미지는 더욱 더 상세하게 조직의 재 배열을 관리하는 분자 메커니즘을 이해 할 수있게했다. 여기서, 우리는이를 달성하기 위해 간단한 방법의 포괄적 인 설명을 제공한다.
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Protocol
참고 : DE-CAD :: GFP 10 : 본 연구에 사용 된 형질 전환 초파리는 다음과 같습니다.
애플 플레이트 1. 준비
- 마이크로파 12.5 g 한천, 125 mL의 100 % 시판 사과 주스, 12.5 g의 글루코스, 및 375 mL의 H 2 O 열 혼합물의 혼합물을 제조하고, 3cm 세포 배양 접시에 부어. 나중에 사용하기 위해 4 ° C에서 혼합물을 저장합니다.
- 사과 플레이트를 제조 한 후, 파리가 알을 배치 할 수 있도록 그 위에 반죽 효모 붙여 넣기의 얇은 층을 추가합니다.
2. 배아 준비 및 라이브 영상 프로토콜
- 짝이어서 반죽 효모에 덮여 사과 접시에 하룻밤 알을 낳기 위해 병에 약 50 파리 (25 명의 남성과 25 명의 여성)을 놓습니다. 병의 입에 사과 주스 플레이트를 설정합니다. 거꾸로 인큐베이터에서 병을 유지합니다. 제 프롬프트 알루미늄 호일 플라스틱 초파리 재고 병 포장전자는 더 많은 알을 낳기 위해 날아갑니다.
- 다음날 아침, 새와 오래된 사과 주스 플레이트를 교체합니다.
- 파리 알루미늄 호일로 병을 포장하여 3 ~ 4 시간 동안 알을 낳기 수 있습니다.
- 세 4 시간 후, 브러시 또는면 나쁜를 사용하여 사과 주스 플레이트에서 배아 체에서 배아를 수집하고 PBS로 씻는다. 12 웰 배양 접시에 배아를 PBS로 2 ~ 3 회 이상 세척 할 것.
- 12 웰 배양 접시에 5 분 동안 50 % 표백제와 배아를 Dechorionate.
- dechorionation 과정에 따라, PBS와 배아를 2 ~ 3 번 더 씻는다.
- PBS 선택 단계 그들의 경계에서의 투명도 수준에 기초하여 현미경 5 배아 함유 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮긴다. 200 μL 피펫 팁을 사용하여 준비된 배아 피펫.
- 다음으로, 유리 커버 슬립에 선택한 두 배아를 배치하고 가늘게 꼰 티슈로 여분의 PBS를 제거합니다. 최대의 배아에게 지느러미 쪽의 방향미세 트위스트 티슈 페이퍼를 이용하여 커버 슬립. 그 후, 미세 바늘과 트위스트 티슈 페이퍼를 사용하여 실리콘 그리스와 유리 커버 슬립에 배아를 연결합니다.
- 슬라이드의 하단에 공간을두고, 배아에 할로 카본 오일 (700)의 작은 방울을 추가하고 거꾸로 들여 쓰기 슬라이드에서 배아를 포함 coverslip에 배치합니다.
- 공 초점 영상 시스템 아르곤 / 488 레이저 및 오일 액침 대물 (63X)를 이용하여 태아를 조사한다.
주 : 해당 발달 단계에서 배아를 식별은 낭 배기 이벤트의 이미지를 캡처하는 것이 중요합니다. 이러한 조건에서, 거의 모든 배아는 배아 분석 성인 개발 배양 될 수있는 적어도 14 단계까지 정상적으로 발전 관찰한다.
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Representative Results
여기서, 우리는 초파리 배아의 낭배 이벤트 및 배아 준비 절차에 대한 일반적인 개요 (도 1)를 나타낸다. 세포막 DE 헤린 : GFP 및 세포 이동의 라이브 영상은 초파리 낭배시에 수행된다 (도 2)를 이용하여 라벨링된다. DE-cadherin의의 GFP 파리는 우리가 세포 부착 접합을 시각화 할 수 있기 때문에, 우리는 혀끝의 세포 모양이 시스템을 사용하여 움직임을 추적 할 수 있습니다. 더 중요한 것은,이 시스템은 우리가 내생 DE-cadherin의 발현 패턴을 추적 할 수 있습니다.
그림 1 : 배아 준비 절차의 일반 개요. A) 달걀 누워에 대한 파리를 설정합니다. B) 배아를 수집 및 배아 체에 배치합니다. 세척 후 C)PBS와 배아를 보내고, 바로 그들을 dechorionate. D)은 PBS를 사용하여 3cm 세포 배양 접시에 배아를 옮긴다. E) 피펫의 올바른 발달 단계에와 커버 슬립에 배치 배아. F)는 진공 그리스를 사용하여 커버 슬립에 배아를 연결합니다. G) 다음으로는 커버 슬립에 할로 카본 기름 한 방울을 추가합니다. H는) 마지막 거꾸로 들여 쓰기 슬라이드에 커버 슬립을 배치합니다. 배아는 시간 경과 이미징을위한 준비가 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 낭배 동안 DE-CAD :: GFP 기반의 라이브 영상을 이용한 실험 절차의 결과. 세포막 DE-cadherin의 표지를 사용 하였다 :GFP 세포 운동의 라이브 영상은 초파리의 낭배 동안 약 500 초 동안 체포됐다. 혀끝 셀 둘레 시간 경과 화상의 대표적인 세트를 이용하여 각 셀의 꼭대기 부분을 추적하기 위해 DE-캐드의 GFP 형광을 사용하여 시각화 하였다; 스케일 바는 20 μm의 =. 혀끝의 수축 및 함입이 발생하는 곳 화살촉을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | MKBH 5726 | |
| Vacuum grease Silicone | Beckman | 335148 | |
| Glass coverslip | Matsunami glass | Thickness No1 | 24 - 36 mm |
| Embryo stariner | Corning | Corning3477 | |
| Plastic Drosophilla Stock Bottles | Hitec | MKC-100 | |
| DE-Cadherin knock-in flies | REF (10) |
References
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